一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件及其制备方法以及应用

摘要

本发明提供一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件及其制备方法以及应用。所述DNA纳米器件由矩形DNA折纸与aC5a适配体杂交构建而成。本发明通过构建一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件，使其具有可控制的药代动力学特点，利用aC5a‑rDON在肾脏中的长滞留时间，在I/R‑阶段一针对氧化应激损伤清除ROS，随后在I/R‑阶段二有效降低炎症损伤，从而实现AKI的多阶段持续联合治疗与序贯保护，根据本发明提供的DNA纳米器件具有肾靶向性强、作用时间长、治疗效果好、无明显毒副作用等优势，为AKI药物的开发提供了一种新的途径，在治疗急性肾衰竭与改善肾功能方面具有巨大的潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物治疗技术，更具体地涉及一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件及其制备方法以及应用。

背景技术

医用急性肾损伤(AKI)是一种严重威胁人类健康的疾病，具有很高的发病率和死亡率。因此，对于AKI的治疗是人们亟待解决的重要问题。氧化应激是AKI的主要发病机制之一，与疾病严重程度和患者预后密切相关。线粒体功能障碍产生的过量活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)通过诱导氧化应激和炎症反应直接损害细胞蛋白和脂质。随后，补体片段C5a被激活，导致炎症反应进一步加剧，诱导细胞因子风暴，最终造成肾小管损伤和肾功能不全。肾缺血再灌注损伤(I/R)是其中最具有代表性的模型之一，多见于肾移植与心脏手术后，且与脓毒症的发生密切相关。

迄今为止，针对抗氧化和抗C5a诱导的炎症反应，已经有多种疗法用于治疗AKI。例如，利用乙酰半胱氨酸(NAC)与ROS的反应性，实现对ROS的清除作用；或是通过天然药物抑制炎症反应，减轻AKI对肾脏的损伤。然而，大多数药物治疗只依赖单因素介导治疗，且只限于治疗疾病进程的某一阶段，效果有限，缺乏多阶段持续持久的干预。DNA纳米技术的最新进展使DNA纳米器件能够创新地用于疾病治疗。自组装的DNA纳米结构为纳米器件和纳米药物的设计提供了一个精确可控的寻址平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件及其制备方法以及应用，从而解决现有技术中缺乏能够有效针对肾缺血再灌注损伤进行序贯治疗的药物的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件，所述DNA纳米器件由矩形DNA折纸与aC5a适配体杂交构建而成。

所述矩形DNA折纸利用DNA自组装技术使用M13mp18 DNA合成。

所述aC5a适配体的DNA序列为：

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC/i2OMeG/CCGC/i2OMeG//i2OMeG/UCUC/i2OMeA//i2OMeG//i2OMeG/CGCU/i2OMeG//i2OMeA//i2OMeG/UCU/i2OMeG//i2OMeA//i2OMeG/UUUACCU/i2OMeG/C/i2OMeG/。

根据本发明的第二方面，提供一种如上面所述的基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件的制备方法，包括以下步骤：S1：单链M13mp18 DNA在订书针链和捕获链的作用下，通过退火折叠形成矩形DNA折纸rDON；S2：aC5a适配体在rDON表面的16个位点与之结合，制备出一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件aC5a-rDONs。

优选地，所述步骤S1包括：将单链M13mp18 DNA与五倍过量的订书针链以及捕获链混合，再按照下列程序：90℃，30S；86-71℃，1min/步；70-60℃，10min/步；59-30℃，15min/步；29-26℃，10min/步；25℃，25min；退火至4℃，即可制得所述rDON，其中，所使用的订书针链的DNA序列如SEQ ID No.1～226所示，所述捕获链根据rDON平面上的16个位点设计而成，所使用的捕获链的DNA序列如SEQ ID No.229～244所示。

优选地，所述步骤S2包括：通过所述捕获链与所述aC5a适配体的DNA序列互补，纯化的rDONs与五倍过量的aC5a适配体在室温下静置1～1.5小时杂交，即可制得所述DNA纳米器件aC5a-rDONs。

根据本发明的第三方面，提供一种DNA纳米器件在制备用于急性肾损伤治疗的药物中的应用。

根据本发明的第四方面，提供一种DNA纳米器件在制备用于肾缺血再灌注序贯治疗的药物中的应用。

根据本发明提供的DNA纳米器件在制备用于肾缺血再灌注序贯治疗的药物中的应用中，在肾缺血再灌注序贯治疗的第一阶段0～8h内，所述DNA纳米器件中的rDONs能有效减轻肾脏的氧化应激损伤，在肾缺血再灌注序贯治疗的第二阶段8h以后，所述DNA纳米器件中的aC5a作为C5a阻滞剂能抑制C5a介导的炎症反应发生，从而实现肾缺血再灌注的序贯治疗。

正如本发明背景技术部分所述，针对肾缺血再灌注损伤，大多数药物治疗只依赖单因素介导治疗，且只限于治疗疾病进程的某一阶段，效果有限，缺乏多阶段持续持久的干预。为此，本发明首次创造性地制备出一种靶向肾脏且能够在肾脏中长时间滞留的DNA纳米器件，该DNA纳米器件由矩形DNA折纸与aC5a适配体杂交构建而成，然后通过凝胶电泳和原子力显微镜(AFM)表征结构，证实构建成功。

