作为对肾细胞癌抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体的反应性的标志物的微生物同群合物

摘要

本发明涉及用于基于从所述个体的粪便样品中存在的微生物群分析来体外确定个体是否患有可能响应用基于抗PD1/PD‑L1/PD‑L2 AB的治疗进行治疗的肾细胞癌(RCC)的方法。公开了用于执行上述方法的12个模型，以及旨在容易执行该方法的工具。

说明书

【发明领域】

本发明涉及抗癌治疗领域。特别地，本发明涉及肠道微生物在治疗免疫检查点抑制剂(ICI)的治疗中的疗效中的作用，治疗肾细胞癌(RCC)。本发明在PD-1/PDL-1/PDL-2阻断之前，为诊断提供了“基于宏基因组学的肠肿瘤微生物组签名”(GOMS)，作为响应或抗性的新型临床结果和6个月治疗的响应或抗性的新型预测因子肾细胞癌。本发明还提供了在接受ICI和/或用ICI治疗期间鉴定有需要细菌补偿治疗的患者的治疗方法。

【背景和现有技术】

在过去十年中，已经在癌症生物学的主要概念进展。理解通过癌症相关突变表达的肿瘤特异性NeoAntigens并通常被免疫抑制肿瘤微环境(TME)常规地产生免疫反应已经开发了针对针对肿瘤进展引起免疫控制的有效免疫治疗的开发(Sharma和Allison，2015a，2015b)。癌症免疫疗法的进展导致治疗各种血液学和固体转移性恶性肿瘤，如黑素瘤，肺，膀胱，肾脏，霍奇金淋巴瘤，急性B细胞白血病，肝脏，默克尔-细胞癌和头部和颈部肿瘤在其他人中(Borghaei et alia，2015；Nghiem et alia，2016；Robert et alia，2011；罗森伯格et alia，2016)。迄今为止，在初始引发阶段(在排水淋巴结)或适应性抗癌免疫反应的初始引发阶段(在排水淋巴结)或效应阶段(在肿瘤床中称为“免疫检查点”)的抑制信号传导途径已经表现出最大的整体生存中的临床福利(Ribas等，2016；Topialet Al。，2012)。该成功的原型示例一直是使用单克隆抗体(MAB)靶向PD-1(由活性/排出的T细胞表达)或其配体PD-L1(通常用TME的癌细胞或细胞表达)(Pardoll，2015)。通过释放这些分子制动器，这种mAb恢复了免疫反应的抗癌自适应臂。

虽然PD-1封锁代表了B-RAF野生型黑色素瘤中最有效的第一线疗法和第二线中不可切除的肺癌中最佳选择，但大约60-70％的肿瘤表现出对这种治疗策略的常规抗性。初级抗性归因于低肿瘤突变负担和肿瘤细胞的差的内在抗原性差(Riaz等，2016；Rizvi等，2015)，有缺陷的抗原呈现和引发阶段(Spranger等，2015)，有限的肿瘤内渗透相关耗尽的T细胞功能(Smyth等，2016)和与腺苷和吲哚胺，2,3-二恶英酶相关的代谢免疫抑制途径(Koyama et Alia，2016；Smyth等，2016)。类似地，还阐明了CTLA-4阻断的初级抗性机制。例如，黑色素瘤呈现因IFN-γ信号传导缺乏对IPILIMIMAB的反应(Gao Et Alia，2016)。

最近，据报道了大约25％的黑素瘤患者(Koyama et Alia，2016；Ribas等，2016；Zaretsky et Alia，2016)的慢性抑制Pd-1受体的慢性抗性机制。在74名黑色素瘤患者中有4个患者，虽然与彭胶珠酮的开发病变连续治疗，但在JAKUS激酶JAK1或JAK2中呈现出杂散突变的损失，但导致STAT1磷酸化降低并降低对抗增殖的灵敏度的衰退IFNS或替代地，在编码β-2微球蛋白的基因内的突变，防止MHC I类分子的折叠和转运到肿瘤细胞T细胞识别的细胞表面(Zaretsky等，2016)。除了这些Darwinian自然选择遗传(或表观遗传)遗传性状，在小鼠中报道了其他获得的抗性机制。主要是由IFN-γ-诱导的PD-L1诱导表达产生的适应性免疫抗性(PARDOLL，2012；TAUBE等，2012)，PD-1的主要配体，TNF诱导的抗原变异损失(Landsberg等，2012年)以及TCR依赖性上调额外的耗尽标志物，如TIM3/HAVCR2(Koyama等，2016；Restifoet Al，2012；Smyth等，2016)，淋巴细胞活化基因3(LAG3)，具有IG和ITIM结构域(TIGIT)，B和T细胞淋巴细胞衰减器(BTLA)和T细胞活化(VISTA)的V域IG抑制剂的T细胞免疫感受器。

本发明人刚刚报道2018年1月5日的Rety et Alia Science，与另外两份报告(Gopalakrishnan V et Alia和Matson v等人)一起报告，该初始抗PD-1/PDL-1的免疫检查点抑制剂(ICI)可能是由于肠道微生物异常。抗生素(ATB)抑制了ICI在晚期肺癌，肾癌和膀胱癌患者中的临床益处。来自癌症患者的粪便微生物群移植(FMT)，他们反应ICI(但不是从非答复患者)中的无菌或ATB治疗的小鼠改善了PD-1阻断的抗肿瘤作用。诊断患者粪便的偏霉菌揭示了对ICI和专用微生物样式的临床反应之间的相关性，其中AkkermansiaMuciniphila相对升高，在检查肺癌和肾癌患者的情况下。肠道脱泻病的诊断很重要，因为它适用于恢复ICI疗效的治疗。实际上，用非响应粪便的A.粘蛋白或Alistipesindistindus indistindus indistindus indistindus indistindus indistinctus以IL-12依赖性方式恢复了PD-1阻断的疗效，通过增加CCR9+CXCR3+CD4+T淋巴细胞进入肿瘤床。

本申请中公开的结果显示了基于宏基因组学的肠道的预测值，其在诊断中计算了从较大的69个肾细胞癌症患者(RCC)患者的数据诊断，所述患者与Nivolumab或PEMBROLIZUAB用于酪氨酸激酶抑制剂或MTOR抑制剂的先进或转移性RCC，用于这种治疗的临床益处。本研究采用3个重新入学标准(最佳结果，3个月的进展时间(TTP)，TTP在6个月内进行，包括或排除11名RCC患者，该患者在抗PD1的第一次施用前2个月内或2个月内服用抗生素ABS。

【发明概述】

根据第一方面，本发明涉及一种体外测定具有肾细胞癌患者(RCC)的个体的方法，可能对抗PD1/PD-L1/PD-L2 AB进行响应治疗基于疗法，包括以下步骤：

(i)来自所述个体的粪便样品(或eLEAL或结肠粘膜样品)，获得基于细菌物种组的相对丰度获得包含至少8种选自表1中所公开的物种组的细菌物种的相对丰度下面。

(ii)使用一种或多个预定义的方程，每个预定方程对应于来自所述细菌物种的至少8种细菌物种的模型，计算所述个体对治疗响应的概率(P

本发明还涉及12种模型，可用于执行上述方法，其中6种来自在过去2个月中未服用任何抗生素的患者的数据中获得的，而其他6种可以用于最近抗生素摄取的患者。这些模型依赖于(部分)微生物群的不同子集(列于下面的表3,6,9和12中)，可以单独使用或组合使用。

设计用于容易地执行上述方法的工具也是本发明的一部分，例如包含在方法(I)的步骤(i)的每个微生物物种中特异的核酸微阵列，例如一组包含引物对的引物对，用于在所述方法的步骤(i)的步骤(i)中进行用于检测的每种微生物物种的序列。

用于确定个体是否需要用细菌组合物和/或通过FMT在接受抗PD1/PD-L1 AB的疗法之前需要细菌补偿的方法也是本发明的一部分。

【附图简述】

【图1.与最佳结果相关的共生菌物种】

RECIST1.1标准考虑到临床效益的预测是“最佳临床结果”。

A.火山图(左)和线性判别分析效果(LEfSe)(右)分析评估推定的用于在RCC患者粪便中建立基于宏基因组学的GOMS(无论抗生素利用)的细菌生物标志物。对每种细菌物种产生计算的火山图：(i)R与NR的平均相对丰度之间的倍数比(FR)的log2(X轴)；(ii)源于基于绝对值的相对丰度计算的Mann-Whitney U测试的P值的co-log10(Y轴)。用Python 2.7在源自LEfSe流程的输出文件上生成LEfSe图，并且考虑了LDA评分≥2的所有物种用于后续分析。

B.ROC曲线评估RCC患者粪便中基于宏基因组学的GOMS(无论抗生素使用)的可预测性。根据ICI治疗后患者的“抵抗”或“响应”临床表型，将患者分为NR和R。用Python 2.7进行组A中所选细菌物种的组合，并进行ROC分析。在5倍交叉验证(没有噪声附加)时，描绘了与具有最佳AUC的细菌物种联合对应的ROC曲线。每条曲线(插图)报告了特异性(X轴)和灵敏度(Y轴)以及它们的最佳值。对角线描绘了对最佳临床结果的可预测性的缺失。

C-D.同于A-B，但仅考虑未服用ATB的患者。

【图2.与TTP>3个月相关的共生菌物种】

被认为是临床益处可预测性的RECIST 1.1标准是“TTP＜或＞3个月”。

A.火山图(左)和LEfSe(右)分析，以评估推定的用于在RCC患者粪便中建立基于宏基因组学的GOMS(无论抗生素利用)的细菌生物标志物。对每种细菌物种产生计算的火山图：(i)R与NR的平均相对丰度之间的倍数比(FR)的log2(X轴)；(ii)源于基于绝对值的相对丰度计算的Mann-Whitney U测试的P值的co-log10(Y轴)。用Python 2.7在源自LEfSe流程的输出文件上生成LEfSe图，并考虑了所有具有LDA评分≥2的物种进行后续分析。

B.ROC曲线评估RCC患者粪便中基于宏基因组学的GOMS(无论抗生素使用)的可预测性。根据ICI治疗后患者的“抵抗”或“响应”临床表型，将患者分为NR和R。用Python 2.7进行组A中所选细菌物种的组合，并进行ROC分析。在5倍交叉验证(没有噪声附加)时，描绘了与具有最佳AUC的细菌物种联合对应的ROC曲线。每条曲线(插图)报告了特异性(X轴)和灵敏度(Y轴)以及它们的最佳值。对角线描绘了对最佳临床结果的可预测性的缺失。

