一种全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体及其制备的方法和应用。所述单克隆抗体包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示。本发明的特异性针对非洲猪瘟病毒的全猪源单克隆抗体，保留了轻链、重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、全猪源、抗体亲和力好、特异性强等优势，可在真核表达系统中进行高效表达。本发明为开发非洲猪瘟病毒诊断试剂盒提供了新型原材料，也为研制全猪源单克隆抗体的预防与治疗性药物提供了新的技术支持。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体以及利用高通量单个B细胞PCR技术制备该单克隆抗体的方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病，其病程短、病死率可达100％。世界卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASF于1921年首次在肯尼亚发现，2018年8月传入我国，随后迅速蔓延至我国多个省市，对我国养猪业的发展造成了巨大的经济损失。到目前为止，尚无有效的商品化疫苗防控ASF，短期内依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制。

ASFV具有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制，目前仍有很多蛋白的功能未知。为了深入研究ASFV编码蛋白在病毒感染中发挥的作用，故需要开发更多能够识别这些蛋白的抗体，深入探究这些蛋白与抗体间相互作用，从而挖掘关键的抗原表位，实现对ASFV感染的准确诊断，优化疫苗设计，为ASF防治提供新方向和新思路。

公开号为CN112592401A和CN112500478A的发明专利分别公开了一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11、VH-VLλ6，以及其制备方法，虽然VH-VLλ11和VH-VLλ6均为非洲猪瘟病毒抗体，但该抗体均为单链抗体，单链抗体仅包括重链可变区和轻链可变区，不包括恒定区。

高通量单个B细胞PCR抗体技术是近年来发展起来的一种新型的抗体制备技术。该技术从单个B细胞扩增抗体基因，并进行体外克隆表达，此方法获得的抗体保留了轻重链可变区的天然配对，具有效率高、全天然源性、基因多样性更丰富等优势。

发明内容

本发明提出了一种全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体以及利用高通量单个B细胞PCR技术制备该单克隆抗体的方法。

本发明第一方面提供一种全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:1或SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示。重链恒定区、Kappa和Lambda轻链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。

本发明第二方面提供一种编码所述全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体的DNA片段。

编码全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体的重链可变区的DNA片段如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示，编码全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体的轻链可变区的DNA片段如SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:8所示。

本发明第三方面提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含有所述的DNA片段。

本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有所述的重组表达载体。

上述全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪外周血中分离得到PBMC，利用流式细胞术进行B淋巴细胞分选，把ASFV抗原特异性单个B淋巴细胞分离至96孔板的孔中；

(2)以步骤(1)分离的PBMC或单个B淋巴细胞的RNA为模板，利用Oligo-dt或随机引物分别将其逆转录合成cDNA；

(3)以步骤(2)PBMC的cDNA为模板，扩增抗体重链和轻链恒定区编码基因；

(4)以步骤(2)单个B淋巴细胞的cDNA为模板，扩增单个B淋巴细胞抗体重链和轻链可变区编码基因；

(5)利用融合PCR技术分别将步骤(4)获得抗体重链可变区和步骤(3)获得重链恒定区，以及步骤(4)获得轻链可变区和步骤(3)获得轻链恒定区序列无缝拼接，得到全长重链基因和全长轻链基因；

(6)将步骤(5)获得的全长重链基因插入到pBudCE4.1真核表达载体EF-1α启动子的下游，同时将步骤(5)获得的全长轻链基因插入到pBudCE4.1真核表达载体CMV启动子的下游；

(7)将步骤(6)得到的猪源抗体真核表达载体转染293T细胞，转染后收集细胞上清进行抗体筛选，筛选后细胞上清用于纯化，即得到全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体。

进一步的，所述的全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体重链恒定区为IgG1型。

进一步的，所述的全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体轻链恒定区为Kappa或Lambda型。

本发明第五方面，可将所述全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体用于制备非洲猪瘟诊断试剂或非洲猪瘟治疗试剂。

