石蒜属荧光EST-SSR分子标记引物和鉴定石蒜属种间杂交种F1代的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种石蒜属荧光EST‑SSR分子标记引物，该引物包括SSR32、SSR115、SSR198和SSR203；本发明还公开了利用该引物鉴定石蒜属种间杂交种F1代的方法及其应用。本发明利用4对上述荧光EST‑SSR分子标记的引物对石蒜和换锦花、石蒜和中国石蒜的杂交种F1代进行真伪鉴定，发现SSR203+SSR115结合杂交种检测率分别达到96.30％、96.15％，与3对引物相结合(SSR203+SSR115+SSR198和SSR203+SSR115+SSR32)鉴定结果相同，可以看出用SSR203+SSR115组合可将石蒜和换锦花、石蒜和中国石蒜杂交种F1代鉴别开，可大大缩短育种周期，减少工作量并节约成本。

说明书

技术领域

本申请涉及石蒜属荧光EST-SSR分子标记引物和鉴定石蒜属种间杂交种F1代的方法及其应用。

背景技术

石蒜属植物(Lycoris)隶属百合目(Liliflorae)石蒜科(Amaryllidaceae)，具地下鳞茎，为多年生草本植物，有“中国郁金香”之称。目前，石蒜属植物育种主要通过种间和种内杂交等常规育种方法和自然群体的选择育种来选育新品种，而对石蒜属植物杂交种真实性的鉴定主要在杂交种开花时从花色和花型等农艺性状来判断，但由于石蒜属植物生长周期长，种子播种后需5-6年时间才能开花，在杂交种早期仅凭叶片和鳞茎的形状和大小进行鉴定及分类会出现误差，尤其是对石蒜属杂交种F1代的真伪鉴定，在销售和生产中极易出现混淆，因此有必要对石蒜属植物种间杂交种F1代进行早期鉴定。

常规的SSR标记是以PCR为基础较为成熟的遗传标记，但存在工作量大、精度低、分析量小的缺点，无法完成大批量样品的检测，而荧光SSR分子标记能准确获得目标DNA片段的大小(精确至1bp)，检测结果稳定、准确且高效并适用于大批量品种的检测分析，已被广泛应用于花生、高山杜鹃、百合、玉米、枇杷、芒等F1代杂交种真实性和纯度检测、遗传多样性分析、种质资源的核心种质的构建等。虽然已开发相关石蒜属植物换锦花的EST-SSR标记，但仅用于石蒜属种质资源鉴定、换锦花和中国石蒜为亲本的杂交种鉴定，但对于更多石蒜属中石蒜和换锦花、石蒜和中国石蒜的杂交种的鉴定未见相关报道。

发明内容

基于此，本申请的目的之一在于提供一种石蒜属荧光EST-SSR分子标记引物，该引物包括SSR32、SSR115、SSR198和SSR203，各引物所对应的序列为：

SSR32正向：CCAGTCGTTCCGTTCCATCA 反向：CTGCTGCACTTGTTCCCAAC

SSR115正向：ATTCTGATCGGCGAAGGAGG反向：ATTTGCAAGGCGGTCAGAGA；

SSR198正向：TCAGGGAATAAACCTCCGCC反向：ACTTGCTATCCTTGGGGCTT；

SSR203正向：ACGTGAGCAGTCCTCCTACT反向：GACATGCCCACTTCTCCCAA。

本发明还提供了一种利用荧光EST-SSR分子标记引物鉴定石蒜属种间杂交种F1代的方法，包括以下步骤：

提取石蒜属种间杂交种F1代的基因组DNA；

利用该荧光EST-SSR分子标记的引物对石蒜属种间杂交种F1代的基因组DNA进行PCR扩增，其中PCR扩增反应总体积为10μL，该扩增反应体系为Taq 1.0U，MgCl

将上述PCR产物进行毛细管电泳分析。

在一个实施方案中，上述引物包含SSR203+SSR115的组合。

在一个实施方案中，上述石蒜属种间杂交种F1代为石蒜和换锦花和/或石蒜和中国石蒜的杂交种F1代。

本发明还提供了上述荧光EST-SSR分子标记的引物在鉴别石蒜属种间杂交种F1代中的应用。

在一个实施方案中，上述石蒜属种间杂交种F1代为石蒜和换锦花和/或石蒜和中国石蒜的杂交种F1代。

在一个实施方案中，上述引物包含SSR203+SSR115的组合。

本发明利用4对上述荧光EST-SSR分子标记的引物对石蒜和换锦花、石蒜和中国石蒜的杂交种F1代进行真伪鉴定，发现SSR203+SSR115结合杂交种检测率分别达到96.30％、96.15％，与3对引物相结合(SSR203+SSR115+SSR198和SSR203+SSR115+SSR32)鉴定结果相同，可以看出用SSR203+SSR115组合可将石蒜和换锦花、石蒜和中国石蒜杂交种F1代鉴别开，可大大缩短育种周期，减少工作量并节约成本。

附图说明

图1为SSR203引物在亲本换锦花、石蒜、中国石蒜及其种间杂交种的扩增产物带型(A换锦花、B石蒜、C中国石蒜、D石蒜和中国石蒜杂交种、E石蒜和换锦花杂交种)；

图2为SSR115引物在亲本换锦花、石蒜、中国石蒜及其种间杂交种的扩增产物带型(A换锦花、B石蒜、C中国石蒜、D石蒜和中国石蒜杂交种、E石蒜和换锦花杂交种)。

具体实施方式

以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。

1.材料与方法

1.1样品材料

石蒜属亲本石蒜，中国石蒜，换锦花及石蒜和中国石蒜的杂交种F1与石蒜和换锦花的杂交种F1共78个样品，种植于浙江农林大学石蒜属种质资源圃，于2020年8-9月盛花期采集各材料花瓣用于提取基因组DNA。

