柠檬马鞭草叶提取物用于增强五羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等神经递质的神经大脑利用率

摘要

本发明的目的是提供了柠檬马鞭草(Aloysia citriodora，或其同义词)的提取物及制剂，并将其用于预防精神压力，提高认知能力和治疗ADHD。为此，应用了柠檬马鞭草(Aloysia citriodora，或其同义词)的提取物及制剂，特别是其水醇提取物。这些提取物可用于食品、食品补充剂、补充平衡饮食或药物制剂。

说明书

背景技术

从植物学上讲，柠檬马鞭草(植物种类：柠檬马鞭草(Aloysia citriodora

柠檬马鞭草在文献中有多个同义术语：Aloysia triphylla(L'Hérit.)Kuntze/Lippia citriodora Kunth/Verbena triphylla L'Herit，这些均在《欧洲药典专著》第1834章(Ph.Eur.Chapter 1834)中有记载。

柠檬马鞭草的拉丁学名Aloysia citriodora(旧称Lippia citriodora)是根据其叶片的气味和味道类似于柑橘的味道，参考“citriodora”而取的。柠檬马鞭草的同义名Aloysia triphylla(旧称Verbena triphylla)是根据树枝上叶片的排布，参考“triphylla”——三片叶子而取的。

柠檬马鞭草在国际上的正确名称如下：

德语：Zitronenverbene,Zitronenstrauch

奥地利语：Luiserkraut

英语：lemon verbena,lemon-scented verbena

法语：verveine citronelle,verveine odorante

荷兰语Citroenverbena,Citroenstruik

葡萄牙语：limonette,buona Luisa

西班牙语cedron,hierba Luisa

在德语口语中，类似“Zitronenkraut”(柠檬草)“Verbenenkraut”(马鞭草)这样的名字经常被错误地并列使用。多数情况下，在一些法语出版物中，马鞭草科的属类有时会被归类到“vervein”目录下，有时也被用作的“Verbena spp.”的同义词，即，铁质草药(ironherbs)，因此，术语“verveine”究竟指的是柠檬马鞭草(Aloysia citriodora)还是马鞭草(Verbena officinalis)并不是可以确切推断的，每次都需要根据上下文来确定。

在马鞭草科中，橙香木属(Aloysia)既不同于甜味草本(Lippia)(例如，代表性的甜舌草(阿芝特克甜草)(Lippia dulcis TREV.)或“墨西哥奥勒冈草”(Lippia graveolensH.B.&K)，也不同于传统药用植物的“常见马鞭草(common vervain)”(Verbenaofficinalis L.)所归属的约250种马鞭草(Verbena)。

从植物学上讲，两者最显著的特点是，橙香木属植物是多年生落叶灌木，高度可达6米，而大多数马鞭草属植物是年生草本，高度最多仅达70厘米，而甜舌草横向贴地生长，高度最高约为20厘米。

柠檬马鞭草是一种源自南美的植物，主要生长区域在智利和乌拉圭。由于缺乏抗冻性，柠檬马鞭草只在欧洲南部地区种植，主要在法国和西班牙。柠檬马鞭草的叶子通常是浅绿色，边缘呈轻微的锯齿状，披针形或锐尖，无毛。叶片长度为3到10厘米不等，宽度则在0.5至3厘米之间。叶片上通常有许多小点(通常称之为油脂腺)，点内含有独特精油，在被触碰的时候，会释放类似柠檬的气味。

柠檬马鞭草常被用到的部位是叶片，而常见的马鞭草—甜舌草，其地上部分(茎、茎尖、花和叶)皆可用。鉴于两者在当代语言中经常被混淆，《欧洲药典》中出现了两篇独立的章节，以供区分，分别提到柠檬马鞭草叶片(《欧洲药典》第1834章，柠檬马鞭草叶片章节)，或常用马鞭草(vervain)草本植物(《欧洲药典》第1854章，Verbena officinalisherba章节)。此外，根据《欧洲药典》第1834章，柠檬马鞭草叶片中一种分析出的称之阿克苷(acteoside)的铅化合物，在文献中有一个同义名——毛蕊花苷(verbascoside)，这就让两者的区分难上加难。

DE 10 2011 078 432 A1中描述了从多种植物中提取的精油及其成分在治疗多动症中的应用。此外，在第[0014]段中，马鞭草被正确地翻译为“马鞭草(Verbenaofficinalis)”，但是，在[0036]、[0046]和[0049]段中，常见马鞭草被错误地翻译为Lippiacitriodora Kunze。在实施例中，不再使用植物学名称，但权利要求中改用马鞭草(Verbenaofficinalis)。这展示了在处理这些定义时不准确的一个例子。

在传统上，柠檬马鞭草新鲜叶片或干燥叶片被用作香料添加剂和药用植物。提到的治疗应用包括以下性质：抗氧化、催乳、镇痛、抗菌、解热、肌肉松弛剂和利尿。据说这一系列活性物质源自于精油的组分和黄酮类化合物。一直以来，《欧洲药典》在干燥全叶的质量标准中规范了柠檬马鞭草叶片中精油含量的最小值为3ml/kg，阿克苷含量的最小值为2.5％以及DC指纹图谱存在黄酮类化合物。

虽然精油经常被说成是一组活性成分，但对于精油中特定成分的特征色谱分析并没有结合它们的效果进行精确描述。因此，柠檬马鞭草的精油成分被用于芳香疗法。在治疗神经性躁动和压力相关的疲劳时，特别是作为茶品口服时，它们可以作为缓解入睡困难或轻微消化不良的药物。

Wannmacher等人检验了柠檬马鞭草茶配方中假设的镇静和抗焦虑作用，但是,在对40名健康受试者的随机双盲平行对照实验中，没有发现任何显著效果(Wannmacher L.等人，“用于治疗焦虑和失眠的植物：II.柠檬马鞭草饮品对正常志愿者实验性焦虑的影响”；《植物疗法(Fitoterapia)》1990；61:449-453)。因此，一种含有低比例精油的简单水性液体提取物并不足以显示其对中枢神经系统(CNS)有重要影响。