本发明的有益效果为：

本发明利用单个B细胞PCR技术，首次成功获得一种特异性针对非洲猪瘟病毒的全猪源单克隆抗体。该抗体保留了轻链、重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、全猪源、抗体亲和力好、特异性强等优势，可在真核表达系统中进行高效表达，后期可利用载体抗性进行抗体稳定细胞系的筛选，从而降低生产成本。本发明为开发非洲猪瘟病毒诊断试剂盒提供了新型原材料，也为研制全猪源单克隆抗体的预防与治疗性药物提供了新的技术支持。

附图说明

图1为重、轻链恒定区编码基因的PCR扩增结果；

M:DL2000相对分子质量标准；1:重链恒定区，大小约为1000bp；2：κ轻链恒定区，大小约为350bp；3：λ轻链恒定区，大小约为350bp。

图2为重链可变区(HV)编码基因的PCR扩增结果；

M:DL2000 Marker；1～5:不同孔HV；

图3为κ和λ轻链可变区编码基因的PCR扩增结果；

A.κ轻链可变区(κV)。M:DL2000 Marker；1～5:不同孔κV；

B.λ轻链可变区(λV)。M:DL2000 Marker；1～5:不同孔λV。

图4为重、轻链全长片段PCR拼接结果；

A.重链可变区及恒定区拼接。M:DL2000 Marker；1～2:重链全长，大小约为1500bp；

B.κ轻链可变区及恒定区拼接。M:DL2000 Marker；1～2:κ轻链全长，大小约为750bp；

C.λ轻链可变区及恒定区拼接。M:DL2000 Marker；1～2:λ轻链全长，大小约为750bp。

图5为抗体真核表达载体转染293T细胞，Western blotting验证结果；

A.κ-9B抗体鉴定结果。M：蛋白Marker；1：转染空载体的293T细胞对照；2：转染κ-9B真核表达质粒293T细胞；

B.λ-1A抗体鉴定结果。M：蛋白Marker；1：转染空载体的293T细胞对照；3：转染λ-1A真核表达质粒293T细胞。

图6为抗体纯化结果；

M：蛋白Marker；1：κ-9B纯化后的抗体；2：λ-1A纯化后的抗体。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

1.样本采集及PBMC分离

颈静脉采集一头非洲猪瘟免疫耐过猪(5个月大，来自河南新乡某猪场)的抗凝血10ml进行PBMC分离。操作方法采用猪外周血淋巴细胞分离试剂盒(天津灏洋/TBD，LTS1110)说明书所记载的方法。

2.目标B淋巴细胞的分离和筛选

采用ASFV和抗猪IgG双标记选择ASFV抗原特异性的猪B淋巴细胞。ASFV灭活后，用生物素(Thermo Scientific

2.1ASFV阳性B淋巴细胞的分选

将分离的淋巴细胞进行计数，用PBS将细胞稀释至1×10

2.2单个B淋巴细胞的处理

向96孔板中加入单细胞裂解液(Thermo life Single Cell Lysis Kit，Thermofish，4458235)，加入量为10μL/孔。

3.猪源ASFV抗体的制备

首先对分离得到的PBMC或分选得到的单个B淋巴细胞进行转录扩增，扩增出抗体重链和轻链的恒定区和可变区基因。对扩增产物进行测序及序列比对分析，将有功能的扩增产物利用融合PCR构建全长重链和轻链基因，然后将其插入真核表达载体，通过转染293T细胞，获得抗体进行功能验证。抗体可变区基因、全长基因的扩增及真核表达质粒的构建基本按照文献进行(Li,K.,Bai,J.,Du,L.,Wang,X.,Ke,C.,Yan,W.,Li,C.,Ren,L.,Han,H.,Zhao,Y.,2019.Generation of porcine monoclonal antibodies based on single celltechnologies.Veterinary immunology and immunopathology 215,109913.)。

