神经调节蛋白用于预防、治疗或延缓心力衰竭的方法和组合物

摘要

本发明涉及纽兰格林蛋白在制备用于预防、治疗或延缓人类心力衰竭的药物中的应用，以及所述用于预防、治疗或延缓人类心力衰竭的药物的使用方法。特别地，本发明提供了预防、治疗或延缓人类心力衰竭的方法，该方法是在患有心力衰竭的特殊人群中使用包含纽兰格林蛋白的药物。特别地，本发明提供了一种使用包含纽兰格林的药物治疗心力衰竭的方法。该方法包含在治疗之前首先对患者进行测试，然后根据测试结果提供恰当的治疗。当测试结果在一个最佳治疗范围时，患者适合通过施用有效剂量的纽兰格林来治疗心衰。

说明书

技术领域

本发明涉及纽兰格林蛋白在制备用于预防、治疗或延缓人类心力衰竭的药物中的应用，以及所述用于预防、治疗或延缓人类心力衰竭的药物的使用方法。特别地，本发明提供了预防、治疗或延缓人类心力衰竭的方法，该方法是在患有心力衰竭的特殊人群中使用包含纽兰格林蛋白的药物。特别地，本发明提供了一种使用包含纽兰格林的药物治疗心力衰竭的方法。该方法包含在治疗之前首先对患者进行测试，然后根据测试结果提供恰当的治疗。当测试结果在一个最佳治疗范围时，患者适合通过施用有效剂量的纽兰格林来治疗心衰。

心力衰竭(heart failure，HF)是各种心脏疾病导致心功能不全的一种综合征。目前治疗心衰的药物主要集中于血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，这些血管舒张剂引起血管扩张、降低血压并减少心脏负荷。虽然使用ACE抑制剂后死亡率的百分数下降是具有统计学差异的，但实际的死亡率仅平均下降3％-4％，并且还有一些潜在的副作用。其他预防或治疗心衰的选择亦有相应的局限。比如，心脏移植显然比药物治疗更昂贵且更具侵入性，并且还进一步受有无供体心脏的限制。使用机械装置，比如双心室心脏起搏器，同样具有侵入性并且比较昂贵。因此，由于当前治疗手段的不足，人们需要有新的治疗方法。

一种很有前途的新的治疗手段涉及给心衰患者或有心衰风险的患者施用神经调节蛋白(neuregulin，NRG，纽兰格林；heregulin，HRG)，又叫神经胶质生长因子(glialgrowth factor,GGF),neu分化因子(new differentiation factor,NDF),为分子量在44KD左右的糖蛋白，它们在细胞间传递信号，是酪氨酸激酶受体ErbB家族的配体。神经调节蛋白家族含4个成员：NRG1，NRG2，NRG3，NRG4(Falls et al.,Exp Cell Res.284:14-30,2003)。NRGs涉及一系列生物学反应：刺激乳腺癌细胞分化和分泌乳汁蛋白；诱导神经嵴细胞分化成Schwann细胞；刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；并且促进心肌细胞成活和DNA合成。用纽兰格林基因严重缺陷的纯合子小鼠胚胎做活体研究证明纽兰格林对于心脏和神经发育是必须的。NRG1在神经系统、心脏和乳腺中起着重要作用，还有证据显示NRG1信号传递在其他一些器官系统的发育、功能以及人类疾病(包括精神分裂症和乳腺癌)的发病机理中起作用。NRG1有很多异构体。对基因突变小鼠(基因敲除小鼠)的研究说明在N末端区或表皮生长因子(EGF)类似区不同的异构体，其在体功能也不一样。本发明是以神经调节蛋白1β(NRG1β)为基础的。

神经调节蛋白1β为一跨膜蛋白(Holmes et al.,Science 256,1205-1210,1992)。膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白类似区(Ig-like domain)和EGF类似区(EGF-likedomain)，膜内部分是C末端。在细胞外基质的金属蛋白酶作用下，神经调节蛋白的膜外部分可被酶切下来而呈游离状态，从而有利于和周围细胞表面的ErbB受体结合，激活相应的细胞信号传递。

ErbB受体家族也分为四类，ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4，它们都是跨膜蛋白，分子量在180-185KD附近。除ErbB2外，它们在膜外的N末端都含配体结合区；除ErbB3外，它们在膜内的C末端都含蛋白酪氨酸激酶活性。其中ErbB1是表皮生长因子的受体，ErbB3和ErbB4都是神经调节蛋白的受体。在神经调节蛋白的受体中，只有ErbB2和ErbB4在心脏表达量较高(Yarden et al.,Nat Rev Mol Cell Biol,2:127-137,2001)。

当神经调节蛋白与ErbB3或ErbB4的膜外部分结合时，将引起ErbB3、ErbB4与其他ErbB受体(常常包括ErbB2)形成异源二聚体，或ErbB4自身形成同源二聚体，然后导致受体的膜内部分被磷酸化(Yarden et al.,Nat Rev Mol Cell Biol,2:127-137,2001)。磷酸化的膜内部分可进一步与细胞内的多种信号传递蛋白结合，从而激活下游ERK或AKT信号通路，引起一系列细胞反应：包括刺激或抑制细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、细胞分化或细胞粘连。