进一步地，发明人还验证了aC5a-rDON清除ROS的能力，包括利用电子自旋共振波谱仪(ESR)检验aC5a-rDON对·OH的清除作用，以及通过试剂盒检测m13，rDON与aC5a-rDON对·OH和ABTS自由基的清除效率。

进一步地，发明人还通过细胞实验验证aC5a-rDON对细胞氧化应激损伤的缓解作用，采用肾脏近端小管HK-2细胞系，利用MTT实验、共聚焦显微镜(LSCM)和流式细胞仪(FCM)分别检测H

进一步地，通过小动物成像验证rDON在体内注射后的高肾脏靶向性与长滞留时间，证明该DNA纳米器件可用于AKI的长程治疗。

进一步地，构建I/R损伤小鼠模型，于损伤后不同时刻检测小鼠血液和肾脏氧化应激产物和炎症因子水平，从而对I/R疾病进展进行分期，并针对不同阶段给予aC5a-rDON与正对照药物治疗，评价在不同阶段中aC5a-rDON的治疗效果。

最后，发明人还通过体内实验验证aC5a-rDON对小鼠I/R的治疗效果，并与rDON及aC5a进行对比，证明aC5a-rDON在肾缺血再灌注损伤的贯序治疗中的优越性与独特性。

根据本发明制备的aC5a-rDONs多阶段序贯治疗AKI的作用模拟图如图1所示，静脉注射aC5a-rDONs后，该纳米器件能够有效靶向肾脏，并在肾脏中长时间停留，在I/R-阶段一(0-8h)，大量ROS产生，DNA组分作为活性氧清除剂减少氧化应激损伤；而在I/R-阶段二(>8h)，aC5a适配体与C5a结合，从而抑制其诱导的剧烈炎症反应。总体而言，aC5a-rDONs利用rDON与aC5a在不同阶段的作用特点，实现了AKI的序贯治疗。

综上所述，本发明通过构建一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件，使其具有可控制的药代动力学特点，利用aC5a-rDON在肾脏中的长滞留时间，在I/R-阶段一针对氧化应激损伤清除ROS，随后在I/R-阶段二有效降低炎症损伤，从而实现AKI的多阶段持续联合治疗与序贯保护，根据本发明提供的这样一种DNA纳米器件具有肾靶向性强、作用时间长、治疗效果好、无明显毒副作用等优势，为AKI药物的开发提供了一种新的途径，并进一步加深了对纳米材料-肾脏相互作用的全面理解，在治疗急性肾衰竭与改善肾功能方面具有巨大的潜力。

附图说明

图1是aC5a-rDONs多阶段序贯治疗AKI的作用模拟图；

图2示出了本发明实施例1中，DNA纳米器件的设计与表征；其中，a为DNA纳米器件的制备过程示意图；b示出了aC5a-rDONs分步组装后的1％琼脂糖凝胶图像，条带1和6：20bpDNA ladder；条带2:m13；条带3：rDON+捕获链；条带4：aC5a-rDON；条带5：cy5.5-rDON；c示出了rDON的AFM图像；d示出了利用ESR光谱检测rDON对羟自由基(·OH)的清除能力的结果示意图；e示出了不同DNA材料对·OH的清除效率的统计；f示出了培养0.5和12h后，不同DNA材料对ABTS自由基的清除效率，n≥3；

图3示出了本发明实施例2中，在细胞中验证DNA纳米器件对ROS的体外清除作用的结果；其中，a示出了H

图4示出了本发明实施例3中，rDON在健康和I/R小鼠体内的生物分布；其中，a示出了I/R小鼠的建模和治疗方案，对禁食C57bl小鼠进行双侧肾蒂夹闭35分钟，实现I/R损伤，I/R后2h，静脉注射cy5.5-rDONs，测定给药后不同时间点的荧光强度；b示出了注射后5、10、20、30min、1、3、6、9、12h分别对健康和I/R小鼠的成像；c示出了注射后5、10、15、20、30、40、50、60、90、120min对肾脏中荧光强度的ROI分析；d-f示出了基于健康和I/R小鼠的时间-荧光强度图像，进一步分析两组小鼠d，12h荧光强度，e，到达峰值时间，f，肾脏清除效率，n≥3，**P<0.01；***P<0.001；

图5示出了本发明实施例4中，I/R损伤过程分期与aC5a-rDONs的序贯治疗作用；其中，a-c为根据MDA和C5a水平的升高将I/R疾病进展过程分为2个阶段，I/R损伤后0(未损伤)、2、4、8、12、24h分别测定的(a)肾脏匀浆MDA水平、(b)血和(c)肾脏匀浆C5a水平，并与健康小鼠比较的结果；d为肾I/R模型建立的时间线、不同治疗处理及参数测定，共同证明了aC5a-rDONs的序贯治疗作用；e为aC5a-rDON对阶段一中，损伤后4hMDA水平的保护作用以及与正对照NAC的比较；f-g为aC5a-rDON对阶段二损伤后8h(f)血、(g)肾脏匀浆C5a水平的保护作用以及与正对照C5a受体(C5aR)拮抗剂的比较；n＝3，*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001；ns，无统计学差异；