C-D.同于A-B，但仅考虑未服用ATB的患者。

【图3.与TTP>6个月相关的共生菌物种】

考虑到临床益处预测的RECIST 1.1标准是“TTP＜或＞6个月”。

A.火山图(左)和LEfSe(右)分析，以评估推定的用于在RCC患者粪便中建立基于宏基因组学的GOMS(无论抗生素利用)的细菌生物标志物。对每种细菌物种产生计算的火山图：(i)R与NR的平均相对丰度之间的倍数比(FR)的log2(X轴)；(ii)源于基于绝对值的相对丰度计算的Mann-Whitney U测试的P值的co-log10(Y轴)。用Python 2.7在源自LEfSe流程的输出文件上生成LEfSe图，并考虑了所有具有LDA评分≥2的物种进行后续分析。

B.ROC曲线评估RCC患者粪便中基于宏基因组学的GOMS(无论抗生素使用)的可预测性。根据ICI治疗后患者的“抵抗”或“响应”临床表型，将患者分为NR和R。用Python 2.7进行组A中所选细菌物种的组合，并进行ROC分析。在5倍交叉验证(没有噪声附加)时，描绘了与具有最佳AUC的细菌物种联合对应的ROC曲线。每条曲线(插图)报告了特异性(X轴)和灵敏度(Y轴)以及它们的最佳值。对角线描绘了对最佳临床结果的可预测性的缺失。

C-D.同于A-B，但仅考虑未服用ATB的患者。

【图4.TTP6个月允许基于MG组成分开没有服用的ATB的R与NR RCC患者】

来自Routy等人Science 2018数据库的所有没有服用ATB的RCC患者被认为是TTP6的统一发现和验证同群。如图1、2、3和4中所述产生α-多样性，β-多样性，火山图和LEfSe图，对NR(橙色)和R(蓝色)同群进行了配对分析，报告是用Python v2.7产生的仅用于显著比较的箱线图(Mann-Whitney U测试，P≤0.05)。与NR相比，响应者往往具有显著较高的α-多样性，并且从NR(β-多样性，p值在坐标图中指示)显著划分。LEfSe，火山和配对分析图突出了2个同群NR和R中的判别物种。

【图5.基于RCC患者的逻辑回归模型(无论抗生素使用和结果_1标准)(考虑到响应者之间的所有SD的结果_1表示)】

无论抗生素使用和结果_1标准，从RCC患者的粪便MG施用逻辑回归模型。每个模型由3个图表描述：特征选择(左)，混淆矩阵(中)和ROC曲线(右)。在5倍交叉验证后产生混淆矩阵和ROC曲线。交叉“真标签”和“预测标签”单元格中的百分比越高，模型可预测性越高。对于ROC曲线，需要考虑AUC(曲线下的区域)和CV_AUC(曲线下的交叉验证区域)。在每个三重曲线的底部报告了逻辑回归描述的模型方程：Exp是具有天然的底的指数，CAG是在闭合区间[0：1]内表达的每个CAG种类的相对丰度，并被标准化(零均值和单位方差)。

【图6.基于RCC患者的逻辑回归模型(无抗生素治疗和结果_1标准)(结果_1表示考虑响应者中所有SD)】

逻辑回归模型是从RCC患者的粪便MG绘制的(没有抗生素使用和结果_1标准)。三重曲线图(特征选择，混淆矩阵，ROC曲线)描述如图6所示。

【图7.基于RCC患者的逻辑回归模型(无论抗生素使用和结果_2标准)(结果_2表示仅考虑响应者中SD>6个月的)】

无论抗生素使用和结果_2标准，从RCC患者的粪便MG绘制逻辑回归模型。三重曲线图(特征选择，混淆矩阵，ROC曲线)描述如图6所示。

【图8.基于RCC患者的逻辑回归模型(没有抗生素治疗和结果_2标准)(结果_2表示仅考虑响应者中SD>6个月的)】

没有抗生素使用和结果_2标准，从RCC患者的粪便MG绘制逻辑回归模型。三重曲线图(特征选择，混淆矩阵，ROC曲线)描述如图6所示。

【优选实施方式的详细描述】

在本文中，使用以下定义：

-“免疫检查点抑制剂”(ICI)表示任何药物，分子或组合物，其阻断由某些类型的免疫系统细胞(例如T细胞)和一些癌细胞制备的某些蛋白质。这些蛋白质有助于保持免疫应答检查，可以防止T细胞杀死癌细胞。当这些蛋白质被阻断时，免疫系统上的“制动器”被释放，并且T细胞能够更好地杀死癌细胞。在T细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白的实例包括PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2。特别是，ICIS包括抗PD1抗体(例如Nivolumab或Pembrolizumab)，抗PD-L1抗体(例如atezolizumab或durvalumab)，抗CTLA-4抗体和抗PD-L2抗体。在科学文献中，ICIS也被指定为“阻塞免疫检查点”，或“免疫检查点阻滞剂”或“免疫检查点阻断药物”。

-本文中的“抗PD1/PD-L1/PD-L2 AB疗法”表示任何治疗，包括使用拮抗PD1，PD-L1或PD-L2的药物。这些包括疗法主要基于ICI，例如药物拮抗PD1或PD-L1或PD-L2，以及使用几种ICIS和/或另外的抗癌药物如化学治疗药物的组合治疗。通过短语“抗PD1/PD-L1/PD-L2 AB基治疗”包括抗PD1+抗CTLA4，抗PD1+聚疗法(Pemetrexed+Carboplatin)，抗LAG3的非限制性实施例。+抗PD1，抗NKG2A+抗PD1，IDO抑制剂+抗PD1和抗ICOS+抗PD1。虽然目前使用的药物拮抗免疫检查点蛋白是单克隆抗体，但是特异性结合PD1，PD-L1，PD-L2或其他蛋白的其他分子可用于开发未来ICI，例如抗体片段或专门设计适体。当然，短语“抗PD1/PD-L1/PD-L2 AB疗法”包括任何治疗，包括拮抗PD1或PD-L1或PD-L2的活性分子。

-“NR”将非响应器状态定义为PD-1/PDL-1/PDL-2封锁

-“R”将响应者状态定义为PD-1/PDL-1/PDL-2封锁

-“NGS”定义了过去，现在或将来的任何下一代测序平台。

-在本文中，每个“细菌物种”由共质基因组(“CAG”)定义，即来自肠道微生物组的一组细菌基因(即肠道微生物的基因曲目)，哪些丰度水平在不同个体样本之间的比例相同。换句话说，根据本发明的细菌物种由来自不同对象的样品中的样品中的丰度水平的细菌基因序列簇定义，而不是随机分布。

依赖于参考基因组的比较依赖于参考基因组的比较分析肉桂元数据的大多数方法，但是人体肠道微生物群多样性超出了引用数据库目前涵盖的内容。在本文所公开的结果中，本发明人使用了基于一系列偏富样品的基于烧结共同基因的方法，这使得能够综合发现新的微生物，而无需参考序列。在下文中，鉴定在患者对基于针对PD1，PD-L1或PD-L2的抗体的患者对患者的疗法作用的一部分物种是新鉴定的物种，在公共数据库中尚未精确参考。对于每个鉴定的物种(新鉴定的和物种非常接近已经引用的物种)，本申请公开了一组是非冗余序列的一组50个细菌基因，并且可以单独使用或组合使用，作为跟踪基因评估对应物种的存在和相对丰度。当然，一旦通过本文公开的一组非冗余基因鉴定，或者以后通过其进一步识别和/或包含到数据群，本领域技术人员可以通过任何适当的方式评估它们的相对丰度例如，通过测量与本申请中公开的50个序列相同的另一种非冗余基因的拷贝数，甚至通过在蛋白质水平而不是在a中识别该物种的签名而不是在核酸样品。因此，本发明不限于使用所公开的序列来测量相应物种的相对丰度。

-明确细菌的“相对丰度”被定义为属于这种细菌物种的整个细菌生态系统的分数。在整个本文中，所有相对丰度都在封闭区间[0：1]内表示，其中1个代表单个细菌物种可用的最大级分(即，具有相对丰度的细菌物种等于1表示样品中存在的100％存在于所考虑的物种中)。对于NGS技术，细菌物种的相对丰度被认为是该所选物种的读长的数量除以代表整个细菌群落的读长总数。对于QPCR技术，细菌物种的相对丰度被认为是该物种X的ΔCt值(通过X的一对引物扩增)除以总细菌的ΔCt值(通过通用引物对扩增为了捕获样品中存在的所有噬菌体，该配对由引物PRK341F和PRK806R或由引物27F和1492R组成的对组成。

-基于所选细菌物种，“可预测性”表示具有逻辑回归的整体模型的可预测性。可预测性在闭合区间内表示为百分比值[0：100]。

-“成功率”是在5倍交叉验证后被认为是NR或R的对象的百分比，与模型可预测性不同。

必要时，稍后在本文中提供其他定义。

本发明涉及一种体外测定具有肾细胞癌的对象的方法，如果具有ICI的癌症治疗，并且更具体地，来自用抗体(或其他抑制分子)的治疗针对免疫检查点阻断剂PD1，PD-L1或PD-L2的治疗，单独或与上面定义的CTLA4和/或其他药物一起。响应者(NR)或响应者(R)状态按照以下步骤建立：

(i)来自所述对象的粪便样品(或来自髂骨或结肠粘膜标本)，基于细菌物种组的相对丰度获得“丰度样式”，表示在闭合区间[0：1]内；

(ii)(ii)使用所获得的丰富样式来计算，使用本申请中提出的一个(或几个)的互补模型，对象不会响应(NR)或响应(R)对待治疗的概率。

重要的是在这里，如上所述，本发明不受用于测量细菌物种的相对丰度的技术的限制，这可以通过NGS(通过任何过去或未来的NGS平台)来获得第一代到市场上的最后一代和开发中的那些，使用作为FASTQ，BAM，SAM或其他类型的文件扩展的任何NGS输出文件)或任何其他技术，例如QPCR(定量聚合酶链反应)使用本文提供的序列或任何其他共变化序列表达所选细菌物种的相对丰度的微阵列。当通过遗传分析评估相对丰度时，数据优选地得出来自鸟枪测序，而不是16S靶向测序，以符合下面材料和方法中描述的生物信息化流程。

根据第一方面，本发明涉及一种体外测定具有肾细胞癌(RCC)的个体的方法，该方法可能会因抗PD1/PD的ICI的治疗而响应治疗方法。L1/PD-L2 AB的疗法，包括以下步骤：

(i)来自所述个体的粪便样品，基于细菌物种组的相对丰度获得包含选自下列的至少8种细菌物种的相对丰度：

【表1：用于评估RCC病人的R或NR状态的细菌物种】

对于每种细菌物种，第三列规定，如果粪便样品中的存在/超重于粪便样品是好(g)或坏(b)预后。

(ii)使用一种或多个预定义的方程，每个预定方程对应于来自所述细菌物种的至少8种细菌物种的模型，计算所述个体对治疗响应的概率(P

在上述方法中，“基于细菌物种组的相对丰度”的“丰度”可以是例如所述相对丰度的载体的形式。该丰富样式将由执行方法(例如，临床医生)的人插入可执行程序(WindowsOS环境)中以获得对象的NR或R概率百分比。

