一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法

摘要

本发明提供了一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法，包括如下步骤：步骤一，依次配制标准品储备液、标准品工作溶液和内标溶液；步骤二，样品处理；步骤三，LC‑MS/MS分析。本发明首次进行了毛发中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己的分析方法的开发验证。本发明的方法简便快速，一步提取，毛发用量少，仅需10mg，采用提取溶液在低温下湿磨提取毛发中的目标物，研磨时间为10min，色谱运行时间短(8min)，灵敏度满足日常检案要求。

说明书

技术领域

本发明涉及钩吻生物碱检测技术领域，尤其涉及一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法。

背景技术

钩吻(Gelsemium elegans)，民间俗称很多，常见的有胡蔓草、断肠草、烂肠草、大炮茶等，为马前科胡蔓藤属野生常绿缠绕藤本植物胡蔓藤(Gelsemium elegang Benth)的全草，主要分布在东南亚和我国南部的贵州、广东、福建、云南和广西等省。全草有剧毒，其毒性主要来源于吲哚类或氧化吲哚类生物碱。其中有毒成分主要有钩吻素子(Koumine)、钩吻素甲(Gelsemine)、钩吻素己(Gelsenicine)等，钩吻素子是最丰富的钩吻生物碱，其次为钩吻素甲，而钩吻素己是毒性最高的钩吻生物碱。钩吻和其他良性草药之间常常会因其形态相似而混淆，从而导致误食和中毒，因此，血液、尿液和毛发等生物检材中钩吻素己、钩吻素子和钩吻素甲的检测是判断钩吻中毒或相关案事件认定的关键。

钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的浓度在血液样品中鲜有报道，而在其他生物检材如尿液或毛发中则几乎没有报道。在一些中毒案件中，许多中毒者经过多天抢救后死亡，未能及时留取血液、尿液等，此时毛发分析可提供有价值的证据。毛发分析已广泛用于法医和临床毒理学。与传统的生物检材(例如血液和尿液)相比，毛发具有检出时限长、能反映较长时间(几个月)的药物使用情况等优点，且样品易获取、易保存，据我们所知，尚未有关于分析测定毛发中钩吻生物碱的研究报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

提供一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，依次配制标准品储备液、标准品工作溶液和内标溶液；

步骤二，将空白毛发样品和待测毛发样品分别依次用超纯水、丙酮清洗，收集最后一次丙酮清洗液吹干，吹干后再分别用甲醇复溶用以排除外污染因素，毛发样品室温下干燥；将干燥后的所述待测毛发样品剪成小段，精密称后置于研磨管中，加入研磨珠、所述内标溶液和甲醇，使用冷冻研磨仪磨碎；然后离心，得到的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测样品溶液；

将干燥后的所述空白毛发样品剪成小段，精密称后分别置于若干研磨管中，分别加入所述标准品工作溶液适量得到不同质量浓度的系列空白毛发样品，加入研磨珠，使用冷冻研磨仪磨碎；然后离心，得到的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到系列空白毛发样品溶液；

步骤三，将所述待测样品溶液和系列空白毛发样品溶液分别进样，LC-MS/MS分析，

其中，色谱条件为：RestekAllure PFP丙基柱，100mm×2.1mm，5μm；流动相A为含0.1％甲酸的20mmol/L乙酸铵缓冲溶液，流动相B为甲醇；流速为0.3～0.5mL/min，流动相A：B＝30～40：60～70等度恒流洗脱8～12min，柱温为室温；自动进样器保持在4℃；

质谱条件为：电喷雾离子器质谱的正离子模式检测，多离子模式监测，采用Analyst software 1.5(Waters)和MultiQuant 3.0.2工作站进行数据收集和分析；质谱仪离子喷雾电压为5500V，离子源温度550℃，气帘气为30psi，雾化气(GS1)、辅助气(GS2)为50psi。

