神经内分泌癌靶向治疗

摘要

大部分神经内分泌(NE)癌过度表达生长抑素受体(SSTRs)。本文公开了用作NE癌靶向治疗剂的抗SSTR2单克隆抗体和抗体药物缀合物(ADC)。还公开了编码所公开抗体的分离核酸，以及含有可操作地连接至表达控制序列的此分离核酸的核酸载体。还公开了用这些载体转染的细胞和这些细胞用以产生所公开的重组抗体的用途。还公开了一种治疗受试者的神经内分泌(NE)癌的方法，其包含向所述受试者施用有效量的与抗癌剂结合的所公开抗体。

说明书

相关申请的交叉引用

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序列表

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背景技术

神经内分泌(NE)癌，如类癌、胰岛细胞瘤和甲状腺髓样癌(MTC)经常转移至肝脏(Adler JT等人,肿瘤学家(Oncologist.)200813(7):779-93；Pinchot SN等人,研究性药物的现代观点(Curr Opin Investig Drugs.)20089(6):576-82；Chen H等人,美国外科医学杂志(J Am Coll Surg.)1998187(1):88-92；Chen H等人,胃肠外科杂志(J GastrointestSurg.)19982(2):151-5；Chen H等人,外科肿瘤学杂志(J Surg Oncol.)200897(3):203-4)。它们是流行性第二高的GI恶性肿瘤(Yao JC等人,临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol.)200826(18):3063-72)。90％的胰腺类癌患者和50％的胰岛细胞瘤患者发展出孤立性肝转移(Hiller N等人,腹部影像(Abdom Imaging.)199823(2):188-90；Brown KT等人,血管与介入放射学杂志(J Vasc Interv Radiol.)199910(4):397-403；Pinchot SN等人.肿瘤学家200813(12):1255-69；Isozaki T等人,内科医学(Intern Med.)199938(1):17-21)。具有未经治疗的孤立性神经内分泌肝转移的患者具有<30％的5年存活概率。据报道，在美国有超过100,000名与NE癌共存的患者，每年有16,000例新诊断，且估计有超过200,000例未诊断病例(Chen H等人,美国外科医学杂志1998187(1):88-92；Norton JA.临床胃肠病学最佳实践与研究(Best Pract Res Clin Gastroenterol.)200519(4):577-8)。因此，有必要开发治疗NE癌的新型治疗。

对于具有局部肿瘤的早期疾病，单独手术切除通常是可以治愈的，但是40-95％的NE癌患者在最初诊断时是转移性的(Shiba S等人,胰腺病学(Pancreatology).201616(1):99-105)，且广泛的转移使得完全切除无法实现。考虑到NE癌对肝的高度侵犯，许多患者不适合手术介入，且NE癌切除后往往在外科床内就会复发。其它形式的治疗，包括化疗栓塞术、放射栓塞术、射频消融、冷冻消融和化疗(即mTOR抑制剂“依维莫司(everolimus)”和多激酶抑制剂“舒尼替尼(sunitinib)”)，显示出有限的疗效且引起重度全身性毒性(BrownKT等人,血管与介入放射学杂志199910(4):397-403；Isozaki T等人,内科医学1999 38(1):17-21；Eriksson B等人,神经内分泌学(Neuroendocrinology)200887(1):8-19；Lal A等人,肿瘤学现代观点(Curr Opin Oncol.)2006 18(1):9-15；Lehnert T.器官移植(Transplantation)199866(10):1307-12；Zhang R等人,内分泌学(Endocrinology)1999140(5):2152-8；Boudreaux JP等人,外科学年鉴(Ann Surg.)2005241(6):839-45；Nguyen C等人,核医学杂志(J Nucl Med.)200445(10):1660-8；Fiorentini G等人,化疗杂志(J Chemother.)200416(3):293-7；Zuetenhorst JM等人,内分泌相关癌症(EndocrRelat Cancer.)200411(3):553-61)。因此，除手术以外，不存在针对转移性NE癌的治愈性治疗。此外，由于这些肿瘤的特征为激素分泌过多，因此NE癌肝转移患者常伴有虚弱症状，如无法控制的腹泻、潮红、皮疹和心力衰竭(Brown KT等人,血管与介入放射学杂志199910(4):397-403；Miller CA等人,北美肿瘤外科临床(Surg Oncol Clin N Am.)19987(4):863-79)。因此，NE癌患者往往具有较差的生活质量，此凸显出迫切需要开发新的治疗策略以减少NE恶性肿瘤的进展。

发明内容

大部分神经内分泌(NE)癌过度表达生长抑素受体(SSTR)，其中SSTR2亚型主要发现于70-100％的NE肿瘤(NET)中的细胞表面上。更确切地说，NET中的SSTR2的表面表达水平比正常细胞中的SSTR2的表面表达水平高大约20倍。因此，本文公开了用作NE癌靶向治疗剂的抗SSTR2单克隆抗体(mAb，IgG)和抗体药物缀合物(ADC)。在一些实施例中，所公开的mAb下调致癌信号传导路径，减少激素积聚和相关类癌心脏衰竭，且增加T细胞的细胞因子产生。更重要的是，mAb证实对过度表达SSTR2的NET有高特异性、强结合和有效的药物递送能力。这样，所公开的ADC具有SSTR2靶向mAb和由mAb递送的强力药物的整合临床益处，从而可克服传统化疗中所观察到的非特异性结合和重度全身性毒性。

所公开的抗SSTR2单克隆抗体是使用从人类SSTR2的第2和第4细胞外结构域克隆的两种肽产生的。还公开了一种特异性结合SSTR2的抗体片段。例如，抗体可以是特异性结合SSTR2的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。本文还公开了至少包含所公开的抗体的抗原结合区的重组、人源化和/或嵌合抗体。在一些实施例中，抗SSTR2区(例如scFv)可包含具有CDR1、CDR2和CDR3序列的可变重(V