3.1抗体基因的扩增

3.1.1 cDNA的合成

以分选PBMC或单个B淋巴细胞的RNA为模板，利用Oligo-dt或随机引物分别将其逆转录合成cDNA(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA，6210A)。

3.1.2抗体恒定区基因的扩增

根据Genbank已公布的猪抗体重链(Genbank No.U03781.1)/κ(GenbankNo.FP312898.2)、λ(Genbank No.CU467669.2)轻链恒定区序列设计引物。其扩增引物如下：

IgCH-F：5'-GCCCCCAAGACGGCCCCATCGGT-3'；

IgCH-R：5'-TCATTTACCCGGAGTCTGGGAG-3'；

IgCκ-F：5'-GGCTGATGCCAAGCCATCCGTC-3'；

IgCκ-R：5'-TCACACTCGTTCCTGCTGAAGCT-3'；

IgCλ-F：5'-GGTCAGCCCAAGGCCRCTCCC-3'；

IgCλ-R：5'-CTAGGCGCACTCGGAGGGCGTCA-3'；

其中IgGH-F/IgCH-R用于扩增重链恒定区基因，IgCκ-F/IgCκ-R用于扩增κ轻链恒定区基因，IgCλ-F/IgCλ-R用于扩增λ轻链恒定区基因。其模板为3.1.1中PBMC反转录产物。PCR扩增体系如下表：

扩增重链恒定区PCR程序分别为：98℃2min，98℃10s、56℃30s、72℃1min、30个循环，72℃10min；扩增轻链恒定区PCR程序分别为：98℃2min，98℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环。扩增完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，重链恒定区基因大小约为1000bp，κ/λ轻链恒定区基因大小约为350bp，切胶回收目的片段。将回收的目的片段插入pMD-19T载体中，经测序验证正确的质粒置-20℃保存备用。

3.1.3抗体可变区基因的扩增

抗体可变区基因采用套式PCR扩增。首先以3.1.1获得的单个B细胞cDNA为模板，利用第一轮猪源抗体IgG1及κ/λ轻链引物扩增抗体可变区基因，然后以第一轮产物为模板，利用第二轮猪源抗体IgG1及κ/λ轻链引物扩增抗体可变区基因。抗体可变区基因两轮扩增引物参照文献(Li,K.,Bai,J.,Du,L.,Wang,X.,Ke,C.,Yan,W.,Li,C.,Ren,L.,Han,H.,Zhao,Y.,2019.Generation of porcine monoclonal antibodies based on single celltechnologies.Veterinary immunology and immunopathology 215,109913.)。

PCR扩增体系如下表：

扩增抗体可变区PCR程序为：98℃2min，98℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环，72℃10min。获得产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将符合预期大小的PCR产物(重链可变区约400bp，κ轻链可变区和λ轻链可变区约350bp)胶回收纯化。胶回收产物进行测序验证。

3.1.4抗体全长基因的扩增

以重/轻链的恒定区和重/轻链的可变区为模板，利用融合PCR将抗体重/轻链分别和各自的恒定区的片段连接起来，从而得到重链/轻链的全长序列。在抗体基因的上游引入前导肽序列，并在上下游引入酶切位点，方便下一步构建真核表达质粒。PCR扩增体系如下表：

PCR程序为：98℃2min，98℃10s、55℃30s、72℃90s、30个循环，72℃10min。获得产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将符合预期大小的PCR产物(重链全长约1500bp，轻链全长约750bp)胶回收纯化。

3.1.5抗体真核表达质粒的构建

将3.1.4获得的抗体重链全长胶回收产物及pBudCE4.1载体进行NotI/XhoI双酶切处理，双酶切产物胶回收后，进行连接，从而将抗体重链全长基因插入到pBudCE4.1载体的EF-1α启动子下游。然后再将该质粒与抗体轻链全长胶回收产物进行SalI/BamHI双酶切处理，目的是为了将轻链全长基因插入到pBudCE4.1载体的CMV启动子下游，从而获得完整的抗体真核表达质粒。