神经调节蛋白对心脏的发育尤其重要(WO0037095，CN1276381，WO03099300，WO9426298，US6444642，WO9918976，WO0064400，Zhao et al.,J.Biol.Chem.273,10261-10269,1998)。在胚胎发育早期，神经调节蛋白的表达主要局限于心内膜，随后通过旁分泌途径释放到周围心肌细胞并与细胞膜上的蛋白酪氨酸激酶受体ErbB4膜外部分结合，ErbB4进而与ErbB2形成异源二聚体。ErbB4/ErbB2复合物的形成及激活对早期海绵样心脏形成小梁是必须的。神经调节蛋白、ErbB4和ErbB2三个蛋白基因中的任何一个缺失都会使胚胎没有小梁并在发育早期死于子宫。WO0037095显示一定浓度的神经调节蛋白可持续激活ERK信号通路，促进心肌细胞的生长及分化，引导心肌细胞和细胞粘连处肌节和细胞骨架的重建，改善心肌细胞的结构，增强心肌细胞的收缩。WO0037095及WO003099300还指出神经调节蛋白可用于检测、诊断和治疗各种心血管疾病。

下面列举了与本发明有关的一些现有技术文献：1.Cardiac muscle functionand manipulation:WO0037095；2.生长因子神经调节蛋白及其类似物的新应用：CN1276381；3.Neuregulin based methods and composition for treatingcardiovascular diseases:WO03099300；4.Zhao YY,Sawyer DR,Baliga RR,Opel DJ,HanX,Marchionni MA and Kelly RA.Neuregulins Promote Survival and Growth ofCardiac Myocytes.J.Biol.Chem.273,10261-10269(1998)；5.Methods for treatingmuscle diseases and disorder:WO9426298；6.Methods of increasing myotubeformation or survival or muscle cell mitogenesis,differentiation or survivalusing a neuregulin:US6444642.7.Therapeutic methods comprising use of aneuregulin:WO9918976；8.Methods for treating congestive heart failure:WO0064400；9.Holmes WE,Sliwkowski MX,Akita RW,Henzel WJ,Lee J,Park JW,YansuraD,Abadi N,Raab H,Lewis GD,et al.Identification of heregulin,a specificactivator p185erbB2.Science 256,1205-1210(1992)；10.Falls DL.Neuregulins:functions,forms and signalingstrategies.Experimental Cell Research,284,14-30(2003).11.Yarden Y,Sliwkowski X.Untangling the ErbB signaling Network.NatureReviews:Molecular Cell Biology,2127-137(2001).

已有研究表明NRG-1的EGF样类似区，约50至64个氨基酸，足以结合并活化这些受体。以前的研究表明纽兰格林-1β(NRG-1β)能以高亲和力直接结合ErbB3和ErbB4。孤儿受体ErbB2能与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体并且其亲和力比ErbB3或ErbB4同源二聚体要高。神经发育的研究结果提示交感神经系统的形成需要完整的NRG-1β、ErbB2和ErbB3信号传导系统。靶向破坏NRG-1β、或ErbB2或ErbB4后由于心脏发育缺陷而导致胚胎致死。最近的研究也突显了NRG-1β、ErbB2和ErbB4在心血管发育以及维持成年正常心脏功能方面具有重要作用。研究表明NRG-1β能增强成年心肌细胞的肌小节的组织结构。施用一种重组的NRG-1βEGF样类似区能够显著改善或防止不同心衰动物模型的心肌功能的恶化，在临床试验中也有同样效果。但是如何使用这种产品或组合物，如何在一些亚人群上取得更好的治疗效果，还需要更多的研究。本发明提供了一种使用包含纽兰格林的药物治疗心力衰竭的方法。该方法包含在治疗之前首先对患者进行测试，然后根据测试结果提供恰当的治疗。当测试结果在一个最佳治疗范围时，患者适合通过施用有效剂量的纽兰格林来治疗心衰。

发明内容

A.发明概述

在纽兰格林治疗心衰的临床试验中，申请人发现通过纽约心脏协会(NYHA)心功能分级或者检测患者血浆中NT-proBNP或BNP水平筛选出来的心衰病人经纽兰格林治疗后能够取得显著的疗效。这些疗效包括死亡率显著下降。这些疗效包括再入院治疗显著减少。NRG还能够显著改善或防止不同心衰动物模型和临床试受试者的心肌功能恶化。纽兰格林，纽兰格林多肽，纽兰格林突变体，纽兰格林衍生物,具有NRG样功能域的复合物或者具有纽兰格林类似活性的化合物都属于本发明的范畴。

本发明的第一方面，提供了一种用于治疗心力衰竭的包含有效剂量神经调节蛋白的药物组分，并且接受该药物组分治疗的患者能够取得显著疗效。在一些实施例中，疗效是死亡率显著下降。在一些实施例中，疗效是再入院治疗显著减少。在一些实施例中，疗效是表征慢性心力衰竭改善的生物标记物水平提高。在一些实施例中，药物组分通过导入疗程施用于患者。在一些实施例中，导入疗程给药方案包括连续施用该药物组分至少3,5,7或10天。在一些优选的实施例中，导入疗程给药方案结束后，维持施用该药物组分至少3,6或12个月。在一些优选的实施例中，维持疗程给药方案包括每3,5,7或10天施用该药物组分。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是女性。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者和治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过1600fmol/ml的男性心衰患者。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者。