在一些实施例中，V

在一些实施例中，抗SSTR2 V

在一些实施例中，抗SSTR2 V

在一些实施例中，抗SSTR2 V

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:8)。

在一些实施例中，抗SSTR2 V

在一些实施例中，VH或VL结构域进一步包含信号肽，如MKLWLNWIFLVTLLNGIQC(SEQID NO:29)或MKLPVGLLVLMFWIPASSS(SEQ ID NO:30)。

重链和轻链优选地通过接头分离。适用于scFv抗体的接头为本领域中已知的。在一些实施例中，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:9)、SSGGGGSGGGGSGGS(SEQ ID NO:10)或GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:11)。scFv可具有式NH

因此，在一些实施例中，抗SSTR2 scFv包含氨基酸序列：MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYHLNWVRQPPGKALEWLALIRNKRYGYRTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDFYDPFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSMKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:12)。

因此，在一些实施例中，抗SSTR2 scFv包含氨基酸序列：MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSMKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYHLNWVRQPPGKALEWLALIRNKRYGYRTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDFYDPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:13)。

因此，在一些实施例中，抗SSTR2 scFv包含氨基酸序列：MKLWLNWIFPVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYHMNWVRQPPGKALEWLALIRNKANGYRTEYSASVKGRFTISRDNSQNILYLQMNTLRAEDSATYYCARDFYDPFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSMKLPVGLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTRVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:20)。

因此，在一些实施例中，抗SSTR2 scFv包含氨基酸序列：MKLPVGLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTRVPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSMKLWLNWIFPVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYHMNWVRQPPGKALEWLALIRNKANGYRTEYSASVKGRFTISRDNSQNILYLQMNTLRAEDSATYYCARDFYDPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:21)。

因此，在一些实施例中，抗SSTR2 scFv包含氨基酸序列：MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYHLNWVRQPPGKALEWLALIRNKRYGYRTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDFYDPFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSMKLPVGLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTRVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:22)。

因此，在一些实施例中，抗SSTR2 scFv包含氨基酸序列：MKLPVGLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTRVPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSMKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYHLNWVRQPPGKALEWLALIRNKRYGYRTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDFYDPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:23)。

因此，在一些实施例中，抗SSTR2 scFv包含氨基酸序列：MKLWLNWIFPVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYHMNWVRQPPGKALEWLALIRNKANGYRTEYSASVKGRFTISRDNSQNILYLQMNTLRAEDSATYYCARDFYDPFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSMKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:24)。

因此，在一些实施例中，抗SSTR2 scFv包含氨基酸序列：MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSMKLWLNWIFPVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYHMNWVRQPPGKALEWLALIRNKANGYRTEYSASVKGRFTISRDNSQNILYLQMNTLRAEDSATYYCARDFYDPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:25)。

还公开编码所公开抗体的分离核酸，以及含有可操作地连接至表达控制序列的此分离核酸的核酸载体。还公开用这些载体转染的细胞以及使用这些细胞来产生所公开重组抗体。

还公开一种组合物，其包含与抗癌剂缀合的所公开的抗体。所公开的抗体可用于将任何有效负载递送至受试者的NE癌。有效负载可以是治疗剂或诊断剂。在一些实施例中，有效负载为可以引起靶向肿瘤细胞的细胞凋亡或细胞焦亡的抗癌剂。在一些实施例中，抗癌剂为小分子药物。在一些实施例中，抗癌剂为单甲基奥利他汀E(monomethyl auristatinE)、吉西他滨(gemcitabine)或白藜芦醇(resveratrol)。抗癌剂可以是化疗剂，如终止DNA构建块合成的药物(例如氨甲蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、羟基脲(hydroxyurea)、勒托替康(lurtotecan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、喷司他丁(pentostatin)和吡柔比星(pirarubicin))；直接损伤DNA的药物(例如顺铂(cisplatin)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、喜树碱(camptothecin)、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、鲁比替康(rubitecan)、贝洛替康(belotecan))；影响有丝分裂纺锤体合成或分解的药物(如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)、长春地辛(vindesine)、多西他赛(docetaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、奥他赛(ortataxel)、紫杉醇(paclitaxel)、特西他赛(tesetaxel)、伊沙匹隆(ixabepilone)和环氧噻酮(epithilones))；或干扰血管生成的药物(如抗VEGF抗体、血管生长抑素、内皮抑制素和肿瘤抑制素)。可替代地，抗癌剂可以是放疗剂(例如90Y、125I、188Re、111In DTPA或131I碘化钠)。

附加至本文所述的肿瘤靶向肽的抗癌药物或抗肿瘤药物的实例包括但不限于：阿克拉霉素(aclarubicin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨基喋呤(aminopterin)、氨柔比星(amrubicin)、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、贝洛替康、白消安(busulfan)、喜树碱、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、道诺霉素、地西他滨(decitabine)、阿霉素、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁、吡柔比星、吡蒽醌(pixantrone)、丙卡巴肼(procarbazine)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、雷替曲塞(raltitrexed)、鲁比替康、赛特铂(satraplatin)、链脲霉素(streptozocin)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)、替尼泊苷、拓扑替康、替加氟(tegafur)、甲氧苄啶(trimethoprim)、乌拉莫司汀(uramustine)、戊柔比星(valrubicin)、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨和佐柔比星(zorubicin)。

在一些实施例中，所公开的抗体与抗癌剂相关的运载体连接。在一个实例中，运载体囊封抗癌剂。运载体包括但不限于：外泌体、胶束、脂质体(例如阳离子脂质体)、纳米颗粒、微球或生物可降解聚合物。肿瘤靶向肽可以通过多种键(例如二硫键、酸不稳定键、肽基键、氧氨基键或肼键)系栓至运载体。为改善抗体与运载体之间的结合，肽可通过适合的聚合物(如PEG(聚乙二醇化))改性。可检测标记或抗癌剂可经由例如与亲脂性分子结合而在运载体内囊封，所述亲脂性分子可帮助将可检测标记或抗癌剂递送至运载体内部。