一种名为“Planox L”的柠檬马鞭草水提取液被描述为具有抗老效果。据说这是基于对上皮细胞的抗氧化和抗炎特性，这些上皮细胞主要在皮肤和肠道部位。

CN107397011(A)描述了一种由九种不同植物混合而成的中草药茶，具有提神效果。这种中草药茶是一种水提取液。所述的描述为马鞭草的成分指的是常见的马鞭草，不是柠檬马鞭草。

CN102309622(B)涉及了马鞭草中用于脑缺血的个别糖苷类。从第[0007]段可知，所述植物为常见的马鞭草(Verbena officinalis)。

Erping Xu等人在《沙特制药杂志(Saudi Pharmaceutical Journal)》25(2017)660-665中，描述了不同植物成分在脑缺血中的试验，其中也试验了马鞭草总糖苷制剂。这些混合物的组成物质尚不清楚。这些糖苷来自“马鞭草(verbena)”，即英语中的常见的马鞭草(vervain)，而不是柠檬马鞭草(lemon verbena)

Carpinella等人在《植物治疗研究(Phytotherapy Research)》24(2010)，259-263中，描述了73种不同植物的纯乙醇提取物，这些提取物随后被分离为水部分和有机部分。所应用的测量体系是“乙酰胆碱酯酶抑制”，被用来筛查阿尔茨海默症等疾病。

DE 10 2007 052 223 A1涉及马鞭草(Verbena officinalis L.)提取物，即常见马鞭草(vervain)；见第[0002]段。

WO 2005/058338 A1涉及柠檬马鞭草提取物。对于其所获得的提取物，并未描述去除精油。

对于通过水性途径、经冻干制备的和不含精油的提取物，Ragone等人还假设了一种通过GABA

Veisi等人的研究证实了这一点，他们还通过水性途径加热干燥，制备了干提取物，并口服施用于大鼠。因此，在高架十字迷宫实验中，对于按每千克体重10mg提取物剂量给药的大鼠，并没有发现提取物的抗焦虑作用(Veisi M,Shahidi S,Komaki A,Sarihi A.:“柠檬马鞭草的水提取物对大鼠焦虑样行为的评估”，《药学阴性结果杂志(J PharmNegative Results)》2015；6:37-9)，但却发现其促焦虑作用(“焦虑样行为”)。

Ceuterick等人探究评估了在伦敦生活的哥伦比亚人的民族药用植物的用途，包括柠檬马鞭草在抗焦虑、镇静和抗抑郁方面的应用(Ceuterick M.，Vandebroek I.，TorryB.，Pieroni A.：“城市民族植物学中的跨文化适应：伦敦的哥伦比亚人药典”，《民族药物学杂志(Journal of Ethnopharmacology)》120(2008)342–359)。在物质方面，总是描述用新鲜或干燥叶片制备的茶，因而是纯的水提取物。迄今为止，尚未描述过，在改变生产方法(例如，提取剂)的情况下，对柠檬马鞭草叶提取物成分范围的影响，以及与影响中枢神经系统的性能的相关性。此外，对于影响CNS的性能的相关成分，没有进一步的分析提示。

没有文献描述过，通过水性乙醇制备的柠檬马鞭草提取物的作用，该提取物基本上不含精油。

本发明的目的在于进一步提供柠檬马鞭草的应用场景。该目的是通过柠檬马鞭草(Aloysia citriodora)叶提取物在治疗和预防神经或脑源性疾病中用途而实现的。

本发明描述了柠檬马鞭草(Aloysia citriodora)叶提取物的标准化制备及其通过影响神经递质而产生的特定CNS介导的临床应用场景的相关作用。因此，之前的应用领域可以被拓展到包括以下范围：注意缺陷障碍的适应症，和/或认知能力的提高(在阿尔茨海默病初期阶段)。

注意缺陷多动障碍(ADHD)是一种精神障碍，发病于儿童时期，以注意力和冲动问题为特征，常伴有多动症。在欧洲，有多达10％的儿童表现出了ADHD的症状(男孩的发生率显著高于女孩)。这些症状可能伴随他们到成年时期，只是症状程度不一。在患ADHD的青少年中，ADHD会伴随其中30％到70％的青少年进入成年阶段(终生性)。

在成年时期，多动症变化成另一种特征，其影响是增加内心的不安。ADHD患者通常也会表现出许多其他精神障碍，例如，抑郁、焦虑、自我认知障碍、自尊障碍和社交恐惧。现有数据表明，ADHD是一种多因素引发的并具有遗传倾向的疾病状态，其中遗传倾向会导致易于发病。

在神经生物学上，ADHD通常被解释为纹状体前额功能障碍。受影响的大脑(更确切地说是额叶)的区域，是对动机、认知(信息转换)、情绪和运动行为进行调节的区域，或者协调它们相互作用的区域。除了额叶，所谓的纹状体区域(大脑基底神经节的一部分)也受到了影响，因此医生也称之为纹状体前额功能障碍。

2009年至2014年间，德国的患病率估值佐证了ADHD的诊断频率的提高，0至17岁患者的诊断率从5.0％增加到6.1％，18至69岁患者的诊断率从0.2％增加到0.4％。它是儿童和青少年最普遍的慢性疾病之一。相较而言，男孩的ADHD患病率高于女孩，儿童的患病率高于青少年。9岁左右的男孩患病率最高，达13.9％(Bachmann CJ，Philipsen A，Hoffmann F：德国的ADHD：诊断和药物治疗趋势—2009-2014年儿童、青少年和成人注意力缺陷/多动症(ADHD)的健康保险数据的全国性分析。Dtsch

尽管对诊断为ADHD的成年人的药物处方率是增多的(处方最多的药物是哌甲酯(methylphenidate)，其次是阿托莫西汀(atomoxetine)和甲磺酸利地美(lisdexamfetamine))，但是儿童和青少年的处方率是降低的。对替代药物的需求非常大。

