一种检测大肠埃希菌O157的分离培养基及其制备方法

摘要

本发明提供了一种检测大肠埃希菌O157的分离培养基及其制备方法。该检测大肠埃希菌O157的分离培养基包括示蛋白胨、鼠李糖、肌醇、山梨醇、蛋白胨、琼脂、3号胆盐、中性红、结晶紫、亚碲酸钾、头孢克肟和β‑半乳糖苷酶显色底物。本发明提供的分离培养基中添加了示蛋白胨、鼠李糖、肌醇、山梨醇和5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑β‑半乳糖苷，并优化了各个组分的含量，不仅降低了假阳性率，同时通过颜色的差异快速辨别大肠埃希菌O157:H7，提高了培养基的特异性且成本未有显著增加。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种检测大肠埃希菌O157的分离培养基及其制备方法。

背景技术

大肠埃希菌O157:H7/HM是一种严重危害人类健康的食源性致病菌，可导致非血性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症，甚至死亡。该菌也是肠道出血性或产志贺毒素大肠埃希菌(EHEC或STEC)中最主要的致病血清型。大肠埃希菌O157:H7/HM能够感染肉类、蔬菜、牛奶、果汁和饮用水等多种食品，已在全球多个国家引发了食品安全问题，因此大肠埃希菌O157：H7/HM的检测愈发受到关注。随着免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，许多检验方法如磁珠富集、免疫法、DNA探针技术等已在大肠埃希菌O157:H7的检测中不断得到扩大应用，但这些方法需要较高的技术且仪器试剂的成本较高，因此高效经济的分离培养基仍具有广大的应用需求。

比较国内外检测标准，改良山梨麦康凯(CT-SMAC)和大肠埃希菌O157显色培养基是常规培养法中应用较多的分离培养基。显色培养基中的酶显色底物是由特异性酶识别基团以及相应的显色基团两部分组成，用于大肠埃希菌O157:H7检测的显色集团主要成分为苯酚衍生物，如5-溴-6-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷、8-羟基喹啉基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸钠盐、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷等。目前市售的大肠埃希菌O157显色培养基一般都添加了两种或两种以上不同的酶底物，成本相对较高。

改良山梨麦康凯(CT-SMAC)培养基价格经济受到青睐，其原理是大肠埃希菌O157不发酵或迟缓发酵培养基中的山梨醇，显示为无色菌落，而发酵山梨醇的微生物通过发酵产酸并在pH指示剂中性红作用下显示为品红色。但是实际检测中一些肠杆菌、变形杆菌等微生物不发酵山梨醇显示为无色菌落；另外，微生物对山梨醇发酵速率不一致，导致在观察时间范围内菌落的红色褪去也显示为无色菌落，这些因素都干扰了大肠埃希菌O157:H7/HM的检出。

因此，目前需要对大肠埃希菌O157:H7/HM的分离培养基进行改进。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测大肠埃希菌O157的分离培养基及其制备方法，该分离培养基经济且具有较高的鉴别能力。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种检测大肠埃希菌O157的分离培养基，包括示蛋白胨、鼠李糖、肌醇、山梨醇、蛋白胨、琼脂、3号胆盐、中性红、结晶紫、亚碲酸钾、头孢克肟和β-半乳糖苷酶显色底物。

进一步地，上述分离培养基包括如下含量的组分：示蛋白胨1-9g/L，鼠李糖1-9g/L，肌醇1-9g/L，山梨醇10-18g/L，蛋白胨15-30g/L，琼脂10-20g/L，3号胆盐1-2g/L，中性红0.01-0.05g/L，结晶紫0.3-1.2mg/L，亚碲酸钾2-3mg/L，头孢克肟0.01-0.08mg/L，β-半乳糖苷酶显色底物0.01-0.02g/L。

进一步地，上述分离培养基包括如下含量的组分：示蛋白胨1-9g/L，鼠李糖1-9g/L，肌醇1-9g/L，山梨醇10-18g/L，蛋白胨20g/L，琼脂15g/L，3号胆盐1.5g/L，中性红0.03g/L，结晶紫1mg/L，亚碲酸钾2.5mg/L，头孢克肟0.05mg/L，β-半乳糖苷酶显色底物0.01-0.02g/L。

