具有反应性精氨酸的抗体化合物及相关的抗体药物缀合物

摘要

本发明提供了在疏水空隙中包含以精氨酸对反应性赖氨酸残基(Lys99)之替换(38C2_Arg)的抗体化合物。本发明还提供了包含与38C2_Arg变体抗体中经改造的精氨酸残基位点特异性缀合的载物部分的抗体药物缀合物化合物(ADC)。本发明中还提供了所述化合物的治疗性应用。

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请要求美国临时专利申请号62/744,339(2018年10月11日提交)的优先权权益。优先权申请的全部公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

背景技术

抗体药物缀合物(antibody drug conjugate，ADC)由通过接头与强效细胞毒性载荷连接的单克隆抗体组成。ADC的概念是靶向递送用于选择性(与全身作用(systemic)相反)化学治疗的高细胞毒性药物，导致针对恶性细胞的更高活性和对健康细胞和组织的更低毒性。随着食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准本妥昔单抗(brentuximab vedotin)

ADC领域正在朝均质ADC发展，理想情况下，其由具有确定药理学特性的单一分子物质组成。均质ADC是mAb、接头和药物的高度限定的组合物，并且通常具有2或4种DAR。在多个位点特异性缀合策略(包括改造半胱氨酸残基(例如，Junutula等.，Nat.Biotechnol.26：925，2008)、非天然氨基酸(例如，Axup等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109：16101，2012)和酶促结合(例如，Strop等.，Chem.Biol.20：161，2013))中，化学可编程抗体(h38C2)已被用于在一步缀合中产生位点特异性ADC，如Nanna等.，Nat.Commun.8：1112，2017中报道。h38C2是在疏水口袋底部的独特反应性赖氨酸处与1，3-二酮或β-内酰胺结合的人源化抗半抗原抗体。疏水口袋内衬的氨基酸残基包围反应性赖氨酸残基，并导致其pKa异常低，为6.3(Barbas等.，Science 278：2085，1997)。

然而，在本领域中仍需要以化学限定的方式更有效产生具有单个和多个载荷的ADC。本发明针对这一需求和其他未满足的需求。

发明内容

在一个方面中，本发明提供了包含催化性抗体38C2的变体(38C2_Arg)或其抗原结合片段的抗体化合物。相对于抗体38C2，38C2_Arg变体抗体在疏水空隙中包含以精氨酸对反应性赖氨酸残基(Lys99)的替换。在本发明的一些抗体化合物中，催化性抗体是人源化的38C2(h38C2)的变体。

在一些实施方案中，38C2_Arg变体抗体或其抗原结合片段包含分别在SEQ ID NO：1和2中示出的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。本发明的一些抗体化合物是双可变结构域(dual variable domain，DVD)抗体化合物或其抗原结合片段，其包含(i)38C2_Arg变体或其抗原结合片段，以及(ii)识别目的靶标的第二抗体可变结构域。在这些实施方案的一些中，38C2_Arg变体被定位成比第二可变结构域更靠近抗体化合物中的C端。这些DVD抗体化合物中的一些是在两个抗体臂中均包含Lys99Arg替换的同二聚体分子。一些其他本发明的这些DVD抗体化合物中的一些是仅在一个抗体臂中包含Lys99Arg替换的异二聚体分子。在一些实施方案中，DVD抗体化合物包含双特异性免疫球蛋白分子。本发明的一些DVD抗体化合物包含作为以下的双可变结构域(DVD)化合物抗原结合片段：Fab、Fab’、F(ab’)

在一些实施方案中，DVD抗体化合物包含嵌合免疫球蛋白序列或人源化免疫球蛋白序列。在一些DVD抗体化合物中，被第二抗体可变结构域识别的目的靶标是肿瘤细胞表面抗原。在这些实施方案的一些中，肿瘤细胞表面抗原可以是HER2、FOLR1、FCMR、CD138、CD79B、PSMA、BCMA、CD38、SLAMF7、Siglec-6、CD70、ROR1或ROR2。

在另一个方面中，本发明提供了抗体药物缀合物(ADC)，其包含通过抗体化合物中的反应性精氨酸残基与抗体化合物缀合的至少一个药物部分。在这些ADC中，抗体化合物包含催化性抗体38C2的变体(38C2_Arg)或其抗原结合片段，所述变体在疏水空隙中具有以精氨酸对反应性赖氨酸残基的替换。在一些实施方案中，ADC中的催化性抗体是人源化的38C2(h38C2)的变体。在本发明的一些ADC中，抗体化合物是包含以下的双可变结构域(DVD)化合物或其抗原结合片段：(i)38C2_Arg或其抗原结合片段，以及(ii)识别目的靶标的第二抗体可变结构域。在本发明的一些ADC中，药物部分通过接头部分与抗体化合物缀合。在这些实施方案的一些中，药物部分在与抗体化合物缀合之前用接头部分衍生化。本发明的一些ADC可利用可切割接头使药物部分衍生化。在一些具体实施方案中，所使用的接头可以是苯乙二醛(phenylglyoxal，PGO)、乙二醛(glyoxal，GO)或甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)。

在本发明的一些ADC中，DVD化合物或其抗原结合片段是在两个抗体臂中均包含Lys99Arg替换的同二聚体分子。在一些其他实施方案中，DVD化合物或其抗原结合片段是仅在一个抗体臂中包含Lys99Arg替换的异二聚体分子。在一些ADC中，所使用的抗体化合物是以下的双可变结构域(DVD)抗体化合物抗原结合片段：Fab、Fab’、F(ab’)

在本发明的一些ADC中，缀合的药物部分包含细胞毒性剂或siRNA。在这些实施方案的一些中，所使用的细胞毒性剂可以是选自以下中的一种：毒素、化学治疗剂、光吸收剂、抗生素、放射性同位素、经螯合的放射性同位素和溶核酶。在多个实施方案中，缀合的药物部分可包含奥瑞他汀、多拉司他汀、西马多丁、喜树碱、鹅膏蕈碱、美登木素生物碱、吡咯并苯并二氮杂

在本发明的一些ADC中，38C2_Arg或其抗原结合片段包含分别在SEQ ID NO：1和2中示出的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，并且目的靶标是HER2。在本发明的一些ADC中，抗体化合物是分别包含SEQ ID NO：5和7中所示的重链和轻链序列的DVD-Fab。在本发明的一些ADC中，抗体化合物是分别包含SEQ ID NO：6和7中所示的重链和轻链序列的DVD-IgG1。在一些实施方案中，ADC中的DVD-IgG1化合物是在两个抗体臂中均包含Lys99Arg替换的同二聚体分子。在一些其他实施方案中，DVD-IgG1是仅在一个抗体臂中包含Lys99Arg替换的异二聚体分子。在这些ADC中的一些中，两个不同的药物部分与异二聚体DVD-IgG1分子的两个抗体臂缀合。

在另一个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的本文中所述的抗体药物缀合物和任选地可药用载体。在另一个方面中，本发明提供了用于在对象中治疗癌症的方法。所述方法需要向需要治疗的对象施用本文中所公开的药物组合物。

通过参考说明书和权利要求书的其余部分，可实现对本发明的本质和优点的进一步理解。

附图说明

图1.Lys与Arg的共价缀合。(a)β-内酰胺-半抗原衍生物与mAbh38C2_Lys的反应性Lys残基的半抗原驱动的共价缀合。侧翼Cys和Thr残基的侧链分别显示为R

图2.h38C2_Arg Fab的晶体结构。(a)Fab形式的h38C2的Lys99Arg突变体的三维结构通过X射线晶体学在

图3.h38C2_ArgFab的晶体结构和pH缀合速率曲线。(a)h38C2_Arg Fab的晶体结构。h38C2_Arg Fab的表面渲染模型显示V

图4.基于h38C2_Arg的DVD-Fab的产生和表征。(a)DVD-Fab由曲妥珠单抗的可变结构域(外部Fv)和h38C2突变体Lys99Arg(内部Fv，以浅灰色圆圈)以及恒定结构域构成。轻链片段(白色)和重链片段(灰色)二者的内部和外部可变结构域通过短间隔物(ASTKGP)(SEQID NO：3)连接。在通过蛋白A亲和色谱从瞬时转染的Expi293F细胞的上清液中纯化之后，通过非还原(nonreducing，NR)SDS-PAGE和考马斯染色DVD-Fab揭示了预期为约70kDa条带并通过还原(reducing，R)SDS-PAGE和考马斯染色揭示了预期为约35kDa条带。(b)使用方法学的逆醇醛转化测量1μM和2μM时亲本(h38C2_Lys)和突变的(h38C2_Arg)DVD-Fab的催化活性以可检测荧光醛(RFU(relative fluorescent unit)，相对荧光单位)和丙酮。绘制一式三份的平均值(±)SD值。(c)将具有h38C2_Arg或h38C2_Lys的DVD-Fab与1、5和10当量的TAMRA的苯乙二醛衍生物(化合物1；图5)或TAMRA的β-内酰胺-半抗原衍生物(化合物2；图5)孵育，并通过SDS-PAGE随后是荧光成像和考马斯染色进行分析。(d)将具有h38C2_Arg或h38C2_Lys的DVD-Fab与10当量的β-内酰胺-半抗原叠氮化物(化合物3；图5)预孵育，随后与1和5当量的化合物1孵育。

图5.苯乙二醛和β-内酰胺衍生物。化合物1和2分别是红色荧光染料TAMRA的苯乙二醛和β-内酰胺-半抗原衍生物。化合物3是β-内酰胺-半抗原一叠氮化物衍生物。化合物4和5分别是细胞毒性药物MMAF的苯乙二醛和β-内酰胺-半抗原衍生物。化合物6是近红外荧光染料Cy7的β-内酰胺-半抗原衍生物。

图6.在缀合之前和之后，基于h38C2_Arg的DVD-Fab的质谱。(a)通过ESI-TOF对具有h38C2_Arg的DVD-Fab进行的分析。未缀合的DVD-Fab的预期质量为73820Da。对于(b)和(c)，分别将5和10当量的苯乙二醛-TAMRA(化合物1；★)与DVD-Fab缀合。具有一种和两种缀合化合物的DVD-Fab的预期质量分别为74623Da和75426Da。