进一步地，所述标准品储备液的配制过程为：分别精密称取钩吻素甲、钩吻素子及钩吻素己标准物质，分别采用甲醇溶解配制成质量浓度为1.0mg/mL标准品储备液，密封后储存于-20℃的冰箱中备用；所述标准品工作溶液的配制过程为：取所述标准品储备液适量，用甲醇逐步稀释得到浓度为10000、5000、1000、100和10ng/mL的标准品工作溶液。

进一步地，所述内标溶液的配制过程为：精密吸取氯胺酮-d4标准溶液10μL，加入990μL甲醇稀释制成内标物质储备液；取所述内标物质储备液适量，用甲醇稀释得到浓度为10ng/mL的内标溶液。

进一步地，将干燥后的所述毛发样品剪成2-3mm小段，精密称取剪段后的所述毛发样品10mg置于2mL的研磨管中，加入适量研磨珠、50μL所述内标溶液和450μL甲醇，使用冷冻研磨仪磨碎。

进一步地，所述冷冻研磨仪的参数设置如下：速度，2500rpm；运行次数，15次；间隔时间为60s，并以18m/s的速度研磨。

进一步地，所述离心的条件为：以9700×g离心3min。

进一步地，所述色谱条件为：RestekAllure PFP丙基柱，100mm×2.1mm，5μm；流动相A为含0.1％甲酸的20mmol/L乙酸铵缓冲溶液，流动相B为甲醇；流速为0.3mL/min，流动相A：B＝30：70等度恒流洗脱8min，柱温为室温；自动进样器保持在4℃。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明首次进行了毛发中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己的分析方法的开发验证。本发明的方法简便快速，一步提取，毛发用量少，仅需10mg，采用提取溶液在低温下湿磨提取毛发中的目标物，研磨时间为10min，色谱运行时间短(8min)，灵敏度满足日常检案要求。

附图说明

图1为钩吻素子在头发中质量浓度为LOQ时的色谱图；

图2为钩吻素甲在头发中质量浓度为LOQ时的色谱图；

图3为钩吻素己在头发中质量浓度为LOQ时的色谱图；

图4为空白头发的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明采用的试剂以及仪器如下：

(1)标准品、试剂和样品

钩吻素子(纯度99.56％)、钩吻素甲(纯度98.36％)及钩吻素己(纯度99.53％)标准对照品粉末均购自成都曼思特生物科技有限公司。内标氯胺酮-d4标准品溶液(1.0mg/mL)购自美国Cerilliant公司。

甲醇和乙腈(HPLC)购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)，丙酮(分析纯)购自上海凌峰化学试剂有限公司(99.5％，中国上海)；甲酸铵(HPLC，≥97.0％)、乙酸铵(HPLC，≥98.0％)、甲酸(HPLC，≥98.0％)均购自CNW Technologies(Duesseldorf，Germany)。去离子水由Milli-Q(Millipore,MA,USA)净水系统制备。PTFE滤膜(0.22μm)购自国药集团化学试剂有限公司。空白毛发由健康志愿者提供。

(2)仪器条件

涡旋混合器(XW-80A)购自上海沪西分析仪器厂有限公司，冷冻研磨仪购于上海净信实业发展有限公司，MiniSpin高速离心机购自德国Eppendorf公司，Milli-Q超纯水制备系统购自美国Millipore公司，BSA124S电子天平购于赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

API 4000QTRAP三重四极杆线性离子阱质谱仪(美国Applied Biosystems公司)。AcquityTM Ultra Performance LC超高压液相色谱仪(美国Waters公司)。色谱条件：液相色谱柱为Restek Allure PFP丙基柱(100mm×2.1mm，5μm)，前接Agilent保护柱Zorbax C8(12.5×2.1mm，5μm)。使用Analyst 1.5软件和MultiQuant 3.0.2工作站进行数据分析。

实施例1

本实施例提供了一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法，并进行了方法学验证。

1.1溶液制备

标准品储备液(1.0mg/mL)：精密称取钩吻素甲、钩吻素子及钩吻素己标准物质各5.0mg，分别置于5mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为1.0mg/mL标准物质储备液，密封后储存于-20℃的冰箱中备用。