在一些实施例中，本文所述的肿瘤靶向抗体连结至囊封一或多种所关注的药剂(例如抗癌剂)的脂质体(作为运载体)。脂质体为包含一或多个同心有序脂质双层的囊泡，其囊封水相。水相通常含有待递送至标靶部位(如肿瘤部位)的药剂。在到达标靶部位后，脂质体与局部细胞的质膜融合以将药剂释放至胞质溶胶中。可替代地，脂质体被细胞内吞或以其它方式作为运输囊泡(例如内体或吞噬体)的内容物被细胞吸收。一旦在运输囊泡中，脂质体降解囊泡的膜或与囊泡的膜融合且释放其内容物。可构建脂质体膜使得其在附近环境变成酸性时变得不稳定(参见例如美国国家科学院院刊(PNAS)84:7851,1987；生物化学(Biochemistry)28:908,1989)。因此，当脂质体进入靶细胞时，脂质体变得不稳定以释放其囊封的内容物。此不稳定过程被称为融合发生(fusogenesis)。二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)通常用于促进此过程。

多种方法可用于制备脂质体。参见例如Szoka等人,生物物理学和生物工程年鉴(Ann.Rev.Biophys.Bioeng.)9:467(1980)、美国专利第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、第4,946,787号、PCT公开第WO 91/17424号、Deamer&Bangham,生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)443:629-634(1976)；Fraley等人,PNAS 76:3348-3352(1979)；Hope等人,生物化学与生物物理学报812:55-65(1985)；Mayer等人,生物化学与生物物理学报858:161-168(1986)；Williams等人,美国国家科学院院刊85:242-246(1988)；脂质体(Liposomes)(Ostro(编辑),1983,章节1)；Hope等人,脂质的化学与物理(Chem.Phys.Lip.)40:89(1986)；Gregoriadis,脂质体技术(Liposome Technology)(1984)和Lasic,脂质体：从物理到应用(Liposomes:from Physics to Applications)(1993))。适合的方法包括例如超声处理、挤压、高压/均质化、微流体化、清洁剂透析、小脂质体运载体的钙诱导融合和醚融合方法，所有这些方法为本领域中众所周知的。

在抗体药物缀合物中，抗体可直接缀合至细胞毒性剂或经由接头结合。合适的接头包括例如可裂解和非可裂解接头。可裂解接头通常容易在细胞内条件下裂解。适合的可裂解接头包括例如可由细胞内蛋白酶(如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)裂解的肽接头。在一些实施例中，接头可以是二肽接头，如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头。其它合适的接头包括可在小于5.5的pH值下水解的接头，如腙接头。其它适合的可裂解接头包括二硫键接头。

还公开一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的本文所公开的肿瘤靶向抗体和有效负载。还公开一种用于治疗受试者的NE癌的方法，其涉及向所述受试者施用治疗有效量的所公开的药物组合物。

在以下附图和描述中阐述本发明的一或多个实施例的细节。本发明的其它特征、目的和优点将从描述和附图和权利要求书而变得显而易见。

附图说明

图1显示SSTR2靶向治疗经由以下各者来治疗NET：1)通过mAb递送的药物使微管蛋白解聚合，2)通过内化mAb抑制激素产生，3)通过mAb阻断SSTR2来下调细胞增殖信号传导路径，或4)活化T细胞的细胞因子产生。

图2A至2C显示SSTR2表达的评估。(A)RT-PCR指示BON细胞中的高SSTR2水平。(B)全细胞细胞蛋白质印迹显示非癌性细胞(917和WI38)中的低SSTR2，但NET细胞系(BON、QGP和H727)中的高SSTR2；膜蛋白质印迹证实非癌性细胞(917)中的低SSTR2，但NET细胞(H727)中的高SSTR2。(C)CLSM显示在活的PanNET细胞(BON)、PanNET异种移植物组织和患者组织中的高SSTR2。

图3A和3B显示抗SSTR2 mAb的特异性靶向。(A)活体动物IVIS成像显示在皮下NET异种移植物中的mAb-AF488积聚。(左)：来自稳定转染的NET-Luc细胞的生物发光信号。(右)：来自NET异种移植物的高度增生区域的荧光信号指示特定SSTR2-mAb。(B)流式细胞测量术展示mAb的高表面结合。

图4A和4B显示抗SSTR2 mAb介导的抗NET。(A)蛋白质印迹展示mAb下调PI3K/AKT(细胞增殖)的表达、改变细胞周期蛋白D1和p21(细胞周期)的水平和降低ASCL/CgA(激素)；(B)流式细胞测量术分析显示通过mAb增加人类T细胞的IL2和IFNγ(细胞因子)两者。

图5A至5B显示ADC毒性。ADC对BON细胞具有较高的毒性IC

图6显示在皮下异种移植物小鼠模型中的体内抗癌功效。用8mg/kgBW ADC或运载体治疗的小鼠通过卡尺测量平均肿瘤体积。误差条代表在n＝6处的标准差；**p≤0.01；***p≤0.001。

图7A和7B为显示患者中的强SSTR2表达的组织微阵列(TMA)。图7A显示TMA的H&E染色，所述TMA包括人类胰腺NET组织(第2-9列，n＝38)和正常组织(对照，第1列，n＝5)。图7B显示TMA的IHC分析显示SSTR2的阳性染色。比例尺等于20μm。71％的这些核心对SSTR2呈阳性且显示强膜定位。