图7.基于h38C2_Arg的DVD-Fab缀合物的人血浆稳定性。(a)将与苯乙二醛-TAMRA(化合物1)缀合的基于h38C2_Arg的DVD-Fab与人血浆在37℃下孵育指定的时间，并通过SDS-PAGE随后是考马斯染色(左)和荧光成像(右)进行分析。(b)通过NIH ImageJ软件对来自“0小时”和“240小时”时间点处的荧光成像的条带强度进行定量，并通过将在“0小时”时间点处的条带强度限定为每个独立实验的100％来绘制三个独立实验的平均值±SD值。t检验用于计算p。

图8.基于h38C2_Arg的抗HER2 DVD-Fab ADC的表征。(a)通过ESI-TOF对与苯乙二醛-MMAF(化合物4)缀合的基于h38C2_Arg的DVD-Fab进行的分析。未缀合和缀合的DVD-Fab的预期质量分别为73820和74950Da。(b)标准(左；F：440kDa；A：158kDa；C：75kDa；O：44kDa)、基于h38C2_Arg的DVD-Fab(中间)和与苯乙二醛-MMAF(化合物4)缀合的基于h38C2_Arg的DVD-Fab(右)的SEC曲线。(c)与β-内酰胺-半抗原-MMAF(化合物5)缀合的基于h38C2_Lys的DVD-Fab(●)、与苯乙二醛-MMAF(化合物4)缀合的基于h38C2_Arg的DVD-Fab(■)和对应的未缀合的DVD-Fab(分别为▲和

图9.通过SPR比较基于h38C2_Arg的抗HER2 DVD-Fab ADC和基于h38C2_Lys的抗HER2 DVD-Fab ADC。针对在瞬时背景耗竭之后指定的未缀合(a、c)和缀合的(b、d)DVD-Fab与由固定在CM5芯片上的抗人Fcγ mAb捕获的HER2-Fc的结合获得的Biacore X100传感图。h38C2_Arg(a、b)和h38C2_Lys DVD-Fab(c、d)的反应性Arg和Lys残基分别绘制成浅灰色圆圈和深灰色圆圈。DVD-Fab以五种不同浓度(12.5、25、50、100和200nM)注射。

图10.同二聚体和异二聚体DVD-IgG1的产生和表征。(a)与DVD-Fab类似，同二聚体DVD-IgG1(左)由曲妥珠单抗的可变结构域(外部Fv)和亲本h38C2或h38C2突变体Lys99Arg(内部Fv，以浅灰色圆圈)以及恒定结构域构成。轻链片段(白色)和重链片段(灰色)二者的内部和外部可变结构域通过短间隔物(ASTKGP)连接。异二聚体DVD-IgG1(右)组合一个臂中的亲本h38C2内部Fv与另一臂中的h38C2突变体Lys99Arg，并利用结进孔(knobs-into-hole)突变

图11.在缀合之前和之后，基于h38C2_Arg的DVD-IgG1的质谱。(a)通过ESI-TOF对具有h38C2_Arg的还原和去糖基化的DVD-IgG1进行的分析。轻链和重链的预期质量分别为36161Da和63151。对于(b)，将5当量的苯乙二醛-MMAF(化合物4)与DVD-IgG1缀合。具有一种缀合化合物的重链的预期质量为64282Da。

图12.具有两个不同载荷的异二聚体DVD-IgG1的一锅式(one-pot)组装。(a)对具有苯乙二醛-TAMRA(化合物1，★)和β-内酰胺-半抗原-Cy7(化合物6，

图13.在与两个不同载荷缀合之前和之后的异二聚体DVD-IgG1的质谱。(a)通过MALDI-TOF对去糖基化异二聚体DVD-IgG1进行的分析。预期质量为198546Da。(b)在TAMRA的苯乙二醛衍生物(化合物1)和MMAF的β-内酰胺半抗原衍生物(化合物5)的依次一锅式缀合之后，对去糖基化异二聚体DVD-IgG1进行的MALDI-TOF分析。具有一个TAMRA和一个MMAF载荷的去糖基化异二聚体DVD-IgG1的预期质量为200408Da。仅具有MMAF载荷的去糖基化异二聚体DVD-IgG1的预期质量为199605Da。(c)在同时进行一锅式缀合之后进行的对应MALDI-TOF分析。

图14.具有两个不同载荷的异二聚体DVD-IgG1的内化和运输。将HER2阳性SK-BR-3细胞(a)和HER2阴性MDA-MB-231细胞(b)与MMAF(通过Lys)和TAMRA(通过Arg)标记的HER2靶向的异二聚DVD-IgG1在不存在(上图)和存在(中图)胞吞抑制剂氧化苯砷(phenylarsineoxide，PAO)的情况下，在37℃下孵育4小时。同种型对照(下图)是与TAMRA(通过Lys)缀合的ROR2靶向的同二聚体DVD-IgG1。在孵育之后，将细胞洗涤、固定、封闭、透化、与FITC缀合的山羊抗人IgG F(ab’)

图15.具有两个不同载荷的异二聚体DVD-IgG1的内化和运输。将HER2阳性SK-BR-3细胞(a)和HER2阴性MDA-MB-231细胞(b)与MMAF(通过Lys)和TAMRA(通过Arg)标记的HER2靶向的异二聚DVD-IgG1在37℃下孵育4小时。在孵育之后，将细胞洗涤、固定、封闭、透化、与FITC缀合的山羊抗人IgG F(ab’)

图16.在与苯乙二醛缀合之前和之后，胃蛋白酶消化的h38C2_Arg Fab的质谱分析。为了绘制缀合位点，将未处理(a、c)和苯乙二醛处理的(b、d)的h38C2_Arg Fab用胃蛋白酶消化，并通过LC-MS/MS进行分析。在经苯乙二醛处理的样品(b)中检测到一种主要的苯乙二醛修饰的肽(YCRTYFT)。针对未标记的肽(c)和苯乙二醛修饰的肽(d)二者给出了检测到的MS/MS谱以及预测的b和y离子。Arg残基上的+116-Da修饰r(+116.03)表明形成了羟基咪唑环，如补充图1b中所示。由于在胃蛋白酶消化之前使用碘乙酰胺来阻断变性和还原蛋白质中的二硫键形成，因此Cys残基上的+57-Da修饰c(+57.02)是脲基甲基基团。

具体实施方式

本发明涉及包含药物部分与包含催化性抗体38C2的变体的抗体化合物的位点特异性精氨酸缀合的ADC。在本领域中已知的是精氨酸缀合由于许多限制不适合用于位点特异性生物缀合。例如，精氨酸是极性且带电荷的氨基酸，其优先存在于分子表面以与溶剂形成氢键。此外，精氨酸的胍基代表高pKa(约12.5)，并且其在生理pH下显示出低亲核性(deGruyter等.，Biochem.56：3863-3873，2017)。

本发明部分基于本发明人进行的研究，以产生用于与h38C2的疏水口袋内部的精氨酸残基位点特异性缀合的独特的环境。这些研究首次证明了位点特异性精氨酸缀合可用于开发新的化学程序化抗体和新的抗体-药物缀合物。通过示例的方式，本发明人将h38C2的反应性赖氨酸残基突变为精氨酸残基，并通过X射线晶体学确定了所得单克隆抗体h38C2_Arg的结构完整性。表明在h38C2_Arg中引入的精氨酸残基具有独特的反应性，从而允许其与苯乙二醛衍生物选择性和稳定缀合。另外，将MMAF的苯乙二醛衍生物与包含h38C2_Arg的HER2靶向的DVD选择性缀合。该ADC化合物与对应的HER2靶向的DVD-ADC表现出相同的效力，后者基于MMAF的β-内酰胺衍生物与野生型h38C2的反应性赖氨酸的选择性缀合。此外，通过组合掩埋的Lys残基和掩埋的Arg残基，本发明人产生了具有野生型h38C2臂和h38C2_Arg臂的DVD-IgG1，提供了具有两个不同载荷的高度均质的ADC的正交一锅式组装。

根据这些示例性研究，本发明提供了新的位点特异性精氨酸缀合的抗体药物和相关用途。如本文中所述，本发明的ADC包含通过抗体化合物中的反应性精氨酸残基与抗体化合物缀合的至少一个药物部分。优选地，本发明的ADC中的抗体化合物包含催化性抗体38C2的变体或其抗原结合片段，所述变体在疏水空隙中包含以精氨酸对反应性赖氨酸残基的替换(38C2_Arg)。在多个实施方案中，ADC的抗体化合物是双可变结构域(DVD)化合物或其抗原结合片段，其包含(i)38C2_Arg或其抗原结合片段，以及(ii)识别目的靶标的第二抗体可变结构域。

在更详细地描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定方面，因为这样的特定方面当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方面的目的，而不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

当提供值的范围时，应理解，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值，直至下限单位的十分之一，以及在该规定范围内的任何其他规定值或中间值，涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受到所规定范围中的任何明确排除的限制。当所规定范围包含一个或两个限制时，排除那些被包含的限制之一或二者的范围也包含在本发明中。

在本文中给出了某些范围，其在数值之前带有术语“约”。本文中使用术语“约”以对其之前的精确数字以及与该术语之前的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定该数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举数字可以是这样的数字，在呈现该数字的上下文中，该数字提供了具体列举的数字的基本等同物。

在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指出通过引用并入以及通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用均是为了其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释承认本发明无权由于在先发明而早于这样的出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期有所不同，所述实际公布日期可能需要独立确认。

除非另外指出，否则本发明的实践可使用在本技术领域内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这样的技术在文献中进行了充分的说明。参见，例如，Methods in Enzymology，第289卷：Solid-Phase PeptideSynthesis，J.N.Abelson，M.I.Simon，G.B.Fields(编辑)，Academic Press；第1版(1997)(ISBN-13：978-0121821906)；美国专利No.4,965,343和5,849,954；Sambrook等.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，(第3版，2000)；Brent等.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley＆Sons，Inc.(ringbou编辑，2003)；Barbas等.，Phage Display：A Laboratory Manual，CSHL Press(2004)；Davis等.，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier SciencePublishing，Inc.，New York，USA(1986)；Methods in Enzymology：Guide to MolecularCloning Techniques，第152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmerl编辑，Academic Press Inc.，San Diego，USA(1987)；Current Protocols in Protein Science(CPPS)(JohnE.Coligan，et.al.，编辑，John Wiley and Sons，Inc.)；Current Protocols in CellBiology(CPCB)(Juan S.Bonifacino et.al.编辑，John Wiley and Sons，Inc.)；Cultureof Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications，R.Ian Freshney，Wiley Blackwell(第7版，2015)；和Animal Cell Culture Methods，Jennie P.Mather和David Barnes编辑，Academic Press(第1版，1998)。以下部分提供了用于实施本发明的组合物和方法的另外的指导。