图6为本发明实施例5中，aC5a-rDONs对I/R小鼠的治疗作用；其中，a-b为治疗后血液中(a)肌酐水平和(b)BUN水平的变化分析，用以评价肾功能；c为治疗后肾脏匀浆中MDA含量的变化，用以评价肾脏氧化应激状态；d-g示出了利用ELISA测定各组肾脏匀浆中MPO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平变化，用以评价肾脏炎症水平；h-i为比较(e)血清、(f)肾脏匀浆中C5a的变化水平，以证明aC5a-rDONs选择性结合C5a的能力；j为肾组织的苏木精-伊红(H&E)染色，虚线框为×100倍视野下肾小管的结构差异，宽箭头表示刷状缘缺失，星号表示肾小管扩张，三角形表示脱落碎片沉淀形成的管型，细长箭头表示炎性细胞浸润；比例尺，40μm；n＝6，**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns，无统计学差异。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1

DNA纳米器件的合成与表征：

1)rDON的自组装过程。

矩形DON是通过将7249个核苷酸的病毒基因组M13mp18(m13 ssDNA)与20-60个碱基的订书针链退火来组装的，订书针链共226条，具体序列见表1。

表1订书针链的DNA序列

所有DON均在1×TAE-Mg

表2 DNA折纸合成退火步骤

2)aC5a-rDONs/cy5.5-rDONs的制备。

在rDON平面上的16个位点设计捕获链，该捕获链与aC5a适配体或cy5.5的DNA序列互补。纯化的rDONs(20nM)与aC5a适配体(100μM，过量5倍)在室温下静置1小时杂交。设计细节和DON序列见下表3。其中，16条“aC5a-数字”标记的核苷酸链为aC5a捕获链，数字代表m13上的折叠位点；40条“Cy5.5-数字”标记的核苷酸链为cy5.5捕获链，数字代表m13上的折叠位点。

表3 aC5a核酸适配体、Cy5.5探针、aC5a及Cy5.5捕获链序列

3)aC5a-rDON的琼脂糖凝胶电泳(AGE)。

在1×TAE/Mg

4)aC5a-rDON的AFM图像扫描。

将aC5a-rDON(2μL，20nm)加至新切割的云母片上并保持吸附2-3min，随后向其中添加1×TAE-Mg

5)利用电子自旋共振(ESR)波谱仪证实rDON对羟基自由基(·OH)的清除能力。

Fenton反应(0.735mM FeSO

6)rDONs对羟基自由基的清除效率比较。

将m13 ssDNA(10nM)以及不同的rDON(5nM)作为反应底物，使用羟基自由基抗氧化能力测定试剂盒(目录号：STA-346-T；Cell Biolabs)测试羟自由基清除效率。所有试验均按照制造商提供的方案进行。重复三次实验以减小误差。

7)rDONs对ABTS自由基的清除效率比较。

本实验采用ABTS自由基阳离子脱色法，以ABTS自由基阳离子(·ABTS+)的还原为基础，检测rDONs清除ROS的能力。将7mmol ABTS溶解于去离子水中并与2.45mM过硫酸钾反应生成·ABTS+，并且在使用前将混合物在室温下避光静置24h。测定·ABTS+纯溶液在734nm处的吸光度，通过调整稀释倍数，使其在734nm处的吸光度近似0.7。随后，将m13ssDNA(10nM，50μL)或不同rDON(5nM，50μL)作为反应底物，与·ABTS+溶液在室温下共孵育，在不同时间点测定各混合溶液和·ABTS+纯溶液(200μL)在734nm处的吸光度值。根据中和的·ABTS+与总·ABTS+的比值计算不同材料对·ABTS+的抑制率。重复三次实验以减小误差。

本实施例步骤3)中所得的凝胶电泳图像如图2中的b所示。电泳图左右两边为DNA参照，其目标DNA从左往右依次为m13，rDON+捕获链，aC5a-rDON，cy5.5-rDON。从凝胶电泳图中可知，该DNA纳米器件被成功合成。

本实施例步骤4)中所得的AFM图像如图2中的c所示。图中显示了rDON的结构信息，其尺寸为90nm×60nm，与原始设计一致。

本实施例步骤5)中所得的rDON对·OH的清除效果如图2中的d所示。ESR光谱显示了·OH的特征峰，且特征峰随着rDON的加入而消失，表明rDON对ROS有较高的清除效率。

本实施例步骤6)中所得的不同材料对·OH的清除效率如图2中的e所示。m13，rDON，aC5a-rDON对·OH的清除效率均大于70％，且aC5a-rDON的清除效率最高。

本实施例步骤7)中所得的不同材料对ABTS自由基的清除效率如图2中的f所示。三组材料与·ABTS+共孵育后，在30分钟时显示出10％的清除效率，且在12小时增加到50％。再次证实了rDON对ROS的清除能力。

实施例2

细胞实验验证DNA纳米器件对ROS的体外清除作用：

1)rDON对受到H

HK-2细胞在37℃、5％CO

2)细胞环境中rDONs体外清除ROS的能力。

HK-2细胞在37℃、5％CO

本实施例步骤1)中所得的细胞活力检测如图3中的a所示。在H

本实施例步骤2)中所得的细胞ROS含量如图3中的c所示。在H

本实施例步骤3)中所得的细胞ROS成像如图3中的b所示，通过FCM对DCF强度进行定量分析，H

实施例3

rDON在健康和I/R小鼠体内的生物分布：

1)肾I/R模型的建立。

对C57bl小鼠尾静脉注射戊巴比妥钠进行麻醉。在手术显微镜下，小鼠取仰卧位，对小鼠作腹部中线切口，暴露双侧肾蒂。同时用迷你钛夹(货号：FT692T，AesculapYasargil)夹闭两侧肾蒂，可观察到肾脏颜色由红转暗。维持35min后，松开钛夹，肾脏颜色由暗转红，肾缺血再灌注损伤模型建立成功。