图8A和8B显示如通过免疫组织化学所验证，抗SSTR2抗体独特地与NET细胞结合，但与正常器官或组织不存在或存在极低的结合。图8A1显示33个正常人类器官(US Biomax，FDA662a，n＝2)中的阴性或极低表面SSTR2染色，所述器官代表大脑、小脑、外周神经、肾上腺、甲状腺、脾脏、胸腺、骨髓、淋巴结、扁桃体、胰腺、肝、食道、胃、小肠、结肠、肺、唾液、咽、肾、膀胱、睾丸、前列腺、阴茎、卵巢、输卵管、乳腺、子宫内膜、子宫颈、心肌、骨骼肌、间皮和皮肤。图8A2显示胰腺NET患者组织(n＝12)中的细胞表面上的阳性SSTR2染色。图8B显示小脑、大脑、肝、肺、肌肉、皮肤、扁桃体、前列腺、胰腺和胰腺NET的代表性高分辨率IHC成像。比例尺等于50μm。

图9A到9E显示抗SSTR2 mAb的发展和产生。图9A显示基于ELISA筛选中的滴度的顶级抗SSTR2 mAb克隆的等级(数据代表平均值±SEM，n＝3)。图9B显示使用流式细胞测量术的前4个克隆的评估。图9C显示SDS-PAGE证实mAb的完整性和纯度(M：标记；1-4：克隆1-4)。图9D显示对照细胞系(WI38和917)和NET细胞系(BON和QGP)中克隆#4的SSTR2结合的评估。图9E显示分批进料悬浮培养物中的mAb产生和杂交瘤细胞生长(数据代表平均值±SEM，n＝3)。活细胞密度(VCD)：▲、细胞存活率：Δ、比生长速率(μ)：□。

图10A至10C显示通过我们的抗SSTR2 mAb的表面结合的体外评估。图10A显示活细胞CLSM动态成像，其显示抗SSTR2 mAb在60分钟内快速且有效地结合至BON细胞表面，随后在70分钟内内化。双色CLSM：标记有GFP的全细胞和标记有AF647的SSTR2mAb-MMAE。图10B显示流式细胞测量术，其显示我们的抗SSTR2mAb在高水平下与BON细胞结合且不与SSTR2阴性对照结合，且我们的mAb具有比商业mAb高得多的结合百分比。在冰上用1μg mAb-AF647/百万细胞染色30分钟。图10C显示AF647 mAb内化于三种NE癌细胞(绿色)中，包括BON、TT和MZ。比例尺等于5μm。

图11A和11B显示通过我们的抗SSTR2 mAb的NET靶向的体内评估。图11A显示IVIS的体内成像，其显示mAb可在小鼠模型中特异性靶向皮下NET异种移植物。抗SSTR2 mAb用荧光染料Cy7标记且使用蛋白A柱纯化。通过尾静脉进行静脉内(i.v.)注射总计50μg Cy5.5-mAb。在Cy5.5-mAb注射后24小时获取IVIS成像。图11B显示mAb靶向人类NET(BON)异种移植组织和小鼠MTC组织两者(n＝3-4)。

图12A至12F显示ADC构建和体外特征。图12A显示使用维持mAb完整性的再桥接接头的抗SSTR2 mAb-MMAE的分子结构。图12B显示MS展示就三种产品形式而言接头-MMAE药物的正确结构和恰当缀合。图12显示游离药物(●)、使用商业抗SSTR2 mAb构建的ADC(安迪生物公司(R&D Systems)，▲)和使用我们的抗SSTR2mAb构建的ADC的IC

图13A和13B显示皮下PanNET异种移植小鼠模型中MTD和PK研究和ADC对脑部的影响。图13A显示，测试包括4、8、12、16和20mg/kg-BW的五个ADC剂量的作用的MTD研究，其显示出对小鼠体重和行为无负面影响，且未达到最大剂量(n＝2)。图13B显示H&E染色，其显示ADC治疗没有改变脑部形态且对脑部没有损伤。比例尺等于200μm。图13C显示PK研究，其显示ADC的稳定性和动力学参数(数据代表平均值±SEM，n＝4)。

图14A至14H显示在PanNET(BON-Luc)异种移植模型中ADC的抗NET功效研究。图14A显示在Bon-Luc细胞注射和治疗之后肿瘤体积变化(数据代表平均值±SEM，n＝6)。肿瘤使用卡尺测量，且计算为椭圆体。黑色箭头指示ADC(8mg/kg BW)治疗日期。图14B显示使用IVIS成像系统的肿瘤荧光通量测量(数据代表平均值±SEM，n＝6)。图14C显示收集携带肿瘤的小鼠。图14D显示在第29天从收集的小鼠身上切除的肿瘤的重量。图14E显示在治疗期间小鼠的体重。▲：用ADC注射的治疗组、●：用mAb注射的对照组和■：用生理盐水注射的对照组。图14F显示来自代表小鼠的肿瘤的蛋白质印迹(n＝3)。图14G显示生理盐水和ADC治疗的肿瘤的抗SSTR2 IHC染色。图14H显示生理盐水或ADC治疗的肿瘤的H&E染色。比例尺等于50μm。***p≤0.001。

图15A和15B显示使用蛋白质印迹评估NET细胞系(BON、H727和QGP)和正常细胞系(917和WI38)中SSTR2表达(图15A)，和使用共焦显微镜成像评估PanNET异种移植物肿瘤组织和患者肿瘤组织中SSTR2表达(图15B)。比例尺等于20或40μm。

图16显示流式细胞测量术分析，其显示通过我们的抗SSTR2mAb和SST类似物(奥曲肽(Octreotide))，人类T细胞的IL2和IFN-γ(细胞因子)两者均增加。

图17显示用于NET治疗的基于抗SSTR2 mAb的ADC的假设机制。(1)通过mAb递送的药物使微管蛋白解聚合；(2)通过mAb阻断SSTR2下调细胞增殖信号传导路径；和(3)活化T细胞的细胞因子产生。

具体实施方式

在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所述特定实施例，且因此，当然可变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不希望具有限制性，因为本公开的范围仅由所附权利要求书限定。

当提供值的范围时，应理解，在所述范围的上限与下限之间的各中间值(除非上下文另外明确指示，否则为下限单位的十分之一)与所述陈述范围中的任何其它值或中间值皆涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内并且也涵盖于本公开内，受到在所陈述的范围内的任何特定地排除的限定。当所陈述的范围包括限值中的一个或两个时，排除所包括的那些限值中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。

