用于监测菌落的细菌生长和预测菌落生物量的系统和方法

摘要

用于最早的微生物生长检测的成像方法。该方法使用图像来确定菌落生物量，并且菌落生物量确定何时可以挑取菌落进行鉴定或抗生素敏感性测试的分析。如果样品源不是纯样品源，则可能需要另外的孵育以在挑取前允许增加菌落的生物量。

说明书

相关申请

本申请要求于2018年12月20日提交的美国临时申请号62/782,513的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

人们越来越关注用于检测微生物生长的培养板的数字图像。在2016年8月6日公布的题为“用于使用监督式高质量成像的图像采集的系统和方法(A System and Method forImage Acquisition Using Supervised High Quality Imaging)”的PCT公开号WO/2015/114121、2016 年10月27日公布的题为“菌落对比度收集(Colony Contrast Gathering)”的WO/2016/172527 和2017年10月27日公布的题为“用于从铺板培养基上的划线样品中自动计数微生物菌落的方法和系统(A Method and System for Automatic Microbial Colonycount from Streaked Sample on Plated media)”的WO/2016/172532中描述了用于对培养板进行成像以检测其上的微生物生长的技术，其全部内容通过引用并入本文。所有上述参考文献都与本申请共同转让。

WO/2015/114121描述了通过控制信噪比来鉴定菌落目标并将这些目标与非菌落伪像和背景区分开来的技术。WO/2016/172527描述了基于自动成像技术解释培养板图像的系统和方法。菌落目标在促进微生物在营养介质上生长的过程中被早期鉴定，并且随着时间的推移和在支持菌落生长的条件下观察这些鉴定的目标的变化。WO/2016/172532描述了系统和方法，通过该系统和方法对鉴定的菌落进行计数以确定菌落是否来自相同微生物并进一步确定菌落计数是否达到或超过预定数量。

菌落的检测、菌落计数、菌落群体分化和菌落鉴定为现代微生物学成像系统限定了目标。尽可能早地实现这些目标达到了迅速将结果交付给患者并且经济地提供这些结果以及分析的目标。自动化实验室工作流程和决策制定可以改善可达到这些目标的速度和成本。

尽管对于检测微生物生长的迹象的成像技术已经取得了显著的进步，但仍然在寻求扩展这种成像技术来支持自动化的工作流程。用于检查培养板来指示微生物生长的仪器和方法难以自动化，这部分地由于板检查的高度的视觉本质。在这方面，期望开发如此技术，其可自动地解读培养板图像，并在自动解读的基础上决定待执行的随后步骤(例如，菌落的鉴定、敏感性测试等)。

鉴定和区分培养板上的菌落可能是困难的，尤其是当菌落具有不同的尺寸和形状并且彼此接触时。彼此“生长到一起”的菌落使得挑取感兴趣菌落变得更加困难，因为从相邻菌落中挑取微生物存在风险，其中相邻菌落是不同的微生物。挑取用于下游处理的菌落样品需要足够数量的菌落和目标菌落的纯度，以避免挑取多种微生物，这会污染下游测试结果。当在板的一些区域生长已经达到汇合时，这些问题更加严重。由于这些原因，如果可能的话，优选在过程的早期鉴定菌落并且确定生长。然而，仍然需要用于孵育的时间，以允许至少菌落的一些生长。因此，一方面，允许菌落生长的越长，其开始与其背景以及互相之间形成的对比越强，并变得越容易鉴定它们。然而，在另一方面，如果允许菌落生长的太久，并且其开始填充板和/或彼此接触，则挑取纯菌落变得更加困难。如果能够在菌落还足够小以彼此分离——尽管对比度相对较差——但仍大到足以提供足够数量的用于测试的样品的孵育时间检测菌落，则该问题可以被最小化或者甚至得以解决。

发明内容

本文描述了用于评估铺板培养基上微生物生长的自动化方法。根据该方法，所提供的培养基用置于基本上光学透明的容器中的生物样品进行接种。接种的培养基在培育箱中孵育。将接种的培养基放置在数字成像设备中的携带接种的培养基的光学透明的容器中。自动化方法还包括在第一时间(t

附图说明

图1是根据本公开的一个方面的用于成像分析和测试培养物的示意图。

图2是图解根据本公开的一个方面的用于成像分析和测试培养物的自动化实验室工作流程程序的流程图。

图3A、3B和3C是根据本公开的一个方面的通过可视化表示菌落形态来示出菌落形态随时间变化的时间对比度的图像。

图3D和3E是示出了在不同的照明条件下的空间对比度的图像。

图4是根据本公开的一个方面的用于获得和分析图像信息的实例程序的流程图。

图5是根据本公开的一个方面的用于获得空间对比度的实例程序的流程图。

图6是根据本公开的一个方面的用于获得时间对比度的实例程序的流程图。

图7是根据本公开的一个方面的用于从图像中滤除伪像的实例程序的流程图。

图8是根据本公开的一个方面的用于标记图像的像素的实例程序的流程图。

图9是根据本公开的一个方面的用于拆分菌落为单独的目标的实例程序的流程图。

图10是根据本公开的一个方面的实例目标分割程序的流程图。

图11是示出了测量汇合的菌落的示意图，其作为图10中分割程序的一部分。

图12是根据本公开的一个方面的

图13A、13B和13C是图解根据本公开的一个方面的隔离因子测量的图。

图14是图解根据本公开的一个方面的

图15A、15B和15C是图解根据本公开的一个方面的菌落生长的表征的图像。

图16A和16B示出了成像平板的一部分，具有图像中样品菌落的放大和重定向的图像。

图16C示出了图16B中的各自图像的矢量图。

图17描绘了根据本公开的一个方面的样本的SHQI、空间对比度和时间对比度图像。

图18是比较图2中的程序的时间线与可比较的手动进行的程序的时间线的流程图。

图19是生长时间线的图解，其将产生足够大小的菌落候选的鉴定，以支持挑取菌落。

具体实施方式

本公开提供了用于至少部分地基于铺板培养基的一个或者多个数字图像中检测的对比度来鉴定和分析铺板培养基上的微生物生长的仪器、系统和方法。本文描述的多个方法可完全地或者部分地自动化，例如被集成为完全或者部分地自动化的实验室工作流程的一部分。

本文描述的系统能够在用于对微生物样品成像的光学系统中实行，用于鉴定微生物以及检测这类微生物的微生物生长。有许多这样的可商业上获得的系统，本文对此没有详细描述。一个实例是BD Kiestra

图1是具有处理模块110以及用于提供铺板培养基的高质量成像的图像获取装置120 (例如，摄像机)的系统100的示意图。处理模块和图像获取装置可进一步连接至其它系统部件，并且由此进一步与其它系统部件相互作用，所述其它系统部件例如用于孵育铺板培养基以使得接种在铺板培养基上的培养物生长的孵育模块(未示出)。这样的连接可以采用轨道系统完全地或者部分地自动化，所述轨道系统接收用于孵育的样本，并且将其输送至培育箱，以及随后在培育箱和图像获取装置之间输送。

处理模块110可根据多种类型信息的处理，来指示系统100的其它部件执行任务。处理器110可以是执行一个或者多个操作的硬件。处理器110可以是任何标准的处理器，例如中央处理单元(CPU)，或者可以是专门的处理器，例如专用集成电路(ASIC)或者现场可编程门阵列(FPGA)。尽管示出了一个处理器块，但系统100也可以包括多个处理器——其可以或者不可以并行操作，或者其它的专用逻辑和存储器，用于储存和追踪与培育箱和/ 或图像获取装置120中的样品容器相关的信息。在这点上，处理单元可追踪和/或储存与系统100中的样本相关的数个类型的信息，包括但是不限于样本在系统中的位置(培育箱或者图像获取装置，在其中的位置和/或朝向，等等)、孵育时间、捕获的图像的像素信息、样品的类型、培养基的种类、预防性处理信息(例如，有害的样本)等等。在这点上，处理器可以能够将本文描述的多种程序全部或者部分自动化。在一个实施方式中，用于实施本文描述的程序的指令可储存在非临时计算机可读介质(例如，软件程序)上。

图2是一个流程图，其示出了用于成像、分析以及任选地测试培养物的实例自动化实验室程序200。程序200可通过自动化微生物实验室系统实行，例如BD Kiestra

在202，提供培养基并且用生物样品接种。培养基可以是光学透明的容器，从而在生物样品被从不同的角度照明时，可以在容器内被观察。接种可遵循预定的模式。用于将样品划线在平板上的划线模式以及自动化方法是本领域技术人员所熟知的，在此不再详细讨论。一种自动化的方法采用磁控珠将样品划线在平板上。在204，培养基被孵育，以允许生物样品生长。