对于ADHD治疗，主要采用的药物是影响大脑多巴胺代谢的兴奋剂。这其中包括约从上世纪中叶开始使用的哌甲酯和安非他明衍生物(DL-安非他明)。这类治疗对约三分之二的ADHD患者有疗效。此外，影响多巴胺或去甲肾上腺素代谢的抗抑郁药物也可用于治疗ADHD。

ADHD的一个成因是大脑信号处理异常。这种异常源自于神经递质去甲肾上腺素和多巴胺的缺乏或有效性下降。例如，注意力由去甲肾上腺素控制，动机通过多巴胺控制。相应地，信号处理受干扰的后果是，受影响的人很难一次专注于一件事，也很难根据外部刺激因素的重要性和非重要性来过滤外部刺激因素，即容易分心和过度刺激。此外，还证明了神经递质5-羟色胺参与ADHD。5-羟色胺控制冲动性，因此，当处于生病状态时，患者的冲动性增加，挫折容忍度低，对各自环境的行为适应差。

哌甲酯是目前治疗ADHD最常用的药物，它能抑制突触前多巴胺和去甲肾上腺素的再吸收，从而提高突触间隙中多巴胺和去甲肾上腺素的浓度。这导致受体上的信号密度增加，尤其是交感神经兴奋性增加。因此，能够抑制去甲肾上腺素和多巴胺(包括少量5-羟色胺)选择性再吸收的物质，有望成为治疗ADHD的候选药物。然而，这类活性物质也广泛存在潜在副作用。已知以下常见副作用：鼻咽炎、食欲减退、体重和体形的中度减轻(在儿童中广泛存在)、精神失衡、焦虑、抑郁、易怒、心律失常等。

临床经验表明，哌甲酯能改善精神病儿童的行为和思维障碍症状。不建议用于治疗6岁以下的儿童。副作用多见于长期服药。长期用药不当甚至可能导致哌甲酯失效(产生耐药性)，并产生心理依赖。

认知能力(信息转化)是纹状体前额功能障碍的一个测量标准。尽管“认知”在应用中有多重意思，但“认知”表示一种综合思考能力。虽然人类的许多认知过程是在有意识的情况下进行的，但“认知”和“意识”的含义并不相同。人类的某些过程可能是无意识的，但却是有认知的。无意识学习就是一个示例。人类的认知能力包括，例如，注意力、记忆力、学习力、创造力、计划力、方向感、想象力、论证、自我观察、意愿、信念等等。可以通过不同的学科来检验认知能力，如精神病学、心理学、哲学和神经科学。

因此，认知能力是一个复杂的过程，可以通过有大脑活动的可测量参数进行量化。学习能力包括记忆力(记忆输入的持续时间和数量)，以及对反应能力、执行逻辑运算的能力(快速和正确)、或空间思维能力的影响，例如，在全新和改变的条件下的确定方位。这种认知功能的障碍通过轻度认知障碍(MCI)的症状进行描述。MCI代表了与年龄相关的认知功能和能力衰退的一种特定病症。在健康人中，MCI的检测可认为是晚期痴呆的一个预先指标。

令人惊讶的是，现已发现柠檬马鞭草叶提取物对去甲肾上腺素和多巴胺的再吸收具有高度抑制作用，并对大鼠大脑皮层突触体中的5-羟色胺具有抑制作用。此外，体外实验结果发现的ADHD适用性，在线虫体内实验、小鼠脑电图记录以及小鼠行为学模型(Morris水迷宫)实验中得到了证实。

这是一个新的发现，特别地，通过口服柠檬马鞭草的水醇提取物，认知领域得到了有利的支持。

研究还发现，定期摄入柠檬马鞭草提取物，如饮用速溶配方，对ADHD患者具有显著的治疗效果。

因此，本发明提供一种柠檬马鞭草(或其同义名称)的叶提取物在治疗ADHD和/或认知和/或轻度认知损伤和/或与压力相关的疲劳状况/应激障碍的中的用途。

根据本发明可以被治疗或预防的疾病包括：躯体形式疾病(倦怠综合征)、急性和创伤后应激障碍、慢性疲劳综合征；神经性躁动(精神压力)、焦虑和抑郁等神经性障碍的症状、和压力症状，如疲倦和虚弱。

优选地，所述神经元疾病不是与蛋白质/肽累积相关的神经退行性疾病，尤其不是阿尔茨海默症或帕金森症。

本发明提供了一种柠檬马鞭草(或其同义名称)叶提取物在制备治疗ADHD的药物的用途。

本发明提供了一种柠檬马鞭草(或其同义名称)叶提取物在制备一种改善认知能力和/或轻度认知损伤的治疗剂的用途。

本发明还提供了一种柠檬马鞭草(或其同义名称)叶提取物在制备一种治疗神经性躁动(精神压力)的治疗剂的用途。

在下文中，通过优选实施例和单独实施例来解释本发明，这些单独实施例也涉及优选实施例。在本发明所述的优选的用途中，符合《欧洲药典》质量标准的干燥和切割的柠檬马鞭草叶片被用于上述目的。在本发明的进一步优选实施例中，采用欧洲药典的干燥柠檬马鞭草叶制备的提取物。或者，也可以同时使用柠檬马鞭草叶片和叶提取物。

例如，当使用柠檬马鞭草的叶提取物时，所述柠檬马鞭草叶提取物是醇-水提取物。在这种情况下，“醇”选自所有可与水混溶的低级(C1到C4)醇。

优选溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、及其混合溶剂，优选乙醇。制备柠檬马鞭草叶提取物所用的醇-水混合物的体积比的选择范围很大。优选地，体积比(％)为99:1至1:99，更优选地，体积比(％)为70:30至30:7％，最优选地，体积比(％)为55:45至45:55(根据提取溶剂中的醇水比)。优选比例包括从10:90到70:30、或从10:90到60:40、或从20:80到70:30、或从20:80到60:40，分别以体积百分比和醇水比表示。