除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本公开的操作或测试中也可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选方法和材料。

本说明书中引用的所有公开和专利均以引用的方式并入本文中，如同每一个别公开或专利经特定且个别地指示以引用的方式并入一般，且以引用的方式并入本文中以公开和描述结合引用的公开的方法和/或材料。对任何公开的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应解释为承认本公开无权先于依据先前公开的此类公开内容。此外，所提供的公开的日期可能不同于可能需要独立确认的实际公开日期。

如所属领域的技术人员在阅读本公开之后将显而易见，本文中所描述和说明的个别实施例中的每一者具有离散的组件和特征，所述特征可容易与其它若干实施例中的任一个的特征分离或与其组合而不脱离本公开的范围或精神。任何所叙述的方法均可以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来实施。

除非另外指示，本公开的实施例将采用在所属领域的技术内的化学、生物学等的技术。

提出以下实例以便向所属领域的一般技术人员提供如何执行所述方法和使用本文所公开和所要求的探针的完整公开内容和描述。已经做出努力来确保关于数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另外指示，否则份数为重量份，温度以℃计，且压力在大气压下或接近大气压。标准温度和压力被定义为20℃和1大气压。

在详细描述本公开的实施例之前，应理解，除非另外指示，本公开不限于特定材料、试剂、反应材料、制造工艺等，因而可变化。还应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且并不意图为限制性的。在本公开中还可能以不同顺序执行步骤，这在逻辑上是可能的。

必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一/一个(种)(a)”、“一/一个(种)(an)”以及“所述(the)”包括复数个指示物。

术语“氨基酸序列”是指代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或词语的列表。本文所使用的氨基酸缩写为氨基酸的常规一个字母代码，且如下表述：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸(glutamate)、谷氨酸(glutamic acid)；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸。

术语“抗体”是指维持特异性结合能力的免疫球蛋白、其衍生物和具有与免疫球蛋白结合域同源或很大程度上同源的结合域的蛋白质。这些蛋白质可源自天然来源，或部分或完全以合成方式产生。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是来自任何物种的任何免疫球蛋白类别的成员，包括人类类别中的任一种：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在例示性实施例中，与本文所述的方法和组合物一起使用的抗体为IgG类别的衍生物。除了完整免疫球蛋白分子之外，还包括在术语“抗体”内的为选择性地结合靶抗原的那些免疫球蛋白分子和人类或人类化形式的免疫球蛋白分子的片段或聚合物。

术语“抗体片段”是指小于全长的抗体的任何衍生物。在例示性实施例中，抗体片段保留全长抗体的至少相当大部分的特异性结合能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv双功能抗体、Fc和Fd片段。抗体片段可以通过任何方式产生。举例来说，抗体片段可通过完整抗体的片段化以酶促方式或以化学方式产生，其可以重组方式由编码部分抗体序列的基因产生，或其可以完全或部分地以合成方式产生。抗体片段可以任选地为单链抗体片段。可替代地，片段可包含例如通过二硫键连接在一起的多个链。片段还可以任选地为多分子复合物。功能性抗体片段将通常包含至少约50个氨基酸，且更通常将包含至少约200个氨基酸。

术语“载剂”是指当与化合物或组合物组合时，有助于或促进化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或任何其它特征以达到其预期用途或目的的化合物、组合物、物质或结构。例如，载剂可选择以使活性成分的任何降解降到最低且使受试者的任何不良副作用降到最低。

术语“嵌合分子”是指通过接合两个或更多个以其天然状态中分别存在的分子而产生的单一分子。单一嵌合分子具有其所有构成分子的所要功能性。一种类型的嵌合分子为融合蛋白。

术语“工程化抗体”是指包含至少一种抗体片段的重组分子，所述抗体片段包含来源于抗体的重链和/或轻链的可变结构域的抗原结合位点，且可任选地包含来自Ig类别中的任一者(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)的抗体的可变和/或恒定结构域的全部或部分。

术语“表位”是指抗体优先且特异结合于其的抗原区域。单克隆抗体优先结合于可在分子上定义的分子的单一特定表位。在本发明中，多个表位可以由多特异性抗体识别。

术语“融合蛋白”是指通过使两种或更多种多肽经由一种多肽的氨基末端与另一种多肽的羧基末端之间形成的肽键接合而形成的多肽。融合蛋白可以通过组成性多肽的化学偶合形成，或可以从编码单一连续融合蛋白的核酸序列表达为单一多肽。单链融合蛋白为具有单一连续多肽主链的融合蛋白。融合蛋白可以使用分子生物学中的常规技术来制备，以将两个基因在框内接合成单一核酸，且随后在产生融合蛋白的条件下在合适的宿主细胞中表达核酸。

术语“Fab片段”是指抗体的片段，其包含通过抗体以酶木瓜蛋白酶裂解产生的抗原结合位点，所述酶木瓜蛋白酶在铰链区N-末端处切割至H-链间二硫键且从一个抗体分子产生两个Fab片段。

术语“F(ab′)2片段”是指含有两种抗原结合位点的抗体的片段，所述抗原结合位点通过抗体分子以酶胃蛋白酶裂解产生，所述酶胃蛋白酶在铰链区C-末端处剪切至H-链间二硫键。

术语“Fc片段”是指包含其重链恒定结构域的抗体的片段。

术语“Fv片段”是指包含其重链和轻链的可变结构域的抗体的片段。

“基因构建体”是指核酸，如载体、质粒、病毒基因组等，其包括用于多肽或以其它方式可转录成生物活性RNA(例如反义、诱饵、核酶等)的“编码序列”，可以转染至细胞(例如在某些实施例中为哺乳动物细胞)内，且可能引起编码序列在用构建体转染的细胞中的表达。基因构建体可包括一个或多个可操作地连接至编码序列的调节元件，以及内含子序列、聚腺苷酸化位点、复制起点、标记基因等。