对本领域技术人员而言，在阅读本公开内容之后将明显的是，本文中所描述和举例说明的每个单独方面具有可容易地与其他数个方面中的任一个特征分离或组合的离散的组件和特征，而不脱离本发明的范围或精神。任何列举的方法均可按照列举事件的顺序或者以在逻辑上可能的任何其他顺序进行。尽管类似于或等同于本文中描述的方法和材料的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试中，但是现在描述一些代表性的说明性方法和材料。

除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Academic Press Dictionary of Science and Technology，Morris(编辑)，Academic Press(第1版，1992)；Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology，Smith等.(编辑)，Oxford University Press(修订版，2000)；Encyclopaedic Dictionary of Chemistry，Kumar(编辑)，Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，Singleton等.(编辑)，John Wiley＆Sons(第3版，2002)；Dictionary of Chemistry，Hunt(编辑)，Routledge(第1版，1999)；Dictionary of Pharmaceutical Medicine，Nahler(编辑)，Springer-VerlagTelos(1994)；Dictionary of Organic Chemistry，Kumar和Anandand(编辑)，AnmolPublications Pvt.Ltd.(2002)；和A Dictionary of Biology(Oxford PaperbackReference)，Martin和Hine(编辑)，Oxford University Press(第4版，2000)。本文中提供了当这些术语中的一些具体应用于本发明时的进一步说明。

应注意的是，除非上下文另外明确指出，否则本文中和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。还应注意的是，权利要求书可被制定为排除任何任选要素。同样地，该陈述旨在用作与权利要求要素的记载相关联的排他性术语例如“仅仅”、“仅”等的使用，或者“负”限制的使用的先行基础。

在本文中可互换使用的术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的基础4-链异四聚体糖蛋白。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链则根据H链同种型通过一个或更多个二硫键互相连接。每条H和L链均具有N端和C端，并且还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链具有在N端的可变结构域(V

来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定结构域的氨基酸序列分配为两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。根据其重链的恒定结构域(C

免疫球蛋白的“可变区”或“可变结构域”是指免疫球蛋白的H或L链的N端结构域。H链的可变结构域可被称为“V

术语“可变”是指可变结构域的某些区段在免疫球蛋白之间的序列差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并限定特定免疫球蛋白对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀分布于大多数可变结构域的110个氨基酸跨度中。相反，V区由15至30个氨基酸的被称为框架区(framework region，FR)的相对不变的段(strench)组成，所述相对不变的段被每个长度为9至12个氨基酸的被称为“高变区”的极度可变的较短区域分隔。天然H和L链的可变结构域各自包含通过形成环连接的三个高变区连接的四个FR，所述四个FR主要采用β-片层构型并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与其他链的高变区一起促进免疫球蛋白的抗原结合位点的形成(参见Kabat等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与免疫球蛋白与抗原的结合，但表现出多种效应物功能，例如使免疫球蛋白参与抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)和补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。

“完整”免疫球蛋白是包含抗原结合位点以及C

出于本文目的“裸免疫球蛋白”是不与药物部分缀合的免疫球蛋白。

“免疫球蛋白片段”包含完整免疫球蛋白的一部分，优选完整免疫球蛋白的抗原结合区或可变区。免疫球蛋白片段的一些实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)

免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段和剩余的“Fc”片段，该命名反映了易于结晶的能力。Fab片段由整条L链以及H链的可变区结构域(V

Fc片段包含通过二硫化物保持在一起的两条H链的羧基端部分。免疫球蛋白的效应物功能由Fc区中的序列决定，该区也是在某些细胞类型上存在的通过Fc受体(Fcreceptor，FcR)识别的部分。

“Fv”是包含完整抗原识别位点和结合位点的最小免疫球蛋白片段。该片段由紧密非共价缔合的一条重链和一条轻链可变区结构域的二聚体组成。在单链Fv(single-chainFv，scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类中的“二聚体”结构缔合。从这两个结构域的折叠中，产生为抗原结合贡献氨基酸残基并赋予免疫球蛋白抗原结合特异性的六个高变环(来自H和L链的各3个环)。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常亲和力低于整个结合位点。当在本文中用于指DVD免疫球蛋白分子时，术语“Fv”是指包含重链和轻链的第一和第二可变结构域二者的结合片段。

还缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接到单个多肽链中的V

本文中使用的“双可变结构域(DVD)化合物”或“双可变结构域(DVD)免疫缀合物”是指具有免疫球蛋白的第一和第二可变结构域(包含Ig的抗原结合片段例如Fab)以及通过接头与第二可变结构域共价缀合的药物部分的化合物。本文中使用的术语“双可变结构域免疫球蛋白”或“DVD-Ig”是指其H和L链二者均包含位置邻近于第一可变结构域的第二可变结构域的免疫球蛋白分子。因此，DVD-Ig的L链从N端至C端包含以下结构域：V

除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”或“抗体”具体包括包含天然存在的变体的天然人和非人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1、IgA2、IgD和IgM抗体。

关于多肽(例如，抗体或免疫球蛋白)的术语“天然的”在本文中用于是指具有自然界中存在的序列的多肽，而不管其制备方式如何。关于多肽(例如，抗体或免疫球蛋白)的术语“非天然的”在本文中用于是指具有然界中不存在的序列的多肽。

术语“多肽”在本文中以最广泛的含义使用并且包含肽序列。术语“肽”通常描述氨基酸的线性分子链，所述线性分子链包含多至约30个，优选多至约60个通过肽键共价连接的氨基酸。

本文中使用的术语“单克隆”是指从基本上均质的免疫球蛋白群体获得的抗体或免疫球蛋白分子(例如，DVD Ig分子)，即除可能少量存在可能天然发生的突变之外，构成该群体的单独的免疫球蛋白是相同的。单克隆免疫球蛋白是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆免疫球蛋白针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示免疫球蛋白从基本上均质的免疫球蛋白群体获得的特征，并且不被解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆免疫球蛋白可通过由

本文中的单克隆免疫球蛋白具体包含“嵌合”免疫球蛋白，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种的抗体以及这样的抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所期望的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；和Morrison等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855)。

“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物(例如鼠或兔))免疫球蛋白是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白。大多数情况下，人源化免疫球蛋白是人免疫球蛋白(接纳体抗体)，其中来自接纳体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代，所述非人物种例如具有期望的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、仓鼠、兔、鸡、牛或非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基也被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含不存在于接纳体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般来说，人源化免疫球蛋白将包含至少一个且通常是两个可变结构域的基本上全部，其中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化免疫球蛋白任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。有关进一步详细说明，参见Jones等.(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等.(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

本文中使用的术语“人免疫球蛋白”旨在包含具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的免疫球蛋白。本发明的人免疫球蛋白可例如在CDR中，并且特别是在CDR3中包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文中使用的术语“人免疫球蛋白”不旨在包含其中已将来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列接枝至人框架序列上的免疫球蛋白。

本文中的“分离的”免疫球蛋白是已在重组宿主细胞中从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的免疫球蛋白。其天然环境的污染物组分是会干扰免疫球蛋白的诊断或治疗性用途的物质，并且可包含酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质，以及产物的不期望副产物。在一些实施方案中，本文中分离的免疫球蛋白将被纯化至：(1)如通过SDS-PAGE或SEC-HPLC方法确定的按重量计大于95％、或按重量计大于98％、或按重量计大于99％；(2)通过使用氨基酸测序仪足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)使用考马斯蓝或优选地银染在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE使其均质。通常来说，分离的免疫球蛋白将通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“特异性结合”或“与……特异性结合”或“对……具有特异性”是指结合部分与结合靶标的结合，例如免疫球蛋白与靶抗原例如，特定多肽上的表位、肽或其他靶标(例如糖蛋白靶标)的结合，并且意指与非特异性相互作用(例如，非特异性相互作用可以是与牛血清白蛋白或酪蛋白的结合)明显不同的结合。特异性结合可被测定，例如通过确定与与对照分子的结合相比结合部分或免疫球蛋白与靶分子的结合。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子(例如过量的未标记靶标)竞争来确定。在该情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量未标记的靶标竞争性抑制，则表明是特异性结合。本文中使用的术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或“与其特异性结合”或“对其具有特异性”可例如通过靶标Kd为以下的分子来表现：至少约200nM、或者至少约150nM、或者至少约100nM、或者至少约60nM、或者至少约50nM、或者至少约40nM、或者至少约30nM、或者至少约20nM、或者至少约10nM、或者至少约8nM、或者至少约6nM、或者至少约4nM、或者至少约2nM、或者至少约1nM或者更大。在某些情况下，术语“特异性结合”是指其中在基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的情况下，分子与特定多肽或特定多肽上的表位的结合。

“结合亲和力”是指分子(例如，免疫球蛋白)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本文中使用的“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，免疫球蛋白和抗原)之间的1∶1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(K

本文中使用的“K

术语“缀合物”、“缀合的”和“缀合”是指共价或非共价连接的任何和全部形式，并且包括但不限于直接遗传或化学融合、通过接头或交联剂偶联和非共价缔合。

本文使用的术语“融合”是指一条多肽链中的不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合进行的组合。术语“融合”明确涵盖内部融合，即除与其一个末端融合之外，还在多肽链内插入不同来源的序列。本文使用的术语“融合”是指不同来源的氨基酸序列的组合。

术语“表位”包含能够与免疫球蛋白特异性结合的任何分子决定簇。在某些方面中，表位决定簇包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些方面中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是被免疫球蛋白结合的抗原的区域。“结合区域”是被结合分子结合的结合靶标上的区域。

术语“靶标”或“结合靶标”以最广泛的含义使用并且具体包含多肽但不限于核酸、碳水化合物、脂质、细胞和当其天然存在时具有或不具有生物学功能的其他分子。

术语“抗原”是指可与免疫球蛋白结合或触发细胞免疫应答的实体或其片段。免疫原是指可在生物体，特别是动物，更特别是哺乳动物(包括人)中引发免疫应答的抗原。术语抗原包含如上所限定的称为抗原决定簇或表位的区域。

本发明的免疫球蛋白的“抗原结合位点”或“抗原结合区”通常在每个可变结构域内包含六个互补决定区(complementarity determining region，CDR)，并且它们在不同程度上促进结合位点对抗原的亲和力。在每个可变结构域中，存在三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。通过与氨基酸序列的编译数据库比较来确定CDR和框架区(FR)的程度，其中已根据序列之间的可变性和/或来自抗体/抗原复合物的结构信息限定了那些区域。还包括在本发明范围内的是由较少的CDR构成的功能性抗原结合位点(即其中结合特异性由三个、四个或五个CDR确定)。少于6个CDR的完整组可足以与一些结合靶标结合。因此，在一些情况下，仅V