优选地，使用乙醇和水的混合物作为提取剂，其中特别合适的混合体积百分比为从70:30到30:70、特别地，从60:40到40:60、或从55:45到45:55。在另一实施例中，特别合适的提取剂包括体积含量为从10:90到30:90％的水的混合物。优选地，比例包括从10:90至70:30、或10:90至60:40、或20:80至70:30、或20:80至60:40，分别以体积百分比和醇水比表示。所有体积百分比的数值均在21℃下获得。

然而，其它混合物，例如水与有机溶剂(例如酮或有机酸)的混合物，也可以用作提取剂。所选有机溶剂的特点是，在提取步骤之后，它们通过蒸馏、升华或冷冻从浓缩提取物中去除。

在本发明的另一优选例中，通过上述示例性提取物制备的提取物并不作为提取物使用，而是作为初级提取物进行进一步纯化。这种处理步骤可以如下：

-在细胞组分存在下对水性提取物进行酶处理；

-通过蒸馏法(优选共沸蒸馏)，去除精油组分和挥发性有机成分；

-通过采用脂肪烃的液-液纯化法，去除精油组分和亲脂性成分，如植物树脂和叶绿素；

-通过液-液萃取法，用正丁醇或乙酸乙酯富集极性的有价值的组分；

-通过液-固萃取法，在固相(如有机吸附聚合物)上富集极性的有价值的组分。

所述纯化步骤的操作和从所述初级提取物中回收的提取物组分，可由本领域技术人员以任何已知的方式实现，因此，在这里不需要深入解释。

此外，在本发明的其他优选实施例中，柠檬马鞭草叶片的提取物和/或从此类提取物中获得的组分，可单独使用，或与其他组分联合使用。类似地，在本发明的其他优选实施例中，柠檬马鞭草叶片的提取物和/或从此类提取物中获得的组分，被单独使用，或与其他组分联合使用，与化学合成物质联合使用，例如，非选择性单胺再吸收抑制剂(NSMRIs)、选择性5-羟色胺再吸收抑制剂(SSRIs)、选择性去甲肾上腺素再吸收抑制剂(NARIs)、5-羟色胺-去甲肾上腺素再吸收抑制剂(SNRIs)、多巴胺再吸收抑制剂(DRIs)、选择性去甲肾上腺素-多巴胺再吸收抑制剂(NDRIs)或MAO抑制剂。

如上所述，基于实施例的本发明的用途，可以以药物制剂的形式使用。因此，它可以采用本领域技术人员已知的常规剂型，包括一定浓度的柠檬马鞭草提取物，其形式能够以常规药物剂型给药。本领域技术人员知晓，剂型取决于给药途径(口服、静脉注射、肌肉注射、鼻腔)，可以是固体、半固体、液体、喷雾、气态或是所需给药途径允许的任何其他形式。此外，上述任一剂型的本发明的用途，还可用作食品补充剂。

下述优选实施例的示例解释本发明。

图1示出了黄酮类物质(黄色)和CQA化合物(浅蓝色)的薄层指纹图谱比较，以柠檬马鞭草提取物组分和50％v/v EtOH初级提取物为例。应用相同的提取物天然组分。

图2a示出了活体的Morris水迷宫行为学测试。

图2b示出了Morris水迷宫行为学测试的测试设置。

图2c示出了柠檬马鞭草提取物(20％v/v和50％v/v EtOH)对认知测试模型中小鼠记忆能力的影响(n＝6)。

图3a示出了远程立体的活体脑电图测量结果；n＝7只大鼠，使用本发明的柠檬马鞭草提取物(50％v/v EtOH)；150mg/kg体重，中枢神经系统快速活动65min。

图3b示出了对照组大鼠的远程立体的活体脑电图测量结果；对大鼠按1ml/kg体重施用水。

图3c示出了使用本发明的柠檬马鞭草提取物(50％v/v EtOH)(UB2010-98批次)，对比使用合成活性物质和《欧洲药典》级别的银杏提取物的，在健康大鼠(n＝8)上的远程立体的活体脑电图测量结果。

柠檬马鞭草叶提取物的制备与表征

实施例1：水提取

将1500g柠檬马鞭草的叶与15L渗透水，在80℃下，混合2次，在不时搅动(搅拌浸渍)情况下提取8h。将混合物放置过夜冷却。将洗脱液与提取的原料分开，并通过纤维素过滤器过滤干净，得到滤液。将滤液在板式蒸发器上蒸发，形成粘稠的提取物。加入水后，将蒸发过程重复两次，除去所有的挥发性成分。向622g提取物(经蒸发后，固含量为71.4％)中，加入190g干的添加剂麦芽糊精。将该70％天然提取物制剂经喷雾干燥，形成米色粉末(喷头温度：185℃，喷雾塔的出口温度：105℃)。得到的提取物制剂是米色粉末，其表征如下：精油含量<0.01％，黄酮类含量0.06％，毛蕊花糖苷含量1.8％。

实施例2：20％乙醇/水(vol/vol)提取

在50℃下，将1700g柠檬马鞭草的叶片与10L的20％(v/v)乙醇混合两次，渗滤8h(搅拌提取)。将混合物与被提取的原料分开，并通过40μm纤维素过滤器过滤干净，得到滤液。通过Sambay式蒸发器，去除滤液中的乙醇，并蒸发形成均匀的粘稠提取物。通过反复加水并在减压下再次蒸发，去除提取物的挥发性成分。向611g提取物(经蒸发后，固含量为69.5％)，加入182g干的添加剂。这种70％的天然提取物制剂包含28％的麦芽糊精和2％的Aerosil(气相二氧化硅)，并于45℃的真空干燥箱中干燥。随后，将提取物置于筛孔为0.315mm的筛磨机中研磨，形成均匀的米褐色粉末。得到的提取物制剂的表征如下：精油含量<0.01％，黄酮类含量0.06％，毛蕊花糖苷含量4.3％。