本发明的另一方面，为慢性心衰患者提供了一种提高生存率或降低死亡率的方法，包括对慢性心衰病人施用一种含有效剂量神经调节蛋白的药物组分。在一些实施例中，药物组分通过导入疗程施用于患者。在一些优选的实施例中，导入疗程给药方案包括连续施用该药物组分至少3,5,7或10天。在一些优选的实施例中，导入疗程给药方案结束后，维持施用该药物组分至少3,6或12个月。在一些优选的实施例中，维持疗程给药方案包括每3,5,7或10天施用该药物组分。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是女性。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者和治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过1600fmol/ml的男性心衰患者。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者。

本发明的另一方面，提供了纽兰格林蛋白在药物制备方面的应用。该药物能为慢性心力衰竭患者提供长期疗效。在一个实施例中，长期疗效指提高生存率。在一个实施例中，长期疗效指减少再入院率。在另一个实施例中，长期疗效指能够表征慢性心衰长期预后的生物标记物的改善(降低)。在一些实施例中，该药物通过导入疗程施用于患者。在一些优选的实施例中，导入疗程给药方案包括至少连续3,5,7或10天施用该药物。在一些优选的实施例中，导入疗程给药方案结束后，对病人进行至少3,6或12个月的维持给药。在一些优选的实施例中，维持疗程给药方案包括每3,5,7或10天施用该药物。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是女性。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者和治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过1600fmol/ml的男性心衰患者。在一个优选的实施例中，治疗的心衰患者是治疗前NT-proBNP的血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者。

本发明的另一方面，提供了一种筛选适合用纽兰格林治心衰的患者的方法。该方法包括检测患者的NT-proBNP血浆水平。在一个实施例中，NT-proBNP血浆水平不超过4000fmol/ml表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个实施例中，NT-proBNP血浆水平为1600fmol/ml到4000fmol/ml表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个实施例中，NT-proBNP血浆水平不超过1600fmol/ml表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个优选的实施例中，NT-proBNP血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个优选的实施例中，NT-proBNP血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者和NT-proBNP血浆水平不超过1600fmol/ml的男性心衰患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个优选的实施例中，任何NT-proBNP血浆水平的女性心衰患者适合用纽兰格林治疗心衰。

本发明的另一方面，提供了一种筛选适合用纽兰格林治疗心衰的患者的方法。该方法包括用纽约心脏协会(NYHA)心功能分级法来评估心脏功能。在一个实施例中，NYHA II级表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个实施例中，NYHAIII级表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。

本发明的另一方面，提供了一种使用纽兰格林治疗慢性心力衰竭的方法。该方法包括治疗前的评估程序和根据该评估结果决定患者是否适合接受纽兰格林治疗。在一些实施例中，评估程序包括慢性心衰患者的NYHA心脏功能评级。在另一个实施例中，评估程序包括检测每一个慢性心衰病人的血浆NT-proBNP或BNP水平。

本发明的另一方面，提供了一种诊断试剂盒，用来筛选适合用纽兰格林治疗的心衰患者。在一个实施例中，该诊断试剂盒包含用于测量心衰患者NT-proBNP血浆水平的免疫分析试剂，其中不超过4000fmol/ml的水平表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个实施例中，NT-proBNP血浆水平为1600fmol/ml到4000fmol/ml表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个实施例中，NT-proBNP血浆水平不超过1600fmol/ml表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个优选的实施例中，NT-proBNP血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者适合用纽兰格林治疗心衰。

本发明的另一方面，为纽兰格林治疗慢性心衰提供了一个伴随的诊断测试。N-末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)作为诊断测试的生物标记物。在一些实施例中，不超过4000fmol/ml的水平表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个实施例中，1600fmol/ml到4000fmol/ml的水平表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个实施例中，NT-proBNP血浆水平不超过1600fmol/ml表明该患者适合用纽兰格林治疗心衰。在另一个优选的实施例中，NT-proBNP血浆水平不超过3000fmol/ml的女性心衰患者适合用纽兰格林治疗心衰。

本发明的另一方面，提供了一种能够确定心衰病人是否适合接受纽兰格林治疗的伴随诊断试剂盒。该伴随诊断试剂盒包含一个检测血浆NT-proBNP或BNP水平的试剂盒和一个如何使用该试剂盒以及如何根据试验结果判断患者是否适合接受纽兰格林治疗的说明书。

本发明的另一方面，提供了一种药盒。这种药盒包括一个或多个含有效治疗剂量纽兰格林蛋白的容器，其中所含蛋白可为单独的纽兰格林蛋白，或与其他药物可接受物质形成组合物。优选的药物形式可与无菌生理盐水、葡萄糖溶液、缓冲溶液或其他药物可接受的无菌溶液结合。作为一种选择，组合物可被冻干或干燥。在一个实施例中，本发明的药盒进一步包括一个针头或注射器，其最好为无菌包装，用于注射，和/或有一个包装好的酒精棉块。在另一个实施例中，本发明的药盒进一步包括说明书，说明书可视情况包括医生或病人使用该药物组份的方法。在另一个优选的实施例中，本发明的药盒包含有效剂量的NRG和诊断试剂盒，该诊断试剂盒包含用于测量心衰患者NT-proBNP血浆水平的免疫分析试剂。