本申请中使用的术语“宿主细胞”表示可被改造以产生根据本发明的免疫球蛋白的任何种类的细胞系统。在一个方面中，中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞用作宿主细胞。在一些实施方案中，大肠杆菌(E.coli)可用作宿主细胞。

本文中使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这样的命名均包含后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包含原代对象细胞和从其衍生的培养物，而与转移次数无关。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不完全相同。包含具有与在原始转化细胞中筛选的相同功能或生物活性的变体后代。

当核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，其被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌性前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与对多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成促进翻译，则与编码序列可操作地连接。一般来说，“可操作地连接”意指连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导的情况下是连续的并且在阅读框内。然而，增强子不一定是连续的。通过在方便的限制性酶切位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

关于肽或多肽序列，即本文中确定的h38C2抗体多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以实现最大百分比序列同一性之后并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守替换的情况下，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以以本领域技术范围内的多种方式来实现比对，例如，使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

“治疗”是指治疗性治疗和预防或防范措施二者，其中目的是预防或减慢(减轻)目标病理病症或障碍。需要治疗的那些包括已患有病症的那些，以及易患病症的那些，或要预防该病症的那些。例如，如果在根据本发明的方法接受治疗量的主题免疫缀合物之后，对象显示出以下一种或更多种的可观察和/或可测量的降低或不存在，则对象或哺乳动物成功“治疗”了癌症：癌细胞数目降低或不存在癌细胞；肿瘤尺寸降低；抑制(即，在一定程度上减缓，优选停止)癌细胞浸润到外周器官中，包括癌症扩散到软组织和骨中；抑制(即，在一定程度上减缓，优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解了与特定癌症相关的一种或更多种症状；降低发病率和/或死亡率，并改善生活质量问题。

本发明提供了包含催化性抗体38C2的变体或其抗原结合片段的抗体化合物。38C2催化性抗体是本领域公知的，并且已在例如美国专利No.8,252,902中良好地表征。38C2抗体的重链可变区包含可与接头反应的单个独特地反应性赖氨酸残基(Lys99)，从而提供了用于与药物部分缀合的连接点。因此，包含38C2抗体的可变结构域的免疫球蛋白分子包含可用于与药物部分缀合的两个这样的连接点(每条重链上一个)。一旦反应性赖氨酸残基与接头缀合，则38C2可变结构域的结合功能丧失，这意味着该可变结构域不再表现出催化活性。

本发明的38C2变体抗体在疏水空隙中包含以精氨酸对该反应性赖氨酸残基的替换，这为药物缀合提供了不同于反应性赖氨酸残基的连接点。对于全长抗体(例如，IgG)或二聚体抗体片段(例如F(ab’)

包含具有被Arg替代的反应性Lys残基的变体38C2抗体的抗体化合物可通过常规实践方法(例如，本文中所示例的重组表达)容易地产生。作为具体示例，适用于本发明的人源化38C2_Arg变体(h38C2_Arg)的重链和轻链变体结构域序列分别在SEQ ID NO：1和2中示出。在第99位的替换的Arg残基在重链序列(SEQ ID NO：1)中加下划线。应注意的是，该变体的轻链可变结构域序列与本领域已知的人源化38C2抗体(h38C2)的轻链可变结构域序列相同。

h38C2_Arg的V

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h38C2_Arg的V

ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLLHTYGSPYLNWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYFCSQGTHLPYTFGGGTKVEIK

在多个实施方案中，本发明的抗体化合物可包含一个或两个上述反应性Arg残基，并且具有与示例序列基本相同的重链和/或轻链序列。例如，除存在一个或更多个反应性Arg残基之外，本发明的抗体化合物的重链和轻链可变结构域氨基酸序列可分别与SEQ IDNO：1和2具有至少约80％同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

本发明还提供了包含通过经改造精氨酸残基与抗体化合物位点特异性缀合的至少一个药物部分的抗体缀合药物(ADC)。优选地，抗体化合物是来源于上述催化性抗体38C2的变体。在一些实施方案中，抗体化合物是在两个抗体臂中均包含Lys99Arg替换的同二聚体分子。在这些实施方案中，ADC可包含与抗体化合物的两个臂中的经改造Arg残基缀合的相同药物部分。在一些实施方案中，抗体化合物是仅在一个抗体臂中包含Lys99Arg替换的异二聚体分子。这样的分子的重链异二聚化可例如通过如本文中所示例的结进孔突变来实现。在这些实施方案中，ADC可包含与一个抗体臂中的经改造Arg残基缀合的第一药物部分和与另一抗体臂中的反应性Lys残基缀合的第二药物部分。在一些实施方案中，ADC中的抗体化合物是单独的人源化38C2_Arg抗体(h38C2_Arg)或其抗原结合片段。在一些其他实施方案中，抗体化合物是双可变结构域(DVD)化合物(如本文中所示例的DVD-Fab或DVD-Ig)或具有38C2_Arg的双特异性抗体。因此，本发明的一些ADC中的抗体化合物是DVD-Ig，其包含与靶抗原(例如，肿瘤细胞表面抗原或受体)结合的第一可变结构域和允许接头分子或接头衍生的药物部分的位点特异性连接的第二可变结构域(38C2_Arg)。

一旦产生了包含反应性Arg的变体38C2抗体，就可根据文献中已报道的方法来产生包含38C2_Arg抗体的DVD-Ig抗体化合物。参见，例如Nanna等.，Nat.Commun.8：1112，2017；和WO2017/049139。与药物部分缀合的DVD-Ig包含用于连接药物部分的第一可变结构域38C2变体和及用于与目的靶标结合的第二可变结构域。当ADC的抗体组分具有完整抗体结构时，DVD-Ig通常包含各自由轻链和重链组成的两个臂。每条轻链和每条重链均包含N端和C端。在一些实施方案中，DVD-Ig的两个臂是相同的，即其中轻链相同且重链相同。例如，这些实施方案中的一些针对具有包含两个h38C2_Arg臂的变体38C2抗体的同二聚体DVD化合物(例如，如本文中所示例的同二聚体HER2靶向的DVD-Ig分子)。在一些其他实施方案中，DVD-Ig的两个臂可以是不同的。例如，一些DVD化合物(例如，如本文中所示例的异二聚体HER2靶向的DVD-Ig)可以是异二聚体，因为DVD化合物的变体38C2抗体组分包含一个h38C2_Lys臂和一个h38C2_Arg臂。在一些实施方案中，38C2变体结构域可被定位成比第二可变结构域更靠近DVD-Ig的C端。在一些其他实施方案中，38C2变体结构域可被定位成比第二可变结构域更靠近DVD-Ig的N端。

在一些实施方案中，DVD-Ig包含38C2_Arg作为用于缀合药物部分的第一可变结构域和与目的靶标(例如，靶抗原或受体)结合的第二可变结构域。在这些ADC中的一些中，反应性Arg存在于38C2_Arg变体的两个臂中，并且相同的药物部分与抗体化合物的两个臂缀合。在一些其他ADC中，仅38C2变体抗体的一个臂中的反应性赖氨酸残基被精氨酸残基替代。如本文中所示例的，这些ADC在两个臂中包含2种不同的药物部分通过适当的接头分别与其缀合的反应性Arg和反应性Lys二者。

变体类型或亚型的免疫球蛋白可用于本发明的DVD-Ig抗体化合物的构建中。例如，轻链可以是κ轻链或λ轻链。根据Fc结构域，重链可以是来自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(例如IgA1或IgA2)、IgM、IgE或IgD抗体的重链。例如，在一些方面中，免疫球蛋白属于IgG类，并且重链包含γ重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgG1类，并且重链包含γ1重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgG2类，并且重链包含γ2重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgG3类，并且重链包含γ3重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgG4类，并且重链包含γ4重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgA类，并且重链包含α重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgA1类，并且重链包含α1重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgA2类，并且重链包含α2重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgD类，并且重链包含δ重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgE类，并且重链包含ε重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白属于IgM类，并且重链包含μ重链。

在多个实施方案中，DVD-Ig抗体化合物的第一和第二可变结构域通过肽接头序列沿其轻链或重链连接。肽接头序列可以是单个氨基酸或多肽序列。本领域中描述了可用于本发明的许多接头，例如WO2017/049139和美国专利No.7,612,181。合适的接头的一些具体实例包括ASTKGP(SEQ ID NO：3)和TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：4)。

本发明ADC中的DVD-Ig的第二可变结构域可以是特异性识别目的靶标多肽或靶抗原的任何抗体或抗原结合片段。例如，它可以是识别肿瘤细胞上的抗原的抗体、抗体结构域或抗原结合片段。免疫球蛋白可通过诱导凋亡、重定向细胞毒性、干扰配体-受体相互作用或阻止对肿瘤表型至关重要的蛋白质的表达来发挥抗肿瘤作用。另外，免疫球蛋白可靶向肿瘤微环境的组分从而扰动重要结构例如肿瘤相关血管的形成。免疫球蛋白还可靶向配体是生长因子的受体(例如表皮生长因子受体)，从而抑制刺激细胞与靶向肿瘤细胞的天然配体的结合。或者，免疫球蛋白可诱导ADCC、ADCP或CDC。

本领域技术人员将认识到，肿瘤相关抗原对于几乎任何类型的癌症均是已知的。可由主题DVD免疫球蛋白分子的第二可变结构域靶向的特异性肿瘤相关结合靶标包含本文中所示例的HER2(ERBB2)。另一些实例包括但不限于FOLR1、FOLR2、CD138、CD19、CD79A、CD79B、ROR1、ROR2、FCMR、CS1、GPA33、MSLN、CD52、CD20、CD3、CD4、CD5、CD8、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD33、CD38、CD44、CD56、CD70、BCMA、Siglec-1、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9。PSMA、BMP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、EGF、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1、IGF1R、IL2、VEGF、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR(ERBB1)、HER3(ERBB3)、HER4(ERBB4)、ENO1、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NROB1、NROB2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、IGFBP3、IGFBP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB21P、DES、DNCL1、ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、TGEA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1(E-钙黏蛋白)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN2A(p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、ESR1、ESR2、F3(TF)、FOSL1(FRA-1)、GATA3、GSN(凝溶胶蛋白)、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、ITGA6(a6整联蛋白)、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、NGFR、NME1(NM23A)、PGR、PLAU(uPA)、PTEN、SERPINB5(丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、TGFA、THBS1(血小板应答蛋白-1)、TIE(Tie-1)、TNFRSF6(Fas)、TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TP53、AZGP1(锌a-糖蛋白)、BPAG1(网蛋白)、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CLDN7(密封蛋白-7)、CLU(簇集素)、FGF1、FLRT1(纤连蛋白)、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGB4(b 4整联蛋白)、KLF5(GC Box BP)、KRT19(角蛋白19)、KRTHB6(毛发特异性的II型角蛋白)、MACMARCKS、MT3(金属硫蛋白-III)、MUC1(黏蛋白)、PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SPRR1B(Spr1)、THBS1、THBS2、THBS4和TNFAIP2(B94)。