实施例3：50％乙醇/水(vol/vol)提取

在50℃下，将1700g柠檬马鞭草的叶片与10L50％(v/v)乙醇混合两次，渗滤8h(搅拌提取)。将混合物与被提取的原料分开，并通过40μm纤维素过滤器过滤干净，得到滤液。滤液在板式蒸发器上预蒸发，最终在45℃真空旋转蒸发器上蒸发，形成无溶剂的粘稠提取物。加水后，将蒸发步骤重复两次，去除提取物中所有挥发性组分。向750g提取物(经蒸发后，固含量为64.3％)，加入206g干的添加剂。这种70％的天然提取物制剂包含28％的麦芽糊精和2％的Aerosil(气相二氧化硅)，并于45℃的真空干燥箱中干燥。随后，将提取物置于筛孔为0.315mm的筛磨机中研磨，形成均匀的褐色粉末。得到的提取物制剂的表征如下：精油含量<0.01％，黄酮类含量0.51％，毛蕊花糖苷含量11.6％。

实施例4：96％vol乙醇提取

在室温20℃下，将1500g柠檬马鞭草的叶片与15L的96％(v/v)乙醇混合两次，在不时搅动(搅拌浸渍)下，提取8h。将混合物与无水的经提取的药材分开，并通过40μm纤维素过滤器过滤干净，得到滤液。将澄清的绿色滤液在平板蒸发器上蒸发，形成粘稠提取物。加水后，重复蒸发步骤两次，去除所有挥发性成分。向190g提取物(经蒸发后，固含量为65.8％)，加入54g干的添加剂。这种70％的天然提取物制剂中包含20％的麦芽糊精和10％的Aerosil(气相二氧化硅)。为了结合和干燥因亲酯性提取剂所导致增加的叶绿素组分，这种提高的二氧化硅含量是必要的。最终，将材料置于45℃的真空干燥箱中干燥，并在球磨机中研磨形成粉末。得到的提取物制剂呈绿褐色粉末状，其表征如下：精油含量<0.01％，黄酮类含量1.7％，毛蕊花糖苷含量19.6％。

提取物的表征

表1提取物的表征

药提比表示浓度因子，从算术上讲，它是天然提取物质的收率的倒数。

所有对比的混合物均取自于同一批次的柠檬马鞭草叶，该批次柠檬马鞭草达到《欧洲药典》的级别(精油含量:0.5％；阿克苷含量:5.6％)。无论制备方法有何不同，最终都将得到不含精油的提取物制剂，这些制剂具有不同的溶液性质、外观和不同含量的极性成分，例如黄酮类或毛蕊花糖苷(苯乙醇糖苷)。类似《欧洲药典》中白桦树叶的检测方法，以金丝桃苷为参照物，通过紫外分光光度法，群组检测确定黄酮类物质。毛蕊花糖苷与阿克苷同义，用类似于《欧洲药典》第1834章的测定柠檬马鞭草的阿克苷HPLC法，检测确定毛蕊花糖苷。

实施例5：测定柠檬马鞭草叶提取物对神经递质去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺影响的性质

根据Perovic和Mül ler法[Perovic S，MüLeller WE，1995年，Arzneimittelforschung 45；1145-1148]，使用获得新鲜分离得到的小鼠突触体进行多巴胺再吸收实验、5-羟色胺再吸收实验和去甲肾上腺素再吸收实验。分别用[

对于提取物对ADHD的适用性的初次筛选，Sommer等人(Sommer等人:“一种草药与哌甲酯的比较：一种未来治疗多动症的替代方法？”(Ein pflanzl iches Arzneimittel imVergleich zu Methylphenidat:Ein alternativer Weg in der zukünftigenBehandlung von ADHS？),2017年9月在德国Münster的GPT植物大会的GPT项目,植物治疗杂志(Zeitschrift fürPhytotherapie)出版物S 01·第38册·DOI:10.1055/S-007-34868))建议了一个再吸收抑制平均值，对于多巴胺或去甲肾上腺素，再吸收抑制平均值<50μg/ml，对于复方治疗，再吸收抑制平均值设为约为20μg/ml，则是有效的。Markowitz等人发现，针对5-羟色胺的效果显著更弱，同时肯定了针对去甲肾上腺素和多巴胺的效果(Moskowitz等人:体外筛选d，l-，dl-右哌甲酯，《青少年精神药理学杂志(Journal of child andadolescent Psychopharmacology)》16,2006,687–698)。

表2柠檬马鞭草叶提取物相对于哌甲酯对神经递质再吸收的抑制作用

令人惊讶地是，所有测试的4种柠檬马鞭草提取物在抑制三种神经递质的再吸收方面均有巨大潜力。其中，对去甲肾上腺素再吸收的抑制作用最高，所有的4种提取物都展现出了非常强大的再吸收抑制作用，再吸收量小于25μg/ml。此外，所有的4种提取物对多巴胺的再吸收抑制作用与多巴胺的剂量相关。三种水乙醇提取物展现了良好的IC

此外，若上述结果与浓度因子(天然的DER值)和提取物的草药性有关，采用中等极性提取物，可获得优选范围，例如提取物2或3。此处，与纯水提取剂相比，药理学特性有了极大地提升，而富集作用几乎相同，草药性相似。如果将其与具有96％v/v乙醇的高度亲油提取剂的提取物4相比，则提取物4的富集度比提取物2高出3倍，DER为12:1。如果将针对三种神经递质的IC

数据对比表明，,假设提取率相同(DER＝4:1)，纯乙醇亲脂性提取物(提取物4)中包含起始物料的有效成分，其含量与中等极性水醇提取物(提取物2)相当。鉴于5-10％相对增益误差，针对三种神经递质的效果是几乎相同的。

即使考虑到更高提取价值(提高材料利用率是必要的：12倍对比4倍)的经济效益，这也算不上优势。此外，提取物4的草药性，包括品相(绿褐色)，处理方式(吸湿性的干提取物)和溶解性(在水媒介中几乎不溶)，比提取物2和3的更差。这是由叶片中角质层蜡和叶绿素组分的转移引起的，而96％v/v的乙醇促进了这种转移。通过使用最大为50％或60％(v/v)的乙醇，可以避免这些问题。