本发明的另一方面，对慢性心衰病人施用药物有效剂量的神经调节蛋白，治疗之前这些患者的NT-proBNP血浆水平处在合适的治疗范围内。在一个实施例中，合适的治疗范围是不超过4000fmol/ml。在另一个实施例中，合适的治疗范围是在1600fmol/ml至4000fmol/ml之间。在另一个实施例中，合适的治疗范围是不超过1600fmol/ml。在另一个优选的实施例中，女性心衰患者合适的治疗范围是不超过3000fmol/ml。在另一个优选的实施例中，通过免疫分析来测定血浆水平。

本发明的另一方面，对慢性心衰病人施用药物有效剂量的神经调节蛋白，这些患者的心功能具体等级是由美国心脏协会(NYHA)心功能分级方法所评定的。在一些实施例中，心功能的特定级别为NYHA II级。在一些实施例中，心功能的特定级别为NYHAIII级。

B.定义

除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。

除非在上下文中明确表明，否则本说明书及其所附权利要求书中，所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括相应的复数参考，并与“至少一个”或“一个或多余一个”可互换使用。

此处所用“神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”是指能够结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的蛋白或多肽，包括神经调节蛋白的异构体、神经调节蛋白中的EGF样功能域、包含神经调节蛋白EGF样功能域的多肽、神经调节蛋白的突变体或衍生物以及其它能够激活上述受体的神经调节蛋白样的基因产物。神经调节蛋白还包括NRG-1，NRG-2，NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG样功能的复合物。优选的，神经调节蛋白是可以结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体的蛋白或多肽。作为例子，但并非为了限制的目的，本发明的神经调节蛋白是NRG-1β2异构体的一个片段，即177-237位氨基酸片段，其中包含了EGF样功能域。该片段的氨基酸序列为：SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ(SEQ ID NO:1)。本发明所用神经调节蛋白可以激活上述受体并调节它们的生物学功能，比如刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；促进心肌细胞的分化、存活以及DNA合成。神经调节蛋白还包括那些具有并不实质性影响生物学功能的保守性突变的神经调节蛋白突变体。本技术领域中普通技术人员熟知，非关键区域的单个氨基酸的突变一般不会引起该蛋白或多肽的生物学功能的改变(参见Watson等人,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Bejacmin/Cummings Pub.co.,p.224)。本发明所用神经调节蛋白可以从天然的来源分离得到，或者通过重组技术、人工合成或其它手段得到。

此处所用“表皮生长因子样功能域”或“EGF样类似区”或“EGF样功能域”是指由neuregulin基因所编码的可以结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的多肽片段，并且与下述参考文献中描述的EGF受体结合区域具有结构相似性：WO 00/64400；Holmes等，Science,256:1205-1210(1992)；美国专利5,530,109和5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.,13:1061-1067(1998)；Chang等，Nature，387:509-512(1997)；Carraway等，Nature，387:512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochem.,122:675-680(1997)；以及WO97/09425。在某些实施方案中，EGF样功能域结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-1的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域是指NRG-1的第177-226位、177-237位或177-240位氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-2的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-3的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-4的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含美国专利5,834,229中描述的氨基酸序列：AlaGlu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp LeuSer Asn Pro。

纽兰格林蛋白的剂型、剂量和给药途径、更好的药物组合物形式，能够根据本领域已知的方法来确定(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,1997.4；Therapeutic Peptidesand Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems,Banga,1999；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,Hovgaard andFrkjr(Ed.),Taylor&Francis,Inc.,2000；Medical Applications of Liposomes,Lasicand Papahadjopoulos(Ed.),Elsevier Science,1998；Textbook of Gene Therapy,Jain,Hogrefe&Huber Publishers,1998；Adenoviruses:Basic Biology to Gene Therapy,Vol.15,Seth,Landes Bioscience,1999；Biopharmaceutical Drug Design andDevelopment,Wu-Pong和Rojanasakul(Ed.),Humana Press,1999；TherapeuticAngiogenesis:From Basic Science to the Clinic,Vol.28,Dole等(Ed.),Springer-Verlag New York,1999)。

纽兰格林蛋白，可被制成口服给药、直肠给药、局部给药、吸入给药、口腔给药(如舌下给药)、非肠道给药(如皮下注射、肌肉注射、皮内注射或静脉注射)、经皮给药或者其他合适的给药方式的制剂。在所有给药方式中，最合适的给药途径取决于治疗状况的性质和严重程度，以及所使用特殊纽兰格林蛋白的性质。纽兰格林蛋白可以单独给药。或者更适宜的，纽兰格林蛋白可以与一些药物可接受的载体或赋形剂共同给药。任何适宜的药物可接受载体或赋形剂能够用于目前的方法(参见如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,April 1997)。

根据本发明，单独的纽兰格林蛋白或其与其他介质、载体、赋形剂结合所制成的不同制剂，适用于各种适当的给药途径，例如海绵窦内注射，皮下注射，静脉注射，肌肉注射，皮内注射，口服或口腔给药。方法可采用单位剂型的注射剂，装在安瓶或多剂量容器中，添加防腐剂。剂型可采用混悬液、溶液、在水或油介质中的乳剂，并且可包含悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以为粉末状，在使用前用一种合适的介质，如无菌无热源水或其他溶剂溶解。本发明中局部给药可以制成泡沫，凝胶，药膏，透皮贴剂或糊剂等。