2)rDONs在健康和I/R小鼠体内的生物分布。

将Cy5.5-rDONs(20nM，150μL)通过尾静脉注射到健康和I/R小鼠中，在给药后5、10、20、30min、1、3、6、9、12h用化学发光荧光图像分析系统(PerkinElmer，美国)对健康和I/R小鼠进行统一成像。根据扫描仪的校准系数，选取肾脏区域获取ROI数据，用于测定肾脏的时间荧光强度曲线，以便进一步分析。重复三次实验以减小误差。

在本实施例中，rDON在小鼠体内的生物分布如图4所示。向健康和I/R小鼠尾静脉注射cy5.5-rDONs后，rDON在肾脏中高度富集，这与其独特的尺寸和形状密切相关。rDON的致密形态导致其可以快速被肾脏滤过，同时，由于其较大的尺寸，rDON在肾脏中只能缓慢排出，进一步加剧了其在肾脏当中的富集。除此之外，rDONs在健康小鼠体内停留3h后被肾脏逐渐清除，而I/R组的停留时间可持续至12h。造成这一现象的主要原因是肾小管损伤引起的肾功能不全，导致肾清除率下降。这种持久的肾脏滞留时间为治疗AKI提供了更长的时间窗口，从而允许aC5a-rDON在I/R期间进行多阶段的干预，是AKI序贯治疗的前提。

除此之外，图4中的c-f进一步展示了健康与I/R小鼠对rDON的不同代谢特点。其中I/R组的荧光强度在注射12小时后可达健康组的2.8倍，I/R小鼠的峰值比健康小鼠增加12.7％，且到达峰值的时间分别为20min和40min。这一具有统计学意义的差异表明，肾功能下降导致了肾脏对rDON的滤过能力降低，由此可能造成rDON在肾脏中的整体滞留时间延长。此外，我们将肾脏清除效率定义为(峰值荧光强度-12h的荧光强度)/峰值荧光强度x100％，以评估给药后12小时内rDONs的肾脏排泄效率。在这一指标上，I/R小鼠显著低于健康小鼠，这与其肾脏排泄能力下降一致。

实施例4

I/R损伤过程分期与aC5a-rDONs的序贯治疗作用：

1)I/R损伤过程分期。

对C57bl小鼠进行I/R建模后，分别于0(未建模)，2，4，8，12，24h收集小鼠血液与肾脏，并制作血清与肾组织匀浆。针对ROS氧化应激与炎症反应两大病理过程，选择脂质氧化产物MDA和C5a含量作为标志物，分别测定血清中C5a含量，肾组织匀浆中MDA与C5a含量，制作其浓度随时间变化曲线。并根据曲线变化确定分期。重复三次实验以减小误差。

2)aC5a-rDONs的序贯治疗作用

对I/R损伤过程进行分期后，评价rDON，aC5a-rDON(20nM，100μL)与aC5a(320nM，100μL)在不同阶段的治疗作用。同时设立两组作为阳性对照组：NAC组用于清除ROS：4.2mg/100μL 1×PBS；C5aR拮抗剂组用于拮抗C5a：1mg/kg PMX 53(目录号：5473/1，Tocris)。造模后2h，将不同药物通过尾静脉分别注射至I/R小鼠体内。于I/R术后4h取肾组织匀浆测定MDA水平，观察I/R-阶段一肾脏的氧化状态；以及在I/R术后8h取血清与肾组织匀浆测定C5a水平，观察I/R-阶段二小鼠的炎症水平。同时，与健康和PBS组小鼠进行肾功能、氧化状态和炎症状态的比较。重复三次实验以减小误差。

本实例中的I/R损伤过程分期与aC5a-rDONs的序贯治疗作用如图5所示。根据I/R进程中各指标的变化，将其分为2个阶段：阶段一为0-8h，此过程主要发生氧化应激损伤，C5a水平尚未升高；阶段二为8h以后，此过程炎症损伤开始产生，C5a水平逐渐上升。针对两阶段进行aC5a-rDON的治疗效果研究。在I/R-阶段一的第4个小时，与PBS处理的I/R组相比，aC5a-rDONs组和NAC组的MDA水平均显著降低，表明rDONs能有效减轻肾脏的氧化应激损伤。而在I/R损伤8h后，即阶段二，aC5a-rDONs可作为C5a阻滞剂抑制炎症反应。aC5a-rDONs组和C5aR拮抗剂组血液中C5a含量均显著降低，主要原因是它们在血液循环中都能结合C5a。然而，C5aR拮抗剂静脉注射后不能靶向肾脏。因此，与PBS组相比，该组肾组织中的C5a含量没有显著差异。相反，aC5a-rDONs具有极高的肾脏靶向性，将aC5a适配体靶向转运至肾脏，从而有效结合C5a，导致该组肾脏C5a含量较PBS组显著降低。在肾I/R损伤中，aC5a-rDONs在阶段一能够有效清除ROS，在阶段二能够进一步抑制C5a介导的炎症反应，说明序贯疗法的DNA纳米器件开发成功。