在206，捕获培养基和生物样品的一个或者多个数字图像。如下文中将要更详细描述的，在孵育过程期间，培养基的数字成像可被实施多次(例如，在孵育开始时、在孵育中间的时间、在孵育结束时)，从而可观察并且分析培养基的变化。培养基的成像可包括从培育箱中移出培养基。培养基的多个图像在不同时间被拍摄时，在成像工作段(session)之间，培养基可被送回培育箱中用于进一步孵育。

在208，基于来自捕获的数字图像的信息，对生物样品进行分析。数字图像的分析可包括图像中包含的像素信息的分析。在一些示例中，像素信息可以在逐像素基础上进行分析。在其它示例中，像素信息可在逐块基础(block by block basis)上进行分析。在进一步的示例中，像素可基于像素的整个区域进行分析，由此通过结合单独像素的信息、选择样品像素或者通过使用其它的统计方法例如下文中将要更详细描述的统计直方图操作，区域中单独像素的像素信息可被得出。在本公开中，被描述为应用于“像素”的操作同样地可用于块或者其它像素分组，并且术语“像素”因而旨在包括这样的应用。

分析可包括确定是否检测到在培养基中生长。从图像分析的角度，可以通过鉴定成像的目标(基于目标和其相邻的环境之间的差异)并且随后鉴定该目标随着时间的变化，从而在图像中检测生长。如本文中更详细描述的，这些差异和变化是两种形式的“对比度”。除了检测生长之外，在208处的图像分析可进一步包括定量检测的生长量、鉴定独特的菌落、鉴定姐妹菌落等。

在210，确定生物样品(特别是，鉴定的姐妹菌落)是否呈现数量上地显著生长。如果发现没有生长或者发现微不足道数量的生长，则程序200可进行至220，在这里输出最终报告。在从210进行至220的情况中，最终报告将可能指示缺乏显著的生长，或者报告正常菌群的生长。

如果确定该生物样品展现出数量上地显著增长，则在212，基于现有的分析，可以从图像中挑取一个或者多个菌落。挑取菌落可以是完全自动化的过程，其中每个挑取的菌落都被采样和测试。可选地，挑取菌落可以是部分自动化的过程，其中多个候选菌落被自动鉴定并且在数字图像上视觉地呈现给操作者，从而操作者可以输入对一个或者多个候选的选择，用于采样以及进一步测试。选择的或挑取的菌落的采样本身可以由系统自动进行。

在214，准备采样菌落用于进一步测试，例如通过将样品铺板在生物体悬液中。在216，使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)成像测试样品，以鉴定从初始培养基中采样的样本的类型。在218，样品还要，或者可选地，进行抗生素敏感性测试(AST)，以鉴定对所鉴定样本的可能处理。

在220，测试结果在最终报告中输出。报告可包括MALDI以及AST结果。如上文所述，报告还可指示样本生长的量化。因此，自动化系统能够从接种的培养基开始，并且生成关于在培养物中发现的样本的最终报告，而很少或者没有额外的输入。

在程序如图2的实例程序中，检测的以及鉴定的菌落通常被称为菌落形成单位(CFU)。 CFU是作为一种或者几种细菌开始的微观目标。随着时间的推移，细菌生长形成菌落。从当细菌被放置在平板上时，时间越早，检测到的细菌越少，因此菌落越小并且与背景的对比度越低。换言之，较小的菌落尺寸产生较小的信号，并且在恒定背景上较小的信号导致较小的对比度。这由下面的等式反映：

(1)

对比度在鉴定图像中的目标例如CFU或者其它伪像中发挥重要的作用。如果目标在亮度、颜色和/或纹理(texture)上与其周围具有显著的差异，则目标可被检测到。一旦目标被检测到，分析还可包括鉴定检测到的目标的类型。这样的鉴定也可以依靠对比度测量，例如鉴定的目标的边缘的平滑性，或者目标的颜色和/或亮度的均匀性(或者缺少均匀性)。为了被图像传感器检测到，该对比度必须足够大以克服图像噪声(背景信号)。

人类对对比度的感知(由韦伯定律决定)是有限的。在最佳条件下，人的眼睛可检测 1％的光水平差异。图像测量的质量和置信度(例如，亮度、颜色、对比度)可由测量的信噪比(SNR)来表征，其中独立于像素强度，100的SNR值(或者使用20log

在本公开中，可以以至少两种方式收集对比度：空间上的和时间上的。空间对比度或者局部对比度量化单个图像中给定区域(例如，像素、相邻像素的组)与其周围之间在颜色或者亮度上的差异。时间上的对比度或者时间对比度，量化一个图像中给定区域与在不同时间拍摄的另外一张图像中相同区域之间在颜色或者亮度上的差异。控制时间对比度的等式与用于空间对比度的等式相似：

(2)

其中t

图3A、3B和3C提供了时间对比度对于成像样品可具有的影响的视觉演示。图3A中示出的图像是在不同的时间点(从左到右，从顶排至底排)捕获的，示出了样品中的总生长。虽然图3A中的生长是显著的，但是从图3B的相应对比度时间图像中，生长甚至更显著，并且甚至可在顺序中更早地被注意到。为清楚起见，图3C示出了图3B中放大的部分。从图3C中可以看到，菌落的部分被成像的时间越长，在对比度图像中使得光斑就越亮。以这种方式，每一个菌落的质心可由菌落的明亮中心或者峰来指示。因此，随着时间推移获得的图像数据可以揭示关于菌落形态变化的重要信息。

为了最大化目标相对于其背景的空间或时间对比度，系统可在不同的背景上使用不同的入射光来捕获图像。例如，任意的顶部光照、底部光照或者侧面光照可用在黑色或者白色背景之上。

图3D和3E提供了光照条件对于成像样本可具有的影响的视觉演示。图3D中的图像是使用顶部光照捕获的，而图3E中的图像是在几乎相同的时间(例如，时间足够接近，没有可注意到的或者显著的生长发生)使用底部光照捕获的。如可以看到的，图3D和3E中的样品的图像中的每一个包含数个菌落，但是可见的关于菌落的另外信息(在这种情况下，溶血)需要图3D中的图像的背面光照或者底部光照，而在图3E的图像中，相同的信息很难被掌握。

在给定的时间点，可在多个照明条件下捕获多个图像。可使用不同的光源捕获图像，由于照明光的水平、照明角度和/或在目标和传感器之间部署的滤光器(例如，红色、绿色和蓝色滤光器)，不同的光源是光谱上不同的。以这种方式，图像获取条件在光源位置(例如，顶部、侧面、底部)、背景(例如，黑色、白色、任何颜色、任何强度)以及光谱(例如，红色通道、绿色通道、蓝色通道)方面是可变的。例如，第一图像可使用顶部照明以及黑色背景捕获，第二图像可使用侧面照明以及黑色背景捕获，并且第三图像可使用底部照明以及没有背景(即白色背景)捕获。而且，为了最大化空间对比度，可以使用特定的算法来产生一组不同的图像获取条件。通过根据给定的顺序和/或在一段时间跨度内改变图像获取条件，这些或者其它算法对最大化时间对比度也是有用的。一些这样的算法在PCT 公开号WO2015/114121中描述。

图4是一个流程图，其示出了至少部分地基于对比度来分析成像平板的实例程序。图4 的程序可被看做是图2的程序200的实例子程序，从而图2的206和208至少部分地使用图4的程序来进行。