进一步纯化

在生产工艺中，将50％v/v乙醇提取的初提物进一步分离为强亲脂组分、非极性亲水组分和极性亲水组分。用已知的分离技术获得6种亚组分，例如，液-液分离，液-固相分离，乙醇再沉淀(重结晶)。通过薄层色谱法(见图1)对其回收率(＝富集因子)、典型组分及其指纹图谱进行了测量。

实施例6：液-液提取

用类似于实施例3的方法，从50％v/v的乙醇中提取得到初级提取物，将初级提取物重新溶解在去矿质的水中至10％干物质，并不断搅拌。然后，分别加入三分之一初级提取物体积的正丁醇，然后剧烈搅拌。随后，在分液漏斗中进行相分离。将合并的三个正丁醇相置于真空旋转蒸发器上蒸发，直至没有溶剂。随后，将含有70％天然物和30％干的添加剂(28％麦芽糊精和2％二氧化硅)的提取相置于45℃的真空干燥箱中进行干燥，然后研磨成均匀的粉末。类似地，剩余的水相被进行处理和干燥，形成70％天然提取物粉末。

实施例7：乙醇再沉淀

用类似实施例3的方法，将从50％v/v的乙醇中提取得到初级提取物，分批加入到96％v/v乙醇中，直到出现10％重量比的不溶的干物质。搅拌60min后，将溶液置于6℃的凉爽环境下，静置24h。亲水物质沉淀析出。

将上层乙醇相分离倒出后，在沉淀物中加水。将混合物置于真空旋转蒸发器上蒸发，直至不含溶剂。随后，将含有70％天然物和30％干的添加剂(28％麦芽糊精和2％二氧化硅)的提取相置于45℃的真空干燥箱中进行干燥，然后研磨成均匀的粉末。将乙醇上清液置于旋转蒸发器上真空蒸发，直到没有溶剂，并且也干燥，形成70％天然提取物粉末。

实施例8：液-固分布

用类似于实施例3的方法，用50％v/v乙醇获得初始提取物，将初始提取物重新溶解于去矿质的水中至含10％干物质，搅拌30min。将溶液置于凉爽的位置，过夜12h。少量提取物以不溶固体形式析出，并通过折纸漏器过滤掉。将澄清洗脱液置于装有XAD-7HP型吸附剂的玻璃柱中。所添加的不溶天然提取物的样品量为干吸附剂重量的25％。吸附剂的选择性很强，它能结合黄酮类、酚类等极性的中等大小的物质，并能让糖、盐和氨基酸等小分子通过。吸附剂的过滤效果是将物质保留在吸附剂内部。然后通过两倍床体积的96％v/v的乙醇洗脱。所获得的乙醇洗脱液通过真空旋转蒸发器蒸发，直至不含溶剂。随后，将含有70％天然物和30％干的添加剂(28％麦芽糊精和2％二氧化硅)的提取相置于45℃的真空干燥箱中干燥，然后研磨成均匀的粉末。同样，将之前收集的(从吸附剂流过)的水相，被处理和干燥，形成干提取物粉末(含70％天然物和30％干的添加剂)。

表3柠檬马鞭草的6种提取物组分的提取物表征

表4：柠檬马鞭草的叶提取组分相比于50％v/v乙醇初提取物对神经递质再吸收的抑制作用

同时考虑到与组分相关的分析数据，分馏结果表明，中极性至极性亲脂性物质的富集可以增强活性效应。随着黄酮类物质、咖啡酰奎宁酸(CQA化合物)和毛蕊花糖苷的富集，对测试的三种神经递质的再吸收抑制作用均增强。

提取物9和提取物10的作用尤其显著，这是吸附树脂分离的结果。吸附剂选择性地将目标物质从水相(提取物9号)中分离出来，相比于初级提取物对5-羟色胺和多巴胺的影响，其活性明显降低。去甲肾上腺素受影响的程度大致相同，这一事实也表明，决定活性的是整体的提取物，而不仅仅是单个的标记物质/物质组。因此，仅就生产技术而言，来自吸附剂的乙醇提取相(提取物10)可实现3.2倍的浓缩因子(分馏为12.9倍，初级萃取物为4.0倍)。对神经递质的整体影响精确地提高了大约这个数量级。

以提取物8和9(乙醇再沉淀)为例，分馏也表明，如果相对的数量分布各为50％，且富集程度没有差异，药理活性也大致相等。同样，尽管一些分析标记物(黄酮类，毛蕊花糖苷)的分布不同，但却发现这种分布导致了这些效果，它们无疑是专一活性物质。这完全取决于提取方法。同样，相比于初级提取物，这一实施例再一次证实，柠檬马鞭草提取物能够影响所测试的三种神经递质。

对于目前可获得的阳性体外数据，提出的问题是它们能在体内实现到何种程度。线虫(Caenorhabditis elegans)是一种生物和遗传发展研究中的主要模型生物。对此，一个很重要的原因是，尽管这种线虫只有差不多1000个体细胞，但它有20000多个基因(人类的基因数约40000个)，其很多基因具有与哺乳动物类似的功能。该线虫基因组编码的近半数蛋白与智人属于同系物，其中包括多种已知的人类疾病基因。因此，在代谢、靶向基因表达和神经元行为方面，线虫是一种典型的模型生物。线虫的整个神经系统包括约300个神经元，由两个独立的部分组成，一个较大的躯体神经系统和一个较小的咽部神经系统。线虫体内的神经递质有乙酰胆碱、谷氨酸、GABA(γ-氨基丁酸)和生物胺，如5-羟色胺和多巴胺。

线虫生活在温和气候区的土壤中，以细菌为食。其体长约为1mm，表皮透明。线虫寿命短，约15-20天(取决于温度和食量)。可将大肠杆菌作为饲料放在琼脂平板上，线虫可以很好地进行培养。根据问题的不同，可以选择性地应用转基因线虫，并用荧光测量直接检测具有特定物质的转化产物，或通过行为测试进行检测。