标准品工作溶液：取标准品储备液适量，用甲醇逐步稀释得到浓度为10000、5000、1000、100和10ng/mL的工作溶液。

流动相A[20mmol/L乙酸铵缓冲溶液(含0.1％甲酸)]：称取0.77g的乙酸铵，置于500mL容量瓶中，加入超纯水溶解，再加入0.5mL的98％甲酸溶液，最后用超纯水定容至500mL，充分混匀即可。

内标溶液(10ng/mL)：精密吸取氯胺酮-d4标准溶液(100μg/mL)10μL，加入990μL甲醇稀释制成内标物质储备液(10μg/mL)。取内标物质储备液适量，用甲醇稀释得到浓度10ng/mL的内标溶液。

1.2样品前处理

将空白毛发样品和待测毛发样品分别置于带塞试管中，分别依次用超纯水清洗3次，丙酮清洗3次，收集最后一次丙酮清洗液(用于吹干复溶看是是否有外污染存在)，吹干后用甲醇复溶用以排除外污染因素，室温下干燥。

将干燥后的待测毛发样品剪成2-3mm小段，精密称取10mg置于2mL的研磨管中，加入研磨珠适量，50μL内标溶液(10ng/mL)和甲醇450μL。使用冷冻研磨仪(参数设置如下：速度，2500rpm；运行次数，15次；间隔时间为60s，并以18m/s的速度研磨)将毛发磨碎。然后以9700×g离心3min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测样品溶液，10μL进样分析。

精密称取上述干燥后的空白毛发样品剪成2-3mm小段，精密称后分别置于若干研磨管中，分别加入标准品工作溶液适量得到不同质量浓度的系列空白毛发样品，加入研磨珠，使用冷冻研磨仪磨碎(参数设置如下：速度，2500rpm；运行次数，15次；间隔时间为60s，并以18m/s的速度研磨)将毛发磨碎。然后以9700×g离心3min，得到的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到系列空白毛发样品溶液，分别以10μL进样分析。

1.3仪器条件

色谱柱：色谱柱为RestekAllure PFP丙基柱(100mm×2.1mm，5μm)；流动相A：20mmol/L乙酸铵缓冲溶液含0.1％甲酸，流动相B：甲醇；流速：0.3mL/min，A：B＝30：70等度恒流洗脱8min，柱温为室温；自动进样器保持在4℃。

检测系统为电喷雾离子器质谱(Applied Biosystems/MDS SCIEX,Toronto,Canada)的正离子模式检测，多离子模式监测，采用Analyst software 1.5(Waters)和MultiQuant 3.0.2工作站进行数据收集和分析。质谱仪离子喷雾电压为5500V，离子源温度550℃，气帘气为30psi，雾化气(GS1)、辅助气(GS2)为50psi。直接进样后进行母离子和子离子，以及去簇电压(Declustering Potential，DP)和碰撞能(Collision energy，CE)的筛选以得到最大的离子强度，保持碰撞解离能量稳定。通过将各目标分析物分别直接质谱进样，依次确立了目标化合物和内标化合物的碎片离子、去簇电压和碰撞能(表1)，使得碎片离子有最大响应值，每个化合物通过两个碎片离子进行计算。

表1各化合物质谱参数、保留时间和离子比

*定量离子对。

1.4方法学验证

根据毛发分析协会(The Society ofHair Testing,SoHT)指导原则以及国际准则进行方法学验证。评估参数主要包括选择性、检测限(limit ofdetection，LOD)、定量限(limit ofquantification，LOQ)、精密度、准确度、线性、回收率和基质效应等。

1.4.1选择性

收集8名健康志愿者的空白毛发样本进行选择性检测，确保在目标物组分的出峰时间内没有其他物质的干扰。此外还考察了可能的同服药物引起的干扰。

结果如图1-4所示，通过比较空白毛发样品中各化合物的色谱图，确认内源性物质对目标物及内标无干扰。各化合物的出峰时间在2.69–4.50min。

1.4.2 LOD和LLOQ

以信噪比S/N≥3时的质量浓度为检测限，S/N≥10时的质量浓度为定量限，且将定量限作为线性范围的最小浓度，对LOQ处的毛发样品进行精密度和准确度实验考察。

分别考察系列空白毛发样品溶液，选择满足信噪比S/N≥3为检测限，S/N≥10为定量限，LOQ处的毛发样品准确度和精确度均在±20％以内。实验结果见下表2和表3。实验结果表明，钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己的LOD分别为0.005ng/mg、0.002ng/mg、0.001ng/mg；钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己的LOQ分别为0.01ng/mg、0.005ng/mg、0.002ng/mg。