在402，在时间t

在404，为第一数字图像中的一个或者多个像素分配坐标。在一些情况下，坐标可以是极坐标，其具有从成像平板的中心点延伸的径坐标以及围绕中心点的角坐标。坐标在后面的步骤中可被用来帮助将第一数字图像与在不同的角度和/或在不同的时间拍摄的平板的其它数字图像对齐。在一些情况下，成像平板可以具有特定的地标(landmark)或基准标记。有利的是这样的基准标记可由传感器检测(即，光学可检测的)。使用基准标记在坐标空间中定向目标是本领域技术人员或普通技术人员众所周知的。合适的光学可检测基准标记的实例包括偏心标记，例如光学透明培养皿底部上的点或线。这种标记可以通过“瞄准”培养皿底部的传感器检测到。如果培养皿的支持物是光学透明的，则传感器可以位于培养皿下方并检测基准标记。如果设置在培养皿中的培养基是光学透明的，则如果安装在培养皿上方，则传感器可以检测到这样的基准标记。为了避免从平板的顶部或底部检测培养板底部的基准标记的困难；基准标记可以是贴在培养皿侧面的标签，例如条形码标签。条形码标签可由传感器检测。在这些实例中，条形码标签的侧面或中心可以为基准标记。可以关于基准标记分配像素坐标。这样，平板在成像设备的坐标空间中的朝向方式可以在成像事件之间复制。可以将覆盖第一图像中地标的像素(一个或多个)的坐标分配给覆盖其他图像中的相同地标的像素(一个或多个)。因此，可以将较早图像中的像素与较晚图像中的同一像素进行比较，因为它们共享相同的坐标。以这种方式，可以很容易地观察到图像之间像素的任何变化。

在406，在时间t

在408，基于之前分配的坐标，将第二数字图像与第一数字图像对齐。对齐图像可进一步包括图像的归一化和标准化，例如，使用PCT公开号WO2015/114121中描述的方法和系统。

在410，确定第二数字图像的对比度信息。对比度信息可在逐像素基础上进行收集。例如，第二数字图像的像素可与第一数字图像的对应像素(处于相同的坐标)比较，以确定时间对比度的存在。另外，第二数字图像的相邻像素可互相比较，或者与已知为背景像素的其它像素比较，来确定空间对比度的存在。像素颜色和/或亮度的变化指示对比度，并且从一个图像至下一个图像或者从一个像素(或者像素的区域)至下一个像素(或者像素的区域)的这种变化的大小可被测量、计算、估计或者以其它方式确定。在给定图像的时间对比度和空间对比度二者都被确定的情况下，基于给定像素的空间和时间对比度的结合(例如，平均、加权平均)，可确定图像的给定像素的总对比度。

在412，基于在410计算的对比度信息，鉴定第二数字图像中的目标。具有相似对比度信息的第二数字图像的相邻像素可被认为属于同一目标。例如，如果相邻像素与其背景之间或者像素之间亮度的差异，和它们在第一数字图像中的亮度是基本上相同的(例如，在预定的阈值量内)，则像素可被认为是属于同一目标。作为一个实例，系统可分配“1”至具有显著对比度(例如，超过阈值量)的任意像素，然后鉴定所有分配“1”的相邻像素的组为目标。该目标可被给予特定的标记或者掩模，从而具有相同标记的像素共享某些特性。该标记可在子程序400的随后过程期间帮助将目标与其它目标和/或背景区分开。鉴定数字图像中的目标可包括分割或者划分数字图像为多个区域(例如，前景和背景)。分割的目的是将图像改变为多个组成部分的表示，以便更容易地分析组成部分。图像分割用于定位图像中感兴趣的目标。

在414，给定目标的特征(在412鉴定)可以被表征。目标特征的表征可包括导出目标的描述性统计(例如，面积、反射比、大小、光密度、颜色、平板位置等)。描述性统计可最终定量地描述收集的关于目标的信息集合的某些特征(例如，从SHQI图像、从对比度图像)。这样的信息可作为种类、浓度、混合物、时间和培养基的函数进行评估。然而，至少在一些情况下，表征目标可从与目标特征相关的定性信息的集合开始，由此，这些定性信息随后被定量地表示。下面的表1提供了可定性地评估并且随后转化为定量表示的实例特征的列表：

表1：目标的定性属性和定量地转化该属性的标准

目标的一些特征，例如形状或者直到它被可视观察的时间，可将目标作为一个整体单次测量。其它的特征可以被多次测量(例如，对于每个像素、对于具有共同的Y坐标的每一行像素、对于具有共同的X坐标的每一列像素、对于具有共同的角坐标的每一射线(ray)像素、对于具有共同的径坐标的一圈(circle)的像素)并且随后例如采用直方图结合为单一测量。例如，可对于每个像素测量颜色，对于每一行、每一列、每一射线或者每一圈的像素测量生长速率或者大小，等等。

在416，基于表征的特征确定目标是否为菌落候选。菌落候选确定可包括输入定量的特征(例如上文中表1中示出的分数)或者其子集至分类器。分类器可包括用于实施监督机器学习算法的混淆矩阵(confusion matrix)，或者用于实施非监督机器学习算法的匹配矩阵，以评估该目标。监督学习在这样的情况下可以是优选的：其中将目标与有限集(例如，两个或者三个)的可能的生物体区分(在这种情况下可在相对有限集的训练数据上训练算法)。相反，非监督学习在这样的情况下可以是优选的：其中将目标与可能的生物体的整个数据库区分，在这种情况下提供全面的——或者甚至是充分的——训练数据是困难的。在混淆或者匹配矩阵的情况下，可在一定范围内数值上测量差异。例如，对于给定的一对目标，“0”可能意味着两个目标应当相互区分，而“1”可能意味着目标难以互相区分。

菌落候选可被储存在自动化系统的存储器中用于进一步的应用(例如，测试、下文中描述的分割程序等)。

多种培养基的应用

在上文的实例中，培养物的评价是针对单一培养基描述的。然而，实例同样适用于其中在多种培养基中评价培养物的示例。

由于细菌的特性(例如，颜色、生长速率等)可能依赖于使用的培养物培养基(“培养基”)的类型而变化，所以在分类(例如，子程序400的416)期间，可将不同的混淆矩阵用于每种培养基。因此，对于两个目标，对一种培养基，分类器输出“0”，而对于相同的两个目标，对不同的培养基，分类器输出“1”，这是完全合理的。分类器的集合结果可以随后一起评估(手动或者基于进一步机器驱动的关系)，从而达到目标的总的或最终的区分或者分类。

多种培养基的评估可使用单个容器来实行。该单个容器可配置为保存多种培养基(例如，双板、三板、四板等)从而多种培养基可同时一起成像。可选地，可通过将培养样品划线在数个容器中，来评估多种培养基，每个容器保存一种或者多种培养基。多个容器中的每一个可然后进行上述的成像程序。从每种培养基获得的信息(例如，表征的特征)可随后被集合地输入分类器，以便对不同培养基内发现的(spotted)生长给出更加知晓的(informed)鉴定。

对比度信息

图5是流程图，其示出了作为图4中410的一部分的用于获得空间对比度的实例子程序500。子程序500接收下列作为输入：一组的一个或者多个背景以及光照条件551以及滤光器554。在502，在来自输入组551的指定的光照和背景条件下获得数字图像。在504，然后，图像被复制(clone)。在506，使用滤光器554对复制的图像之一滤光。在图5的实例中，低通内核被用作滤光器，但是技术人员知道可使用的其它滤光器。在508，计算未滤光的图像减去滤光的图像与滤光的图像加未滤光的图像的比率。在510，基于508计算的比率获得空间对比度图像。该程序500可针对每个背景和光照条件551重复。程序500的每次重复产生另一个空间对比度图像，其可在510用于迭代地更新之前储存的空间对比度图像。因此，全面的对比度图像(包括来自每个照明条件的对比度)可以迭代地建立。在一个实施方式中，在每次迭代中，清楚的对比度图像——其中对比度设置仍然设定为0(与迭代建立的对比度图像相比)——可被提供作为每个照明设置的输入。如果在512确定最后的图像已被处理，则程序500结束。

图6是流程图，其示出了同样作为图4中410的一部分的用于获得时间对比度的实例子程序600。子程序600接收下列作为输入：一组的一个或者多个背景以及光照条件651；以及滤光器655。在602，获得在指定的光照和背景条件下拍摄的第一和第二数字图像的每一个。在604，t

为了进行关于对比度的全面的或者总体的确定，空间和时间对比度结果可进一步结合。空间和时间对比度的结合在本文被称作“混合对比度”(MC)。在一个实施方式中，可从时间t

(3)

滤光

为了增强图像分析，在图4的子程序400中可包括另外的过程。例如，可分析第一数字图像寻找在时间t

可对捕获的图像使用一个滤光过程，以减去附着在成像平板或者镜头上的灰尘和其它伪像。当考虑透明培养基(例如，麦康凯琼脂、CLED琼脂、显色琼脂(CHROMagar)等) 时，可预期一些水平的灰尘会存在于捕获的图像上。灰尘对给定图像的影响可至少部分地由拍摄图像的具体光照和背景条件决定。例如，当使用白色培养基时，在下面采用黑色背景从上面照明培养基时，反射伪像和灰尘会最容易被观察到。作为另一个进一步的实例，当使用有色或者黑色培养基时，在下面采用白色背景从上面照明培养基时，伪像和灰尘将会最容易被观察到。作为进一步的实例，在大多数的任意培养基中，不考虑背景，当从下面照射培养基时，吸收光的伪像和灰尘将被观察到。在任何情况下，灰尘和伪像的管理是复杂的图像处理挑战，其可以显著地影响微生物生长的检测。