实施例9：6-OHDA诱导的变性对多巴胺能神经元的保护作用：

6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤多巴胺能神经元，这在不同的动物模型中均有使用。转基因线虫BZ555株在多巴胺能神经元中表达绿色荧光蛋白。因此，6-OHDA诱导的神经退行性变化或其减少，可通过荧光显微镜定量。将线虫暴露在50mM的6-OHDA溶液中，其荧光强度因神经元的退化而降低。安非他酮是一种选择性去甲肾上腺素和多巴胺再吸收抑制剂(NDRI)，将其用作阳性对照物。通过抑制去甲肾上腺素(NA)或多巴胺(DA)转运体(再吸收)，安非他酮阻止神经毒素6-OHDA进入以及损伤神经元。相比于阴性对照组，用600μg/ml实施例3制备的50％乙醇的柠檬马鞭草提取物处理后，荧光强度提高了20％(保护功能)。

表5柠檬马鞭草提取物对6-OHDA引导的线虫退化的影响

6-OHDA诱导神经元损伤动物模型是一种公认的ADHD实验模型(Kostrzewa RM等人:ADHD的药理学模型；《神经传导杂志(J Neural Transm)》(Vienna)2008；115:287-98)。线虫模型中的阳性对照组证实了这一点。本发明所述的柠檬马鞭草提取物，与阳性对照组相似，已被报道能够抑制NA和DA的再吸收(见上述实施例5)。本发明所述的柠檬马鞭草提取物能够起到相当于阳性对照组1/3效力的保护作用。

实施例10：对线虫模型中β-淀粉样蛋白诱导的毒性的影响

为了测试柠檬马鞭草提取物对β-淀粉样蛋白的毒性的影响，应用了能够表达人β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)转基因线虫CL4176株。Aβ的表达能够通过升温来进行诱导。将处理过的同龄线虫在16℃中孵育48h。待温度升至25℃后，孵育24h，线虫因为Aβ-低聚物的毒性开始瘫痪。每两小时评估一次线虫的瘫痪状态(实验设置参考Heiner等人:线虫神经退化疾病模型中，毒马草属希腊山茶(Sideritis scardica)提取物抑制α-突触核蛋白和β-淀粉样蛋白肽聚集。《药用植物(Planta Medica)》81–PW_127,2015)。能够抵消β-淀粉样蛋白毒性作用的物质延缓了动物的瘫痪。这种物质延迟了老年痴呆症中的神经退化。中位数(PT50)是指正好50％的线虫瘫痪的时间，用作比较值。

表6柠檬马鞭草提取物(50％v/v乙醇)对β-淀粉样蛋白引发的毒性的影响

用柠檬马鞭草叶提取物(50％v/v乙醇)能够延缓β-淀粉样蛋白引发的麻痹1.5h。阿克苷作为提取物中一种单独的物质，能够有效的产生保护作用(+1.8h)。据报道，一种毒马草属希腊山茶(Sideritis scardica)(50％乙醇)的植物提取物可适合用于ADHD(EP 2229 950B1)，在同样的模型进行了测试，并作为阳性对照，展现了很显著的效果(+3.5h)。

实施例11：对β-淀粉样蛋白引发的神经元功能障碍的影响

β-淀粉样蛋白类物质能够损伤神经元，引发神经元控制行为的功能障碍。转基因线虫CL2355株，以泛神经元水平表达β-淀粉样蛋白。这会导致认知障碍，如向引诱剂(苯甲醛)移动的趋化运动衰退。在实验中，测量了趋化指数，该趋化指数是指在琼脂平板上向引诱剂移动的线虫的比例。对照组的CL2122株不会表达β-淀粉样蛋白，因而没有行为障碍；其趋化指数较高。实验方法与Heiner等人的方法一致。

表7柠檬马鞭草提取物对神经功能障碍的影响

本发明的柠檬马鞭草叶提取物(50％v/v乙醇)进行处理，显示了一个显著增加了2.3倍的趋化指数。与未处理的CL2355株测试组相比，效果改善了46％。这是因为β-淀粉样蛋白引发的神经元退化减少，而神经元对认知能力非常重要。阿克苷作为提取物中一种单独的物质，明显参与了神经保护作用(约达到CL2122株对照组趋化指数的88％)。

实施例12：在Morris水迷宫(MWM)中的行为测试

在Morris水迷宫动物模型中，认知能力的提升是显而易见的，尤其是当处于压力存在的环境时，学习能力的大提升，尤其是保持力。在一个装满泥水的圆形水池中，横向上有特殊标记，即外部线索，测试的动物(在本实施例中是小鼠)，经过几天的训练后，小鼠能够独立地寻找隐藏在水面下的救生台，并记住其空间位置。在距离水池边缘约30cm的位置，将小鼠放入水中，小鼠立即用游泳动作寻找救生台。相比于传统的简单迷宫动物实验，这一测试系统的优点在20世纪80年代初便为人所知，即，没有定点指示标记但有整体指示标记，而且由于动物的逃生行为，该任务还具有高动机因素。此实验主要是为了测试在压力状况下动物的(空间)学习能力(识别和记忆)，并测量其可能产生的影响。测量参数包括动物找到救生台的时间，移动到达救生台的距离以及在水池正确区域的相对停留时间。这些参数都受训练效果的影响。因此，到达的时间和路程通常会减小，在正确区域的停留时间会延长。训练的效果也会受神经递质浓度的影响[博士论文，Freiburg大学(2004),TheresaSchweizer:“3,4-二氨基吡啶诱导的大鼠脑切片神经递质释放：老年大鼠的皮层和海马研究，以及海马事件5-羟色胺损伤和海马中缝内移植大鼠的研究”(3,4-Diaminopyridinevozierte Freisetzung von Neurotransmittern aus Hirnschnitten von Ratten:Untersuchungen im Kortex und Hippocampus an alten Ratten,sowie an Ratten mitserotonergen