本发明所采用的药物可接受组分和相应的给药方式包括但不限于美国专利5,736,154；6,197,801B1；5,741,511；5,886,039；5,941,868；6,258,374B1；和5,686,102所公布的内容。

用于治疗或预防的药物剂量大小会由于患者的严重程度和给药途径的不同而不同。给药剂量，或给药频率，也因每个病人的年龄、体重、条件和反应不同而不同。

需要注意的是，主治医生应该知道如何及何时根据毒性或不良反应去终止、中断或调整治疗剂量至低剂量。相反的，如果临床反应不足，医生也应该知道如何及何时去调整治疗至高水平。

任何适合的给药途径都能够被使用。剂型包括片剂，锭剂，扁囊剂，分散剂，混悬剂，溶液，胶囊，贴剂等等，参见《Remington’s Pharmaceutical Sciences》。在实际应用中，单独的纽兰格林蛋白作为活性物质或其与其他药物载体、赋形剂，如β-环糊精，2-羟基-丙基-β-环糊精，按照常见的药物配制技术组合成混合物。根据给药途径不同，局部给药或非胃肠道用药，所需要的载体形式也不同。在制备非胃肠道给药剂型中，如静脉注射或灌注，可采用本领域技术人员所熟知的药物媒介，如水，乙二醇，油，缓冲液，糖，防腐剂，脂质体等。类似的非胃肠道组分包括，但不限于5％w/v葡萄糖，生理盐水或其他溶液。单独的纽兰格林蛋白，或其与其他物质形成的组合物，被制成静脉注射液盛于药瓶中，容量范围从1ml到2000ml不等。稀释液的容量将根据给药的总剂量不同而不用。

本发明也提供了一种药盒来实施本发明的给药方案。这种药盒包括一个或多个含有效治疗剂量纽兰格林蛋白的容器，其中所含蛋白可为单独的纽兰格林蛋白，或与其他药物可接受物质形成组合物。优选的药物形式可与无菌生理盐水、葡萄糖溶液、缓冲溶液或其他药物可接受的无菌溶液结合。作为一种选择，组合物可被冻干或干燥。在这种情况下，药盒可视情况进一步包含一种药物可接受的溶液，最好为无菌溶液，当需要注射时，与组合物配成溶液。典型的药物可接受溶液是生理盐水和葡萄糖溶液。

在另一个实施例中，本发明的药盒进一步包括一个针头或注射器，其最好为无菌包装，用于注射，和/或有一个包装好的酒精棉块。说明书可视情况包括医生或病人使用该药物组份的方法。

此处所用的“治疗”或“处理”是指可以使不适、紊乱或疾病的症状改善或向好的方向改变的任何方式。其效果可以是预防性的，完全或部分防止某一疾病或其症状发生，也可以是治疗性的，部分或完全治愈某一疾病和/或该疾病引起的不利影响。治疗还包括此处所述组合物的任何药物用途。

此处所用“心力衰竭”是指一种心脏功能的异常，在这种情况下，心脏不能按照组织代谢的需要进行供血。心力衰竭包括多种疾病状态比如充血性心力衰竭，心肌梗死，心律失常，家族性肥厚性心肌病，缺血性心脏病，特发性心肌病和心肌炎等之类的。心力衰竭可由多种因素导致，包括但不限于缺血性，先天性，风湿性，病毒性、毒性或特发性心力衰竭。慢性心脏肥大是一种显著的充血性心力衰竭前期的疾病状态，其可以引起心脏停搏。

除上下文另有说明，此处所用“蛋白”与“多肽”、“肽段”含义一致。

除上下文另有说明，此处所用“血浆”与“血清”含义一致。

除上下文另有说明，此处所用“不超过”是指“小于等于”。

此处所用“长期疗效”是指短期内可能无法观察到的由治疗或干预所引起的疗效。对于慢性心力衰竭患者而言，长期疗效可能是提高生存率，减少入院再治疗率，或是表征长期预后的生物标记物改善。在一些实施例中，观察疗效的时间期限约为6个月。在一些实施例中，观察疗效的时间期限约为1年。在一些实施例中，观察疗效的时间期限约为2年。在其他的实施例中，观察疗效的时间期限约为3年，5年，10年或更长。

此处所用“存活”是指机体保持活力或生存的时间或几率，可以用生存时间或生存率来表达。生存时间是指从诊断或治疗开始到生命结束的时间期限。生存率是指在诊断或治疗的一段时间期限内存活下来的患者百分比。对于单个个体来说，经治疗或干预后延长生存时间可被视为疗效。对于一组个体或大量人群来说，延长平均生存时间或提高生存率被视为疗效。

此处所用“再入院治疗”是指在一定时期内病人需要去医院治疗的次数或频率。入院可能是由各种条件引起的，或者仅由正在治疗中的同样条件引起的。对于每个个体来说，在一定时期内减少再入院治疗的次数可被认为是疗效。对于一组个体或大量人群来说，减少再入院治疗的总次数或平均时间被视为疗效。