灰尘和伪像可被分为两种类型：(A)能够改变位置的那些；和(B)不能改变位置的那些。灰尘和伪像可随着时间积累，这意味着类型A和B二者的数量都可随着时间变化。尽管如此，观察显示在数量上类型A比类型B更容易随时间变化。当然，类型A也更容易变化，例如由于平板被移入或者移出成像室。

通常地，类型B是由与平板本身关联的伪像例如墨点(在平板下方印刷的品牌、批号和信息)、与塑料模具注入点关联的瑕疵或者磨砂区域(frosted region)引起的。类型B也可以是由粘在培养基的顶部的、陷在培养基内的或者静电粘在平板下侧的灰尘或者气泡引起的。

从观察的成像点看，甚至类型A的灰尘和伪像本身几乎不会位置改变。然而，由于平板的塑料和培养基充当滤光器和镜头的原因，观察到的类型A的伪像的特性和位置可能轻微变化，这取决于培养基颜色、培养基水平以及塑料。类型B的灰尘和伪像也不会改变位置。但是，就类型B的灰尘和伪像连接到培养基并且培养基随着时间遭受轻微运动和漂移(主要是因为在培育箱中随着时间轻微干燥的原因)而言，类型B的灰尘和伪像可随着培养基移动。因此，类型B的灰尘和伪像的位置也至少在一定程度上容易细微地变化。

在对比度方面，类型A的灰尘的颗粒(speck)可以说是在t

如上所解释的，为了得到混合对比度结果，可以把空间和时间对比度图像结合。类型A 和B二者的灰尘和伪像的影响可进一步从混合对比度结果中消除。在一个实施方式中，如果目标(例如，CFU候选)在混合对比度结果中被鉴定，则可将其与在时间t

另一种滤光过程可用于减去在平板上形成的凝结(例如，在孵育工作段开始时从冰箱转移到培育箱期间)。在一个实例凝结滤光器中，平板使用底部光照来照明，从而与没有凝结的位置相比，更少的光透过凝结的位置。可随后评估图像的光密度，低光密度的区域可从图像中减去。

另外地或者可选地，图像掩模可被构造以从t

上述的滤光过程通过避免偶然包括灰尘、凝结或者其它伪像作为目标并且在414加快性质表征——因为这样的表征将只对于有效像素实施——可以改进子程序400。

限定目标和标记

可加入图4的子程序400的另一过程是分配标记至在412鉴定的目标。目标可被给予特定的标记，使得具有相同标记的像素共享某些特性。标记可在子程序400的随后过程期间帮助将目标与其它目标和/或背景区分。图8是流程图，其示出了用于标记在时间t

一旦对t

分割(segmentation)

可以被包括作为子程序400的一部分的另一过程是分割过程，其用于将在时间t

在一些情况下，在两个接壤的菌落具有不同的特征(例如，不同的颜色，不同的纹理) 时，分割可简单地包括对汇合区域的特征分析。然而，空间和时间对比度不总是足以单独地鉴定菌落之间的边界。图9是流程图，其示出了用于将这样的菌落分开为单独的目标(例如，采用单独的标记)，或者换句话说，分割菌落的实例程序900。图9的实例程序900使用在时间t

可运用多种因子，例如包含因子(inclusion factor)，以确定给定标记的局部最大值属于一个菌落还是不同的菌落。包含因子是指示相邻像素是否与相邻目标相关联的因子。这样的因子可在分割策略中使用来确定是将在给定标记中的两个局部最大值分裂为两个单独的目标还是将它们合并为单一目标。

图10是示出了这样的实例分割策略的流程图。程序1000可用作图9中步骤910的子程序。如图10中所示的，鉴定两个局部最大值1051和1052。在1002，对于每个最大值，鉴定周围区域。在图10的实例中，区域“A”围绕最大值1051，并且区域“B”围绕最大值1052。出于下文的实例等式的目的，假定区域A的大小为大于或者等于区域B。在一些情况中，每个区域可给定为椭圆形状，其具有沿着区域的水平轴的水平距离(xA，xB)以及沿着区域的垂直轴的垂直距离(yA，yB)。为了阐明图10的程序，图11提供了区域A 和B以及它们各自最大值的实例图解。

在1004，对于每个局部最大值1051和1052，确定从最大值至目标边缘的距离。在一些情况下，所确定的距离为在1002分配的区域的平均或者中值距离，下文称为距离图。区域A的距离图下文中称为rA，区域B的距离图称为rB。

在1006，基于两个局部最大值之间的距离“d”以及在1004确定的距离，计算包含因子。在一个实施方式中，包含因子利用下面的等式计算：

(4)

在1008，确定包含因子是小于预定范围、大于预定范围还是在预定范围内(例如，在 0.5和1之间)。如果包含因子小于预定范围，则确定最大值与同一目标相关联。如果其大于预定范围，则确定最大值与不同的目标相关联。

对于落入范围内的包含因子，不能立即清楚最大值属于相同的目标还是不同的目标，并且需要更多的处理。程序1000然后在1010继续，其中使用在两个最大值之间的位置处的第三区域“C”的坐标来计算两个最大值的各自周围区域的凸性。在一些情况下，该区域可以是两个区域的加权中心，使得区域C的中心点更接近较小的区域B而不是较大的区域 A。对于区域C，也可以计算水平和垂直距离xC、yC，以及距离图H。例如，可使用上述的值以及区域C的中心点和最大值A之间的距离d(A，C)，根据如下等式计算凸性：

(5)

(6)

(7)

(8)ΔH＝H-(0.9R)

在1012，确定凸性值是否大于(更加凸起)给定的阈值。例如，可将ΔH与0的阈值比较。如果凸性值大于阈值，则该最大值被确定为与不同的目标相关联。否则，在1014，区域C的一个或者多个参数被更新，从而区域C的大小增加。例如，基于ΔH更新偏移距离(distOffset)，例如，ΔH的值被限定在0和1之间(如果ΔH大于1，其被四舍五入至1) 并且然后被加至偏移距离。

在1016，确定区域C的大小是否满足或者超过阈值。如果该阈值被满足或者超过，则该最大值被确定为与同一目标相关联。换句话说，如果区域A和B之间的差异是如此不确定的，使得区域C增加，直到其开始遮盖区域A和B，这是最大值1051和1052应当属于同一目标的良好指示。在上述的实例中，这可通过偏移距离满足或者超过最大值之间的距离d来指示。否则，操作返回至1010，并且基于区域C的更新的参数(一个或多个)重新计算区域A和B的凸性。

一旦每个最大值的关联性被确定，则确定的关联性可被储存在例如矩阵(也被称作关联矩阵)中。储存的信息可用于将最大值的全部列表减少为候选目标的最终列表。例如，在关联矩阵的情况下，可从最大值的完全列表产生主列表(master list)，并且然后可迭代地检查每个最大值，并且如果关联的最大值仍然在列表上，则从主列表中移除。

在图9和10的实例中，第二图像拍摄的时间t

利用时间t

虽然上述过程和程序仅需要在时间t

例如，如果t

在前述概念的一个应用中，在时间t

使用在t

除了追踪生长速率和分割以外，菌落的其它方面可在t

在其他情况下，可知菌落会随着时间变化颜色。因此，在t

目标特征

如上结合图4所讨论的，在成像平板上的目标的特征可作为在成像平板上实施的图像分析的一部分进行表征。该表征的特征可包括静态特征(与单一图像有关)和动态图像(与多个图像有关)二者。

静态特征目的在于反映在给定时间的目标属性和/或周围背景。静态特征包括如下内容：

(i)重心：这是提供成像的目标在坐标空间(例如，x-y、极性)中的重心的静态特征。目标的重心，如目标的极坐标，提供在给定的光照和背景条件下特征组的不变性。重心可通过首先为图像中所有的菌落确定加权的质心来获得(M是所有检测的菌落的二元掩模)。加权的质心可基于图像的每个像素具有相等值的假定确定。给定菌落的重心然后可在x-y 坐标系中通过如下的等式描述(其中E＝{p∣p∈M}(E是当前菌落的二元掩模)，x坐标的范围为[0，图像宽度]，y坐标的范围为[0，图像高度]，并且每个像素是一个单位)：