进一步地，在上述分离培养基中，示蛋白胨的含量为5g/L。

进一步地，在上述分离培养基中，鼠李糖的含量为5g/L。

进一步地，在上述分离培养基中，肌醇的含量为5g/L。

进一步地，在上述分离培养基中，山梨醇的含量为18g/L。

进一步地，在上述分离培养基中，β-半乳糖苷酶显色底物的含量为0.02g/L。

进一步地，上述β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷。

本发明的第二方面是提供上述分离培养基的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，按照所需分离培养基的体积计算各个组分的质量并称取；

步骤二，在去离子水中加入示蛋白胨、鼠李糖、肌醇、山梨醇、蛋白胨、琼脂、3号胆盐、中性红和结晶紫，加热至完全溶解；

步骤三，加入β-半乳糖苷酶显色底物，搅拌溶解，然后分装灭菌；

步骤四，加入过滤除菌的亚碲酸钾和头孢克肟，混匀，倒平板，备用。

进一步地，步骤三中采用高温蒸汽灭菌技术，灭菌参数为121℃、15分钟。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的分离培养基中添加了示蛋白胨、鼠李糖、肌醇、山梨醇和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷，并优化了各个组分的含量，不仅降低了假阳性率，同时通过颜色的差异快速辨别大肠埃希菌O157:H7，提高了培养基的特异性且成本未有显著增加。

附图说明

图1为本发明一实施例中采用GMAC和CT-SMAC培养基对大肠埃希菌O157:H7和普通大肠埃希菌进行分离培养的结果；

图2为本发明一实施例中采用涂布法或者接种法接种大肠埃希菌O157:H7和非0157大肠埃希菌的混合菌液到GMAC和CT-SMAC培养基中进行分离培养的结果；

图3为本发明一实施例中采用GMAC和CT-SMAC培养基对人工污染样品中大肠埃希菌O157:H7进行检测的结果。

具体实施方式

本发明提供了检测大肠埃希菌O157的分离培养基及其制备方法。具体地，该大肠埃希菌O157的分离培养基包括示蛋白胨、鼠李糖、肌醇、山梨醇、蛋白胨、琼脂、3号胆盐、中性红、结晶紫、亚碲酸钾、头孢克肟和β-半乳糖苷酶显色底物。该分离培养基增加

在本发明一优选的实施方式中，分离培养基包括如下含量的组分：示蛋白胨1-9g/L，鼠李糖1-9g/L，肌醇1-9g/L，山梨醇10-18g/L，蛋白胨15-30g/L，琼脂10-20g/L，3号胆盐1-2g/L，中性红0.01-0.05g/L，结晶紫0.3-1.2mg/L，亚碲酸钾2-3mg/L，头孢克肟0.01-0.08mg/L，β-半乳糖苷酶显色底物0.01-0.02g/L。在本实施例中，增加山梨醇在分离培养基中的含量，可使普通大肠埃希菌在较长时间内保持发酵山梨醇的色泽。

在本发明一优选的实施方式中，分离培养基包括如下含量的组分：示蛋白胨1-9g/L，鼠李糖1-9g/L，肌醇1-9g/L，山梨醇10-18g/L，蛋白胨20g/L，琼脂15g/L，3号胆盐1.5g/L，中性红0.03g/L，结晶紫1mg/L，亚碲酸钾2.5mg/L，头孢克肟0.05mg/L，β-半乳糖苷酶显色底物0.01-0.02g/L。更优地，在分离培养基中，示蛋白胨的含量为5g/L；鼠李糖的含量为5g/L；肌醇的含量为5g/L；山梨醇的含量为18g/L；β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷，其含量为0.02g/L。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供一种检测大肠埃希菌O157的分离培养基，每1000mL培养基含有示蛋白胨5g、鼠李糖5g、肌醇5g、山梨醇18g、蛋白胨20g、琼脂15g、3号胆盐1.5g、中性红0.03g、结晶紫1mg、亚碲酸钾2.5mg、头孢克肟0.05mg、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.02g。