如下面的实验部分所述，可以从代表同群的临床数据获得多种模型，以评估个体的概率，以响应(或不响应)治疗。实验部分详细介绍了12个可能的模型，但是基于不同的策略，虽然基于不同的策略，但都提供了非常好的可预测性和成功率。

可以使用其他模型，并记住，在上述表1中鉴定为“良好细菌”的细菌物种的过度陈述，和/或在同一张表中鉴定为“不良细菌”的细菌物种的代表性表明个人很可能响应治疗，而在上表1中鉴定为“不良细菌”的细菌物种的过度陈述，和/或鉴定为同一表中被鉴定为“好的细菌”的细菌物种的代表性表明个人可能是穷人响应治疗。为了评估细菌物种是否在粪便样品中过度或持代表性，将其相对丰度与对应于正常/健康志愿者的相同细菌物种的相对丰度(即没有癌症的个体)的对照值进行比较。。对于在对照志愿者中未检测到的细菌物种，仅仅存在细菌的存在被认为是过度陈述。方程用于“重量”的每种物种的预测值，或者更高的代表性，更精确地计算患者对治疗(P

在步骤(ii)中，可以使用若干方程，每个方程对应于基于8个细菌的子集中的模型，从步骤(i)所述的设置。然后，临床医生将与每个方程中的每条方程中获得的结果组合以更精确地预测患者的R或NR状态。

根据上述方法的特定实施方式，步骤(ii)中使用的至少一个方程对应于存在于所述个体的粪便样品中存在的一组至少8种细菌物种的模型。然而，也可以使用基于8个细菌的模型，其也可以使用，特别是如果它组合到一个或多个模型。

根据上述方法的另一个具体实施方式，步骤(ii)中使用的模型导致总可预测性至少为65％，成功率至少为70％。模型的性能取决于所获得的同群的代表性，并在用于构建模型的策略的相关性。统计技术人员可以很容易地计算模型的总体可预测性和成功率，并确定其是否满足所需的可预测性和成功率标准。

根据上述方法的另一个特定实施方式，如果它高于75％(固定阈值)和/或如果在使用的不同模型中，则在步骤(ii)中获得的概率评分被解释为临床意义，并且总是采取的考虑到抗生素使用(已知或未知)。

根据本发明的另一方面，上述方法与来自RCC患者的粪便样品的另一种方法组合，所述患者是否可能是良好的响应，以与ICI的治疗，基于动物模型。已经在本发明人的团队(WO2016/063263)中已经描述了这种方法(WO2016/063263)，并且包括从患者进入无菌(GF)模型动物的粪便样品的粪便微生物移植(FMT)的步骤(例如，GF鼠标)；(ii)步骤(i)后至少7至14天，用可移植的肿瘤模型接种所述小鼠；(iii)用ICI治疗接种的小鼠；(iv)测量治疗动物中的肿瘤尺寸。步骤(iv)的结果是说明可以预期所述患者所述治疗的响应。如果用动物获得的结果与模型预测的NR或R状态不同(具有X％的概率)，则在临床医生的结论中将占据动物模型的结果。

当个体在过去2个月内的抗生素方案暴露未知时，根据本发明的方法优选使用，在步骤(i)中，细菌物种组，其包含至少8种选自的细菌物种：

【表2：优选用于评估患者的抗生素方案暴露在过去2个月内的患者的R或NR状态(最佳结果标准)未知】

根据用于评估在过去2个月的抗生素方案暴露的患者的患者的R或NR状态(最佳结果标准)的方法的优选实施方式是未知的，步骤(ii)中使用一种，两3个方程，这对应于由其CAG编号识别的以下细菌物种的模型：

【表3：模型1.2、2.2和3.2中使用的细菌组】

根据上述方法的优选实施方式，使用的至少一个方程对应于用一组细菌获得的模型，这些细菌全部存在于个体的样品中。但是，即使缺少一些细菌，也可以运行模型。在这种情况下，优选在步骤(ii)中使用至少2个和优选至少3例程。

根据上述方法的特定实施方式，基于下面的实验部分所示的模型1.2,2.2和/或3.2，所以用于计算所述个体响应治疗的概率的方程(P

[B]

其中X

【表4：模型1.2、2.2和3.2的回归系数】

当然，通过从其他临床数据开始的本申请中描述的那些，本领域技术人员可以通过本领域技术人员改进这些系数(即，除了或者在使用的数据中，除了另外的同群中，来自其他同群的临床数据通过发明人)，甚至只是因为在逻辑回归中使用的10000迭代(参见方法)，每次都会确保每个系数的弱“浮动随机性”，而不是超过0.2单位。如果使用不同的技术用于测量细菌物种的相对丰度(例如，使用QPCR而不是MGS分析)，则系数也可以不同。重要的是，即使使用不同的技术，回归系数也会保留其正或负符号，这意味着一个明确的CAG物种对整体模型的正面或负面贡献。

如果患者在过去2个月内未服用任何抗生素，则优选使用含有至少8种选自组的细菌物种的细菌物种组来进行根据本发明的方法。：

【表5：细菌物种优选用于评估在过去2个月内未服用抗生素的患者的R或NR状态(最佳结果标准)】

根据用于评估在过去2个月内未服用抗生素的患者的患者的R ORNR状态(最佳结果标准)的方法的优选实施方式，其中一个或3个方程在步骤(ii)中使用，每个方程对应于由其CAG编号识别的以下细菌物种组的模型：

【表6：模型4.2、5.2和6.2中使用的细菌组】

根据上述方法的优选实施方式，使用的至少一个方程对应于用一组细菌获得的模型，这些细菌全部存在于个体的样品中。但是，即使缺少一些细菌，也可以运行模型。在这种情况下，优选在步骤(ii)中使用至少2个和优选至少3例程。

根据上述方法的特定实施方式，基于下面的实验部分所示的模型4.2、5.2和/或6.2，用于计算所述个体抵抗(P

[A]

[B]

其中X

【表7：模型4.2、5.2和6.2的回归系数】

如上所述，如果使用不同的技术用于测量细菌物种的相对丰度(例如，使用QPCR而不是MGS分析，则可以改变这些系数几种原因或甚至改变。

上面的模型1.2，2.2，3.2，4.2，5.2和6.2是使用最佳结果的标准获得的。患者首先回应治疗但是几个月后复发的患者被视为受访者。为了评估个体可能与治疗中的长期益处，定义为至少6个月的进展(TTP)，本发明人通过考虑只考虑超过6的稳定疾病获得额外的模型响应者中的月份(SD>6个月)(实验部分中的结果_2)。这些模型基于微生物同群合物的部分不同子集。

用于评估在过去2个月中的抗生素方案暴露的个体是否未知，可能与用抗PD1/PD-L1/PD-L2 AB疗法治疗的长期益处，根据本发明优选在步骤(i)中，细菌物种中的ase，其中包含至少8种选自下列的细菌物种：

【表8：细菌物种优选用于评估患者的抗生素治疗期间的患者的R或NR状态(TTP>6个月标准)未知】

根据用于评估在过去2个月的抗生素方案暴露的患者的患者的R或NR状态(TTP>6个月标准)的方法的优选实施方式是未知的，在步骤(ii)中使用一个，两3个方程，这对应于由其CAG编号识别的以下细菌物种组的模型：

【表9：模型7.2、8.2和9.2中使用的细菌组】

根据上述方法的优选实施方式，步骤(ii)中使用的至少一个方程对应于用一组细菌获得的模型，这些细菌全部存在于个体的样品中。但是，即使缺少一些细菌，也可以运行模型。在这种情况下，优选在步骤(ii)中使用至少2个和优选至少3例程。

根据上述方法的特定实施方式，基于下面的实验部分所示的模型7.2,8.2和/或9.2，所以用于计算所述个体抵抗的概率(P

[A]

其中X

【表10：模型7.2、8.2和9.2的回归系数

如已经提到的，如果使用不同的技术用于测量细菌物种的相对丰度，则可以改变这些系数。

如果患者在过去2个月中未服用任何抗生素，则根据本发明的方法，用于评估其从抗PD1/PD的治疗中具有长期益处(TTP>6个月)的概率在步骤(i)中，优选使用细菌物种组来进行-11/Pd-L2 AB的疗法，该细菌物种包含至少8种选自下列的细菌物种：

【表11：优选用于评估在过去2个月内未服用抗生素的患者的R或NR状态(最佳结果标准)】

根据在过去2个月内未服用抗生素的患者的评估患者的R或NR状态(TTP>6个月标准)的优选实施方式，在步骤(ii)中使用了2种或3个方程，每个对应于由其CAG编号鉴定的以下细菌物种组的模型的校准：

【表12：模型10.2、11.2和12.2的细菌物种】

根据上述方法的优选实施方式，步骤(ii)中使用的至少一个方程对应于用一组细菌获得的模型，这些细菌全部存在于个体的样品中。但是，即使缺少一些细菌，也可以运行模型。在这种情况下，优选在步骤(ii)中使用至少2个和优选至少3例程。

根据上述方法的特定实施方式，基于下面的实验部分所示的模型10.2,11.2和/或12.2，使得所述个体抵抗治疗的概率(P

[A]

[B]

其中X

【表13：模型10.2、11.2和12.2的回归系数】

至于其他模型，如果使用不同的技术用于测量细菌物种的相对丰度，则可以改进这些系数。

根据本发明方法的特定实施方式，在第1次施用任何ICI之类的任何ICI之前获得粪便样品，例如抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体。

根据另一特定实施方式，该个体已经接收到与PD1/PD-L1/PD-L2 AB的疗法不同的一线治疗，用于治疗其的RCC。然而，本发明的方法不限于接受PD1/PD-L1/PD-L2AB的患者作为第二线疗法，并且目前公开的方法也可用于评估响应者或非响应者状态RCC患者患者单独接受一线PD1/PD-L1/PD-L2 AB的疗法，或与其他抗肿瘤药物(化疗或其他ICI组合，如上所述的抗CTLA-4)。

根据另一个具体实施方式，施用于患者的基于抗PD1/PD-L1/PD-L2的疗法是用抗PD1抗体如Nivolumab或Pembrolizuab或抗PD-L1抗体治疗例如，atezolizumab或durvalumab。

根据其另一个方面，本发明涉及用于确定癌症患者是否需要在施用抗PD1/PD-L1/PD-L2 AB的疗法和/或在该治疗期间需要进行细菌补偿的方法，包括通过如上所述的方法评估吗？患者可能是这种治疗的良好响应者，其中如果患者未被鉴定为良好的响应者，则患者需要细菌补偿。