在这组测试中，一共测试了两个实验组，每组6只小鼠。第一组对照组包括转基因动物(AD-B6品系)，用水处理，这些动物因为其遗传倾向会在出生50天内展现了极强的β-淀粉样蛋白沉积，即它们会罹患阿兹海默症。另外两个对照组包括转基因动物(AD-B6品系)，这些动物从出生50天起就施用实施例2或实施例3中所述的柠檬马鞭草的提取物溶液。每只小鼠摄入的天然提取物的剂量都是400mg/kg体重。

当小鼠鼠龄达到95天时，通过Morris水迷宫实验对小鼠进行行为生物学试验(95-100天)。试验包括一个测试/学习单元，每天早晚学习，共四天。早上的学习是首先在没有救生台的情况下跑步30s，并记录小鼠在救生台通常摆放位置(目标象限)的停留时间。另外四轮跑步如下进行：在有隐藏救生台的情况下，每轮跑步试验中小鼠的出发位置不同。

分析的参数是小鼠到达救生台的时间(逃逸潜伏期)，如图2所示。结果表明，施用本发明的20％v/v乙醇提取的柠檬马鞭草提取物的小鼠，记忆能力有明显的提升。因此，逃逸潜伏期从第一天的相对值100％，改善到第二天的24.6％，和第三天的22.4％。50％v/v乙醇提取的亲脂性略强的柠檬马鞭草提取物，其实验效果随时间的延长而改善，并达到同等数量级。逃逸潜伏期从第一天的相对值100％，改善到第二天的42.0％，和第三天的19.1％。因此，施用柠檬马鞭草提取物的动物往往在第二天和第三天就能很快到达救生台，而在第四天，动物达到平台的速度则显著更快(p<0.05)。在第四天，此模型中，受治疗的动物的学习能力与健康动物的学习能力达到了同一水平；然而，与具有β-淀粉样斑块的转基因动物相比，它们展现了显著的差异。这些结果出乎意料地表明，柠檬马鞭草提取物能够提高认知能力。

实施例13:健康大鼠的脑电图特征

脑电图(基于希腊语，encephalon＝脑，graphein＝写)简称EEG，是一种通过记录电压变化来测量大脑总电活动的医学诊断程序。脑电图提供了一个图示脑电变化的标准化的神经学研究程序。在临床评估中，完成一次操作需要至少12个不同电极组合的通路。所得的数据由专业的专家研究，以确定特征图谱。一种广泛应用的分析脑电信号的数学方法是傅里叶变换为频域。通常，脑电图被划分为频带(所谓的脑电图带)，其中，带数和准确的划分被不同地具体展示。频带的划分及其限制，在历史上经过调整，并不总是与被认为有用的边界一致，这是基于更现代的研究。例如，θ带分成θ1间隔和θ2间隔区，以评估部分间隔的不同含义。特别地，对于长时间和睡眠脑电图，可用软件算法来进行辅助的或自动的评估，来再现模式识别。

但是，脑波不仅可以被测量，还可以被影响。其中，可如下实现：通过特殊的生物反馈—神经反馈，作为药理活性物质，例如精神药物的影响结果[Dimpfel W等人(1996)“功能地形脑电图的源密度分析：认知药物作用的监测”《欧洲医学研究杂志(Eur J Med Res)》1:283–290]。这种评估也被称为电药理图。在神经反馈中，通常将EEG带细分成比经典的EEG图更精细，以便更详细地解读。频率范围内振幅的增加与某些精神状态或活动有关。例如，θ2波与记忆和学习能力、注意力和/或创造力相关。同样地，经过广泛的校正，可以得出以下结论，神经递质介导的CNS活动，具体可以分为多巴胺能，5-羟色胺能，胆碱能或去甲肾上腺素能亚群。

每组7只Fischer-344大鼠，分别将4个半微电极植入到每只大鼠脑部的4个区域，“额叶”、“海马体”、“纹状体”和“网状结构(formatio reticularis)”。电位场的可测量变化，通过无线电进行传输并对其进行评估，给出一个电药理图。

用根据实施例3的柠檬马鞭草干提取物制剂处理动物，剂量当量为150mg/kg体重。为此，将各剂量的药物溶解在水中并给药一次。用水做对照实验。在45分钟的给药前观察阶段后，通过灌胃给动物口服试验液，然后动物留观5分钟。随后，展开长达5h的测量阶段。通过快速傅里叶变换(FFT)获得频带数据，取60min内的平均值。采用Wilcoxon-Mann-WhitneyU测试，对对照组(水)进行统计评价。

对实施例3得到的50％v/v乙醇的柠檬马鞭草提取物的检测，显示出在施药后1h内不同频带的数据有显著变化(见图3，EEG图)。具体地，θ，α1，α2和β1频带均受到影响，这表明去甲肾上腺素能、5-羟色胺能、多巴胺能和谷氨酰胺能系统均受到了影响。这种复杂的活动现象以前在对单胺氧化酶有抑制作用的药物中观察到过。例如，类似的电药理图可以参见吗氯贝胺(moclobemide)(一种被批准为抗抑郁药的单胺氧化酶抑制剂)和哌甲酯(一种多巴胺和去甲肾上腺素再吸收抑制剂，对5-羟色胺能受体5-HT1A和5-HT2B具有额外的激动活性，被批准用于治疗ADHD)。

这些结果表明，柠檬马鞭草提取物适合用于治疗ADHD。

在小鼠的血清中，没有发现应激激素皮质醇水平升高，这说明提取物可以预防或至少减轻测试造成的常见精神压力。

同样，可以观察到与银杏提取物(欧洲药典级别)相似的EEG图谱，这表明，柠檬马鞭草提取物具有能够改善认知能力的特性。

大鼠的EEG数据证实了神经递质结合研究的体外结果。总之，所有的临床前数据给出了清晰的证据，即柠檬马鞭草叶提取物可以用作CNS-活性提取物，优选地，用于改善认知能力或ADHD等应用领域。