(9)

(ii)极坐标：这也是静态特征，并且可用于进一步表征在成像平板上的位置，如重心。通常来说，极坐标沿着径向轴(d)和角轴(θ)来测量，其中平板中心的坐标为[0,0]。Igv

(10)d＝k×距离(igv

(11)θ＝角度(条形码,O

(iii)图像矢量：二维极坐标可又变换为一维的图像矢量。该图像矢量可表征图像的像素的强度作为径向轴(通常，菌落的中心具有最高的强度)的函数和/或角轴的函数。在许多情况下，图像矢量在成像目标中分类相似性/区别方面可更加精确。

(iv)形态特征：其描述给定目标的形状和大小。

(a)面积：这是一个形态特征，并且可基于成像目标中的像素的数量来确定(也被称作“点(blob)”)，不计算目标中的孔。当像素密度可用时，可以以物理尺寸测量面积(例如，mm

(12)A＝k

(b)周长：目标的周长也是形态特征，并且可通过测量目标的边缘并且把边缘的总长度加和在一起来确定(例如，具有1平方单位面积的单个像素具有4单位的周长)。与面积一样，长度可用像素单位(例如当k不可用时)或者物理长度(例如，当k可用时)来测量。在一些情况下，周长还可包括目标中任何孔的周长。另外地，阶梯效应(当对角线的边缘被数字化为阶梯状的箱(box)时所导致)可通过计数内角为

(13)P＝k×∑

(14)

(15)如果：

{∑(t∈M,l∈M,r∈M,b∈M)＝2,(l∈M≠r∈M),(t∈M≠b∈M)}

(p是内部并且p是角)

那么：q(n

否则：q(n

(c)圆度：目标的圆度也是形态特征，并且可根据面积和周长的结合来确定。在一个实施方式中，使用下列等式计算圆度：

(16)

(d)半径变异系数(RCV)：这也是形态特征，并且用于通过取得目标在自重心延伸的所有N个方向或者角度θ中的平均半径

(17)

(18)

(19)

(v)处境特征(contextual feature)，其描述在对其它检测的目标和板壁边缘的监视下，目标的邻域地形关系。例如，在成像的菌落的情况下，菌落的一个处境特征可以是，菌落是是自由的、具有有限的自由空间、还是与其它周围的菌落竞争使用(access to)资源。这样的特征趋向于帮助分类在相同的感知环境中生长的菌落，并且/或者区分在不同环境中生长的菌落。

(a)影响区域：这是考虑目标与其周围目标之间的空间并且预测分析的目标可扩展占据的区域(没有其它的、不同的目标首先扩展占据该相同区域)的处境特征。影响区域可以以

(20)

(b)至板壁的距离：这是计算目标的边缘距最近的板壁的距离(D

在一个实施方式中，该距离可使用下列等式表征：

(21)

(c)隔离因子：这是基于目标的大小和距最近边缘(例如，另一个目标、板壁的最近边缘)的距离来表征给定目标的相对隔离的处境特征。图13A-C图解了隔离因子的方面。图13A图解了其中最近边缘是从菌落到板壁的距离d的示例。图13B和13C图解了其中最近边缘属于另一菌落的示例。在这样的情况下，绘制以分析的菌落为中心围绕其的圆，然后扩张(首先小的，如图13B，然后更大的，如图13C)直到圆接触相邻菌落。在图13A-C 的实施方式中，隔离因子(IF)可使用下列等式表征：

(22)

(d)周边占据比率：这是表征对于给定目标在给定的距离d内，平板的边界

(23)

(e)相对周边占据比率：在一些示例中，可使用目标的平均半径乘以预定因子

(24)RNOR(x)＝NOR(d)

(vi)光谱特征，其描述给定目标的光性质。颜色(红色、绿色和蓝色通道；色调、照度和色度，或者任何其它颜色空间变换)、纹理和对比度(随着时间和/或跨越空间)是这样特征的实例。光谱特征可在使用菌落掩模的孵育过程期间从在不同的时间点和/或在不同的照明条件下捕获的图像导出，并且可进一步与给定菌落的

(a)通道图像：这是光谱特征，其中特定的颜色通道(例如，红色(R)、绿色(G) 和蓝色(B))用于光谱分辨图像。

(b)亮度：这也是光谱特征，其用于使用RGB通道作为输入来表征图像的亮度。

(c)色调：这是光谱特征，其中图像的面积被表征为表现与被感知的颜色(例如，红色、黄色、绿色、蓝色)或者其结合类似。色调(H2)通常使用下列等式表征：

(25)H

(26)

(27)

(d)色度：这是用于表征图像区域相对于其亮度的视彩度(colorfulness)的光谱特征——如果该区域被类似地照明为白色。色度(C

(28)

(e)径向分散：分析色调和色度对比度的径向分散能够实现α、β和γ溶血的区分。

(f)最大对比度：该特征通过计算距图像的中心点(例如，成像的菌落的中心)给定半径r处像素的测量平均对比度的最大值，来表征图像的分辨率。该特征可用于基于由分析目标诱导的生长描述在时间t

(29)最大对比度

(vii)背景特征，其描述分析目标的邻域中的培养基的改变。例如，在成像菌落的情况下，该变化可以由菌落周围微生物的生长引起(例如，溶血迹象、PH的改变或者特定的酶促反应)。

动态特征目的在于反映目标属性和/或周围环境随着时间的变化。时间序列处理允许静态特征随时间相关。这些特征的离散的一阶和二阶导数提供这些待表征特征随时间变化的瞬时“速度”和“加速度”(或者稳定水平或减速度)。动态特征的实例包括如下内容：

(i)用于追踪上述静态特征随着时间变化的时间序列处理。在给定孵育时间测量的每个特征可根据其相对孵育时间被参考，以允许这些特征与在随后孵育时间测量的特征相关联。图像的时间序列可用于检测目标例如CFU随着时间出现和生长，如上文所述。基于对之前捕获的目标图像的正在进行的分析，可通过自动的过程对成像的时间点进行预设或者限定。在每个时间点，图像可以是给定获取配置，无论是整个系列的单个获取配置，或者作为从多个获取配置捕获的整个系列的图像。

(ii)用于提供这些特征随着时间变化的瞬时速度和加速度(或者稳定水平或减速度)的上述特征的离散的一阶和二阶导数(例如，追踪生长速率，如上文所述)：

(a)速度：特征对时间的一阶导数。基于下列等式，特征x的速度(V)可以以(x 单位)/小时表征，Δt是以小时表示的时间跨度：

(30)

(31)

(32)

(b)加速度：特征对时间的二阶导数，也是速度的一阶导数。加速度(A)可基于下列等式表征：

(33)

上述图像特征可从目标或者目标的处境测量，并且目的在于捕获在各种培养基和孵育条件下生长的生物体的特异性。列出的特征不意味着是穷举的，并且本领域技术人员可以根据本领域已知的多种基于已知图像处理的特征来改进、扩大或者限制该特征组。

图像特征可针对图像中每个像素、像素的组、目标或者目标的组收集。为了更一般地表征图像的区域甚至整个图像，收集特征的分布可以以直方图构造。为了分析或者以其它方式处理到来的图像特征数据，直方图本身可依赖于数种统计特征。

统计直方图特征可以包括如下内容：

(i)最小值：直方图内捕获的分布的最小的数值。这可通过下面的关系表征：

(34)

(ii)最大值：直方图中捕获的分布的最大的数值。这可根据下面的关系表征：

(35)

(iii)总和：直方图内捕获的所有单个值的总和。总和可通过下面的关系限定：

(36)

(iv)平均值：算术平均，或者平均。根据下列关系，这是所有分数的总和除以分数的数量(N)：

(37)

(v)四分之一分位(Q1)：分布的25百分位的分数。25％的分数低于Q1，并且75％的分数高于Q1。这可通过下面的关系描述：

(38)

(vi)中位数(Q2)：分布的50百分位的分数。50％的分数低于中位数，并且50％的分数高于中位数。与平均值相比，中位数对极端分数较不敏感，并且这通常使其对于高度斜分布来说，是比平均值更好的量度。这可通过下面的关系描述：

(39)

(vii)四分之三分位(Q3)：分布的75百分位的分数。75％的分数低于Q3并且25％的分数高于Q3。这通过下面的关系描述：

(40)