实施例2

本实施例提供一种检测大肠埃希菌O157的分离培养基，每1000mL培养基含有示蛋白胨2g、鼠李糖2g、肌醇2g、山梨醇10g、蛋白胨20g、琼脂15g、3号胆盐1.5g、中性红0.03g、结晶紫1mg、亚碲酸钾2.5mg、头孢克肟0.05mg、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.01g。

实施例3

本实施例提供一种检测大肠埃希菌O157的分离培养基，每1000mL培养基含有示蛋白胨9g、鼠李糖9g、肌醇9g、山梨醇15g、蛋白胨20g、琼脂15g、3号胆盐1.5g、中性红0.03g、结晶紫1mg、亚碲酸钾2.5mg、头孢克肟0.05mg、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.015g。

实施例4

本实施例提供上述实施例提供的分离培养基的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，按照所需分离培养基的体积(1000ml)称取各个组分；

步骤二，在去离子水中加入示蛋白胨、鼠李糖、肌醇、山梨醇、蛋白胨、琼脂、3号胆盐、中性红和结晶紫，加热至完全溶解；

步骤三，加入β-半乳糖苷酶显色底物，搅拌溶解，然后分装，121℃下高温蒸汽灭菌15min；

步骤四，待冷至约50℃，加入过滤除菌的亚碲酸钾、头孢克肟，混匀，倒平板，备用。

验证实施例1

本实施例采用实施例1提供的分离培养基(GMAC)为代表和传统的改良山梨醇麦康凯琼脂基础培养基(CT-SMAC)进行特异性验证，所采用的标准菌株：大肠埃希菌O157:H7(CICC 21530)、大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、粪肠球菌(ATCC29212)、奇异变形杆菌(CMCC(B)49005)、乙型副伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50094)、阪歧肠杆菌(ATCC29544)、弗氏柠檬酸杆菌(ATCC 43864)，合计8株。分离菌株：大肠埃希菌O157:H747株、大肠埃希菌37株、神户肠杆菌1株、液化沙雷氏菌1株、豪氏变形杆菌1株、摩氏摩根氏菌1株、普通变形杆菌1株、弗氏柠檬酸杆菌1株、布氏柠檬酸杆菌1株，菌株列表见表1。以上菌株于-70℃低温保存，均来源于食品样本分离。所有菌株已经多相分类鉴定，背景信息明确。

表1.分离菌株信息

所有菌株增菌培养后划线接种于大肠埃希菌O157分离培养基(GMAC)和传统CT-SMAC培养基，18h-24h观察：以大肠埃希菌O157:H7(CICC 21530)为试验菌株，在分离培养基中的生长率大于0.5；以金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、粪肠球菌(ATCC 29212)为试验菌株，分离培养基的选择性G≤1。从图1可见在GMAC培养基中目标菌大肠埃希菌O157:H7显示蓝绿色菌落，非目标菌普通大肠埃希菌显示红色菌落，在传统CT-SMAC培养基中目标菌大肠埃希菌O157:H7显示无色菌落，非目标菌普通大肠埃希菌的大部分菌落也显示为无色菌落。进一步将大肠埃希菌O157:H7与普通大肠埃希菌菌液混合后接种于同一平板，图2显示GMAC培养基大肠埃希菌O157:H7显示的蓝绿色菌落能在非目标菌的背景下清晰辨别，因此大肠埃希菌O157:H7与普通大肠埃希菌在GMAC培养基中更易区分。

结果表明实施例1提供的用于检测大肠埃希菌O157:H7的分离培养基具有较高的特异性。

验证实施例2

本实施例采用实施例1提供的分离培养基对人工污染样品中大肠埃希菌O157:H7进行检测，具体的实验步骤和结果如下：

标准菌株大肠埃希菌O157:H7(CICC 21530)制备成浓度为10

取25mL纯牛奶置于225mL已灭菌的mEC肉汤中，然后分别加入1mL目标菌和非目标菌菌液，培养后，将培养液划线接种于大肠埃希菌O157分离培养基(GMAC和CT-SMAC)。由图3可知，在GMAC培养基中，目标菌显示蓝绿色，与背景菌显著区分，易区分。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。