3.1.6抗体表达

将293T细胞铺于10cm皿中，待细胞长满单层约80％左右，转染3.1.5获得的抗体表达质粒。取10μg质粒加入到500μLopti-MEM中，再加入10μL转染试剂lipofectamine 2000(Invitrogen，11668-019)，吹打混匀后，室温作用15min，加入293T细胞。转染72h后分别收集细胞和上清进行抗体功能验证。获得两株可识别非洲猪瘟的猪源单克隆抗体，将其命名为κ-9B和λ-1A，κ-9B抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，κ型轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示、κ型轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；λ-1A抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，λ型轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示、λ型轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.1.7抗体的纯化

将3.1.6收集的细胞上清进行抗体纯化，其纯化步骤参照GE Healthcare公司的HiTrap Protein A HP使用说明书进行操作。

4.抗体鉴定及筛选

4.1猪源抗体Western blotting检测方法

抗体转染293T细胞后，细胞用RIPA裂解液裂解，转染空载体的细胞作为对照组，细胞裂解后加入5×的蛋白上样缓冲液，在沸水中煮沸10min。样品跑SDS-PAGE胶，跑胶结束后将胶转移至硝酸纤维膜(NC)上。将NC膜在5％的脱脂奶粉中室温封闭1h，然后加入用0.05％PBST稀释的HRP-pig IgG(1万倍稀释)，室温作用1h，0.05％PBST洗膜4次，5min/次。然后加入ECL显影液在ChemiDocTM XRS化学发光成像分析系统上进行显影。

4.2表达抗体活性鉴定

4.2.1包被ASFV检测抗体

ASFV灭活抗原用50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)1:1比例稀释包被酶标板，50μL/孔，4℃过夜包被；0.05％PBST洗涤液洗涤4次，拍干；加入100μL海藻糖(8.4g/L)4℃封闭10h；甩干后加入抗体转染上清或纯化后抗体(0.1mg/mL)50μL/孔，37℃温箱作用30min；0.05％PBST洗涤液洗涤4次，拍干；HRP标记的猪二抗1:20000稀释后50μL/孔，37℃温箱作用30min；0.05％PBST洗涤液洗涤4次，拍干；加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱作用15min，加入50μL终止液(2M H

4.2.2包被抗体检测ASFV

用50mM碳酸盐缓冲液(PH 9.6)将纯化抗体稀释至0.1mg/ml包被酶标板，50μL/孔，4℃过夜包被；0.05％PBST洗涤液洗涤4次，拍干；加入100μL海藻糖(8.4g/L)4℃封闭10h；封闭完成后，加入50μL ASFV抗原，37℃温箱作用30min；0.05％PBST洗涤液洗涤4次，拍干；加入50μL1:20000稀释的HRP标记的猪二抗，37℃温箱作用30min，0.05％PBST洗涤液洗涤4次，拍干；加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱作用15min，加入50μL终止液(2M H

5.结果

5.1重/轻链恒定区编码基因的扩增

以PBMC cDNA为模板扩增抗体重链、κ/λ轻链恒定区，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图1所示，抗体重链恒定区片段大小约为1000bp，抗体κ/λ轻链恒定区片段大小均约为350bp。

5.2重链可变区编码基因的扩增

从96孔分选的单个B淋巴细胞cDNA中扩增得到大小约为400bp的PCR产物，与预期扩增产物大小一致；切胶回收后，送PCR产物测序。测序结果与抗体基因库(IMGT)进行比对分析，证实扩增得到的序列为猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体重链可变区(HV)，如图2所示。

5.3轻链可变区编码基因的扩增

从96孔分选的单个B淋巴细胞cDNA中扩增得到大小约为350bp的PCR产物，与预期扩增产物大小一致；切胶回收后，送PCR产物测序。测序结果与抗体基因库(IMGT)进行比对分析，证实扩增得到的序列为猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体κ轻链(κV)和λ轻链可变区(λV)，如图3所示。