术语“一致性"是指两种核酸分子或多肽之间的序列一致性。一致性可以各自通过比较每个序列中可以出于比较目的比对的位置来进行测定。当比较序列中的位置由相同碱基占据时，那么分子在所述位置处为相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或一致性程度是由核酸序列共享的位置处的相同或匹配核苷酸的数目的函数。各种比对算法和/或程序可用于计算两个序列之间的一致性，所述算法包括FASTA或BLAST，其可用作GCG序列分析包(威斯康星州麦迪逊威斯康星大学(University of Wisconsin,Madison,Wis.))的一部分，且可与例如默认设置(default setting)一起使用。例如，涵盖与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％一致性且优选地展现大体上相同功能的多肽，以及编码此类多肽的多核苷酸。除非另外指示，相似性分数将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比是基于BLASTP阳性分数，且序列一致性百分比是基于BLASTP一致性分数。BLASTP“一致性”显示高分序列对中的总残基的数目和分数相同；且BLASTP“阳性”显示比对分数具有正值且彼此类似的残基的数目和分数。本公开涵盖且包含与本文所公开的氨基酸序列具有这些一致性或相似性程度或任何中间相似性程度的氨基酸序列。类似多肽的多核苷酸序列使用遗传密码推断出，且可以通过常规方式获得，确切地说，通过使用遗传密码反向翻译其氨基酸序列获得。

术语“接头”为此领域理解的且是指连接两种化合物(如两种多肽)的分子或分子群组。接头可以包含单一连接分子或可包含旨在使连接分子与化合物以特定距离分离的连接分子和间隔分子。

术语“核酸”是指天然或合成分子，其包含单核苷酸或由一个核苷酸的3'位置处的磷酸基连接至另一核苷酸的5'末端的两个或更多个核苷酸。核酸不受长度限制，且因此核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

术语“可操作地连接至”是指核酸与另一核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和转译终止位点以及其它信号序列为可操作地连接至其它序列的核酸序列的实例。例如，将DNA可操作连接至启动子的是指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得此类DNA的转录通过RNA聚合酶从启动子起始，所述RNA聚合酶特异性地识别、结合到DNA且转录DNA。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”互换使用是指包含通过一个氨基酸的羧基键联到另一个氨基酸的α氨基的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。

术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或与合理效益/风险比相称的并发症的化合物、材料组合物和/或剂型。

当参考特定多肽使用时，术语“多肽片段”或“片段”是指其中相比于参考多肽自身，氨基酸残基缺失但其中剩余的氨基酸序列通常与参考多肽的氨基酸序列相同的多肽。此类缺失可能发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端，或二者皆有。片段通常为至少约5、6、8或10个氨基酸长，至少约14个氨基酸长，至少约20、30、40或50个氨基酸长，至少约75个氨基酸长，或至少约100、150、200、300、500个或更多个氨基酸长。片段可保留参考多肽的生物活性中的一个或多个。在各种实施例中，片段可包含参考多肽的酶活性和/或相互作用位点。在另一实施例中，片段可具有免疫原性特性。

术语“蛋白结构域”是指蛋白质的一部分、蛋白质的部分或显示结构完整性的整个蛋白质；此测定可基于蛋白质的一部分、蛋白质的部分或整个蛋白质的氨基酸组成。

术语“单链可变片段”或“scFv”是指其中重链结构域和轻链结构域连接的Fv片段。一或多个scFv片段可以连接至其它抗体片段(例如重链或轻链的恒定结构域)以形成具有一或多个抗原识别位点的抗体构建体。

如本文所用，“间隔子”是指接合包含融合蛋白的蛋白质的肽。一般来说，除了接合蛋白质或保留它们之间的一定最小距离或其它空间关系以外，间隔子将不具有特定生物活性。然而，可以选择间隔子的构成氨基酸以对分子的一些特性产生影响，如分子的折叠、净电荷或疏水性。

当指多肽(包括抗体)或受体时，如本文所用的术语“特异性结合”是指决定蛋白质或多肽或受体在蛋白质和其它生物制剂的非均质分子群体中存在的结合反应。因此，在指定条件(例如抗体的情况下的免疫分析条件)下，当特定配位体或抗体并未与样品中存在的其它蛋白质或与所述配位体或抗体在生物体中可能接触的其它蛋白质大量结合时，所述特定配位体或抗体“特异性结合”至其特定“靶”(例如抗体特异性结合至内皮抗原)。一般来说，“特异性结合”第二分子的第一分子具有与第二分子大于约10

如本文所用，术语“特异性递送”是指分子与携有特定靶分子或标记的细胞或组织的优先结合，而不与不具有所述靶分子的细胞或组织的优先结合。当然，认识到分子与非靶细胞或组织之间可存在某种程度的非特异性相互相用。然而，特异性递送可通过靶分子的特异性识别来介导而区分。通常特异性递送促使所递送的分子与携有靶分子的细胞之间的结合比所传递的分子与不具有靶分子的细胞之间的结合强得多。

术语“受试者”是指为施用或治疗的目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类或家畜患者。术语“患者”是指在临床医生(例如医师)的治疗下的受试者。

术语“治疗有效”是指所使用的组合物的量是足以改善疾病或病症的一或多种起因或症状的量。这种改善仅需要降低或改变，不必消除。

术语“转化”和“转染”意指将核酸(例如表达载体)引入至接受者细胞中，包括将核酸引入至所述细胞的染色体DNA中。

术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理性病状或病症为意图而对患者进行医学管理。这一术语包括积极治疗，即专门为了改善疾病、病理性病状或病症而进行的治疗，并且还包括病因治疗，即专门为了去除相关疾病、病理性病状或病症的原因而进行的治疗。另外，此术语包括姑息性治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理性病状或病症的治疗；预防性治疗，即针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理性病状或病症的发展的治疗；以及支持性治疗，即用于补充针对相关疾病、病理性病状或病症的改善的另一种特异性疗法的治疗。