实施例5

aC5a-rDONs对I/R小鼠的治疗作用：

1)肾I/R的药物治疗。

实验设立5组小鼠：第1组为未经任何处理的健康对照小鼠(健康组)；第2组为经1×PBS(100μL，PBS组)处理的I/R小鼠；第3组为经20nM rDON(100μL，rDON组)处理的I/R小鼠；第4组为经20nM aC5a-rDON(100μL，aC5a rDON组)处理的I/R小鼠；第5组为经320nMaC5a(100μL，aC5a组)处理的I/R小鼠。以上各组均在损伤后2h通过尾静脉注射给药。重复六次实验以减小误差。

2)检测血清学指标。

在I/R损伤后24h处死各组小鼠，将血样收集到EP管中，静置1小时后在4℃下以3000G离心15分钟，取上清。利用试剂盒(目录号：C011-2-1，C013-2-1，南京建城生物工程研究所)检测血肌酐和尿素氮水平。设置复孔以减小误差。

3)酶联免疫吸附试验(ELISA)。

在I/R损伤24h后处死各组小鼠，分离左肾组织，置于4℃裂解液中(10μL/mg肾组织)，使用匀浆机制备组织匀浆。利用双肌酸蛋白质分析试剂盒(目录号：23227，Pierce，ThermoScientific)测定总蛋白含量，并利用ELISA试剂盒(目录号：ab155458，ab208348，ab197742，ab100713，ab193718，Abcam)对炎症因子和C5a水平进行定量。血液中C5a的水平以ng/ml表示，肾匀浆中C5a、MPO、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平以pg/mg protein表示。试验按照制造商提供的方案进行,并根据标准曲线计算测量值。设置复孔以减小误差。

4)肾切片苏木精-伊红(H&E)染色。

在I/R损伤后24h处死各组小鼠，分离左肾组织，用4％多聚甲醛固定，随后进行石蜡包埋，切片，由公司进行H&E染色(Servicebio)。

本实施例步骤1)中的肾I/R治疗效果如图6中的a-b所示。在PBS组中观察到血清肌酐(sCr)和尿素氮(BUN)显著增加，分别比健康组高28.5倍和3.9倍，表明小鼠肾功能显著下降。当用rDONs处理时，sCr和BUN的值分别从167.6±14.6μmol/L和44.7±1.4mmol/L降低到87.3±23.9μmol/L和11.5±1.9mmol/L。此外，添加aC5a后，aC5a-rDON组的治疗效果比rDON组进一步提高，说明其较好的治疗效果主要是由于aC5a-rDONs在两个阶段的双重作用。

本实施例步骤2)中的肾I/R治疗效果如图6中的c-i所示。与PBS组相比，aC5a-rDON组MDA含量显著降低。利用髓过氧化物酶(MPO)进一步检测aC5a-rDONs的抗炎作用，尽管rDON组由于ROS含量下降导致MPO水平降低，但aC5a-rDON能够更有效地抑制炎症细胞的活化，显示出与健康组相当的MPO水平。同时，与PBS组相比，aC5a-rDON组的代表性炎症因子水平，包括IL-6、IL-1β和TNF-α，均受到显著抑制。定量分析其抑制率，发现aC5a-rDONs组MPO降低64.4％，IL-6降低48.5％，IL-1β降低72.7％，TNF-α降低24.5％，明显优于rDON组。C5a在血液和肾组织中的变化趋势与炎症因子相同。总体而言，aC5a-rDON组的疗效明显优于rDON组和游离aC5a组，可将其归因于aC5a-rDON在序贯治疗中的双重功能。

本实例步骤(3)中的肾切片H&E染色如图6中的j所示。其中只有aC5a-rDON组中的肾小管几乎完全恢复，而其他三组均显示不同程度的肾小管受损，进一步证明了aC5a-rDON的独特治疗作用。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件及其制备方法以及应用

<160> 284

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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caagcccaat aggaacccat gtacaaacag tt 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aatgccccgt aacagtgccc gtatctccct ca 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgccttgact gcctatttcg gaacagggat ag 32

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagccgcccc accaccggaa ccgcgacgga aa 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aaccagagac cctcagaacc gccaggggtc ag 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttattcatag ggaaggtaaa tattcattca gt 32

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cataacccga ggcatagtaa gagcttttta ag 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

attgagggta aaggtgaatt atcaatcacc gg 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaaagtaata tcttaccgaa gcccttccag ag 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcaatagcgc agatagccga acaattcaac cg 32

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctaatttac gctaacgagc gtctaatcaa ta 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcttaccagc cagttacaaa ataaatgaaa ta 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atcggctgcg agcatgtaga aacctatcat at 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctaatttatc tttccttatc attcatcctg aa 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcgttataga aaaagcctgt ttagaaggcc gg 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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gctcattttc gcattaaatt tttgagctta ga 32

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<211> 32

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<213> 人工序列

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aattactaca aattcttacc agtaatccca tc 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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ttaagacgtt gaaaacatag cgataacagt ac 32

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<213> 人工序列

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tagaatccct gagaagagtc aataggaatc at 32