根据本发明的这一方面，细菌补偿可以通过粪便微生物会移植(FMT)来完成，所述微生物脂肪来自一种或几种供体(例如，从响应者到治疗)，可能富含众所周知的细菌菌株在这种情况下，或通过施用细菌组合物。本发明人已经描述了可用于这种补偿和恢复患者的能力的细菌组合物，以响应治疗(例如，在WO 2016/063263和WO2018/1155519中)。对初始NR状态有益的细菌菌株的非限制性实例是：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila，布劳特氏菌属(Blautia)菌株，伴生粪球菌(Coprococcuscomes)株，Alistipes shahii，其他Alistipes属(Alistipes)物种(例如Alistipesindistinctus和/或Alistipes onderdonkii和/或Alistipes finegoldii)，瘤胃球菌科(Ruminococcacae)、梭菌目(Clostridiales)物种、拟杆菌目(Bacteroidales)物种，放线菌门(Actinobacteria)，科里氏杆菌目(Coriobacteriales)物种，史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，Actinotignum schaalii，以及如下另外的细菌：

·梭菌目(Clostridiales)细菌中的小克里斯滕森氏菌(Christensenel laminuta)物种；

·丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)中的Dielma fastidiosa或多枝丹毒丝梭菌(Erysipelatoclostridium ramosum)物种；

·粘液真杆菌(Eubacterium limosum)；

·拟杆菌目(Bacteroidales)细菌中的萨利尔斯氏拟杆菌(Bacteroidessalyersiae)和/或Barnesiella intestinihominis物种；

·科里氏杆菌目(Coriobacteriales)细菌中的小肠柯林斯菌(Col linsel laintestinalis)和/或田中柯林斯菌(Col linsella tanakaei)物种；

·硬壁菌门(Firmicutes)细菌中的Flavonifractor plautii物种。

可以对根据本发明的方法评估的具有初始NR状态的患者有益的组合物的实例是：

·组合物，其包含：

(i)选自下列的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物：于2013年11月7日以保藏号CNCM I-4815保藏在法国国家微生物保藏中心(CNCM)的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株13144、于2017年8月31日以保藏号CNCM I-5224保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR7、于2017年11月27日以保藏号CNCM I-5260保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR4、及于2017年11月27日以保藏号CNCM I-5261保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR11；及

(ii)选自保藏在法国立克次体单位菌株保藏中心(CSUR)的Akkermansiamuciniphila株p2261和p3415的Akkermansia muciniphila及其混合物；及

(iii)粘液真杆菌(Eubacterium limosum)。

·组合物，其包含：

(i)选自下列的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物：于2013年11月7日以保藏号CNCM I-4815保藏在法国国家微生物保藏中心(CNCM)的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株13144、于2017年8月31日以保藏号CNCM I-5224保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR7、于2017年11月27日以保藏号CNCM I-5260保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR4、及于2017年11月27日以保藏号CNCM I-5261保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR11；及

(ii)Barnesiel la intestinihominis。

·组合物，其包含：

(i)选自下列的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物：于2013年11月7日以保藏号CNCM I-4815保藏在法国国家微生物保藏中心(CNCM)的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株13144、于2017年8月31日以保藏号CNCM I-5224保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR7、于2017年11月27日以保藏号CNCM I-5260保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR4、及于2017年11月27日以保藏号CNCM I-5261保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR11；及

(ii)小克里斯滕森氏菌(Christensenel la minuta)。

·组合物，其包含：

(i)选自下列的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物：于2013年11月7日以保藏号CNCM I-4815保藏在法国国家微生物保藏中心(CNCM)的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株13144、于2017年8月31日以保藏号CNCM I-5224保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR7、于2017年11月27日以保藏号CNCM I-5260保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR4、及于2017年11月27日以保藏号CNCM I-5261保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)株IGR11；及

(ii)Actinotignum schaalii。

设计用于执行根据本发明方法的核酸微阵列也是本发明的一部分。这种核酸微阵列包含在所述方法的步骤(i)中的每个微生物物种的核酸探针(即，在表1中召开的那些中选择的至少8种)。在一个具体实施方式中，核酸微阵列是寡核苷酸微阵列，其包含至少一种特异于选自SEQ ID NO：1-2950的序列的寡核苷酸。例如，所述微阵列包含至少8个寡核苷酸，每个寡核苷酸对于表1中所述的一种不同物种的一种序列特异性。本发明的微阵列当然可以包括更多寡核苷酸，所述寡核苷酸特异于SEQ ID NO：1-2950的序列例如，至少符号寡核苷酸，分为与本文所述的模型12个模型相对应的12组NX8寡核苷酸，n是包含在1和25之间的整数，其对应于用于特异性评估一种特异性细菌存在的寡核苷酸的数量物种。根据本发明的微阵列可以进一步包含至少一种用于检测至少一种至少一种对照细菌物种的基因的寡核苷酸。方便的细菌物种可以是例如细菌物种，其丰度在具有R或NR状态的个体之间不变化。优选地，寡核苷酸的长度为约50个碱基。使用本发明中已知的微阵列寡核苷酸设计的任何方法，可以基于每个基因的基因组序列设计适用于SEQ ID NO：1-2950的任何基因的合适的微阵列寡核苷酸。特别地，可以使用为设计微阵列寡核苷酸设计的任何可用软件，例如OligoArray软件，GoAraysSoftware，阵列设计师软件，PRIMER3软件或母版软件，所以通过技术人员已知艺术。

如上所述，所述述所述细菌物质的相对丰度可以通过与本文所用的肉群分析不同的技术来测量，特别是当本领域技术人员知道要测量哪种细菌物种。可用于此目的的特定技术是QPCR(定量PCR)。基于PCR的技术进行了旨在对测量的序列特异的扩增引物进行。因此，本发明还涉及适于进行上述方法的引物组，即，引物组，其包含引物对，用于在所述方法的步骤(i)步骤(I)中用于在步骤(i)的步骤(I)的每个微生物物种的扩增序列(也就是说，在表1中召开的那些中选择了至少8种)。这种引物组包含至少16个引物，但它可包含更多的引物，例如30、40、50、60、70、80、100、200、300、500、1000、2000或更高。根据特定实施方式，该引物组包含至少一个特异性放大在SEQ ID NO：1-2950中选择的序列的一部分的引物对。当然，根据本发明的底漆组可以有利地包含2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、200、300、500、1000或更多对引物每个专门放大在SEQ ID NO：1-2950中选择的序列的一部分。

在本发明的描述过程中，本发明的其他特征也将变得显而易见，所述生物测定在本发明的框架中进行的并且提供了所需的实验支持，而不限制其范围。

【实施例】

【材料与方法】

【粪便样品的分析】

在MetaGenoPolis(Jouy-en-Josas，法国)开发的定量宏基因组学流程被用来达到RCC肠道微生物群的物种级描述。通过自动平台(SAMBO，MetaGenoPolis)从69个粪便样品中提取DNA，并使用离子质子序列仪进行鸟枪测序，达到>2000万短DNA序列读长(MetaquantPlatform，Metagenopol)。读长被过滤(Q>25)并清洁以消除可能的污染物作为人类读长。然后将高质量(HQ)读长映射到MetaHIT hs_9.9M基因目录，并通过2步过程来计数：(1)使用唯一映射的读长；(2)根据基于唯一读长的映射率归因共享的读长。用于映射的标识阈值设为>95％，以克服基因等位基因变体和目录本身的非冗余性质。HQ读长被缩小为1千3百万，每个样品才能校正测序深度，然后通过RPKM(读长/千碱基/百万映射的读长)方法标准化。因此获得了基因频率的概况矩阵，并用作MetaOMineR(在MetaGenoPolis的R套装的套件)的输入文件。

为了实现RCC粪便样品中微生物的物种级描述，将hs_9.9M目录聚集成1436个MetaGenomic物种(MGS)，大致>500个基因，其在数百种样品中丰富，最终属于相同的微生物物种。使用BLASTn相对于nt和wgs NCBI数据库，使用与之前测序的生物的基因同源性进行MGS的分类注释。在每个MGS的分类分配后，使用标准化的MGS平均信号构建了50个共丰度基因(CAG)的频率分布矩阵，因此，得到的样品内的每个MG的总和等于1。通过该方法分配了每个物种到一个明确的CAG编号。

【统计分析】

在频率分布矩阵上使用多变量统计，以描述肠道微生物组成和多样性。使用Python 2.7和相关统计/图形库(Matplotlib，Scikit学习，Pandas，Numpy)，通过配对分析、线性判别分析效果尺寸(LEfSe)和火山图比较全部MGS。p值小于或等于0.05被认为是统计学显著的。对每种细菌物种进行计算来产生火山图：(i)R与NR的平均相对丰度的倍数比(FR)的log2(X轴)，和(ii)基于相对丰度以绝对值计算的来自Mann-Whitney U测试的p值的Co-log10(Y轴)。为了使火山图形表示变得容易，在TTP6处，所选择的p值小于或等于0.7。用Python 2.7，基于源自LEfSe流程的输出文件生成LEfSe图，并且考虑了LDA评分≥2的所有物种用于后续分析。

【构建预测模型】

实施双策略以选择用于构建模型的细菌物种。

第一策略(“以人为基准”)依赖于：(i)执行接收器操作特征(ROC)曲线在所有可能的细菌物种的所有可能组合上实现支持向量机(SVM)分类器，寻找提供最佳曲线下面积(AUC)值的组合；(ii)用选定的细菌物种构建逻辑回归分类器和RFECV(带有交叉验证的递归特性消除)特征选择；(iii)使用从原始数据集导出的训练/测试子集进行ROC曲线和混淆矩阵的度量。

第二策略(“机器学习”)依赖于：(i)构建所有细菌物种(不置换)的逻辑回归分类器和RFECV特征选择，选择具有更高排序的(等于1)；(ii)通过RFE(递归功能消除)执行新的特征选择，选择具有最高排序的8种；(iii)重新构建新的逻辑回归分类器以及8种所选细菌物种上的RFECV功能选择；(iv)使用从原始数据集导出的训练/测试子集进行ROC曲线和混淆矩阵的度量。

第一和第二策略之间的主要区别在于，第一策略允许基于最高AUC选择它们(称为“联合”)的原始数据集中的所有细菌物种的组合，而第二策略由于逻辑回归模型的自然收敛而能够选择单个物种，以选择所有变量以达到最大可预测性。

使用来自Scikit学习模块(版本0.19.1)的方法“逻辑Regression”，“RFE”和“RFECV”，在Python(版本2.7)中构建了逻辑回归分类器和特征选择模型的实现。构建SVM分类器(C-支持向量分类)的实现使用来自Scikit学习模块(版本0.19.1)的方法SVC，在Python(2.7版本2.7)中进行。使用从Python 2.7中作为内置的“itertools”模块中的方法“组合”，在Python(版本2.7)中执行第一策略中的ROC曲线组合。

逻辑回归系数β通过逻辑回归分类器计算，具有以下要求：未添加到决策功能的常量(也称为截距)；最大迭代等于10000；一个Liblinear求解器(L2罚分)。用逻辑回归估计器(无截距，10000最大迭代，Liblinear求解器)在Python中实施RFECV特征选择模型(步骤＝1，等于3的交叉验证，评分精度)，在区间[1:(n