(viii)众数(mode)：在分布中最经常出现的分数。这用作集中趋势的量度。众数作为集中趋势的量度的优点在于：它的含义是显而易见的。而且，它是可以与标称数据一起使用的集中趋势的仅有量度。众数在很大程度上受制于样品波动并且因此通常不用作集中趋势的唯一量度。同样，很多分布具有多于一个的众数。这些分布被叫做“多峰的”。众数可通过下面的关系描述：

(41)

(ix)三均值(trimean)：将第25个百分点加上两倍的第50个百分点(中位数)加上第 75个百分点，并且除以4计算的分数。三均值几乎与中位数一样抗拒极端分数，并且在斜分布中，与算术平均值相比，较少受制于采样波动。然而，对正态分布来说，其通常不如平均值有效。三均值可根据下面的关系描述：

(42)

(x)截断平均值：通过丢弃一定百分比的最低和最高分数，然后计算剩余分数的平均值，从而计算的分数。例如，截断50％的平均值是通过丢弃较低和较高的25％的分数，并且计算剩余分数的平均值，从而计算的。进一步的实例，中位数是截断100％的平均值，算术平均值是截断0％的平均值。与算术平均值相比，截断平均值通常不易受到极端分数的影响。因此对于斜分布来说，与平均值相比，其不易受到采样波动的影响。对正态分布来说，它通常效率较低。作为一个实例，截断50％的平均值由下列关系描述：

(43)

(xi)范围：最小的和最大的数值之间的差。范围可以是可用的扩展的量度。然而，由于其仅基于两个值，其对极端分数敏感。由于这种敏感性，范围通常不用作扩展的唯一量度，但是如果用作对扩展的其它量度如标准差或者半内四分距的补充，其还是有意义的。

(xii)半内四分距：计算为75百分位(Q3)和25百分位(Q1)之间的差的一半的扩展的量度。由于分布中一半的分数位于Q3和Q1之间，半内四分距是覆盖所述一半分数所需的距离的一半。在对称分布中，从低于中位数的一个半内四分距伸展至高于中位数的一个半内四分距之间的间距将包含一半的分数。然而，对斜分布来说不是这样的。与范围不同，半内四分距通常基本上不受极端分数的影响。然而，在正态分布中其比标准差更容易受到采样波动的影响，并且因此不经常用于近似正态分布的数据。半内四分距根据如下的关系来限定：

(44)

(xiii)方差：分布扩展的量度。根据如下的关系，通过从其平均值取得每个数的均方差，计算方差：

(45)

(xiv)标准差：方差的函数，其测量分布的值与平均值多宽地离散。标准差是方差的平方根。虽然与范围相比，其通常对极端分数较不敏感，但标准差通常比半内四分距更敏感。因此，当有极端分数存在的可能时，半内四分距可用于补充标准差。

(xv)偏度：围绕其平均值的分布不对称性的度量。如果分布的尾部之一比另一个更长，则分布是偏斜的。正偏度表明具有朝着更正的值(大于平均值)延伸的不对称尾部的分布。负偏度表明具有朝着更负的值(小于平均值)延伸的不对称尾部的分布。偏度可根据下列关系计算：

(46)

(xvi)峰度：与正态分布相比，分布的陡度或者平坦度的量度(或者相对峰宽)。正的峰度表示相对尖的分布。负的峰度表示相对平的分布。峰度基于分布的尾部的大小，并且可通过下列关系确定：

(47)

上述统计方法可用于分析灰度值的空间分布，这通过计算图像中每个点处的局部特征和从局部特征的分布得到一组统计结果进行。利用这些统计方法，分析区域的纹理可被描述并且被静态地限定。

纹理可使用纹理描述符来表征。纹理描述符可在图像的给定区域上计算(在下文更详细地讨论)。一种通常运用的纹理方法是共现(co-occurrence)方法，由Haralick,R.等人提出，“用于图像分类的纹理特征”，IEEE Transactions of System,Man andCybernetics,Vol.3,pp. 610-621(1973)，其通过引用并入本文。在该方法中，在θ方向上分开距离d的像素的灰度级对的相对频率被结合以形成相对位移矢量(d，θ)。相对位移矢量被计算并且储存在矩阵中，称作灰度级共现矩阵(GLCM)。该矩阵用于提取二阶统计的纹理特征。Haralick提出 14种不同的特征来描述二维概率密度函数p

纹理可使用纹理描述符来表征。纹理描述符可在图像的给定区域上计算(在下文更详细地讨论)。一种通常运用的纹理方法是共现(co-occurrence)方法，由Haralick,R.等人提出，“用于图像分类的纹理特征”，IEEE Transactions of System,Man andCybernetics,Vol.3,pp. 610-621(1973)，其通过引用并入本文。在该方法中，在θ方向上分开距离d的像素的灰度级对的相对频率被结合以形成相对位移矢量(d，θ)。相对位移矢量被计算并且储存在矩阵中，称作灰度级共现矩阵(GLCM)。该矩阵用于提取二阶统计的纹理特征。Haralick提出 14种不同的特征来描述二维概率密度函数p

(i)角二阶矩(ASM)通过下式计算：

(48)

(ii)对比度(Con)通过下式计算：

(49)

(iii)相关性(Cor)通过下式计算(其中σ

(50)

(iv)熵(Ent)通过下式计算：

(51)

这四个特征还列出在Strand,J.等，“用于纹理分类的局部频率特征”，PatternRecognition, Vol.27,No.10,pp 1397-1406(1994)[Strand94]中，其也通过引用并入本文。

对于给定的图像，上述特征被评估的图像区域可通过掩模(例如，菌落掩模)或者通过延伸超出掩模的

图14示出了几种可能的区域。区域1410是仅扩展远至菌落本身的菌落掩模。区域1420 是菌落的

如上文所述，使用沿着孵育过程中的不同时间点的菌落掩模以及它们相关的

上述特征列表中的任何一个特征或者特征的结合可用作特征组，用于在不同的孵育条件下，捕获在成像平板的各种培养基上生长的生物体的特异性。该列表并不意味着是详尽的，并且本领域任何技术人员可以根据待成像的预期目标和本领域已知的多种基于图像处理的特征来改进、扩大或者限制这些特征组。因此，上述实例特征是以例证的方式提供的，而不是限制性的。

本领域技术人员可意识到其它的测量和方法来确定目标形状和特征，并且上述的实例是以例证的方式提供的，而不是限制性的。

对比度建立

通常难以最初预测图像系列中哪一个图像将对生长检测、计数或鉴定提供价值。这部分是因为对于不同的菌落形成单位(CFU)以及在不同的培养基中，图像对比度变化。在数个菌落的给定图像中，一个菌落可能与背景具有高度希望的对比度，而另一个菌落可能与背景不具有用于生长检测的足够对比度。这也使得使用单一方法鉴定培养基中的菌落变得困难。

因此，期望从所有可用的材料，通过空间(空间差异)和时间(在相同成像条件下的时间差异)，以及通过使用不同的成像条件(例如，红色、绿色和蓝色通道，亮的和暗的背景，光谱图像或者任何其它的颜色空间变换)，建立对比度。还期望从多个可用的来源收集对比度，来提供标准化的图像作为算法的输入，用于检测菌落。

图像数据可基于任何数量的因素来限定。例如，图像数据可被限定为寻求的具体时间点和/或具体信息(例如，空间图像信息可能不需要像时间图像信息所需的那么多时间点)。也可以选择照明配置和颜色空间，以实现特定的对比度目标。为了检测具有所需尺寸(或者在目标范围内的尺寸)的目标，空间频率也可以改变。

为了检测离散的目标，对比度可被设定为[0,1]上的绝对值，或者带正负符号的[-1,1]。对比度输出的标度(scale)和偏移也可以被指定(例如，具有带正负符号的对比度的8比特的图像，偏移可以为127.5，标度可以是127.5)。在其中对比度被设定为极值的实例中，绝对偏移可设定为0，标度设定为256。

空间对比度可用于检测在均匀背景上的离散的目标。可利用等式提供图像I上距离r内的位置(x,y)处的空间对比度

(52)

(53)

时间对比度可用于检测移动的目标或者随着时间变化的目标(例如在成像平板上出现和/或扩展的CFU)。可利用公式提供在图像I上时间t

(54)

空间对比度收集可以根据预先编程的顺序以自动化的方式通过生成平板的多个SHQI 图像进行实施。可以在给定的孵育时间生成多个图像，以进一步菌落检测研究。在一个实施方式中，其中根据如下的等式，在给定的时间、在距检测的菌落的数个不同半径处(R