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<213> 人工序列

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cttttacaca gatgaatata cagtaaacaa tt 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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tttaacgttc gggagaaaca ataattttcc ct 32

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<213> 人工序列

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cgacaactaa gtattagact ttacaatacc ga 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggatttagcg tattaaatcc tttgttttca gg 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgaaccaaa acatcgccat taaatggtgg tt 32

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<213> 人工序列

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gaacgtggcg agaaaggaag ggaacaaact at 32

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<211> 32

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<213> 人工序列

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tagccctacc agcagaagat aaaaacattt ga 32

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cggccttgct ggtaatatcc agaacgaact ga 32

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<213> 人工序列

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ctcagagcca ccaccctcat tttcctatta tt 32

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<213> 人工序列

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ctgaaacagg taataagttt taacccctca ga 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agtgtacttg aaagtattaa gaggccgcca cc 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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gccaccactc ttttcataat caaaccgtca cc 32

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<211> 32

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<213> 人工序列

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gtttgccacc tcagagccgc caccgataca gg 32

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<213> 人工序列

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gacttgagag acaaaagggc gacaagttac ca 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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gaaggaaaat aagagcaaga aacaacagcc at 32

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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tattttgctc ccaatccaaa taagtgagtt aa 32

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<213> 人工序列

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ggtattaaga acaagaaaaa taattaaagc ca 32

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<213> 人工序列

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taagtcctac caagtaccgc actcttagtt gc 32

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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ttgaattatg ctgatgcaaa tccacaaata ta 32

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> 人工序列

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agcaccgttt tttaaaggtg gcaacatagt agaaaa 36

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tacatacatt ttgacgggag aattaactac agggaa 36

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<211> 36

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<213> 人工序列

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tatagaagtt ttcgacaaaa ggtaaagtag agaata 36

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<211> 36

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<213> 人工序列

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taaagtactt ttcgcgagaa aactttttat cgcaag 36

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

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acaaagaatt ttattaatta catttaacac atcaag 36

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 36

<212> DNA

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ccgaaatccg aaaatcctgt ttgaagccgg aa 32

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<213> 人工序列

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ccagcagggg caaaatccct tataaagccg gc 32

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gcataaagtt ccacacaaca tacgaagcgc ca 32

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttcgccattg ccggaaacca ggcattaaat ca 32

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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agacagtcat tcaaaagggt gagaagctat at 32

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<213> 人工序列

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aggtaaagaa atcaccatca atataatatt tt 32

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<213> 人工序列

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ttttaattgc ccgaaagact tcaaaacact at 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggaattactc gtttaccaga cgacaaaaga tt 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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gaataaggac gtaacaaagc tgctctaaaa ca 32