此处所用“N端脑利钠肽”或“NT-proBNP”是指无活性的N端脑利钠肽(BNP)前体片段，pro-BNP是BNP的前体，BNP是一种与激素有关的活性钠尿肽，主要由左心室壁的心肌细胞释放。在心肌壁的伸缩作用下，前激素proBNP经过蛋白酶切，分裂成BNP和无活性的NT-proBNP。

在怀疑或确定心衰的日常处理中，测定BNP和NT-proBNT的血浆水平是非常有前景的手段。大多数有关BNP和NT-proBNP在临床上的应用提出了它们的诊断特性，并有越来越多的证据可以支持BNP和NT-proBNP的预后价值。由于NT-proBNP在血液中的半衰期是BNP的6倍，所以它是使用更广泛的心衰诊断或预后指标。血浆中的NT-proBNP水平可以由商业化药盒分析。为了举例说明而非限制，商业化药盒来自Roche或Biomedica公司。

BNP和NT-proBNP在血浆中的水平都可以用作筛选、诊断心衰，并且对建立心衰的预后非常有用，这是由于这两种标记物在病情恶化的患者身上典型升高。并且，本发明发现BNP或NT-proBNP水平可以指示适合用纽兰格林治疗心衰的患者。

此处所用“纽约心脏协会”或“NYHA”心脏功能分级是一种简单的划分心力衰竭程度的方法。它根据患者身体活动能力的限制程度将患者分为4类。限制或症状是指正常呼吸和不同程度的呼吸困难和/或心绞痛：I，无症状并且普通的活动量不受限制，例如当走路，爬楼梯等时呼吸困难；II,轻度症状(轻度呼吸困难和/或心绞痛)并且普通的活动受到轻度的限制；III,体力活动显著受限制，甚至在少于正常活动量的情况下，例如，短距离行走(20-100m)，休息时尚感舒适；IV，严重限制活动量，即使在休息时也有症状，大多数病人卧床不起。

此处所用“活性单位”或“EU”或“U”是指能诱导50％最大活性反应的标准产品的用量。换句话说，为了测定某一活性制剂的活性单位，必须测定EC50。例如，如果某一产品的EC50是0.1μg，则这个量就是1个单位。进一步讲，如果使用了1μg该产品，就是使用了10EU(1/0.1)。可以用本领域已知的任何方法来测定EC50，包括下面的实施例中发明人所使用的方法。活性单位的测定对于基因工程产品和临床使用药物的质量控制是重要的，这样可以使不同药品和/或不同批次的产品以同样的标准来定量。

以下简要描述本发明中所采用的一种快速、敏感、高通量并定量的检测NRG-1生物活性的方法，其主要利用NRG可以结合并激活细胞表面的ErbB3和ErbB4受体，并间接导致ErbB2受体磷酸化的特性(参见Michael D.Sadick等,1996,Analytical Biochemistry,235:207-214以及WO03/099300)。

简而言之，该方法名为激酶受体活化酶联免疫吸附试验(kinase receptoractivation enzyme-linked immunosorbant assay，KIRA-ELISA)，其主要包括两块分开的微孔板。其中一块微孔板进行细胞培养、配体刺激、细胞裂解和受体溶解。而另一微孔板则进行受体捕获和磷酸化ELISA检测。该方法用于检测NRG蛋白诱导的贴壁的乳腺癌细胞系MCF-7的ErbB2受体活化水平。用Triton-X100裂解液来溶解膜蛋白，其中游离的ErbB2受体被包被在ELISA孔中的与ErbB3或ErbB4无交叉反应的ErbB2特异性抗体捕获，并通过抗磷酸酪氨酸ELISA检测所捕获的ErbB2受体的磷酸化水平。制出有重复性的标准曲线，heregulinβ1(177-244)的EC50值大约为360pM。当相同的样品分别用KIRA-ELISA法和定量的抗磷酸酪氨酸Western Blot法检测ErbB2受体的磷酸化水平时，可以发现这两种方法所测的结果具有非常紧密的关联性。此处所描述的分析方法可具体地量化ErbB2酪氨酸磷酸化水平，该磷酸化是HRG蛋白同ErbB3和/或ErbB4受体作用的结果。

由于大多数基因工程药物是蛋白质或多肽类，它们的活性可通过其氨基酸序列或空间结构组成的活性中心所决定。蛋白质或多肽类的活性效价与它们的绝对量并不一致，所以不能像化学药物一样用重量单位来计量。然而，基因工程药物的生物活性一般同药效学和效价确定方法一致，该方法可以通过给定的生物活性确定其效价单位。因此，确定生物活性是定量活性物质过程的一部分，同时也是基因工程产物的质量控制的重要组成部分。生物活性标准的建立对于基因工程产物和临床用药的质量控制是相当重要的。

能引起最大反应50％的标准品的用量被定义为1个活性单位(1EU)。因此，不同的药物或不同批次的产品能用统一的标准来定量。

具体实施方式

实施例1：随机、双盲、多中心、标准治疗基础上的安慰剂并行对照评价重组人纽兰格林对慢性心力衰竭患者的生存研究(209试验)