(55)

如果对于给定的图像I

(56)

(57)

对比度算符K进一步得益于该已知的SNR信息，并且上述等式变为：

(58)

时间对比度收集也可以根据预先编程的顺序，以自动化的方式，通过生成平板的多个 SHQI图像进行实施。多个图像可在多个孵育时间内生成，至少其中的一个是t

(59)

在上述的实例中，矢量可以是两个时间点(例如，t

与空间对比度一样，如果对于给定的图像I

(60)

(61)

对比度算符K进一步得益于该已知的SNR信息，并且上述等式变为：

(62)

在上述的实例中，最大算符可由任何其它统计算符代替，例如百分位(例如，Q1、中位数、Q3或者任何其它百分位)或者加权的总和。加权的数值可来自从训练数据库提取的前期工作，由此将监督对比度提取的领域打开至神经网络。另外地，可以使用多种算法，多种算法的结果使用另一个算符例如最大算符进一步结合。

图像对齐

当随着时间拍摄多个图像时，为了从它们获得有效的时间估计，需要非常精确地对齐图像。这样的对齐可通过机械对齐装置和/或算法(例如，图像追踪、图像匹配)的方式来实现。该领域的那些知识对实现该目标的这些方案和算法是已经认知的。

例如，在收集了平板上的目标的多个图像的情况中，可确定目标位置的坐标。基于这些坐标，在随后时间收集的目标的图像数据可然后与之前的图像数据相关联，并且随后用于确定目标随着时间的变化。

为了快速以及有价值地利用图像(例如，当用作分类器的输入时)，在空间参照系中储存图像以最大化其不变性是重要的。因为菌落的基本形状描述符是大体上圆形的，所以极坐标系可用来储存菌落图像。当菌落第一次被检测到时，菌落质心可被鉴定为菌落位置的中心。该中心点以后可作为菌落的每个后续图像的极坐标变换的初始中心。图16A示出了具有中心点“O”的成像平板的放大部分。从点“O”延伸的两条射线“A”和“B”被示出覆盖在图像上(为了清楚的目的)。每条射线与各自的菌落(被圈住的)相交。图16A的圈住的菌落在图16B的图像1611和1612中更详细地显示。在图16B中，图像1611(与射线“A”相交的菌落)被重新定向在图像1613(“A’”)内，使得图像1613的径向轴与图像1612 的径向轴对齐，从而该重新定向的图像的最左部分与图16A的点“O”最接近，并且该重新定向的图像的最右侧部分与点“O”离得最远。该极坐标的重新定向允许更容易地分析成像平板的不同取向的菌落(考虑到如照明这样的因素)。

在图16C中，对图16B的图像1611、1612和1613的每个完成极坐标变换。在极坐标变换的图像1621、1622和1623中，各自重新定向的图像1611、1612和1613的径向轴(从每个各自成像的菌落的中心延伸)在图16C的图像中从左到右绘制，并且角轴(各自菌落的)从上向下绘制。

对于每个极坐标图像，可使用例如形状特征和/或直方图特征(例如目标的颜色或者强度的平均值和/或标准差)，沿着径向轴和/或角轴，生成汇总的一维矢量组。甚至当考虑旋转时形状和直方图特征通常是不变的，也有可能在旋转时一些纹理特征显示显著的变化；因此，不能保证不变性。因此，从相同的视点或者角度照明来呈现每个菌落图像是显著有益的，这是因为目标纹理差异可随后被用于互相区分。由于照明条件通常示出与围绕平板成像中心的角度位置相关的变化，所以穿过菌落和平板中心的射线(在图16B的图像1611、 1612和1613的每个中示出为线)可作为每次图像极坐标变换的原点(θ)。

进一步的对齐挑战来自于这样的事实：平板培养基不是绝对冷冻的和刚性的，并且因此可从一次拍摄至下一次拍摄轻微移位。因此，不能绝对假定在一个时间拍摄的图像的某些坐标处的平板区域必然完美地与在稍后时间拍摄的相同坐标处的平板区域对齐。换言之，关于孵育过程期间将给定像素与在不同时间点捕获的相应像素精确匹配，培养基的轻微变形可导致小的不确定性。

为了考虑这种不确定性，时间t

本领域任何技术人员将认识到从t

如果

(63)

(64)

(65)

SNR的改善

在典型的照明条件下，光子散粒噪声(传感器上的入射光子到达速率的统计变化)限制了检测系统的SNR。现代传感器具有足够的容量，其为每个有效的(active)平方微米大约1,700 至大约1,900个电子。因此，当成像平板上的目标时，主要关心的不是用于成像目标的像素的个数，而是在传感器空间内被目标覆盖的面积。增加传感器的面积为成像目标改善SNR。

可通过利用这样的照明条件捕获图像，来改善图像质量，在所述照明条件下光子噪声控制SNR

(66)

其中I是在传感器处由电子流产生的平均电流。由于物质和光穿过电磁波谱的吸收/反射的差异，颜色被感知，对捕获的颜色的置信度将依赖于系统以高SNR记录强度的能力。图像传感器(例如，CCD传感器、CMOS传感器等)是本领域技术人员熟知的，在此不再详细描述。

为了克服经典的SNR成像限制，成像系统可在图像获取期间进行成像平板的分析，并且基于该分析实时地调节照明条件和曝光时间。该过程在PCT公开号WO2015/114121中描述——其通过引用并入，并且通常被称为监督的高质量成像(SHQI)。该系统还可以在不同的颜色通道内为平板的不同亮度区域定制成像条件。

对于图像的给定像素x，y，在当前的帧N期间获取的像素的SNR信息可与在之前或者随后获取的帧(例如，N-1、N+1)期间获取的相同像素的SNR信息结合。作为示例，结合的SNR由下式决定：

(67)

利用新的获取更新图像数据后，获取系统能够预测最佳的下一个获取时间，其将根据环境约束最大化SNR(例如，在感兴趣的区域内每个像素的最低要求的SNR)。例如，平均非饱和条件中捕获的5张图像将促进暗区的SNR(最大强度的10％)提升

图像建模

在一些情况中，当计算一个或者多个图像的像素之间的空间或者时间对比度时，给定图像的像素信息可能是不可用的，或者可能是弱化的(degraded)。例如，如果平板的图像没有在细菌生长之前的时间内被捕获(例如，平板没有在时间t

在这样的情况中，不可用的或者弱化的图像(或者图像中的某些像素)可以利用平板的模型图像替换或者增强。模型图像可提供像素信息，其反映在不可用的或者弱化的图像的特定时间预期平板看起来如何。在时间t

在弱化的图像的情况下，当像素信息不如图像中剩余部分那么锐利时(例如，由于下面的凝结阻碍了一些光穿过平板，并且因此使平板的具有凝结的部分轻微地较不透明)，可使用信号恢复来锐化图像中弱化的像素特征，来完成弱化的图像的增强。信号恢复可包括确定图像剩余部分的强度信息，鉴定强度信息的中值强度，并且随后使用图像剩余部分的中值强度替换图像的较小锐度区域的强度信息。

应用

本公开很大程度上基于在不同稀释度的盐水中实施以模拟典型的尿报告量(CFU/ml桶组(Bucket group))的测试。用于每个隔离物的悬液被调节至0.5马克法兰氏标准(McFarland Standard)，并且用于在BD真空采尿管(Vacutainer tube)(目录号364951)中的估计的1×10

使用ReadA Compact处理平板(35℃，非CO

在其它情况下，可在48小时的跨度内获得图像——对于前24小时，以2小时间隔，对于接下来的24小时，以6小时间隔。在这样的情况下，在48小时的跨度内将获得总共 17个图像，包括自时间t

利用已知的目标像素大小、归一化的照明条件和每带(band)每像素的高信噪比，纠正所有获取的图像的镜头几何相差和色差，光谱平衡所有获取的图像。用于本文描述的方法和系统中的合适摄像机对本领域技术人员来说是已知的，本文不再详细描述。作为实例，当菌落的直径在100μm的范围内并且具有足够的对比度时，使用400万像素的摄像机去捕获 90mm平板图像应当允许计数(enumeration)上至30菌落/mm