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<400> 128

ctcatcttga ggcaaaagaa tacagtgaat tt 32

<210> 129

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 129

aaacgaaatg acccccagcg attattcatt ac 32

<210> 130

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 130

cttaaacatc agcttgcttt cgagcgtaac ac 32

<210> 131

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 131

tcggtttagc ttgataccga tagtccaacc ta 32

<210> 132

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 132

tgagtttcgt caccagtaca aacttaattg ta 32

<210> 133

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 133

ccccgattta gagcttgacg gggaaatcaa aa 32

<210> 134

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 134

gaatagccgc aagcggtcca cgctcctaat ga 32

<210> 135

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 135

gagttgcacg agatagggtt gagtaaggga gc 32

<210> 136

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 136

gtgagctagt ttcctgtgtg aaatttggga ag 32

<210> 137

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 137

tcatagctac tcacattaat tgcgccctga ga 32

<210> 138

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 138

ggcgatcgca ctccagccag ctttgccatc aa 32

<210> 139

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 139

gaagatcggt gcgggcctct tcgcaatcat gg 32

<210> 140

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 140

aaataatttt aaattgtaaa cgttgatatt ca 32

<210> 141

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 141

gcaaatatcg cgtctggcct tcctggcctc ag 32

<210> 142

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 142

accgttctaa atgcaatgcc tgagaggtgg ca 32

<210> 143

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 143

tatattttag ctgataaatt aatgttgtat aa 32

<210> 144

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 144

tcaattcttt tagtttgacc attaccagac cg 32

<210> 145

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 145

cgagtagaac taatagtagt agcaaaccct ca 32

<210> 146

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 146

gaagcaaaaa agcggattgc atcagataaa aa 32

<210> 147

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 147

tcagaagcct ccaacaggtc aggatctgcg aa 32

<210> 148

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 148

ccaaaatata atgcagatac ataaacacca ga 32

<210> 149

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 149

cattcaacgc gagaggcttt tgcatattat ag 32

<210> 150

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 150

acgagtagtg acaagaaccg gatataccaa gc 32

<210> 151

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 151

agtaatctta aattgggctt gagagaatac ca 32

<210> 152

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 152

gcgaaacatg ccactacgaa ggcatgcgcc ga 32

<210> 153

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 153

atacgtaaaa gtacaacgga gatttcatca ag 32

<210> 154

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 154

caatgacact ccaaaaggag ccttacaacg cc 32

<210> 155

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 155

aaaaaaggac aaccatcgcc cacgcgggta aa 32

<210> 156

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 156

tgtagcattc cacagacagc cctcatctcc aa 32

<210> 157

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 157

gtaaagcact aaatcggaac cctagttgtt cc 32

<210> 158

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 158

agtttggagc ccttcaccgc ctggttgcgc tc 32

<210> 159

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 159

agctgattac aagagtccac tattgaggtg cc 32

<210> 160

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 160

actgcccgcc gagctcgaat tcgttattac gc 32

<210> 161

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 161

cccgggtact ttccagtcgg gaaacgggca ac 32

<210> 162

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 162

cagctggcgg acgacgacag tatcgtagcc ag 32

<210> 163

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 163

gtttgaggga aagggggatg tgctagagga tc 32

<210> 164

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 164

ctttcatccc caaaaacagg aagaccggag ag 32

<210> 165

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 165

agaaaagcaa cattaaatgt gagcatctgc ca 32

<210> 166

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 166

ggtagctagg ataaaaattt ttagttaaca tc 32

<210> 167

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 167

caacgcaatt tttgagagat ctactgataa tc 32

<210> 168

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 168

caataaatac agttgattcc caatttagag ag 32

<210> 169

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 169

tccatataca tacaggcaag gcaactttat tt 32

<210> 170

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 170

tacctttaag gtctttaccc tgacaaagaa gt 32

<210> 171

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 171

caaaaatcat tgctcctttt gataagtttc at 32

<210> 172

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 172

tttgccagat cagttgagat ttagtggttt aa 32

<210> 173

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 173

aaagattcag ggggtaatag taaaccataa at 32

<210> 174

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 174

tttcaactat aggctggctg accttgtatc at 32

<210> 175

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 175

ccaggcgctt aatcattgtg aattacaggt ag 32

<210> 176

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 176

cgcctgatgg aagtttccat taaacataac cg 32

<210> 177

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 177

tttcatgaaa attgtgtcga aatctgtaca ga 32

<210> 178

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 178

atatattctt ttttcacgtt gaaaatagtt ag 32

<210> 179

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 179

aataataagg tcgctgaggc ttgcaaagac tt 32

<210> 180

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 180

cgtaacgatc taaagttttg tcgtgaattg cg 32

<210> 181

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 181

acccaaatca agttttttgg ggtcaaagaa cg 32

<210> 182

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 182

tggactccct tttcaccagt gagacctgtc gt 32

<210> 183

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 183

tggtttttaa cgtcaaaggg cgaagaacca tc 32

<210> 184

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 184

gccagctgcc tgcaggtcga ctctgcaagg cg 32

<210> 185

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 185

cttgcatgca ttaatgaatc ggcccgccag gg 32

<210> 186

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 186

attaagttcg catcgtaacc gtgcgagtaa ca 32

<210> 187

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 187

tagatggggg gtaacgccag ggttgtgcca ag 32

<210> 188

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 188

acccgtcgtc atatgtaccc cggtaaaggc ta 32

<210> 189

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 189

catgtcaaga ttctccgtgg gaaccgttgg tg 32

<210> 190

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 190

tcaggtcact tttgcgggag aagcagaatt ag 32

<210> 191

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 191

ctgtaatatt gcctgagagt ctggaaaact ag 32

<210> 192

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 192

caaaattaaa gtacggtgtc tggaagaggt ca 32

<210> 193

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 193

tgcaactaag caataaagcc tcagttatga cc 32

<210> 194

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 194

tttttgcgca gaaaacgaga atgaatgttt ag 32

<210> 195

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 195

aaacagttga tggcttagag cttatttaaa ta 32

<210> 196

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 196

actggataac ggaacaacat tattacctta tg 32

<210> 197

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 197

acgaactagc gtccaatact gcggaatgct tt 32

<210> 198

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 198

cgattttaga ggacagatga acggcgcgac ct 32

<210> 199

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 199

ctttgaaaag aactggctca ttatttaata aa 32

<210> 200

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 200

gctccatgag aggctttgag gactagggag tt 32

<210> 201

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 201

acggctactt acttagccgg aacgctgacc aa 32

<210> 202

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 202

aaaggccgaa aggaacaact aaagctttcc ag 32

<210> 203

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 203

gagaatagct tttgcgggat cgtcgggtag ca 32

<210> 204

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 204

acgttagtaa atgaattttc tgtaagcgga gt 32

<210> 205

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 205

ttttcgatgg cccactacgt aaaccgtc 28

<210> 206

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 206

tatcagggtt ttcggtttgc gtattgggaa cgcgcg 36