使用Python 2.7，使用SVM分类器(Linear核)构建接收器操作特征(ROC)曲线，并用于评估所选细菌物种或联合的实际预测含义。使用2种不同的方法来实现这样的选择：(1)从LEfSe分析(LDA评分≥2)中检索的物种检索并组合在所有可能的组合(2×2、3×3、4×4、5×5等)，和(2)考虑所有物种，将具有最佳AUC的前5个组合到联合中。为每个最佳组合计算曲线下面积(AUC)，特异性和灵敏度，并报告为ROC曲线和表格数据。使用了5倍的交叉验证，没有添加噪音。还报道了平均相对丰度(平均值±标准误差)，倍数比(FR)，同群比较的FR和p值的Log10(R对比NR，非-参数Mann-Whitney U测试)。

根据上述方法，细菌物种以下列方式选择：(i)对于第一策略，考虑到所有可用物种的所有组合，尤其是来自LEfSe的所有组合，我们为NR和R状态为具有最高AUC值的每个结果_1、结果_2、TTP3和TTP6时间点选择了“联合”；(ii)对于第二策略，我们为结果_1和结果_2选择了具有RFECV然后RFE等级等于1的细菌物种，无论是负和正逻辑回归系数(β)。

考虑到2种上述策略，对于他们2个，基于标准化的原始数据(删除均值和缩放到单位方差)，实施一个逻辑回归分类器，以计算待在方程[2]中使用的回归系数(β)。因此，每个所选细菌物种对每个模型的相对贡献被β系数加权并代入方程[2]，以便通过方程[1]预测确定的新对象的结果的估计(以概率百分比)。

P＝1/(1+exp^-z)[1]，和

z＝β1*x1+…+βn*xn[2]

对于这2种策略，实施了2个特征选择模型(RFECV然后RFE)模型，以将所选物种的数量优化为8，对于在将来的实施和即将临床实际使用的诊断试剂盒有用的数。通过作为ROC曲线的矩阵和混淆矩阵，使用原始数据集的t训练/测试子集，实施最终模型(基于3个不同组的8个细菌物种构建)的评估(在Python 2.7和Scikit学习0.19中通过训练_测试_分离方法实施)。

对于结果_1，考虑到全部上述的实施方式、方法和策略，并考虑到逻辑回归分类器的二分/互补性质，在本发明中我们建议4个方程([3]，[4]，[6]，[7])，以预测确定的新对象JD的NR或R状态。其中2个([3]，[4])考虑到未知的抗生素方案/治疗状态的最终性，而另外2个([6]，[7])考虑到个体在过去2个月期间未施用抗生素。

为了规避对象同群中自然变化源(粪便采样，粪便稠度，样品存储，测序偏倚等)的警告，这些警告可能会影响代表性不足的细菌物种的相对丰度，发明人仅基于平均相对丰度大于或等于0.001(当以区间[0:1]表示时)或0.1％(当以区间[0:100]表示时)，为抗生素治疗未知的对象([5])和在采样前的最后2个月内未服用抗生素的对象([8])建立了另外2个方程([5]，[8])。这些物种样式经历了如上所述的第二建模策略。

对于结果_2，考虑到所有上述实施方式，方法和策略，并考虑到逻辑回归分类器的二分/互补性质，在本发明中，我们提出了4个方程([9]，[10]，[12]，[13])来预测确定的新对象JD的NR或R状态。其中2个([9]，[10])考虑了未知的抗生素治疗方案/治疗状态的可能性，而其他2个([12]，[13])则认为该个体在过去2个月期间未服用抗生素。

为了规避可能导致影响代表性不足的细菌物种的相对丰度的对象同群(粪便采样，粪便稠度，样品存储，测序偏倚等)中的自然变异的警告，发明人仅基于平均相对丰度大于或等于0.001(当以区间[0:1]表示时)或0.1％(当以区间[0:100]表示时)，为抗生素治疗未知的对象([11])和在采样之前的最后2个月内未服用抗生素的对象([14])建立了另外2个方程([11]，[14])。这些物种样式经历了如上所述的第二建模策略。

【实施例1：与根据RECIST 1.1标准的临床结果相关的基于宏基因组学的GOMS(图1)】

我们通过鸟枪测序使用定量宏基因组学探讨了肠道微生物群的组成，每个样品达到>2000万短的DNA序列读长，然后分析了990万基因参考目录的结果(J.Li,Nat.Biotechnol.32,834-841(2014))。从开始治疗前的69例患有RCC的患者中提取总DNA(表1)。在69例RCC患者中，在MG分析之前，58名未服用ATB，而11名被开了ATB处方。如在材料和方法中报道，将每种宏基因组学物种(MGS)分配给一个明确的共丰基因型(CAG)，基于与先前测序的生物的基因同源性(使用BLASTn相对于nt和WGS数据库)进行随后的分类注释。R(响应者)被定义为那些表现出完整或部分或稳定疾病>3个月的患者，而NR(非响应者)被定义为患有渐进疾病。

【表14：患者的特征】

IMDC，国际转移性肾细胞癌数据库联合(包括：Karnofsky性能状态，从诊断到治疗，血红蛋白，血清钙浓度，中性粒细胞和血小板计数)；ATB，抗生素。

本表中描述了本研究中包含的69RCC相关的临床参数(在诊断，响应，追踪时，性别，年龄，抗生素，疾病状态)。

当在所有69名患者中分开响应者(R)和非响应者(NR)(根据RECIST1.1评估的最佳临床反应)时，我们未能观察到10％的FDR的显著差异。

【与更差的临床结果关联的GOMS】

然而，在考虑LEfSe组合物种时获得允许鉴定AUC值为0.882、特异性为0.778(真阳性病例)和灵敏度为0.860(假阳性病例)的“抗性”患者的最佳预测模型，在模型中保留的共生菌中在NR中增加的(“不良细菌”)是：

·梭菌属(Clostridium)boltae ATCC BAA 613(倍数增加13)

·普拉斯尼奇粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)KLE1255-3(倍数增加4.4)

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)CAG617(仅可在NR中检测到)

·粪便普雷沃氏菌(Prevotel la copri)CAG164(仅可在NR中检测到)

·罕见小球菌属(Subdoligranulum sp.)4_3_54A2FAA(倍数增加2.6)

而在NR中减少的那些(“良好细菌”)是：

·拟杆菌属(Bacteroides sp.)CAG 144(减少62倍)

·不动杆菌属(Acinetobacter)CAG196(减少3.4倍)

·真杆菌属(Eubacterium sp.)CAG38(减少2.3倍)

截止值对应于表2中的平均值±SEM。我们只保留了最终模型的p值＜0.05的那些物种，并在本专利中为了最佳结果而要求良好和不良细菌之间的平衡。

当在未服用ATB的RCC中分开响应者(R)和非响应者(NR)(根据RECIST1.1评估的最佳临床反应)时，我们未能观察到FDR p值＜0.05的显著差异。

然而，在考虑LEfSe组合物种时获得允许鉴定AUC值为0.879、特异性为0.707(真阳性病例)和灵敏度为0.950(假阳性病例)的“抗性”患者的最佳预测模型，在模型中保留的共生菌中在NR中增加的(“不良细菌”)是：

·梭菌属(Clostridium)boltae ATCC BAA 613(倍数增加15.7)

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)CAG617(仅可在NR中检测到)

而在NR中减少的那些(“良好细菌”)是：

·拟杆菌属(Bacteroides sp.)CAG 144(减少50倍)

·真杆菌属(Eubacterium sp.)CAG115(减少47倍)

·惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)物种CAG80(减少14倍)

·硬壁菌门(Firmicutes)细菌物种CAG65_1(减少1.9倍)

截止值对应于表15中的平均值±SEM。我们只保留了最终模型的p值＜0.05的物种。根据本发明，良好和不良细菌之间的平衡对于最佳结果至关重要。

【与最佳临床结果关联的GOMS】

在考虑LEfSe组合物种时，获得允许在所有患者中鉴定AUC值为0.863、特异性为0.798(真阳性病例)和灵敏度为0.842(假阳性病例)的“响应”患者的最佳预测模型，在模型中保留的以下有害共生菌减少为：

·梭菌属(Clostridium)boltae ATCC BAA 613(倍数降低13)

·普拉斯尼奇粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)KLE1255-3(倍数降低15)

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)CAG617(infini，仅可在NR中检测到)

·罕见小球菌属(Subdoligranulum sp.)4_3_54A2 FAA(倍数降低2.6)

而在R中增加的那些(“良好细菌”)是：

·拟杆菌属(Bacteroides sp.)CAG 144(增加62倍)

·真杆菌属(Eubacterium sp.)CAG38(增加2.3倍)

·固氮螺菌属(Azospirillum)sp CAG 239(增加3.8倍)

截止值对应于表15中的平均值±SEM。我们只保留了最终模型的p值＜0.05的物种，在本专利中为了最佳结果而要求良好和不良细菌之间的平衡。

当考虑LEfSe组合物种时，获得允许在未服用ATB的患者中鉴定AUC值为0.845、特异性＝0.990和灵敏度＝0.614的“响应”患者(R)的最佳预测模型，并且在模型中保留的共生菌是：

在R中减少的如下：

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)_CAG_617(infini，在R中缺乏)

·梭状梭菌(Clostridium clostridioforme)_2_1_49FAA_1(在R中减少6.3倍)

在R中增加的如下：

·平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)CAG 211(在R中增加327倍)

·嗜粪拟杆菌(Bacteroides coprophilus)DSM 18228JCM 13818(仅在R中存在)

·惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)_CAG_80(在R中增加14倍)

·真杆菌属(Eubacterium sp.)_CAG_202(在R中增加5.4倍)

·真杆菌属(Eubacterium sp.)_CAG_115(在R中增加47倍)

截止值对应于表15中的平均值±SEM。我们仅保留了最终模型的p值＜0.05的物种。根据本发明，良好和不良细菌之间的平衡对于最佳结果至关重要。

【表15：与最佳(或更差)临床结果相关的共生细菌】

部分A包括所有RCC患者，而部分B仅考虑未服用抗生素的患者。指示每个共生菌的SEM(标准误差平均值)的平均相对丰度，以及比较响应者(R)和非响应者(NR)的平均值的比作为倍数变化及其log2值，当p值＜0.05时，不被认为是显著相关的。

【实施例2：根据RECIST 1.1标准的与TTP＞3个月关联的基于宏基因组学的GOMS(图2)】

根据RECIST 1.1标准的与TTP>3个月关联的基于宏基因组学的GOMSGOMS(图2)。

当在所有69名患者中分开响应者(R，TTP>3个月)和非响应者(NR，TTP＜3个月)(根据RECIST1.1评估的最佳临床反应)时，我们未能观察到FDR p值＜0.05的显著差异。当在未服用ATB的RCC中分开响应者(NR，TTP＜3个月)和非响应者(NR，TTP＜3个月)(根据RECIST1.1评估的最佳临床反应)时，我们未能观察到FDR p值＜0.05的显著差异。