为了评价注射用重组人纽兰格林-1对慢性心力衰竭的疗效，在中国的多个临床中心进行了双盲、多中心、标准治疗基础上的安慰剂并行对照的II期临床试验。共有351位心功能为NYHA III或IV级的慢性心力衰竭入组，并被随机分为安慰组或rhNRG组(0.6μg/kg)。各组之间在统计学和背景治疗方面无显著性差异。按照计划，病人在医院连续10天施用药物，第11天允许出院。从第3周到第25周做为门诊病人每周用药一次。采集病人治疗前，和每次用药后的血样。血浆NT-proBNP水平在核心实验室里检测(试剂盒来自Biomedica)。在该研究的第52周采集生存信息。

受试药物：

规格：rhNRG-1，61个氨基酸构成Neuregulin-1β2异构体的EGF类似功能域，分子量为7054Dal(1μg＝0.14nmol)。

安慰剂：

规格：rhNRG-1的赋形剂(250μg/支，不含重组人纽兰格林-1蛋白活性成分)

给药方案：

临床试验的入组标准包括年龄为18-65岁、左心室射血分数(LVEF)≤40％的慢性心衰患者(NYHA心功能分级III或IV级)，临床症状稳定(包括临床症状、体征和接受心衰标准基础治疗已达目标剂量或最大耐受量1个月以上)。主要的排除标准包括急性心肌梗死，肥厚型心肌病，缩窄性心包炎，明显的瓣膜病变或先天性心脏病，重度肺动脉高压，收缩压<90mmHg或>160mmHg，严重室性心律失常，前6个月内有心脏外科治疗或脑血管意外者，幽闭恐惧症或怀孕女性。所用患者均需理解并签署知情同意书。

实施例2：多中心、随机、双盲、标准治疗基础上的安慰剂平行对照评价重组人纽兰格林对慢性心力衰竭患者的生存研究(301试验)

为了评价注射用重组人纽兰格林-1对慢性心力衰竭的疗效，在中国的多个临床中心进行了双盲、多中心、标准治疗基础上的安慰剂并行对照的III期临床试验。共有331位心功能为NYHA III或IV级的慢性心力衰竭入组，并被随机分为安慰组或rhNRG组(0.6μg/kg)或rhNRG组(1.0μg/kg)。各组之间在统计学和背景治疗方面无显著性差异。按照计划，病人在医院连续10天施用药物，第11天允许出院。从第3周到第25周做为门诊病人每周用药一次。采集病人治疗前，和每次用药后的血样。血浆NT-proBNP水平在核心实验室里检测(试剂盒来自Biomedica)。在该研究的第52周采集生存信息。

受试药物：

规格：rhNRG-1，61个氨基酸构成Neuregulin-1β2异构体的EGF类似功能域，分子量为7054Dal(1μg＝0.14nmol)。

安慰剂：

规格：rhNRG-1的赋形剂(250μg/支，不含重组人纽兰格林-1蛋白活性成分)

给药方案：

临床试验的入组标准包括年龄为18-80岁、左心室射血分数(LVEF)≤40％的慢性心衰患者(NYHA心功能分级III或IV级)，临床症状稳定(包括临床症状、体征和接受心衰标准基础治疗已达目标剂量或最大耐受量1个月以上)。主要的排除标准包括急性心肌梗死，肥厚型心肌病，缩窄性心包炎，明显的瓣膜病变或先天性心脏病，重度肺动脉高压，收缩压<90mmHg或>160mmHg，严重室性心律失常，前6个月内有心脏外科治疗或脑血管意外者，幽闭恐惧症或怀孕女性。所用患者均需理解并签署知情同意书。

实施例3：多中心、随机、双盲、标准治疗基础上的安慰剂平行对照评价重组人纽兰格林对慢性心力衰竭患者的生存研究(305试验)

为了评价注射用重组人纽兰格林-1对慢性心力衰竭的疗效，在中国的多个临床中心进行了双盲、多中心、标准治疗基础上的安慰剂并行对照的III期临床试验。共有679位心功能为NYHA II或III级的慢性心力衰竭入组，并被随机分为安慰组或rhNRG组(0.6μg/kg)。各组之间在统计学和背景治疗方面无显著性差异。按照计划，病人在医院连续10天施用药物，第11天允许出院。从第3周到第25周做为门诊病人每周用药一次。采集病人治疗前，和每次用药后的血样。血浆NT-proBNP水平在核心实验室里检测(试剂盒来自Biomedica)。在该研究的第52周采集生存信息。

受试药物：

规格：rhNRG-1，61个氨基酸构成Neuregulin-1β2异构体的EGF类似功能域，分子量为7054Dal(1μg＝0.14nmol)。

安慰剂：

规格：rhNRG-1的赋形剂(250μg/支，不含重组人纽兰格林-1蛋白活性成分)

给药方案：

临床试验的入组标准包括年龄为18-75岁、左心室射血分数(LVEF)≤40％的慢性心衰患者(NYHA心功能分级II或III级)，临床症状稳定(包括临床症状、体征和接受心衰标准基础治疗已达目标剂量或最大耐受量1个月以上)。主要的排除标准包括急性心肌梗死，肥厚型心肌病，缩窄性心包炎，明显的瓣膜病变或先天性心脏病，重度肺动脉高压，收缩压<90mmHg或>160mmHg，严重室性心律失常，前6个月内有心脏外科治疗或脑血管意外者，幽闭恐惧症或怀孕女性。所用患者均需理解并签署知情同意书。