本发明ADC中的DVD-Ig的第二可变结构域的氨基酸序列可包含嵌合的、人源化的或人氨基酸序列。这样的序列的任何合适的组合均可并入本发明DVD-Ig抗体化合物的第二可变结构域。

抗原结合可变区序列可选自能够结合特异性靶标并且是本领域公知的多种单克隆抗体。这些包括但不限于抗TNF抗体(美国专利No.6,258,562)、抗IL-12和或抗IL-12p40抗体(美国专利No.6,914,128)；抗IL-18抗体(US 2005/0147610 A1)、抗C5、抗CBL、抗CD147、抗gp120、抗VLA4、抗CD11a、抗CD18、抗VEGF、抗CD40L、抗Id、抗ICAM-1、抗CXCL13、抗CD2、抗EGFR、抗TGF-β2、抗E-选择素、抗Fact VII、抗Her2/neu、抗Fgp、抗CD11/18、抗CD14、抗ICAM-3、抗CD80、抗CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2整联蛋白、抗α4β7整联蛋白、抗α4β1整联蛋白、αvβ3整联蛋白、抗αvβ5整联蛋白、抗CD52、抗HLA DR、抗CD22、抗Siglec-1、抗Siglec-4、抗Siglec-5、抗Siglec-6、抗Siglec-7、抗Siglec-8、抗Siglec-9、抗PSMA、抗BCMA、抗ROR1、抗ROR2、抗DLL3、抗FOLR1、抗FOLR2、抗CD5、抗SLAMF7、抗FCMR、抗CD20、抗MIF、抗CD64(FcμR1)、抗TCR αβ、抗CD2、抗Hep B、抗CA 125、抗EpCAM、抗gp120、抗CMV、抗gpIIbIIIa、抗IgE、抗CD25、抗CD33、抗HLA、抗VNR整联蛋白、抗IL-1α、抗IL-1β、抗IL-1受体、抗IL-2受体、抗IL-4、抗IL4受体、抗IL5、抗IL-5受体、抗IL-6、抗IL-8、抗IL-9、抗IL-13、抗-IL-13受体、抗IL-17和抗IL-23。参见，例如Beck等.，Nat Rev Drug Discov.2017，16：315-337；Carter andLazar，Nat Rev Drug Discov.2018，17：197-223；Kaplon and Reichert，MAbs.2018，10：183-203；Reichert，MAbs.2017，9：167-181；Reichert，MAbs.2016，8：197-204；和PrestaLG，J.Allergy Clin.Immunol.2005，116：731-6。

抗原结合可变区序列也可选自批准用于临床试验或用于临床用途的开发的多种治疗性抗体。这样的治疗性抗体包括但不限于

ADC中的DVD-Ig抗体化合物可涵盖嵌合的、人源化的和人免疫球蛋白序列，并且在一些方面中，可包含其任何混合物。在一些实施方案中，可针对效应物功能对其进行修饰，例如，以便增强免疫球蛋白的ADCC、ADCP或CDC。这可通过在免疫球蛋白的Fc区中引入一个或更多个氨基酸替换来实现。作为替代或补充，可在Fc区域中引入一个或更多个半胱氨酸残基，从而允许该区域中链间二硫键形成。由此产生的免疫球蛋白可具有改善的内化能力和/或提高的ADCC、ADCP或CDC。参见Caron等.，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。例如，为了提高免疫球蛋白的血清半衰期，可将挽救受体结合表位并入免疫球蛋白(特别是免疫球蛋白片段)中，如美国专利5,739,277中所述。本文中使用的术语“挽救受体结合表位”是指负责提高IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如，IgG

作为示例，本发明提供了用于特异性靶向肿瘤抗原HER2的包含38C2_Arg的DVD-Ig和DVD-Fab。这些DVD化合物包含与HER2结合的可变结构域和作为第二可变结构域的人源化38C2_Arg可变结构域。可变结构域可在每条轻链和重链上与肽接头序列例如ASTKGP(SEQID NO：3)连接。为了促进重组蛋白产生，可将信号肽序列例如MDWTWRILFLVAAATGAHS(SEQID NO：8)放置在重链和轻链序列的N端。本文中示例的DVD-Ig和DVD-Fab分子的轻链氨基酸序列(曲妥珠单抗V

HER2靶向的DVD-Fab的重链(SEQ ID NO：5)

HER2靶向的DVD-IgG1的重链(SEQ ID NO：6)

HER2靶向的DVD-Fab和DVD-IgG1的轻链(SEQ ID NO：7)

在多个实施方案中，除在38C2组分的一个或两个臂中具有针对反应性Lys残基的Arg替换之外，本发明的HER2靶向的DVD化合物还可包含与SEQ ID NO：7基本上类似的轻链氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：7具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。作为替代或补充，HER2靶向的DVD化合物可包含与SEQ ID NO：6或7基本上类似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO：6或7具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。

本发明的抗体缀合药物(ADC)中的药物部分通常通过合适的接头序列或接头部分以位点特异性方式与38C2_Arg抗体缀合。接头用于连接载物部分(例如，药物部分)与DVD-Ig，并且可使用任何合适的化学过程。多种类型的接头功能可包含在本发明的ADC中，包括但不限于可切割接头和不可切割接头，以及可逆接头和不可逆接头。

可切割接头是依赖靶细胞内的过程(例如细胞质的降低、在溶酶体或内体中暴露于酸性条件，或被细胞内的特定酶(例如蛋白酶)切割)来释放药物部分的那些。因此，免疫缀合物在靶细胞内被内化和加工之后，可切割接头允许附着的药物部分以其原始形式释放。可切割接头包括但不限于其键可被酶(例如，肽接头)；还原条件(例如，二硫化物接头)；或酸性条件(例如，腙和碳酸盐)切割的那些。不可切割接头利用免疫缀合物的分解代谢降解用于释放药物部分。释放的药物部分通常保留接头以及与接头缀合的免疫球蛋白的氨基酸残基。不可切割接头包括但不限于PEG接头、烃接头和硫醚接头。

可逆接头利用可使用合适的试剂容易地断裂或逆转的化学键。因此，在形成可逆接头之后，可通过用试剂处理使接头在期望的位置断裂，从而从接头释放免疫球蛋白分子。不可逆接头利用在其形成之后不易断裂或逆转的化学键。因此，在形成不可逆接头之后，免疫球蛋白分子不能轻易地释放。

为了与本发明的ADC中的反应性Arg残基进行位点特异性缀合，可使用本领域已知与该残基具有反应性的任何化学部分。例如，合适的接头的一些非限制性实例包括例如苯乙二醛(PGO)、乙二醛(GO)和甲基乙二醛(MGO)。参见例如Takahashi，J.Biochem.81：395-402，1977。如上所述，本发明的一些ADC除经改造的精氨酸残基之外，还包含与38C2中的反应性赖氨酸残基缀合的药物部分。多种其他接头部分可用于位点特异性Lys缀合。参见，例如WO2017/049139。例如，用于位点特异性赖氨酸缀合的可逆接头的非限制性实例包括例如二酮部分。用于位点特异性赖氨酸缀合的不可逆接头的非限制性实例包括例如β-内酰胺部分。

在一些实施方案中，用于连接药物部分的接头可包含氨基酸单元。氨基酸单元允许通过蛋白酶切割接头，从而在暴露于胞内蛋白酶(例如溶酶体酶)时促进药物从免疫缀合物的释放。参见，例如Doronina等.(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。氨基酸单元的一些非限制性实例包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。二肽的一些非限制性实例包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。三肽的一些非限制性实例包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可包含天然存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸。可对氨基酸单元的选择性进行设计和优化用于通过特定的酶(例如，肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶)进行酶促切割。

在一些实施方案中，接头可以是支化或树突型接头部分，用于通过支化多功能接头部分共价连接多于一个药物部分与免疫球蛋白(Sun等(2002)Bioorganic＆MedicinalChemistry Letters 12：2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic＆Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。支化树突接头的一些非限制性实例包括2，6-双(羟甲基)-对甲酚和2，4，6-三(羟甲基)-苯酚树枝状单元(WO 2004/01993；Szalai等(2003)J.Amer.Chem.Soc.125：15688-15689；Shamis等(2004)J.Amer.Chem.Soc.126：1726-1731；Amir等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42：4494-4499)。支化接头可提高药物与免疫球蛋白的摩尔比，即载荷，这与ADC的效力相关。因此，例如，在免疫球蛋白仅带有一个用于缀合的反应性氨基酸残基的情况下，多个药物部分可通过支化接头连接。

适合在本发明的ADC中使用的接头(包括延伸物、间隔物和氨基酸单元)，可通过本领域已知的方法，例如美国专利公开No.2005/0238649 A1中描述的那些合成。

本发明的ADC旨在将载荷或载物部分(例如，药物)递送至特定的目的靶标。载荷广泛地包括但不限于生物活性部分，例如药物部分和表达修饰部分，以及非生物活性部分，例如可检测部分(例如，可检测标记)。药物部分的非限制性实例包括能够杀伤靶细胞或阻止靶细胞生长的细胞毒性剂和细胞生长抑制剂。在一些实施方案中，所使用的药物部分是毒素、化学治疗剂、抗生素、放射性同位素、经螯合的放射性同位素和溶核酶。在一些实施方案中，用于本发明的ADC的药物部分可以是由聚合物药物组成的聚合药物。例如，ADC中的载荷可以是通过由Mersana Therapeutics(Cambridge，MA)开发的Fleximer技术产生的聚合药物。参见，例如Yurkovetskiy等.，Cancer Res.2015，75：3365-72。

在一些实施方案中，本发明的ADC中的载荷是选自以下的药物部分：奥瑞他汀；多拉司他汀；西马多丁；鹅膏蕈碱(包括但不限于α-鹅膏蕈碱)；单甲基奥瑞他汀F(MMAF)；单甲基奥瑞他汀E(MMAE)；美登木素生物碱(包括但不限于DM1、DM3和DM4)；吡咯并苯并二氮杂