然而，多变量模型允许找到一些具有临床相关性的GOMS。

【与TTP＜3个月关联的GOMS】

3个月的抵抗力是我们在RCC患者分析的最佳临床读数。

在考虑LEfSe组合时，获得最佳预测模型，允许在所有患者中鉴定AUC值为0.913、特异性为0.798(真阳性病例)和灵敏度为0.910(假阳性病例)的“抗性”患者(NR)，在模型中保留的共生菌中在NR中增加的“不良细菌”如下，如表16所示：

·梭菌属(Clostridium sp.)_CAG_7_1(在NR中增加2倍)

·Hungatel la hathewayi_12489931_1(在NR中增加47倍)

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)_CAG_617(无限，仅可在NR中检测到)，及

·双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biformis)_DSM_3989_1(在NR中增加48倍)，

然而，在NR(良好细菌)中固氮螺菌属(Azospiril lum sp.)_CAG_239减少11倍。

但是，在未服用ATB的患者中，此模型中保留的给出了AUC＝0.884，特异性＝0.667，灵敏度＝1.000的细菌列表是：

对于不良细菌，增加的是：

·鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)_ATCC_BAA_613(在NR中增加15倍)

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)_CAG_617(仅在NR中存在)

·双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biformis)_DSM_3989_1(在NR中增加32倍)、及

·普拉斯尼奇粪杆菌(Faecalibacterium cf.prausnitzii)_KLE1255(在NR中增加8.8倍)

对于良好细菌，降低的是：

·真杆菌属(Eubacterium sp.)_CAG_38(在NR中减少2倍)

·真杆菌属(Eubacterium sp.)_CAG_115(在NR中减少37倍)

我们确实在我们的最终模型中保留了TTP3 NR的良好和不良细菌之间的比率(见表16，部分B)。

【与TTP>3个月关联的GOMS】

在考虑LEfSe组合时，获得允许在所有患者中鉴定AUC＝0.876、特异性＝0.990和灵敏度＝0.727的“响应者”患者(R)的最佳预测模型，并且在模型中保留的共生菌中在R中减少的“不良细菌”如下，如表16所示：

·鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)_ATCC_BAA_613(在R中减少92％)

·梭菌属(Clostridium sp.)_CAG_7_1(减少46％)

·普拉斯尼奇粪杆菌(Faecalibacterium cf.prausnitzii)_KLE1255_3(减少83％)

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)_CAG_617(仅在NR中存在)

·双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biformis)_DSM_3989_1(减少79％)

·嗜胨菌属(Peptoniphilus sp.)_oral_taxon_836_str__F0141(仅在NR中存在)

然而，固氮螺菌属(Azospirillum sp.)_CAG_239在R中增加11倍(良好细菌)。

但是，在未服用ATB的患者中，在该模型中保留的给出了AUC＝0.899、特异性＝0.990和灵敏度＝0.836的细菌列表是：

对于不良细菌，以下减少：

·鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)_ATCC_BAA_613(在R中减少93.2％)

·梭菌属(Clostridium sp.)_CAG_7_1(减少44.5％)

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)_CAG_617(仅在NR中存在)

·粪便普雷沃氏菌(Prevotel la copri)_CAG_164(仅在NR中存在)

·双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biformis)_DSM_3989_1(减少96.9％)

·普雷沃氏菌属(Prevotel la sp.)_CAG_279_1(仅在NR中存在)

·普拉斯尼奇粪杆菌(Faecalibacterium cf.prausnitzii)_KLE1255(减少88.6％)

对于良好细菌，以下增加：

·Akkermansia muciniphila_CAG_154(在R中增加2.5倍)

·真杆菌属(Eubacterium sp.)_CAG_115(在R中增加37倍)

我们确实在我们的最终模型中保留了TTP3 R的良好和不良细菌之间的比率(见表16，部分B)。

【表16：与TTP>或＜3个月关联的共生细菌】

部分A包括所有RCC患者，而部分B仅考虑未服用抗生素的患者。指示每个共生菌的SEM(标准误差均值)的平均相对丰度，以及比较响应者(R)和非响应者(NR)的平均值的比率作为倍数变化及其log2值，当p值＜0.05时，不被认为是显著相关的。

【实施例3：根据RECIST 1.1标准的基于宏基因组学的与TTP＞6个月关联的GOMS(图3)】

当在所有RCC患者中分开响应者(R，TTP>6个月)和非响应者(NR，TTP＜6个月)(根据RECIST1.1评估的TTP6)时，我们没有观察到FDR p值＜0.05的显著差异(未显示)。在未服用ATB的RCC中分开响应者(NR，TTP＜6个月)和非响应者(NR，TTP＜6个月)(根据RECIST1.1评估的TTP6)时，我们观察到了FDR p值＜0.05的显著差异(图4)。值得注意的是，在未服用抗生素的RCC患者中，罕见小球菌属(Subdoligranulum sp.)_CAG_314_1和真杆菌属(Eubacterium sp.)_CAG_115与TTP＞6个月关联。。

我们进行了允许找到具有临床相关性的非常稳健的GOMS的多元模型。

【与TTP>6个月关联的GOMS】

在考虑LEfSe组合时，获得允许在所有患者中鉴定AUC值为0.845、特异性为0.889(真阳性病例)和灵敏度为0.800(假阳性病例)的“响应”患者(R)的最佳预测模型，并且在模型中保留的良好共生菌如下，如表17所示(部分A)：

·梭菌属(Clostridium sp.)_CAG_230(在R中增加6.7倍)

·梭菌属(Clostridium sp.)_CAG_167(在R中增加2.8倍)

·固氮螺菌属(Azospirillum sp.)_CAG_239_3(仅可在R中检测到)

·硬壁菌门(Firmicutes)细菌_CAG_176_12(在R中增加6.9倍)

应减少的不良共生菌是：

·尖锐粪球菌(Coprococcus catus)_GD_7_6(减少65.6％)

·颤杆菌属(Oscillibacter sp.)_KLE_1745_6(减少56.6％)

截止值对应于表17中的平均值±SEM。

然而，在未服用ATB的患者中，在该模型中保留的有利细菌列表不同并包括以下的，在考虑LEfSe组合时获得达到0.804的AUC值，0.848的特异性(真正的阳性病例)和0.770的灵敏度(假阳性病例)的(表17，部分B)：

·真杆菌属(Eubacterium sp.)_CAG_180_1(在R中增加3倍)

·真杆菌属(Eubacterium sp.)_CAG_115(在R中增加13倍)

·惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)_CAG_80(在R中增加5.4倍)

·穗状丁酸弧菌(Butyrivibrio crossotus)_DSM_2876(仅可在R中检测到)

截止值对应于表17中的平均值±SEM。这些有利和不利的共生菌是影响针对PD1阻断的有利反应的主要物种。

【与TTP＜6个月关联的GOMS】

对于所有患者中与短TTP＜6个月关联的细菌，显著细菌列表非常抑制，甚至无需ATB。很少有可能与抗性显著相关：

·梭菌目(Clostridiales)细菌_VE202_14_1(在NR中检测不到)

·梭菌属(Clostridium sp.)_CAG_230(在R中增加6.7倍)

·固氮螺菌属(Azospirillum sp.)_CAG 239_1(在NR中检测不到)。

【表17：与TTP>或＜6个月关联的共生细菌】

部分A包括所有RCC患者，而部分B仅考虑未服用抗生素的患者。指示每个共生菌的SEM(标准误差均值)的平均相对丰度，以及比较响应者(R)和非响应者(NR)的平均值的比率作为倍数变化及其log2值，当p值＜0.05时，不被认为是显著相关的。

【实施例4：无论抗生素使用的RCC患者的结果，结果_1标准】

在本实施例中，基于一套69个“参考样式”构建了3种不同的模型，其是从训练逻辑回归模型中使用的69个样本获得的标准化丰度表征(零均值和单位方差)。标准化是均质化细菌物种丰富的动态范围所必需的。

基于材料和方法中描述的应用于具有未知的抗生素使用史和结果_1标准(最佳结果)的69名RCC患者(NR＝27；R＝42)的第一策略，我们选择了25种给出了逻辑回归模型总体可预测性等于89.86％的细菌物种(模型1.1)。为了测量25个物种的模型的良好度，在原始数据集的子集执行5倍交叉验证之后，模型本身能够预测60％的NR和69％的R对象，其中CV_AUC＝0.917和AUC＝0.785。在RFECV和RFE特征选择上，从上述25种中选择了8种：基于这8个物种构建了给出了79.71％的总体可预测性的模型(模型1.2，图5)，以下表18中报告了这些物种的总结统计数据。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集执行5倍交叉验证之后，模型本身能够预测NR的40％和77％的R对象，CV_AUC＝0.635和AUC＝0.815。

基于应用于具有未知的抗生素使用史和结果_1标准的69名RCC患者(NR＝27；R＝42)的第二策略(机器学习)，我们考虑了数据集的全部细菌物种(n＝1112)。在第一轮特征选择之后，RFECV给出了共生的排序＝1～31的物种，其在5倍交叉验证之后，能够预测100％的NR和100％的R对象，其中CV_AUC＝1和AUC＝1(模型2.1)。在第二轮特征选择时，RFE给出了排序＝1到8的物种，为后续逻辑回归分类器选择。基于这8个物种构建的模型给出了89.86％的总体可预测性(模型2.2，图5)，下表19中报告了这些物种的汇总统计数据。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集执行的5倍交叉验证之后，模型本身能够预测80％的NR和92％的R对象，其中CV_AUC＝1和AUC＝0.923。

【表18：模型1.2中选择的物种统计数据】

【表19：模型2.2中选择的物种统计数据】

考虑到整个RCC同群中具有大于或等于0.001(如果以区间[0:1]表示，因此为0.1％)的平均相对丰度的细菌物种(n＝181，1112种以上的总物种，占总微生物组成的16.3％)，我们对抗生素使用史未知的和结果_1标准的69例RCC患者(NR＝27；R＝42)应用了第二策略(机器学习)。在第一轮特征选择后，RFECV给出了排序＝1～21的物种，其经过5倍交叉验证后，能够共同预测100％的NR和92％的R的对象，CV_AUC＝0.573和AUC＝1(模型3.1)。在第二轮特征选择之后，RFE给出了排序＝1～8的物种，其被选择用于随后的逻辑回归分类器。基于这8个物种构建的模型给出了85.51％的总体可预测性(模型3.2，图5)，这些物种的总结统计数据记载在下表20中。为了衡量模型的良好度，在对原始数据集的子集进行了5倍交叉验证之后，模型本身能够预测80％的NR和85％的R对象，CV_AUC＝0.635并且AUC＝0.831。当粪便样本的存储、测序、刚度等方面出现问题时，最后一种模型的设计更低廉。

根据模型1.2、2.2和3.2，其基于未知的抗生素使用史和结果_1标准进行建模，并且全部基于8种细菌物种，因此可以正确地比较它们，结果表明模型2.2具有最高可预测性(89.86％)及最高CV_AUC和AUC。