术语“变异体”是指具有保守性氨基酸取代、非保守性氨基酸取代(即简并变异体)、编码氨基酸的每个密码子(即DNA和RNA)的摆动位置内的取代、添加到肽的C末端的氨基酸的氨基酸序列或肽序列；或与参考序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性的肽。

术语“载体”是指能够将载体序列所连接的另一核酸运输至细胞中的核酸序列。术语“表达载体”包括任何载体(例如质粒、粘粒或噬菌体染色体)，其含有适合于由细胞表达的形式的基因构建体(例如连接至转录控制元件)。

本文公开选择性地结合癌细胞上的人类SSTR2的单克隆抗体。本文还公开可以特异性地识别表达SSTR2的癌症(如NE癌)的重组抗体。

可以用于所公开的组合物和方法中的抗体包括任何类别的全免疫球蛋白(即，完整抗体)、其片段和至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白质。抗体之间的可变结构域序列不同且可变结构域被用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性通常不是均匀分布在抗体的可变结构域中的。它通常集中在轻链和重链可变结构域中三个称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)或高变区的区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个大部分采用β片层构型的FR区，所述FR区通过三个CDR连接，从而形成环，所述环连接β片层结构并且在一些情况下形成β片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点。

可以采用在免疫后能够在无内源免疫球蛋白产生存在下产生完全人类抗体库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已描述嵌合和种系突变小鼠中抗体重链接合区(J(H))基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在此类种系突变小鼠中人类种系免疫球蛋白基因阵列的转移将在抗原攻击时导致人类抗体产生(参见例如Jakobovits等人,美国国家科学院院刊,90:2551-255(1993)；Jakobovits等人,自然(nature),362:255-258(1993)；Bruggemann等人,免疫学年鉴(Year in Immunol.),7:33(1993))。人类抗体还可以在噬菌体呈现库中产生(Hoogenboom等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),227:381(1991)；Marks等人,分子生物学杂志,222:581(1991))。Cote等人和Boerner等人的技术也可用于制备人类单克隆抗体(Cole等人,单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy),Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,免疫学杂志(J.Immunol.),147(1):86-95(1991))。

任选地，抗体在其它物种中产生并且“人源化”用于在人类中施用。非人类(例如鼠)抗体的人源化形式为含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人类物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架残基被相应非人类残基置换。人源化抗体还可包含在接受体抗体中和在所输入的CDR或构架序列中都不存在的残基。一般来说，人源化抗体将包含实质上所有的至少一个并且通常两个可变结构域，其中所有或实质上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区并且所有或实质上所有的FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分(Jones等人,自然,321:522-525(1986)；Riechmann等人,自然,332:323-327(1988)；和Presta,现代结构生物学评(Curr.Op.Struct.Biol.),2:593-596(1992))。

人源化非人类抗体的方法为所属领域中众所周知的。一般来说，人源化抗体具有一或多个从非人类来源引入到其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常常被称为“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一或多条多肽链的DNA序列。人源化可以按照Winter和合作者的方法通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代相应人类抗体序列来进行(Jones等人,自然,321:522-525(1986)；Riechmann等人,自然,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,科学(Science),239:1534-1536(1988))。因此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式为嵌合抗体或片段(美国专利低4,816,567)，其中实质上小于完整人类可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。

还公开具有生物活性的抗体的片段。片段无论是否与其它序列连接，都可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或所选择的其它修饰，其条件是与未修饰的抗体或抗体片段相比，所述片段的活性不会显著改变或受损。

技术还可以适合于产生对本公开的抗原蛋白具有特异性的单链抗体。单链抗体的产生方法为所属领域的技术人员众所周知的。可以通过使用短肽接头使重链和轻链的可变结构域融合在一起来产生单链抗体，从而在单个分子上重构抗原结合位点。已开发如下单链抗体可变片段(scFv)：其中一个可变结构域的C末端通过15至25个氨基酸肽或接头系栓至其它可变结构域的N末端而不显著破坏抗原结合或结合的特异性。接头经过选择以使重链和轻链能以其适当的构象取向结合在一起。

还公开一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂中所公开的抗体。药物载剂为所属领域技术人员已知。这些载剂最通常将为用于将药物施用于人类的标准载剂，包括溶液，如无菌水、生理盐水和在生理pH下的缓冲溶液。例如，合适载剂和其配制物描述于雷明顿：医药科学和实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)(21版),PP.Gerbino编,宾夕法尼亚州费城的利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA.)2005。通常，适当量的药学上可接受的盐用于配制物中以使配制物等张。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于：生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液。溶液的pH值优选为约5至约8，并且更优选为约7至约7.5。溶液应不含RNA酶。其它载剂包括持续释放制剂，如含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品形式，例如薄膜、脂质体或微米粒子。所属领域的技术人员将显而易见，取决于例如施用途径和施用的组合物的浓度，某些载剂可更优选。

药物组合物除所选分子外还可包括载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包括一或多种活性成分，例如抗微生物剂、消炎剂、麻醉剂等。

肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)，和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液、包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外运载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或不挥发性油。静脉内运载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的补充剂)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

一些组合物可能呈药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐形式施用，所述酸加成盐或碱加成盐是通过与以下酸反应形成：无机酸，如盐酸、氢溴酸、过氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸；和有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、顺丁烯二酸和反丁烯二酸；或通过与以下碱反应形成：无机碱，如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾；和有机碱，如单烷基胺、二烷基、三烷基胺和芳基胺以及被取代的乙醇胺。

还公开编码所公开的SSTR2特异性抗体的多核苷酸和多核苷酸载体。编码所公开的抗体和其区域的核酸序列可使用所属领域中已知的重组方法来获得，例如使用标准技术通过从表达基因的细胞中筛选文库；通过由已知的包括所述基因的载体衍生基因；或通过与含有所述基因的细胞和组织直接分离。可替代地，所关注基因可以合成而非克隆的方式产生。