在一些实施方案中，本发明的ADC可包含修饰给定生物响应的药物部分。药物部分不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物活性的蛋白质、肽或多肽。这样的蛋白质可包括例如毒素，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板来源的生长因子、组织纤溶酶原激活剂、细胞因子、凋亡剂、抗血管生成剂或生物响应调节剂，例如如淋巴因子。在一些实施方案中，药物部分可以是细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素。细胞毒素的一些实例包括但不限于紫杉烷类、DNA烷化剂类(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、微管溶素类似物、倍癌霉素类似物、奥瑞他汀E、奥瑞他汀F、美登木素生物碱类和包含反应性聚乙二醇部分的细胞毒性剂、taxon、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，及其类似物或同源物。

药物部分还可包含例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、消融剂(ablating agent)(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(原名道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如，更生霉素(dactinomycin)(原名放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(anthramycin，AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。参见，例如美国专利公开No.20090304721，其通过引入整体并入本文。可与本发明的抗体、抗体片段(抗原结合片段)或功能性等同物缀合的细胞毒素的其他非限制性实例包括倍癌霉素、加利车霉素、美登素和奥瑞他汀及其衍生物。

本发明的ADC中的载物部分也可以是放射性同位素或经螯合的放射性同位素，以产生细胞毒性放射性药物，称为放射性免疫缀合物。可与抗体缀合用于诊断或治疗的放射性同位素的一些实例包括但不限于碘-131、铟-111、钇-90、镥-177、铋-213和砹-211。在本领域中建立了用于制备放射性免疫缀合物的方法。放射性免疫缀合物的实例是市售的，包括Zevalin

在一些实施方案中，本发明的ADC的载荷可以是用于近红外(near infrared，NIR)光免疫治疗(photoimmunotherapy，PIT)的光吸收剂。PIT是可诱导肿瘤的快速且特异性破坏的新的肿瘤靶向的抗癌平台。治疗由药物(癌症靶向的光活化抗体缀合物)和在肿瘤部位施加光的装置系统组成。PIT的独特之处在于，它组合了癌细胞的分子靶向以实现高的肿瘤特异性，以及导致广谱抗癌活性的癌细胞破坏的生物物理机制，而不管患者肿瘤的致癌机制如何。参见，例如Mitsunaga等.，Nat.Med.17：1685-92，2011。例如，本发明的DVD化合物可包含NIR PIT光吸收剂(例如，IR700)和靶向肿瘤细胞的抗原结合可变结构域。

在多个实施方案中，本发明的ADC的载荷可以是单个药物单元或多个相同的药物单元，例如同一药物部分上的2、3、4、5、6、7、8、9或10个药物单位。在一些实施方案中，药物部分包含在相同药物部分上的两个不同药物单元。例如，在一些方面中，单个药物部分可包含MMAF药物单元和PBD单体药物单元二者。此外，在某些方面中，主题免疫缀合物可包含与免疫缀合物的第一臂缀合的第一药物部分和与免疫缀合物的第二臂缀合的第二药物部分。因此，药物部分的多种组合中的任一种均可通过接头与主题DVD-Ig缀合。作为示例，ADC可在其两个臂上包含位点特异性Arg缀合的羧基四甲基罗丹明(TAMRA)和位点特异性Lys缀合的MMAF。

在一些实施方案中，本发明的ADC中的载物部分是表达修饰部分。表达修饰部分包括但不限于非蛋白质编码RNA(“non-protein-coding RNA，npcRNA”)。在一些实施方案中，npcRNA可以是例如微RNA(microRNA，miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)、小RNA及其编码前体、异染色质siRNA(heterochromatic siRNA，hc-siRNA)、Piwi-相互作用RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(trans-acting siRNA，ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪剂RNA(tracer RNA，tcRNA)、指导RNA(gRNA)和单指导RNA(single-guide RNA，sgRNA)。

在一些实施方案中，本发明的ADC中的载物部分是可检测部分。可检测部分包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)以及间接检测(例如，通过酶促反应或分子相互作用)的部分(例如酶或配体)。示例性的标记包括但不限于放射性同位素

本发明的位点特异性精氨酸缀合的抗体药物缀合物(ADC)可用本领域已知的任何方法和本文中所示例的特定技术来产生。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码DVD重链和/或DVD轻链的一种或更多种表达载体通过标准技术被转染到宿主细胞中。术语“转染”的多种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中的广泛多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐转染等。尽管可在原核或真核宿主细胞中表达本发明的DVD免疫球蛋白，但优选在真核细胞中并且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达DVD免疫球蛋白，因为这样的真核细胞(并且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装和分泌适当折叠且具有免疫活性的DVD免疫球蛋白。

用于表达本发明的重组免疫球蛋白的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR选择性标志物(例如如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)一起使用的dhfr-CHO细胞，其在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220中进行了描述)、人胚肾(Human EmbryonicKidney，HEK)细胞、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码DVD免疫球蛋白的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使DVD免疫球蛋白在宿主细胞中表达或者更优选地使DVD免疫球蛋白分泌到其中生长宿主细胞的培养基中的时间来产生DVD免疫球蛋白。可使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收DVD免疫球蛋白。

在用于重组表达本发明的DVD免疫球蛋白的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码DVD重链和DVD轻链二者的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体中，DVD重链和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调控元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还带有DHFR基因，该基因允许使用甲氨蝶呤选择/扩增用于选择已用该载体转染的CHO细胞。培养选择的转化宿主细胞以允许表达DVD重链和轻链，并从培养基回收完整的DVD免疫球蛋白。使用标准的分子生物学和组织培养技术制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞并从培养基回收DVD免疫球蛋白。另外，本发明的一些方面包括合成本发明的DVD免疫球蛋白的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成本发明的DVD免疫球蛋白。一种方法还可包括从培养基中分离DVD免疫球蛋白以产生分离的免疫球蛋白。

主题DVD免疫球蛋白的特征在于它们可以以类似于常规抗体的方式产生和纯化。DVD免疫球蛋白的产生可在不进行恒定区的任何序列修饰或任何种类的化学修饰的情况下，导致具有期望活性的均质单一主要产物。

本发明的位点特异性Arg缀合的ADC可用于多种预防性、治疗性和诊断性应用。本发明的ADC的具体应用将取决于与抗体化合物缀合的载荷或药物部分。当使用基于DVD的ADC时，具体应用还取决于由DVD中的第二可变结构域识别的靶分子。因此，本文中所述的抗体化合物和ADC可用于治疗多种肿瘤。本发明的化合物可容易地应用于许多特定的癌症治疗。这样的治疗性应用包括，例如，通过已知的肿瘤靶向抗体或如本文中所示例的抗原结合可变结构域将药物部分递送至肿瘤。它们还包括不直接靶向肿瘤细胞的治疗，例如，用于靶向T细胞、其他免疫细胞和肿瘤支持细胞的抗体-siRNA缀合物。它们还包括其他非常规癌症治疗，例如，使用近红外(NIR)光免疫治疗(PIT)用于治疗肿瘤(以及非肿瘤细胞)。本发明的化合物(例如，基于DVD的ADC)也可用于治疗非肿瘤适应证，例如感染性疾病、自身免疫病、心血管疾病、代谢性疾病。参见，例如Beck等.，Nat Rev Drug Discov.2017，16：315-337。

作为示例，本发明的一些ADC(包括包含本文中所示例的HER2靶向的DVD化合物的ADC)可通过靶向和杀伤表达特定肿瘤抗原的细胞用于多种癌症和其他疾病的治疗。合适的癌症类型包括但不限于血液系统癌症、癌、肉瘤、黑素瘤和中枢神经系统癌症。可用本发明的ADC治疗的血液系统癌症的一些非限制性实例包括：白血病、急性髓性白血病(acutemyeloid leukemia)、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenousleukemia)、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。可用本发明的ADC治疗的癌的一些非限制性实例包括皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、肺癌、鼻咽癌、结直肠癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾癌和乳腺癌。可用本发明的ADC治疗的肉瘤的一些非限制性实例包括血管肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性外周神经鞘瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’ssarcoma)和滑膜肉瘤。可用本发明的ADC治疗的中枢神经系统癌症的一些非限制性实例包括神经胶质瘤、脑膜瘤和神经瘤。可用本发明的ADC治疗的其他癌症的非限制性实例包括黑素瘤。

在一些实施方案中，本发明的ADC可与一种或更多种另外的治疗联合使用以治疗特定的癌症。例如，本发明的ADC可与其他药物例如抗肿瘤剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂或免疫抑制剂组合使用或作为常规治疗的辅助。另外的治疗剂的一些非限制性实例包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星、放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、贝伐单抗、伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、依鲁替尼、艾代拉里斯(idelalisib)、来那度胺、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇和多西他赛。任何抗肿瘤剂均可用于这样的组合治疗。这些包括常规和/或实验性化学治疗剂、放射治疗等。

对于治疗性用途，可将本发明的ADC配制成药物组合物。所述药物组合物通常包含有效量的免疫缀合物和可药用载体。本发明的药物组合物可通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将取决于目标疾病或病症和所期望的结果而变化。为了通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能有必要用防止其失活的材料包被化合物或与该化合物共施用。例如，可在合适的载体例如脂质体或稀释剂中将化合物施用于对象。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域己知的。

本发明的药物组合物还可包含佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和/或分散剂。可通过灭菌程序并通过包含多种细抗菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)二者来确保阻止微生物的存在。还期望在组合物中包含等张剂，例如糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可实现可注射药物形式的延长吸收。

可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得有效实现特定患者之所期望的治疗响应的活性成分的量、组合物和施用方式而对患者无毒。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、总体健康状况和既往病史，以及医学领域公知的因素。药物组合物必须是无菌的并且流动至所述组合物可通过注射器递送的程度。除水之外，载体优选为等张的缓冲盐溶液。

本发明的药物组合物还可包含有效量的第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是抗体、抗肿瘤剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂或免疫抑制剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自：顺铂、卡铂、奥沙利铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星、放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、贝伐单抗、伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、依鲁替尼、艾代拉里斯、来那度胺、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇和多西他赛。

提供以下实施例、序列和附图以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中阐明。应理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的方法进行修改。