<210> 207

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 207

gggagaggtt tttgtaaaac gacggccatt cccagt 36

<210> 208

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 208

cacgacgttt ttgtaatggg ataggtcaaa acggcg 36

<210> 209

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 209

gattgacctt ttgatgaacg gtaatcgtag caaaca 36

<210> 210

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 210

agagaatctt ttggttgtac caaaaacaag cataaa 36

<210> 211

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 211

gctaaatctt ttctgtagct caacatgtat tgctga 36

<210> 212

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 212

atataatgtt ttcattgaat ccccctcaaa tcgtca 36

<210> 213

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 213

taaatatttt ttggaagaaa aatctacgac cagtca 36

<210> 214

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 214

ggacgttgtt tttcataagg gaaccgaaag gcgcag 36

<210> 215

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 215

acggtcaatt ttgacagcat cggaacgaac cctcag 36

<210> 216

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 216

cagcgaaatt ttaactttca acagtttctg ggattttgct aaactttt 48

<210> 217

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 217

aacatcactt gcctgagtag aagaact 27

<210> 218

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 218

tgtagcaata cttctttgat tagtaat 27

<210> 219

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 219

agtctgtcca tcacgcaaat taaccgt 27

<210> 220

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 220

ataatcagtg aggccaccga gtaaaag 27

<210> 221

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 221

acgccagaat cctgagaagt gttttt 26

<210> 222

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 222

ttaaagggat tttagacagg aacggt 26

<210> 223

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 223

agagcgggag ctaaacagga ggccga 26

<210> 224

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 224

tataacgtgc tttcctcgtt agaatc 26

<210> 225

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 225

gtactatggt tgctttgacg agcacg 26

<210> 226

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 226

gcgcttaatg cgccgctaca gggcgc 26

<210> 227

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 227

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa c 21

<210> 228

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 228

gtggtagtta ggagtgaatg c 21

<210> 229

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 229

tttttttttt tttttttttt tcttaccagc cagttacaaa ataaatgaaa ta 52

<210> 230

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 230

tttttttttt tttttttttt tagaatccct gagaagagtc aataggaatc at 52

<210> 231

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 231

tttttttttt tttttttttt tagccctacc agcagaagat aaaaacattt ga 52

<210> 232

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 232

tttttttttt tttttttttt aggttttgaa cgtcaaaaat gaaagcgcta at 52

<210> 233

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 233

tttttttttt tttttttttt aaatcaatgg cttaggttgg gttactaaat tt 52

<210> 234

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 234

tttttttttt tttttttttt gcgtaagaga gagccagcag caaaaaggtt at 52

<210> 235

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 235

tttttttttt tttttttttt aaccagagac cctcagaacc gccaggggtc ag 52

<210> 236

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 236

tttttttttt tttttttttt tcggcattcc gccgccagca ttgacgttcc ag 52

<210> 237

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 237

tttttttttt tttttttttt gaatagccgc aagcggtcca cgctcctaat ga 52

<210> 238

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 238

tttttttttt tttttttttt aaataatttt aaattgtaaa cgttgatatt ca 52

<210> 239

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 239

tttttttttt tttttttttt gaagcaaaaa agcggattgc atcagataaa aa 52

<210> 240

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 240

tttttttttt tttttttttt gcgaaacatg ccactacgaa ggcatgcgcc ga 52

<210> 241

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 241

tttttttttt tttttttttt tggactccct tttcaccagt gagacctgtc gt 52

<210> 242

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 242

tttttttttt tttttttttt acccgtcgtc atatgtaccc cggtaaaggc ta 52

<210> 243

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 243

tttttttttt tttttttttt tttttgcgca gaaaacgaga atgaatgttt ag 52

<210> 244

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 244

tttttttttt tttttttttt gctccatgag aggctttgag gactagggag tt 52

<210> 245

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 245

gagccgcccc accaccggaa ccgcgacgga aattttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 246

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 246

aaccagagac cctcagaacc gccaggggtc agttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 247

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 247

cataacccga ggcatagtaa gagcttttta agttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 248

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 248

aaaagtaata tcttaccgaa gcccttccag agttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 249

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 249

gcaatagcgc agatagccga acaattcaac cgttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 250

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 250

atcggctgcg agcatgtaga aacctatcat atttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 251

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 251

ctaatttatc tttccttatc attcatcctg aattttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 252

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 252

gccaccactc ttttcataat caaaccgtca ccttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 253

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 253

gtttgccacc tcagagccgc caccgataca ggttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 254

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 254

gaaggaaaat aagagcaaga aacaacagcc atttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 255

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 255

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<210> 256

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 256

ggtattaaga acaagaaaaa taattaaagc cattttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 257

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 257

taagtcctac caagtaccgc actcttagtt gcttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 258

caccagagtt cggtcatagc ccccgccagc aattttttgc attcactcct aactacgac 59

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcggcattcc gccgccagca ttgacgttcc agttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

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atacccaaga taacccacaa gaataaacga ttttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

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atcagagaaa gaactggcat gattttattt tgttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aatgcagacc gtttttattt tcatcttgcg ggttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 263

catatttaga aataccgacc gtgttacctt ttttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 264

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 264

tgaggcaggc gtcagactgt agcgtagcaa ggttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 265

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 265

tgcctttagt cagacgattg gcctgccaga atttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 266

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 266

tgaacaaaca gtatgttagc aaactaaaag aattttttgc attcactcct aactacgac 59

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 267

ctttacagtt agcgaacctc ccgacgtagg aattttttgc attcactcct aactacgac 59

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 268

ccagacgagc gcccaatagc aagcaagaac gcttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 269

agaggcataa tttcatcttc tgactataac tattttttgc attcactcct aactacgac 59

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 270

tttcatttgg tcaataacct gtttatatcg cgttttttgc attcactcct aactacgac 59

<210> 271

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

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tcgcaaatgg ggcgcgagct gaaataatgt gtttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggaattactc gtttaccaga cgacaaaaga ttttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcatcttga ggcaaaagaa tacagtgaat ttttttttgc attcactcct aactacgac 59

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 276

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aaagattcag ggggtaatag taaaccataa atttttttgc attcactcct aactacgac 59