使用下列的培养基评估在其上生长的菌落的对比度：

TSAII 5％绵羊血(BAP)是广泛应用于尿培养物的非选择性培养基。

BAP基于菌落形态和溶血，用于菌落计数和推定的ID。

麦康凯II琼脂(MAC)：用于最常见的革兰氏阴性UTI病原体的选择性培养基。MAC用于产乳糖菌落的分化。MAC也抑制变形杆菌属的群集。BAP和MAC被普遍用于尿培养物。由于对一些革兰氏阴性物的部分抑制，一些培养基不被推荐用于菌落计数。

粘菌素萘啶酮酸琼脂(CNA)：用于最常见的革兰氏阳性UTI病原体的选择性培养基。 CNA不像MAC通常用于尿培养物，但是如果发生革兰氏阴性菌落的过度生长，则其可帮助鉴定菌落。

定位显色琼脂(CHROMA)：广泛用于尿培养物的非选择性培养基。CHROMA基于菌落颜色和形态，用于菌落计数和ID。大肠杆菌和肠球菌通过该培养基鉴定，并且不需要确证检验。由于成本的原因，CHROMA使用少于BAP。对于混合样品，也使用CLED培养基。

胱氨酸乳糖电解质缺乏(CLED)琼脂：基于乳糖发酵，用于菌落计数和尿病原体的推定ID。

样本处理BD Kiestra

图17图解了在检索显色琼脂(上图)和血琼脂(下图)培养基二者上的摩氏摩根菌(Morganella morganii)生长中的对比度收集算法性能的一个实例。显色琼脂和BAP都是广泛应用于微生物实验室的非选择性生长培养基。图17的中间图像的每个都呈现了由来自平板上方的光照明(顶部照明)的成像平板。左边的图像示出了中间图像的相应空间对比度。空间对比度基于1毫米中值内核(median kernel)。最后，右边的图像示出了中间图像的时间对比度。时间对比度是由在0小时(t

如图17所示，当处理半透明菌落时，特别是在边缘过渡较小时，局部对比度具有其局限性，这是因为单独使用空间对比度算法，只有最强对比度的汇合区域可从图像选取。空间对比度可能不能选取目标。还从图17中明显的是时间对比度对于隔离的菌落的有效性。

图17(特别是底部的血琼脂图像)也强调了单独使用空间对比度检测在透明培养基上生长的问题。在透明壳体(case)上打印的油墨具有非常强的边缘，并且因此具有强的空间对比度。这最终使得任何其它空间对比度非常难以被看到，这是因为菌落不具有如此强的限定的边缘。因此，本公开中，时间对比度与空间对比度结合使用具有可观的益处。

最终，上述对比度确定的结果是用于快速检测和鉴定成像的培养基中菌落的方法可被自动化。该自动化的方法提供了超过可相比的手动方法的显著优势。

图18示出了一对流程图，其比较了自动测试过程1800的时间线(例如，图2中的程序200)与可相比的手动实施的测试过程1805的时间线。每个过程都开始于实验室接收用于测试的样本1810、1815。每个过程随后进行孵育1820、1825，在此期间样本可被多次成像。在自动化的过程中，在孵育大约12小时后，进行自动化评估1830，在该时间之后，可明确地确定在样本中是否没有生长(或者正常的生长)1840。如图17的结果所示，在自动化过程中时间对比度的使用很大程度上提高了检测菌落的能力——即使在仅12小时之后。与此相反，在手动过程中，直到进入孵育过程将近24小时，才可以进行手动评估1835。只有在24小时后才能明确地确定在样本中是否没有生长(或者正常的生长)1845。

图19图解了可以确定菌落半定量的时间线。平板2005在2000处接种。新接种的平板 2005的参考图像在2010处获得。这是本文前面描述的背景图像。孵育进行预定的时间间隔，之后在2015处获得平板2005的另一张图像。将该图像与在2010处获得的图像进行比较，以获取可能指示微生物生长的目标变化或伪像的证据。如果没有微生物生长的指示，则孵育平板，并且在预定时间之后，在2020处获得另一张图像。在步骤2020处，检测目标的变化或伪像作为微生物生长的证据。从图像分析的角度来看，可以通过鉴定成像目标(基于目标与其相邻环境之间的差异)然后鉴定目标随时间推移的变化来检测图像中的生长。如上更详细所述，这些差异和变化是“对比度”的两种形式。除了检测生长之外，在2020处的图像分析可以进一步涉及确定被鉴定为菌落的目标是否具有足够的生物量以被收获进行分析。图19表明在步骤2020处未鉴定出足够的生物量，并且需要进一步孵育。在2025处，图像证明了菌落，但那些菌落目标需要进一步评估，以不仅要量化菌落，还要评估菌落的性质(即它是否是其他已鉴定菌落目标的姐妹；它是否是纯的(即单一的微生物种类)菌落还是混合(即多种微生物种类)菌落。菌落汇合以及其如何确定在描述目标分割的以上部分中进行了描述。如果没有生长，或者在预定的时间后发现微不足道数量的生长，则在2022处平板2005被发布(release)为无菌。最终报告可能会表明没有显著生长，或报告正常菌群的生长。

生物量通过将目标与生物量相关联来确定。确定目标的大小并与指示阈值生物量的预定目标大小进行比较。在步骤2025中，如果目标由纯样品形成，那么当目标覆盖的培养基面积达到或超过第一阈值时，可以挑取生物量用于下游测试。如果生物样品不是纯样品，则进一步孵育接种的样品皿。如果基于在步骤2025处获得的图像还没有全部挑取感兴趣的目标，则在步骤2030处进一步孵育接种的培养板并再次成像。将图像中与菌落相关的目标的大小与第二预定大小阈值进行比较。如果目标的大小以及因此生物量高于第二阈值，那么至少部分的生物量被挑取。第二预定阈值是以下之一：i)如果目标来自纯样品，则为生物量覆盖的阈值面积；或ii)如果目标来自不纯的样品，则为生物量的直径。第二预定阈值生物量大于第一阈值。这可以通过将图19中步骤2025处的目标大小与步骤2030处的目标大小进行比较来看出。步骤2030中的目标明显大于步骤2025中的目标，但步骤2025中鉴定的目标可以被挑取，如果有信心目标/生物量来自纯样品的话。

如果确定生物样品表现出数量上显著的生长，则在2025或2030处(取决于何时检测到具有足够生物量的目标菌落)一个或多个菌落可被鉴定为被挑取用于分析的菌落候选。挑取菌落可以是完全自动化的过程，其中对每个挑取的菌落进行采样和测试。可选地，挑取菌落可以是部分自动化的过程，其中多个菌落候选被自动鉴定并在数字图像中可视地呈现给操作者，使得操作者可以输入一个或多个候选的选择用于采样和进一步测试。所选择或挑取的菌落的采样本身可以由系统自动化。相对于2025和2030处，可以挑取菌落的时间取决于在2025处首次观察到时所观察菌落的已知情况。如果菌落是从被推定的纯样品(例如深伤口或切口)发展而来的，则一旦有足够的数量来观察菌落并收集它，就可以挑取菌落。处理此类样品的时间是至关重要的，避免一个或多个另外的孵育周期意味着可以提前数小时提供测试结果。如果样品不是推定地纯的，则需要另外的孵育周期以允许菌落进一步生长以帮助鉴定和量化这些菌落。

再次参考图18，自动化过程的使用还允许更快的AST和MALDI测试。自动化过程中的这样的测试1850可在初评1830之后不久开始，并且结果可通过24小时标记获得1860 和报告1875。与此相反，手动过程中的这样的测试1855通常直到接近36小时标记时才开始，并且在数据可被检查1865和报告1875之前耗费额外的8到12小时来完成。

总之，手动测试过程1805示出了耗费上至48小时，需要18-24小时的孵育时期，只有在此之后才评估平板的生长，并且也没有办法追踪样品已经孵育了多久。与此相反，因为自动化测试过程1800可检测菌落之间甚至相对很差的对比度(与背景以及互相之间比较)，并且可以进行成像和孵育，而不需要微生物学家必须保持定时追踪，在样本可被鉴定并且准备用于进一步的测试(例如，AST，MALDI)之前只需要12-18小时的孵育，并且整个过程可在大约24小时内完成。因此，本公开的自动化过程，在本文描述的对比度处理的帮助下，提供了样品的较快测试，而对测试结果的质量和准确性没有不利的影响。

虽然已经参考具体实施方式对本公开进行了描述，但是应当理解这些实施方式仅仅是对本公开的原理和应用的说明。因此，应当理解，可对说明性的实施方式进行多种改进，并且可设计其它的布置，而不脱离由所附的权利要求所限定的本公开的精神和范围。