实施例

提供以下实施例以举例说明而非限制本发明。

实施例1：

催化性抗体38C2，其通过使用具有β-二酮功能的芳族半抗原进行小鼠反应性免疫产生，并且其人源化形式h38C2在可变重链结构域(V

接下来，我们确定了Arg99的pK

保留深口袋表明，与掩埋的Lys99类似，掩埋的Arg99将具有可用于位点特异性缀合的独特反应性。为了对此进行测试，我们首先克隆、表达和纯化具有来源于人源化抗人HER2 mAb曲妥珠单抗

表2.h38C2_Arg Fab结晶的数据收集和细化统计

接下来，我们通过质谱(mass spectrometry，MS)分析了h38C2_Arg DVD-Fab。与预期的MW 73,820Da相比，未缀合的抗体揭示了观察到的分子量(molecular weight，MW)为73,836Da(图6)。在与5倍摩尔过量的化合物1孵育之后，观察到的MW提高了803Da，这对应于在Arg99处形成稳定羟基咪唑环的预期MW提高。缀合抗体与未缀合抗体的比为约8.5∶1.5。当化合物1的摩尔过量提高至10倍时，未缀合抗体的信号降低。然而，对应于具有两个经修饰Arg残基的抗体缀合物的新信号以单缀合抗体与双缀合抗体的比为约8.3∶1.7出现。

为了确认Arg99为缀合位点，用胃蛋白酶消化未处理和经苯乙二醛处理的h38C2_Arg Fab，并通过LC-MS/MS进行分析。我们实现了轻链序列和重链序列二者＞90％氨基酸序列覆盖。对于缀合的h38C2_Arg Fab但不是未缀合的h38C2_Arg Fab，检测到在Arg上具有116-Da修饰的六肽Tyr-Cys-Arg-Thr-Tyr-Phe(图16)。该六肽与Arg99周围的氨基酸序列匹配，并且是唯一可检测到的经修饰的肽，其中相对丰度高于对应的未经修饰的肽，从而验证了位点特异性Arg99修饰。Arg残基上的116Da质荷比(m/z)移位与Arg的胍基和苯乙二醛之间羟基咪唑环的形成相一致(图1b)。尽管在该实验中可检测到另外的经修饰重链肽和轻链肽，但它们的相对丰度比对应的未经修饰的肽低得多。

为了评估Arg：苯乙二醛加合物的稳定性，使h38C2_Arg DVD-Fab与化合物1缀合，并在37℃下与人血浆一起孵育多至10天。在0、6、12、24、48、96、144、192和240小时之后的分析揭示了缀合物的高稳定性，其中在10天之后累积衰减为约15％(图7)。

实施例3

在建立缀合效率、选择性和稳定性的情况下，我们接下来研究了Arg：苯乙二醛加合物对于组装均质ADC的适用性。为此，我们合成了MMAF的苯乙二醛衍生物(化合物4；图5)，类似于MMAF的β-内酰胺半抗原衍生物(化合物5；图5)，我们用于组装基于亲本h38C2_Lys的均质ADC。使用与化合物1相同的条件，使h38C2_Arg DVD-Fab与化合物4反应，并通过MS确定缀合物，揭示了在约8.5∶1.5比下缀合和未缀合抗体的观察质量分别为74,970Da和73,837Da，并接近于DAR为1的预期质量(图8a)。尺寸排阻色谱(size exclusionchromatography，SEC)进一步显示，MMAF缀合的h38C2_Lys99Arg DVD-Fab不含聚集体(图8b)。

DVD-Fab形式的ADC在亚纳摩尔浓度下揭示了对HER2阳性人SK-BR-3乳腺癌细胞的细胞毒性，而在100nM、最高测试浓度下揭示了对HER2阴性人MDA-MB-231乳腺癌细胞是无活性的(图8c)。重要的是，当与由亲本h38C2_Lys DVD-Fab和化合物5组装的基于Lys99的ADC(IC

MMAF缀合的h38C2_Arg99 DVD-Fab的效力促使我们产生以DVD-IgG1形式的对应ADC(图10a)。通过MS对ADC的分析揭示了两个主峰，一个对应于未缀合的轻链并且另一个对应于具有单个MMAF载荷的重链(图11)。还检测到对应于未缀合重链(重链主峰的15％)和具有两个MMAF载荷的重链(0.5％)的次峰，表明总DAR为约1.7。如预期的那样，以DVD-IgG1形式的基于Arg99的ADC揭示了与以DVD-IgG1形式的基于Lys99的ADC的基本相同的效力和选择性(图10c)。

实施例4：

我们接下来开始通过将h38C2_Arg和h38C2_Lys组合到一个DVD-IgG1中来利用Arg：：苯乙二醛和Lys：：β-内酰胺缀合的正交性。值得注意的是，该组装涉及两条不同的重链和两条相同的轻链，使得能够利用结进孔突变用于重链异二聚体化(图10a)(参见，例如Merchant等.，Nat Biotechnol 16，677-681，1998)。以与基于Arg99的异二聚体DVD-IgG1相当的质量和数量表达和纯化异二聚体DVD-IgG1(图10a)，并揭示了与基于Lys99的DVD-IgG1相比催化活性预期降低约50％(图10b)。MMAF的苯乙二醛或β-内酰胺半抗原衍生物(分别为化合物4和5)与异二聚体DVD-IgG1的缀合产生DAR约为1倍的具有高效力和选择性的ADC，尽管IC

为了测试h38C2_Arg和h38C2_Lys的正交缀合化学是否允许一锅式标记具有两个不同载荷的异二聚体DVD-IgG1，我们将TAMRA的苯乙二醛衍生物(化合物1)与近红外荧光染料Cy7的β-内酰胺半抗原衍生物(化合物6；图5)进行组合。在没有间歇性纯化或缓冲液交换步骤的情况下将两种染料依次与异二聚体DVD-IgG1缀合(图12a)。不论缀合顺序如何，一锅式反应均产生相同质量和数量的双标记异二聚体DVD-IgG1。使用还原性SDS-PAGE，发现TAMRA和Cy7荧光二者均局限于重链，如预期那样分别用于与h38C2_Arg和h38C2_Lys进行位点特异性缀合(图12b)。接下来，我们使用相同的一锅式组装用于依次缀合TAMRA的苯乙二醛衍生物(化合物1)和MMAF的β-内酰胺半抗原衍生物(化合物5)。MS证实了具有单个TAMRA和单个MMAF载荷的双标记异二聚体DVD-IgG1作为主要产物，尽管没有TAMRA载荷的MMAF标记的异二聚体DVD-IgG1也是突出的(图13a和b)。值得注意的是，根据MS，化合物1和化合物5的同时而非依次缀合以类似的缀合效率递送双标记的异二聚体DVD-IgG1(图13c)。

双标记使得能够产生可在内化和运输期间直接追踪的荧光ADC。为了研究该效用，我们在不存在和存在胞吞抑制剂氧化苯砷(PAO)的情况下，将HER2阳性SK-BR-3(图14a和图15a)和HER2阴性MDA-MB-231细胞(图14b和图15b)与MMAF/TAMRA标记的异二聚体DVD-IgG1在37℃下孵育4小时，并随后通过共聚焦荧光显微术分析细胞。仅观察到SK-BR-3细胞的内体TAMRA荧光并且在不存在PAO的情况下，这表明HER2介导的内化和运输。用FITC缀合的山羊抗人IgG F(ab’)

实施例5：

细胞系：乳腺癌细胞系SK-BR-3和MDA-MB-231购自ATCC，并且在补充有10％(v/v)热灭活的FBS和1×青霉素-链霉素(含100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素；全部均来自Thermo Fisher)的DMEM中培养。Expi293F细胞在补充有1×青霉素-链霉素(全部均来自Thermo Fisher)的Expi293表达培养基中培养。

h38C2_Arg Fab、DVD-Fab和DVD-IgG1的克隆、表达和纯化：

Fab.h38C2 Fab(Rader等.，J Mol Biol 332，889-899，2003)的轻链(V

DVD-Fab.如在Nanna等.，Nat Commun，8：1112，2017中所述，克隆与分别由曲妥珠单抗的V

DVD-IgG1.如在Nanna等.，Nat Commun，8：1112，2017中所述，使用与DVD-Fab相同的内部(h38C2_Arg)和外部结构域(抗-HER2)编码序列，将DVD-IgG1克隆到pCEP4中。组合h38C2_Arg重链与亲本h38C2_Lys重链的异二聚体DVD-IgG1基于C

h38C2_Arg Fab的结晶和结构确定：在室温(room temperature，RT)下从包含20％(w/v)PEG 3350、40mM硫酸铵和200mM柠檬酸铵(pH4.8)的沉淀剂条件通过蒸汽扩散获得晶体。在高级光源同步加速器设备(Advanced Light Source synchrotron facility)(劳伦斯伯克利国家实验室，Lawrence Berkeley National Laboratory)上在5.0.1光束线上的Pilatus3 6M检测器上收集布拉格间距(Bragg spacing)为

催化活性测定：使用方法学(List等.，Proc Natl Acad Sci U S A 95，15351-15355，1998)分析催化活性，并完全如Nanna等.(上文)中所述进行。

苯乙二醛和β-内酰胺衍生物的合成：化合物1(苯乙二醛-TAMRA)、2(β-内酰胺-半抗原-TAMRA)、3(β-内酰胺-半抗原-叠氮化物)、4(苯乙二醛-MMAF)和6(β-内酰胺-半抗原-Cy7)的合成及其通过

抗体缀台：DVD-Fab与苯乙二醛和β-内酰胺-半抗原衍生物的缀合。将10μM h38C2_Arg和h38C2_Lys DVD-Fab与在50mM HEPES、50mM NaHCO

DVD-IgG1与苯乙二醛和β-内酰胺-半抗原衍生物的缀合。为了产生DVD-IgG1形式的ADC，将10μM同二聚体h38C2_Arg DVD-IgG1或异二聚体h38C2_Arg/h38C2_Lys DVD-IgG1与在PBS(pH 6.6)中的50μM苯乙二醛-MMAF(化合物4)在37℃下孵育3小时。并行地，将10μM同二聚体h38C2_Lys DVD-IgG1或异二聚体h38C2_Arg/h38C2_Lys DVD-IgG1与50μMβ-内酰胺-半抗原-MMAF(化合物5)在RT下孵育4小时。在孵育之后，使用illustra NAP-5柱(GEHealthcare)去除游离化合物，并用Amicon Ultra 0.5-mL离心过滤器将ADC浓缩至在PBS(pH 7.4)中为2mg/mL。