5.4抗体全长片段的拼接

利用融合PCR将抗体可变区和恒定区片段无缝连接，组装重链和轻链全长片段。重链全长大小约为1500bp；λ和κ链全长大小约750bp；与预期扩增结果一致，如图4所示。

5.5抗体转染细胞Western blotting检测

为了进一步验证获得的抗体为猪源抗体，分别收集转染抗体与空载体293T细胞，用猪源HRP-IgG抗体进行检测，Western blotting结果表明，转染抗体组能检测到特异性条带，而空载体对照组未检出条带，这表明所获得的抗体为猪源抗体，如图5所示。

5.6抗体转染上清的ELISA检测

抗体真核表达质粒转染293T细胞后，对其上清进行ELISA检测，转染空载体的细胞上清作为阴性对照，如表1所示，抗体转染组的OD值明显高于阴性对照，说明该抗体真核表达质粒转染293T细胞后能够分泌抗体，且该抗体能够结合ASFV，证实为猪源的抗ASFV抗体。

表1抗体转染上清的ELISA检测结果

5.7抗体的纯化

将收集的转染抗体细胞的上清与Protein A进行结合，进一步分离猪源IgG。洗脱后的产物经SDS-PAGE鉴定，结果表明得到了较纯的猪源单克隆抗体，如图6所示。

5.8纯化后抗体ELISA检测

5.8.1 ASFV包被检测抗体活性

将ASFV抗原包被酶标板，按照4.2.1所述程序进行检测，检测结果如表2所示，结果表明ASFV与猪源抗体κ-9B和λ-1A发生了特异性结合。

表2纯化抗体ELISA检测结果

2.8.2纯化抗体包被检测ASFV

将纯化抗体包被酶标板，按照4.2.2所述程序进行检测，检测结果如表3所示，结果表明所纯化后的κ-9B和λ-1A抗体可以与ASFV发生特异性结合。

表3 ASFV ELISA检测结果

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体及其制备方法

<130> 无

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 132

<212> PRT

<213> African swine fever virus

<400> 1

Glu Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Asp Phe Ile Asn Thr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Thr Lys Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Gln Asn Thr Ala Asp

65 70 75 80

Leu Leu Met Arg Ile Leu Arg Ile Glu Asp Thr Val Arg Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Met Ser Asp Ser Gly Gly Arg Asn Cys Val Ala Gly Asp Ser Ser

100 105 110

Cys Pro His Tyr Tyr Gly Met Asn Leu Trp Gly Pro Gly Val Glu Val

115 120 125

Val Val Ser Ser

130

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> African swine fever virus

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Val Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala

65 70 75 80

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<210> 3

<211> 396

<212> DNA

<213> African swine fever virus

<400> 3

gaggggaagc tggtggagtc tggaggaggc ctggtgcagc ctggggggag tctgagactc 60

tcctgtgtcg gctctggatt cgacttcata aacacctaca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg gctggccacc attagcacta agggtattag tacttactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccaaagaca actcccagaa cacggccgat 240

ctgctcatgc gcatcctgag aatcgaagac acggtccgct atttctgtgc aatgagcgat 300

agcggtggtc gaaattgcgt tgccggggat tcttcgtgtc cccattacta tggtatgaat 360

ctctggggcc caggcgttga agtcgtcgtg tcctca 396

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<211> 321

<212> DNA

<213> African swine fever virus

<400> 4

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gggaaggctc ctaaactctt gatcgttgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatcc 180

cggttcaagg gcagtggatc tggcaccgat ttcaccctca ccatcagtgg cctgcaggct 240

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<213> African swine fever virus

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<212> PRT

<213> African swine fever virus

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<210> 8

<211> 324

<212> DNA

<213> African swine fever virus

<400> 8

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<213> African swine fever virus

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