【表20：模型3.2中选择的物种的统计数据】

【实施例5：无论抗生素使用的RCC患者的预测模型，结果_1标准】

根据实施例4中获得的结果，且由于响应者(R)被预计在全部3个被建议有8个物种的模型中优于非响应者(NR)的事实(图5)，我们考虑了相对于R的逻辑回归β系数。

对于模型1.2，根据R的β系数(R_coeff)，属于测试的对象JD的R同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

-1.084*CAG01039+

-0.9723*CAG00473+

-0.9907*CAG00140+

-0.6234*CAG00610+

-0.8468*CAG01141+

0.8994*CAG00413+

0.6041*CAG00317)][3]

在方程[3]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”(即用于训练逻辑回归模型的每个粪便样品的每个细菌物种的所有相对丰度)标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

对于模型2.2，根据R的β系数(R_coeff)，属于测试对象JD的R同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

-1.1164*CAG01141+

-1.2839*CAG00650+

-1.1156*CAG00928+

-1.014*CAG00473+

-0.9394*CAG00122+

-0.8085*CAG01144+

-0.7679*CAG00063)][4]

在方程[4]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

对于模型3.2，根据R的β系数(R_coeff)，属于测试对象JD的R同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

-1.027*CAG00473+

-0.9968*CAG00327+

-1.0043*CAG01039+

-0.7456*CAG00140+

-0.8736*CAG01263+

0.7032*CAG00037+

-0.6073*CAG00357)][5]

在方程[5]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

【实施例6：没有使用抗生素的RCC患者的结果，结果_1标准】

在本实施例中，基于一套58个“参考样式”构建了3种不同的模型，其是从训练逻辑回归模型中使用的58个样本获得的标准化丰度表征(零均值和单位方差)。标准化是均质化细菌物种丰富的动态范围所必需的。

基于第一策略适用于没有抗生素使用史和结果_1标准(最佳结果)的58例RCC患者(NR＝19；R＝39)，我们选择了25种给出了逻辑回归模型的总体可预测性等于89.66％的细菌物种(模型4.1)。为了测量25个物种模型的良好度，在对原始数据集的子集执行5倍交叉验证之后，模型本身能够预测67％的NR和100％的R对象，其中CV_AUC＝1和AUC＝0.778。在RFECV和RFE特征选择上，从上述25种中选择了8种：基于这8个物种构建了给出了87.93％的总体可预测性的模型(模型2.2，图6)，下表21中报告了这些物种的总结统计数据以下。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集上执行的5倍交叉验证之后，模型本身可以预测100％的NR和92％的R对象，其中CV_AUC＝1和AUC＝1。

基于应用于没有抗生素使用史和结果_1标准的58例RCC患者(NR＝19；R＝39)的第二策略(机器学习)，我们考虑了数据集的所有细菌物种(n＝1083)。在第一轮特征选择之后，RFECV给出了共生的排序＝1至9的物种，其在5倍交叉验证之后，能够预测100％的NR和92％的R对象，具有CV_AUC＝1和AUC＝1(模型5.1)。在第二轮特征选择时，RFE给出了排序＝1到8的物种，为后续逻辑回归分类器选择。基于这8个物种构建的模型给出了93.1％的总体可预测性(模型5.2，图6)，下表22中报告了这些物种的总结统计数据。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集上执行的5倍交叉验证之后，模型本身可以预测100％的NR和92％的R对象，其中CV_AUC＝1和AUC＝1。

【表21：模型4.2中选择的物种的统计数据】

【表22：模型5.2中选择的物种的统计数据】

考虑到整个RCC同群中具有大于或等于0.001(如果以区间[0:1]表示，因此为0.1％)的平均相对丰度的细菌物种(n＝183，总数超过1083，占总微生物组成的16.9％)，我们对58名无抗生素使用史和结果_1标准的RCC患者(NR＝19；R＝39)应用了第二策略(机器学习)。在第一轮特征选择后，RFECV给出了排序＝1至20的物种，经过5倍交叉验证后，它们能够共同预测100％的NR和92％的R对象，CV_AUC＝0.917，并且AUC＝1(模型6.1)。在第二轮特征选择之后，RFE给出了排序＝1到8的物种，其被选择用于随后的逻辑回归分类器。基于这8个物种构建的模型给出了84.48％的总体可预测性(模型6.2，图6)，这些物种的总结统计结果记录在下表23中。为了衡量模型的良好度，在对原始数据集的子集进行了5倍交叉验证后，模型本身能够预测67％的NR和100％的R对象，CV_AUC＝0.917和AUC＝0.889。如果粪便样品的存储，测序，刚度等存在问题，那么最后一个模型的设计价格将更低廉。

根据模型4.2、5.2和6.2，其在没有抗生素使用史和结果_1标准的情况下建模，并且全部基于8种细菌物种，以便适当地进行比较，所以显示模型5.2具有最高的可预测性(93.1％)最佳CV_AUC和AUC。

【表23：模型6.2中选择的物种的统计数据】

【实施例7：RCC患者没有抗生素使用的预测模型，结果_1标准】

根据实施例6中获得的结果，并且由于响应者(R)被预计在前2个被建议有8个物种的模型中优于非响应者(NR)(图7)，而在最后一个模型中是相反的事实，我们为模型4.2和5.2考虑了相对于NR的逻辑回归β系数，以及为模型6.2考虑了相对于R的逻辑回归β系数。

关于模型4.2，并且根据NR的β系数(NR_coeff)，属于测试对象JD的NR同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

0.8761*CAG01039+

0.9951*CAG00473+

0.7609*CAG00487+

1.1107*CAG00140+

0.9402*CAG01141+

0.7187*CAG01208+

-0.5812*CAG00413)][6]

在方程[6]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

关于模型5.2，并且根据NR的β系数(NR_coeff)，属于测试对象JD的NR同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

0.8931*CAG00300+

1.0042*CAG00473+

1.1282*CAG00650+

1.2569*CAG00720+

1.2397*CAG00727+

0.7595*CAG00963+

1.0235*CAG01141)][7]

在方程[7]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

关于模型6.2，根据R的β系数(R_coeff)，属于测试对象JD的R同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

-0.8848*CAG00008+

-0.9776*CAG00698+

-0.9997*CAG00473+

-1.0697*CAG00327+

-0.7806*CAG01039+

-0.8376*CAG00897+

-0.7459*CAG00766)][8]

在方程[8中]，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

【实施例8：RCC患者的结果无论抗生素使用，结果_2标准】

在本实施例中，基于一套67个“参考样式”构建了3种不同的模型，其是从训练逻辑回归模型中使用的67个样本获得的标准化丰度表征(零均值和单位方差)。标准化是均质化细菌物种丰富的动态范围所必需的。

基于适用于67例具有未知的抗生素使用史和结果_2标准(TPP>6个月)的RCC患者(NR＝37；R＝30)的第一策略，我们选择了10种给出了逻辑回归模型的总体可预测性等于65.22％的细菌物种(模型7.1)。为了测量10种的模型的良好度，在对原始数据集的子集执行的5倍交叉验证之后，模型本身能够预测78％的NR和44％的R对象，其中CV_AUC＝0.370和AUC＝0.716。在RFECV和RFE特征选择上，从上述10种中选择了8种：基于这8个物种构建了给出了66.67％的总体可预测性的模型(模型7.2，图7)，下表24中报告了这些物种的总结统计数据。为了测量模型的良好度，在原始数据集的子集上执行5倍的交叉验证之后，模型本身能够预测78％的NR和44％的R对象，其中CV_AUC＝0.481和AUC＝0.704。

基于应用于未知抗生素使用史和结果_2标准的67名RCC患者(NR＝37；R＝30)的第二策略(机器-学习)，我们考虑了数据集的所有细菌物种(n＝1112)。在第一轮特征选择之后，RFECV给出了共生的排序＝1～1070的物种，在5倍交叉验证之后，能够预测11％的NR和100％的R对象，其中CV_AUC＝0.667和AUC＝0.667(模型8.1)。在第二轮特征选择时，RFE给出了排序＝1到8的物种，为后续逻辑回归分类器选择。基于这8个物种构建的模型给出了88.41％的总体可预测性(模型8.2，图7)，表25中报告了这些物种的总结统计数据。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集执行的5倍交叉验证之后，模型本身能够预测100％的NR和67％的R对象，CV_AUC＝0.667和AUC＝0.926。

考虑到整个RCC同群中具有大于或等于0.001(如果以区间[0:1]表示，因此为0.1％)的平均相对丰度的细菌物种(n＝181，在1112种以上的细菌中，占总微生物组成的16.3％)，我们对67名RCC患者(抗生素使用史和结果_2标准未知)应用了第二策略(机器学习)(NR＝37；R＝30)。在第一轮特征选择后，RFECV给出了排序＝1至175的物种，经过5倍交叉验证后，它们能够共同预测33％的NR和78％的R的对象，CV_AUC＝0.222和AUC＝0.605(模型9.1)。在第二轮特征选择之后，RFE给出了排序＝1到8的物种，其被选择用于随后的逻辑回归分类器。基于这8个物种构建的模型的整体可预测性为88.41％(模型9.2，图7)，下表26列出了这些物种的总结统计数据。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集进行5倍交叉验证后，模型本身能够预测89％的NR和78％的R对象，CV_AUC＝0.481，AUC＝0.864。当粪便样本的存储、测序、刚度等方面出现问题时，最后一种模型的设计使其价格更便宜。

根据基于未知的抗生素使用史和结果_2标准进行建模的所有模型，结果表明，模型8.2具有良好的可预测性(84.41％)，具有良好的CV_AUC和AUC，可以在NR和R患者中被选择为最具有辨识性的。

【表24：模型7.2中选择的物种的统计数据】

【表25：模型中选择的物种统计数据】

【表26：模型9.2中选择的物种的统计数据】

【实施例9：无论抗生素使用的RCC患者的预测模型，结果_2标准】

根据实施例8中获得的结果，我们为模型7.2、8.2和9.2考虑了相对于NR的逻辑回归β系数。

对于模型7.2，根据非响应者的β系数(NR_coeff)，属于测试对象JD的NR同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

0.4092*CAG00013+

0.2708*CAG00873+

0.7665*CAG01141+

-0.5899*CAG00668+

-0.5181*CAG00669+

-0.8415*CAG00886+

-0.7339*CAG00889)][9]

在方程[9]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

对于模型8.2，根据NR的β系数(NR_coeff)，属于测试对象JD的NR同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

-1.0581*CAG00474+

-0.8984*CAG00624+

1.3189*CAG00650+

-0.7324*CAG00676+

-0.6623*CAG00771+

-1.1372*CAG01197+

-0.8525*CAG01321)][10]

在方程[10]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

对于模型9.2，根据NR的β系数(NR_coeff)，属于测试对象JD的NR同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

0.8927*CAG00601+

0.7108*CAG00607+

-1.2341*CAG00669+

1.0379*CAG00861+

-1.0016*CAG00880+

-0.872*CAG00937+

-0.8362*CAG01321)][11]