1.2基因组DNA提取和EST-SSR引物筛选

采用改良CTAB法提取石蒜属亲本石蒜、中国石蒜换锦花及杂交种花瓣基因组DNA，用Nanodrop2000测定DNA的质量和浓度，并经1.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测拍照。

分别以石蒜属亲本中国石蒜、石蒜和换锦花基因组DNA为模板，从课题组前期开发的59对石蒜属植物通用EST-SSR引物中筛选条带清晰、重复性好且具多态性的引物，EST-SSR PCR反应扩增体系为(10.0μl)：Taq 1.0U，MgCl

1.3荧光EST-SSR分子标记毛细管电泳和杂交种F1鉴定

选择15对具多态性EST-SSR引物交由杭州霄凌生物技术有限公司进行荧光标记，四色引物为一组，正向引物分别加注FAM(蓝)、HEX(绿)、TAMRA(黄)和ROX(红)荧光，分别在石蒜属亲本石蒜、中国石蒜和换锦花及其杂交种的77个样品进行多重PCR扩增，EST-SSRPCR扩增产物于遗传分析仪(ABI 3730XL，ThermoFisher Scientific，USA)进行毛细管电泳检测分析，机器自动化读取数据。根据电泳结果选择(中国石蒜、石蒜和换锦花)种内一致、且种间具有多态性、具有特异、单一且重复性好的引物用于杂交种鉴定。通过比较亲本与杂交种EST-PCR扩增产物，杂交种F1具有父母本互补型或有变异型扩增带型的样品鉴定为真杂种。

杂交率(％)＝真实杂交种样本数/样本总数×100％

表1 15对EST-SSR引物序列和PCR扩增结果

2.结果与分析

2.1亲本间特异型EST-SSR引物的筛选

利用59对石蒜属通用的EST-SSR引物从亲本中国石蒜、换锦花和石蒜共25个单株中筛选出具种间多态性的15对EST-SSR引物进行荧光标记，对78个亲本和种间杂交种样品基因组DNA进行PCR扩增，经荧光毛细管电泳后，每对引物在每个样品中均获得精确的DNA片段大小，从亲本中国石蒜、换锦花和石蒜样品中选择出种内一致性且种间多态性的3对特异引物用于石蒜和换锦花，石蒜和中国石蒜种间杂交种的鉴定，其中SSR引物203在换锦花、石蒜和中国石蒜的特征片段大小分别为204bp、189bp和204bp(见图1)；SSR引物115在换锦花、石蒜和中国石蒜的的特征片段分别为226bp、230bp和228bp(见图2)；SSR引物198在石蒜和换锦花的特征条带分别为228bp和221bp。因此SSR引物203，115和198可以进行石蒜和换锦花杂交种F1(包括正交和反交)的鉴定。

2.2种间杂交种F1代的鉴定

利用SSR203、SSR115和SSR198筛选的3对特异性荧光EST-SSR分子标记引物对27个石蒜和换锦花杂交种进行鉴定，结果表明引物SSR203从石蒜和换锦花杂交种共检测到真实杂交种占88.46％，其中具有双亲特征条带189/204的占69.23％，而特异条带的杂交种占19.23％，引物SSR115检测到石蒜和换锦花杂交种占84.61％，其中具有父母本特征条带的占53.85％，特异条带占30.77％，SSR198检测率只有53.85％，而将引物两两组合检测发现SSR203+SSR115的检测率可达96.30％，大于SSR203+SSR198和SSR115+SSR198组合的鉴定率(88.89％)，而3对引物结合(SSR203+SSR115+SSR198)的杂交种检出率为96.30％，和SSR203+SSR115的检出率一致，可见仅用SSR203+SSR115结合即可对石蒜和换锦花杂交种苗期进行早期鉴定。

同样，用3对EST-SSR引物对石蒜和中国石蒜杂交种F1进行鉴定，引物SSR203对石蒜和中国石蒜杂交种真实性检出率为80.77％，其中具有双亲特征条带175/169的杂交种占42.31％，具变异条带的占38.46％；引物SSR115和SSR32对石蒜和中国石蒜杂交种真实性检出率分别为50％和69.23％，而引物两两结合SSR203+SSR115和SSR203+SSR32的鉴定效率可达96.15％，与3对引物结合(SSR203+SSR115+SSR32)的杂交种鉴定率相一致，高于SSR115+SSR32的结合(76.92％)，因此可用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SSR203+SSR115+SSR32对石蒜和中国石蒜杂交种进行鉴定。

为节省成本，可用SSR203+SSR115结合可在石蒜和换锦花，石蒜和中国石蒜的杂交种F1代早期进行鉴定，缩短育种周期和减少工作量。

表2对EST-SSR引物对石蒜属种间杂交种鉴定

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 石蒜属荧光EST-SSR分子标记引物和鉴定石蒜属种间杂交种F1代的方法及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccagtcgttc cgttccatca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgctgcact tgttcccaac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attctgatcg gcgaaggagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atttgcaagg cggtcagaga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagggaata aacctccgcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acttgctatc cttggggctt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgtgagcag tcctcctact 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacatgccca cttctcccaa 20