表2各目标物在毛发中的回归方程、线性范围、相关系数、LOD及LOQ

表3各目标物在毛发中的精密度和准确度

1.4.3线性

以目标物在毛发中的质量浓度为横坐标，目标物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x)最小二乘法进行回归运算，求得线性方程，并计算相关系数(R

通过考察质量浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.03、0.5、1、5和10ng/mg9个不同浓度的空白毛发样品溶液，将目标化合物和内标的峰面积比和浓度按照加权(1/x)最小二乘法进行回归运算，得到线性数据和相关系数R

1.4.4精密度与准确度

对LOQ、低、中、高4个浓度进行精密度和准确度的考察，取空白毛发加入混合对照品溶液适量得到质控样品，每个浓度6份样品，连续测定4天。按“1.2”项下方法进行样品前处理，按“1.3”项下方法进样分析，计算日内精密度和准确度。准确度用偏倚表示，通过线性计算浓度，比较线性计算所得值与添加浓度之间的百分比。精密度用相对标准偏差(RSD)表示。连续测定4天，并与标准曲线同时测定，以当日的标准曲线计算质控样品的浓度，计算日间精密度。精密度考察了在同日和不同日重复实验的变化。

对LOQ、低、中、高四个浓度进行精密度和准确度的检测，每个浓度六份样品，连续测定四天。结果表明，各化合物的日内精密度为1.8％–10.8％，日间精密度为1.9％–9.6％。日内和日间准确度的范围分别为-3.6–8.8％和-2.9％–4.5％。数据证明该方法对目标化合物有着良好的准确度与精密度，符合要求。精密度和准确度结果见表3。

1.4.5基质效应和回收率

根据Matuszewski等提出的方法将样品分为三组计算提取回收率和基质效应。Ⅰ组：8份不同来源的毛发按“1.2”项下的方法提取前添加一定浓度混合对照品溶液；Ⅱ组：8份不同来源的毛发按“1.3”项下的方法提取后添加相应浓度的混合对照品溶液；Ⅲ组：配制相应浓度的混合对照品溶液。取不同来源的空白毛发加入混合对照品溶液适量得到质量浓度为0.03ng/mg和10ng/mg(低浓度)的质控样品，每个浓度每组各8份样品。按“1.3”项下方法进样分析，记录峰面积(A)。提取回收率＝AⅠ/AⅡ,基质效应＝AⅡ/AⅢ。

结果表明，各目标物的提取回收率范围为79％–83％，基质效应范围为74％–87％，不同来源毛发的基质效应的相对标准偏差(RSD)≤14％，内标(0.01ng/mg)的基质效应为80％，提取回收率为77％，补偿了提取回收率和基质效应的影响。基质效应和提取回收率结果列于表4。

表4各目标物在毛发中的提取回收率和基质效应

应用例

经过方法学验证后，本发明的方法被应用于因误服钩吻中毒而死的实际案例中。受害人头发长度约10cm，对被送检的毛发样本分为S1(0-1cm)、S2(1-2cm)、S3(2-3cm)、S4(3-4cm)、S5(4-5cm)、S6(5-6cm)、S7(6-7cm)、S8(7-8cm)、S9(8-9cm)、S9(9-10cm)10个片段进行分析测定。结果显示在S6(5-6cm)、S7(6-7cm)、S8(7-8cm)的头发段中均检出钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己，而浓度最高的为S7(6-7cm)，钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己浓度分别为29.4、17.6和4.7pg/mg。结果表明受害人几个月前服用过钩吻。

上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。