在方程[11]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

【实施例10：RCC患者没有抗生素使用的结果，结果_2标准】

在本实施例中，基于一套56个“参考样式”构建了3种不同的模型，其是从训练逻辑回归模型中使用的56个样本获得的标准化丰度表征(零均值和单位方差)。标准化是均质化细菌物种丰富的动态范围所必需的。

基于适用于56名没有抗生素使用史和结果_2标准的RCC患者(NR＝29；R＝27)的第一策略，我们选择了10种逻辑回归模型的总体可预测性等于72.41％的细菌物种(模型10.1)。为了测量10种的模型的良好度，在对原始数据集的子集执行5倍的交叉验证之后，模型本身能够预测78％的NR和67％的R对象，其中CV_AUC＝0.667和AUC＝0.796。在RFECV和RFE特征选择上，从上述10个物种中选择了8种：基于这8个物种构建了给出了68.97％的总体可预测性的模型(模型10.2，图8)，表27中报告了这些物种的总结统计数据。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集执行5倍的交叉验证之后，模型本身能够预测89％的NR和100％的R对象，其中CV_AUC＝0.556和AUC＝0.981。

基于应用于没有抗生素使用史和结果_2标准的56名RCC患者(NR＝29；R＝27)的第二策略(机器学习)，我们考虑了数据集的全部细菌物种(n＝1083)。在第一轮特征选择之后，RFECV给出了共生的排序＝1至51的物种，在5倍交叉验证后，能够预测89％的NR和83％的R对象，其中CV_AUC＝0.944和AUC＝0.944(模型11.1)。在第二轮特征选择时，RFE给出了排序＝1到8的物种，为后续逻辑回归分类器选择。基于这8个物种构建的模型给出了91.38％的总体可预测性(模型11.2，图8)，下表28中报告了这些物种的总结统计数据。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集执行5倍交叉验证之后，该模型本身能够预测78％的NR和100％R对象，CV_AUC＝1和AUC＝0.981。

【表27：模型10.2中选择的物种统计数据】

【表28：模型11.2中选择的物种的统计数据】

【表29：模型12.2中选择的物种的统计数据】

考虑到整个RCC同群中具有大于或等于0.001(如果以区间[0:1]表示，因此为0.1％)的平均相对丰度的细菌物种(n＝183，总数超过1083，占总微生物组成的16.9％)，我们对56名无抗生素使用史和结果_2标准的RCC患者(NR＝29；R＝27)应用了第二策略(机器学习)。在第一轮特征选择之后，RFECV给出了排序＝1至20的物种，经过5倍交叉验证后，它们能够共同预测78％的NR和67％的R对象，CV_AUC＝0.833，AUC＝0.852(模型12.1)。在第二轮特征选择之后，RFE给出了排序＝1到8的物种，这些等级被选择用于随后的逻辑回归分类器。基于这8个物种构建的模型的总体可预测性为89.66％(模型12.2，图8)，表29中报告了这些物种的总结统计数据。为了测量模型的良好度，在对原始数据集的子集进行5倍交叉验证后，模型本身能够预测78％的NR和50％的R对象，CV_AUC＝0.889，AUC＝0.611。如果粪便样本的存储、测序、刚度等方面存在问题，那么最后一种模型的设计价格将更为低廉。

根据模型10.2、11.2和12.2，其在没有抗生素使用史和结果_2标准的情况下进行建模，并且基于8种细菌物种以便适当地进行比较，表明模型11.2在NR和R中具有最高辨识度，具有良好的可预测性(91.38％)和优秀的CV_AUC和AUC。

【实施例11：RCC患者没有抗生素使用的预测模型，结果_2标准】

根据实施例10中获得的结果，并且由于在全部被建议有8个物种的模型中，响应者(R)被预计在模型10.2和11.2中优于非响应者(NR)，而在模型12.2中是相反的事实(图7)，为了使它们可比较，我们为模型10.2和11.2考虑了相对于R的逻辑回归β系数，而为模型12.2考虑了相对于的NR的逻辑回归β系数。

关于模型10.2，并且根据R的β系数(R_coeff)，属于测试对象JD的R同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

-0.5496*CAG00013+

-0.4646*CAG00873+

-0.5496*CAG01141+

0.5684*CAG00668+

0.5129*CAG00669+

0.6623*CAG00886+

0.7102*CAG00889)][12]

在方程[12]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

关于模型11.2，并且根据R的β系数(R_coeff)，属于测试对象JD的R同群的概率估计(表示为百分比)如下计算：

P

1.13*CAG00530+

-1.183*CAG00601+

-0.9544*CAG00607+

0.8929*CAG00646+

1.0919*CAG00713+

0.4881*CAG00919+

1.1606*CAG01158)][13]

在方程[13]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

关于模型12.2，并且根据NR的β系数(NR_coeff)，属于测试对象JD的NR同群的概率估计(表示为百分比)计算如下：

P

1.1396*CAG00218+

-1.0166*CAG00341+

-0.8403*CAG00474+

-0.7067*CAG00508+

-1.185*CAG00880+

0.8466*CAG01263+

-0.8895*CAG01321)][14]

在方程[14]中，“CAGXXXXX”表示来自所测试的对象JD的粪便样品中由叙述的CAG定义的细菌物种的相对丰度。这些相对丰度需要表示为标准值(零均值和单位方差)。最佳选择是用一套已知的“参考样式”标准化测试对象的“丰度样式”，且本发明要求一个用来使P

【讨论】

上面描述的方法依赖于以下正面特征：

(i)可以使用不同的NGS测序平台(454、Illumina、IonTorrent、Nanopore、PacBio)和分子生物学技术(qPCR，微阵列，......)

(ii)在闭合区间[0：1]内模型(选择的细菌物种)的相对丰度的表达。

(iii)如果测试的对象没有属于所选择的模型的一个或多个所选物种，则由于其加和性质和所提出的双策略，该模型保持了高可预测性。

(iv)2种策略中的每一个都分为2种不同的模型，其中一个仅限于过去2个月内未服用抗生素的个体，而另一个则考虑未知的抗生素方案/治疗状况的可能性。

如材料和方法所述，根据用于将明确对象的“丰度样式”适当地拟合为建议的模型之一的统计方法，我们提出以下步骤：

(i)从对象中取出的粪便样品经历DNA提取和用优选的NGS平台的鸟枪测序(如上所述)，以及闭合区间[0：1]内的相对丰度通过材料和方法中描述的生物信息流程来测量。

(ii)对象JD的可预测性评分(P)表示属于确定同群(NR或R)的概率估计(表示为百分比)定义如下：

P＝1/(1+exp^-z) [1]，和

z＝β1*x1+…+βn*xn [2]

其中z是对数比值比(表示事件会发生的概率和事件不会发生的概率之间的比的自然对数)，Exp是天然基础中的指数，每个β是根据本发明预先计算的回归系数，并且每个x是在闭合区间[0：1]内所示的所选细菌物种的相对丰度，义务表示为标准化数据(平均值移除和单位方差缩放)；

(iii)如果步骤(ii)中获得的P评分被解释为有临床意义，如果它高于75％(固定阈值)和/或它在所使用的不同模型中是一致的，始终考虑到抗生素使用(已知或未知)。

在上述方法中，回归系数β必须通过逻辑回归分类器计算，有以下要求：未添加到决策功能的常数(也称为截距)；最大迭代等于10000；Liblinearsolver(带L2罚分)。在Sci-Kit学习库指南的第1.1.11节中解释和描述了逻辑回归的所有这些参数。

结果_2意味着在响应者中仅考虑SD>6个月。

基于本文所公开的结果，我们得出以下观点：

(1)GOMS(“肠道肿瘤微生物组签名”)可以绝对可以在PD-1阻断期间预测良好的临床结果，在AUC>0.9和RCC中的适当的特异性和灵敏度。

(2)对比R与NR对比的临床标准可能受到肠道肿瘤微生物组的组成的影响。

(3)考虑到“人为驱动”策略时，R和NR的GOMS是大且相同的GOMS，并且它们可以基于逻辑回归系数预测不同的NR或R状态。

(4)临床意义依赖于“有利”和“不利”共生菌之间的平衡，可分别检测在R粪便或NR粪便中的较高丰度。

(5)一些物种耐受ATB，主要是硬壁菌门(Firmicutes)成员。

(6)我们的在RCC 2L的整个群体上的最佳预测最小的生态系统(称为“GOMS”)基于少量MGS(不利的普雷沃氏菌属(Prevotel la spp.)，粪杆菌属(Faecalibacterium spp.)，尖锐粪球菌(Coprococcus catus)，迟缓埃格特菌(Eggerthel la lenta)，鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)对比有利的萨特菌属(Sutterel la spp.)，Akkermansia，Alistipes属(Alistipes spp.))，如通过配对分析和逻辑回归模型证明。

(7)备注，一些有利的共生菌是健康与癌症个体之间观察到的差异的一部分(在HV(vs癌症pts)中过表达的细菌也与抗PD1治疗患者的R表型相关)。

在本文中，我们提出了不同的GOMS(肠道肿瘤微生物组签名)，以预测患有RCC的明确对象的NR或R状态，这取决于ICI治疗的2个主要标准：(i)在过去2个月内存在抗生素治疗/使用情况；(ii)结果(结果_1或结果_2)的RECIST定义。作为第一步，我们证明了GOMS能够在结果_1，TTP3和TTP6中区分NR和R，并且后者显示出在Routy等人Science 2018中报告的第一同群中的显著α-和β-多样性。基于ROC曲线的用于最佳描述符(单细菌物种或联合)的平均AUC值(在NR和R中)在TTP3显示更高的预测值：无论抗生素使用，我们具有平均AUC

在上述研究中，我们通过火山，LEfSe和配对分析NR和R的细菌签名，无论抗生素使用，以及在预先服用ICI治疗的2个月内未服用抗生素的人的细菌签名。我们发现，从TTP6的原始签名中，NR中没有细菌物种抵抗ATB，而响应者之间的18％抵抗ATB(图3)。所有这些物种对于具有未知抗生素方案的RCC患者可能是良好的预测因子。基于前述的GOMS，抗生素使用和根据RECIST标准的结果状态，本文提出了不同的逻辑回归模型。在双重策略(如材料和方法中描述)和内部特征选择和5倍交叉验证后，我们为RCC患者(无论有无ATB)制作了6种模型(模型1.2，模型2.2，模型3.2，模型7.2，模型8.2，模型9.2)，我们为无ATB治疗的RCC患者制作了其他6种模型(模型4.2，模型5.2，模型6.2，模型10.2，模型11.2，模型11.2，模型12.2)(见表30)。从第一调查开始，在逻辑回归模型之后，ATB似乎在2种结果的整体模型可预测性下降了大约4％：实际上，我们具有平均值Pred.

【表30：每个模型中的细菌物种。“良好细菌”以粗体突出显示】

【表31：每种细菌物种的特定序列】

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