异二聚体DVD-IgG1与苯乙二醛和β-内酰胺-半抗原衍生物的依次和同时一锅式缀合。将PBS(pH 6.6)中的10μM异二聚体h38C2_Arg/h38C2_Lys DVD-IgG1依次与50μM苯乙二醛-TAMRA(化合物1)在37℃下孵育3小时，并随后不经纯化即与β-内酰胺-半抗原-Cy7(化合物6)在37℃下孵育3小时。并行进行相反的顺序(首先是化合物6，然后是化合物1)。将5μg每种缀合混合物上样至10孔NuPAGE 4％至12％Bis-Tris蛋白凝胶上。通过E-凝胶成像仪上的蓝光观察TAMRA缀合并且使用Odyssey CLx成像系统(LI-COR)观察Cy7缀合。通过PageBlue蛋白质染色溶液依次对凝胶进行染色。使用相同的顺序程序，产生与化合物1和化合物5缀合的异二聚体h38C2_Arg/h38C2_Lys DVD-IgG1。对于瞬时缀合，将PBS(pH 6.6)中的10μM异二聚体h38C2_Arg/h38C2_Lys DVD-IgG1同时与50μM化合物1和化合物6在37℃下孵育3小时。

质谱：DVD-Fab.如上所述在将5和10当量的苯乙二醛-TAMRA(化合物1)或5当量的苯乙二醛-MMAF(化合物4)与h38C2_Arg DVD-Fab缀合之后，使用illustra NAP-5柱去除游离化合物并用Amicon Ultra 0.5-mL离心过滤器将缀合的DVD-Fab浓缩至在PBS(pH 7.4)中为1mg/mL。在稀释到水中之后，在Agilent电喷雾电离飞行时间(Electrospray IonizationTime of Flight，ESI-TOF)质谱仪上获得数据。使用Agilent BioConfirm软件获得去卷积质量。

DVD-IgG1.如上所述在将5当量的苯乙二醛-MMAF(化合物4)与h38C2_Arg DVD-IgG1缀合，去除游离化合物并进行浓缩之后，将缀合的DVD-IgG1在RT下用PBS中的50mM DTT还原10分钟，并随后在37℃下通过PNGase F(New England Biolabs)酶促去糖基化过夜。根据制造商的说明，通过蛋白G HP SpinTrap(GE Healthcare)去除该酶。用Amicon Ultra0.5-mL离心过滤器将缀合的DVD-IgG1浓缩至在PBS(pH 7.4)中为2mg/mL。在稀释到水中之后，如上所述获取ESI-TOF数据。在不进行还原的情况下，将与苯乙二醛-TAMRA(化合物1)和β-内酰胺-半抗原-MMAF(化合物5)缀合的异二聚体h38C2_Arg/h38C2_Lys DVD-IgG1去糖基化，并如上所述处理用于ESI-TOF数据获取。

人血浆稳定性测定：为了评估其在人血浆中的稳定性，将PBS中的1mg/mL与苯乙二醛-TAMRA(化合物1)缀合的基于h38C2_Arg的DVD-Fab与等体积的人血浆(Sigma-Aldrich)混合，并在37℃下孵育。在0、6、12、24、48、96、122、196和240小时之后，将2μL等分试样冷冻并储存在-80℃下。在收集所有时间点的等分试样之后，在还原条件下使用10孔NuPAGE 4％至12％Bis-Tris蛋白凝胶通过SDS-PAGE对其进行分析。通过E-凝胶成像仪(ThermoFisher)上的蓝光观察荧光条带，并随后通过PageBlue蛋白质染色溶液对凝胶进行染色。该实验独立进行三次。通过NIH ImageJ软件对0和240小时的条带强度进行定量，并绘制为平均值±SD值。

细胞毒性测定：将SK-BR-3和MDA-MB-231细胞以5×10

尺寸排阻色谱：使用与

表面等离子体共振：使用Biacore试剂和软件(GE Healthcare)在Biacore X100仪器上进行SPR，用于测量未缀合和缀合的DVD-Fab与HER2结合的动力学和热力学参数。使用人抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)提供的试剂和说明，将小鼠抗人IgG C

共聚焦荧光显微术：将SK-BR-3和MDA-MB-231细胞以5×10

实施例6：

一般信息：所有非水性反应均在氩气气氛下在烘箱干燥或火焰干燥的玻璃器皿中进行。除非另有说明，否则所有试剂均购自商业供应商并且无需进一步纯化即可使用。二氯甲烷、四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺通过干燥剂(活化的A1-氧化铝)的溶剂柱纯化。购买甲醇作为试剂级溶剂。在氩气气氛下，从氢化钙蒸馏二异丙基乙胺和三乙胺。所有反应均通过薄层色谱或分析型LCMS进行监测。薄层色谱是在预先涂有0.25mm厚度的Merck TLC硅胶60F254玻璃板上进行的。通过UV光(254nm)、KMnO

方案1.TAMRA-TPG(1)的合成

化合物S1的合成。将四乙二醇(6.0ml，34.8mmol)在THF(17ml)中的溶液冷却至0℃，并添加氢化钠(0.903g，22.59mmol)。将反应在0℃下搅拌1小时。然后将炔丙基溴(1.5ml，16.83mmol)添加至冷却溶液中。使反应升温至室温并搅拌16小时。将反应用冰冷的水淬灭。将混合物用CH

化合物S2的合成。将S1(0.8g，3.44mmol)和三乙胺(1.440ml，10.33mmol)溶解在CH

化合物S3的合成。将S2(986mg，2.55mmol)溶解在DMF(5mL)中并随后添加叠氮化钠(415mg，6.38mmol)。将反应混悬液在50℃油浴中搅拌16小时。然后蒸发DMF。将黄色残留物混悬在二乙醚中。通过装有一小块脱脂棉的注射器过滤掉淡黄色沉淀物。将获得的澄清黄色溶液在减压下干燥。将残留物用硅胶柱色谱(50％EtOAc/己烷至100％EtOAc，用10％PPh-3溶液观察TLC随后是茚三酮染色)纯化。获得作为澄清淡黄色黏性液体的产物(0.37g，57％)。

化合物S4的合成。将S3(370mg，1.438mmol)溶解在THF(3.0ml)中，并添加三苯基膦(754mg，2.88mmol)随后添加水(0.026ml，1.438mmol)。将反应在室温下搅拌6小时。然后将反应物在真空下干燥。将黏性黄色残留物通过硅胶柱色谱(2％至10％CH

化合物S5的合成。将5-TAMRA(20.0mg，0.046mmol)和HATU(17.67mg，0.046mmol)溶解在DMF(250μL)中。向混合物溶液添加DIPEA(40μl，0.229mmol)并在室温下搅拌10分钟。然后将S4(11.82mg，0.051mmol)在DMF(150μl)中的溶液添加至活化的TAMRA溶液。将反应在室温下搅拌1小时(反应的LCMS显示5-TAMRA的完全消耗)。将反应物在真空下干燥并将剩余的残留物通过制备型薄层色谱(5％、7.5％和10％CH

化合物1的合成。在室温下向S5(7.8mg，0.012mmol)和水合4-叠氮苯基乙二醛(3.51mg，0.018mmol)在CH

方案2.叠氮化物-β-内酰胺(2)和TAMRA-β-内酰胺(3)的合成

S6是根据由Magano J.等.(Org.Process Res.Dev.，2014，18：142-151)报道的程序合成的。

S7是根据由Smith B.D.等.(J.Org.Chem.2008，73，第6053至6058页)报道的程序合成的。

1H-NMR(400MHz，氯仿-d)δ3.33(t，J＝6.7Hz，2H)，2.75(t，J＝6.8Hz，2H)，1.68(p，J＝6.8Hz，2H).IR(净相)3371.92，2936.85，2869.87，2089.28.

化合物2的合成。向200μL无水DMF中的S6(15.0mg，0.030mmol)添加S7(6.00mg，0.060mmol)在120μL无水DMF中的溶液。将反应在室温下搅拌1小时。用硅胶柱色谱纯化产物(8.2mg，66％)。

化合物3的合成。向2(9.32mg，0.022mmol)和5(6)-TAMRA-PEG4-炔丙基(7.2mg，0.011mmol)在CH

方案3.MMAF-TPG(4)的合成

化合物S8的合成。将三乙二醇(6ml，44.9mmol)在THF(22.45ml)中的溶液冷却至0℃，并添加氢化钠(1.167g，29.2mmol)。将反应在0℃下搅拌1小时。然后添加炔丙基溴(1.5ml，16.83mmol)。将反应在室温下搅拌16小时。将反应用冰冷的水淬灭，用CH

化合物S9的合成。向S8(200mg，1.063mmol)在THF(0.5ml)中的溶液添加叔丁醇钾(5.96mg，0.053mmol)。然后向反应逐滴添加丙烯酸叔丁酯(177mg，1.381mmol)。将反应在室温下搅拌16小时。将反应用1M HCl中和，然后用CH

化合物S10的合成。向S9(273.0mg，0.863mmol)在CH

化合物S11的合成。将S10(6.15mg，0.024mmol)、HATU(8.09mg，0.021mmol)用DMF(100μl)溶解。然后向溶液添加DIPEA(10.32μl，0.059mmol)。将混合物在室温下搅拌10分钟。然后将MMAF TFA盐(10mg，0.012mmol，Levena Biopharma)在DMF(100μl)中的溶液添加至活性酸溶液。将反应在室温下搅拌1小时。将反应物通过0.2μM PFTE进行过滤并用制备型HPLC(210nm)纯化。蒸发包含产物的级分并冻干以得到作为白色固体的产物。

化合物4的合成。将S11(7.5mg，7.70μmol)与水合4-叠氮基苯乙二醛(2.231mg，0.012mmol)在CH

方案4.Cy7-β-内酰胺(3)的合成

化合物S12的合成。将S6(50.0mg，0.100mmol)溶解在200μLTHF中。然后将2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基-1-胺(36.0mg，0.165mmol)在200μL THF中的溶液添加至反应小瓶。将反应在室温下搅拌16小时。将反应物在减压下浓缩并通过硅胶柱色谱(1％CH

化合物3的合成。将青色素7-炔烃(2.0mg，3.21μmol，Lumiprobe Corporation)和化合物3(2.062mg，3.86μmol)在CH

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因此，已参考上述代表性实施方案对本发明进行了广泛地公开和举例说明。应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行多种修改。还应注意的是，本文中引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的均在此通过引用明确地整体并入，如同每个被单独地如此表示一样。在与本公开内容中的定义冲突的程度上，排除包含在通过引用并入的文本中的定义。