申请人对三项独立临床试验的数据进行了统计分析。包含全部女性受试者(包括纽约心功能分级NYHA II-IV级的轻、中度与重度患者)的三个独立试验合并分析数据表明：与标准治疗基础上的安慰剂对照组相比，女性用药组受试者获得了统计学显著的生存率获益(P＝0.016)。在研究周期内，受试者相对全因死亡率降低达50％以上。在每个独立试验中，全部女性用药组受试者都显示出生存率获益，与三个试验合并分析的趋势一致。

合并分析显示在研究周期内，整体而言受试者基线期NT-proBNP水平越低，生存获益(全因死亡率相对降低幅度)越大；在基线期NT-proBNP水平不超过3000fmol/mL的女性受试者中，用药组女性受试者死亡率为0％，而标准治疗基础上的安慰剂对照组全因死亡率为近10％，受试者生存获益统计学极其显著(P<0.001)。各独立试验也展现出与合并分析一致的女性受试者生存获益趋势。

临床结果表明，重组人纽兰格林-1对轻中度心衰患者更有效的发现与经主动脉缩窄诱发的心衰大鼠模型结果一致。表明当心衰进入偏心肥大和泵血功能衰竭的更严重阶段，ErbB2和ErbB4受体表达明显下调。因此，在心衰的早期阶段，也即ErbB2/ErbB4受体表达下调之前，重组人纽兰格林-1能为患者带来更大受益。

表1.全因死亡率-亚组分析总结：(对209/301/305研究进行数据汇总分析)

缩写：LVEF＝左心射血分数；N＝分析总量；n＝特定类别数量；NYHA＝美国纽约心脏病学会心力衰竭分级

分析发现基线NT-proBNP<1600fmol/ml时，无论男性还是女性受试者，重组人纽兰格林-1均显示出统计学上显著降低死亡率(表1)，但这一结论并不适用于具有较高基线NT-proBNP的两性合并数据分析。进一步分析发现，重组人纽兰格林-1在所有接受测试的女性受试者中均显示出统计学上显著降低死亡率(表1)。在单项研究209、301和305中也发现了女性受试者具有相同趋势，如表2所示。

表2.全因死亡率-亚组分析总结：单项临床试验(209/301/305分析)

缩写：LVEF＝左心射血分数；N＝分析总量；n＝特定类别数量；NYHA＝美国纽约心脏病学会心力衰竭分级

由于女性受试者在汇总研究和单项研究中均显示出更好的死亡率改善，因此基于女性受试者的基线期NT-proBNP百分位数进行了进一步的亚组分析。亚组包括NT-proBNP<1600fmol/ml(～50％)，NT-proBNP<3000fmol/ml(～75％)和所有女性患者，对这些亚组进行汇总和单项分析，如表3所示。

在三项临床研究209、301和305的汇总分析中发现，在女性重组人纽兰格林-1治疗组患者的三个亚组NT-proBNP<1600，NT-proBNP<3000fmol/ml和所有女性用药患者的死亡率分别为0％、0％和7.1％。这三个亚组相对应的安慰剂组的死亡率分别为8.4％，10.4％和16.1％，表明重组人纽兰格林-1能显著降低死亡率,尤其是在NT-proBNP<3000fmol/ml的亚组中，约占注册女性受试者的75％，如表3所示。

在209、301和305单项试验研究分析中发现，女性重组人纽兰格林-1治疗组NT-proBNP<3000fmol/ml亚组的死亡率分别为0％，0％和0％，而相对应的安慰剂组死亡率分别为21.4％，8.3％和6.3％，如表3所示。

对于男性患者，在NT-proBNP<4000fmol/ml或NT-proBNP<3000fmol/ml的亚组中，部分临床试验显示，重组人纽兰格林-1治疗组的死亡率优于安慰剂组。但更优选的是，对于NT-proBNP<1600fmol/ml的男性受试者，在三项临床研究209、301和305的汇总分析中，发现重组人纽兰格林-1治疗组与安慰剂组相比，治疗组的死亡率都有一致性的大幅降低(2.6％vs 5.6％)，与NT-proBNP<1600fmol/ml的所有性别受试者的综合分析一致。

表3.全因死亡率-女性亚组分析总结：(209/301/305研究数据汇总分析&单项分析)

基于以上分析，将三项临床试验中的NT-proBNP<3000fmol/ml的女性受试者和NT-proBNP<1600fmol/ml的男性受试者，进行单项和汇总分析，如表4所示。在这些男性和女性组合的受试者中重组人纽兰格林-1治疗组的死亡率结果均明显优于安慰剂。

表4.全因死亡率-亚组分析总结：(209/301/305研究数据汇总分析&单项分析)

上述列举的实施例不会限制本发明的保护范围。在没有背离本发明的宗旨和范围的情况下，本技术领域内的技术人员可以对本发明进行调整和改变。因此，本发明的保护范围应当根据权利要求来定义，而不是通过具体的实施例来限定。

序列表

<110> 上海泽生科技开发股份有限公司

<120> 神经调节蛋白用于预防、治疗或延缓心力衰竭的方法和组合物

<150> CN202010113391.3

<151> 2020-02-24

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 61

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn

1 5 10 15

Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr

35 40 45

Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln

50 55 60