编码抗体的核酸的表达通常通过将编码所述抗体的核酸可操作地连接至启动子并且将所述构建体并入表达载体中来实现。典型的克隆载体含有转录与翻译终止子、起始序列和适用于调节所需核酸序列表达的启动子。

所公开的核酸可以克隆到许多类型的载体中。例如，可将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。备受关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

此外，可按病毒载体的形式，将表达载体提供给细胞。病毒载体技术在所属领域中为众所周知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,分子克隆：实验指南(MolecularCloning:A Laboratory Manual),纽约冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,New York))中，和其它病毒学和分子生物学手册中。作为载体是有用的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，适合的载体含有至少一种生物体中作用的复制起点、启动子序列、适宜的限制性核酸内切酶位点和一或多种可选标记。在一些实施例中，多核苷酸载体为慢病毒或逆转录病毒载体。

已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。所选择的基因可以插入到载体中且使用所属领域中已知的技术将其包装于逆转录病毒粒子中。然后重组病毒可以分离并且体内或离体递送至受试者的细胞。

合适的启动子的一个实例为立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列为强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一实例为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，还可使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。可替代地，启动子可为诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

额外启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。

为了评估抗体或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可含有可选标志基因或报告基因，或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中识别和选择表达细胞。在其它方面，可选标记可携带在单独的DNA片段上且用于共转染程序。可选标记和报告基因两者均可侧接有适当的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。适用的可选标记包括例如抗生素抗性基因。

报告基因用于识别潜在转染的细胞和评估调节序列的功能。一般来说，报告基因为不存在于接受体生物体或组织中或不由其表达的基因，且编码通过一些易于检测的特性(例如酶活性)来体现表达的多肽。在DNA已引入至接受体细胞之后的合适时间分析报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白质基因。合适的表达系统为众所周知的且可使用已知技术制备或商业上获得。一般来说，将具有最小5'侧接区，显示最高水平的报告基因表达的构建体识别为启动子。这类启动子区可与报告基因连接且用于评估药剂用于调节启动子驱动的转录的能力。

将基因引入和表达至细胞中的方法为所属领域中已知的。在表达载体的情形下，载体可以通过所属领域中的任何方法容易地引入至宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物方式转移至宿主细胞中。

将多核苷酸引入至宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在所属领域中众所周知。参见例如，Sambrook等人(2001,分子克隆：实验指南,纽约冷泉港实验室)。

用于将所关注的多核苷酸引入至宿主细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，且尤其逆转录病毒载体已成为将基因插入哺乳动物(例如人类细胞)中最广泛使用的方法。

用于将多核苷酸引入至宿主细胞中的化学方式包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。适用作体外和体内递送运载体的例示性胶状系统为脂质体(例如人工膜囊泡)。

在利用非病毒递送系统的情况下，例示性递送运载体为脂质体。在另一方面，核酸可与脂质结合。与脂质结合的核酸可以囊封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子连接至脂质体、包覆在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、以脂质的悬浮液形式包含在内、含有胶束或与胶束复合、或以其它方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，其可存在于双层结构如胶束中，或以“折叠”结构存在。其还可简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集物。脂质为脂肪物质，其可以是天然存在的或合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃和其衍生物的化合物类别，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。适合使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从密苏里州圣路易斯的西格玛获得(Sigma,St.Louis,Mo.)；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从纽约州的普莱恩维尤的K&K实验室(K&K Laboratories,Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可从卡尔贝林生物化学公司(Calbiochem Behring)获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可从阿拉巴马州伯明翰的阿万蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc,Birmingham,Ala.)获得。

还公开一种通过向受试者施用治疗有效量的所公开的药物组合物来治疗个体中的表达SSTR2的癌症的方法。所公开的组合物，包括药物组合物，可以用多种方式施用，取决于是否需要局部或全身性治疗和取决于待治疗的区域。例如，所公开的组合物可静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或经皮施用。组合物可以经口、经肠胃外(例如静脉内)、通过肌肉内注射、通过腹膜内注射、经皮、体外、经眼、经阴道、经直肠、鼻内、局部等施用，包括局部鼻内施用或通过吸入器施用。

如果使用，肠胃外施用组合物的特征通常为注射。可注射剂可以以常规形式作为液体溶液或悬浮液、作为适合于在注射之前形成溶液或液体中悬浮液的固体、或作为乳液制备。修改的肠胃外施用方法涉及使用缓慢释放或持续释放系统使得恒定剂量被维持。

本文中所公开的组合物可以预防性地施用于处于罹患表达SSTR2癌症风险下的患者或受试者。因此，所述方法可进一步包含在施用本文所公开的组合物之前识别处于表达SSTR2癌症风险下的受试者。

所需的组合物的准确量将随各受试者而变化，取决于受试者的物种、年龄、体重和一般病状、所治疗的过敏性病症的严重程度、所使用的具体核酸或载体、其施用模式等等。因此，不可能限定每种组合物的准确量。然而，所属领域的一般技术人员可以仅使用本文中的教示提供的常规实验来确定适当量。例如，用于施用组合物的有效剂量和时程可以凭经验确定，且进行这类测定在所属领域的技术范围内。用于施用组合物的剂量范围为足以产生影响症状病症的所要作用的那些剂量范围。剂量应不大到引起不良副作用，如非所需交叉反应、过敏性反应等。一般来说，剂量将随着年龄、病状、性别和患者疾病的程度、施用的途径，或其它药物是否包括在疗程中变化，并且可由所属领域的技术人员确定。在任何反向指示的情况下，个别医生可调节剂量。剂量可以变化，并且可以每天一或多次施用剂量进行施用，持续一天或若干天。可以在文献中找到针对给定类别的药物产品的适当剂量的指导。单独使用的所公开的组合物的典型每日剂量可以在每天约1μg/kg至多达100mg/kg体重范围内，取决于上文提及的因素。

在一些实施例中，以相当于肠胃外施用约0.1ng至约100g每公斤体重、约10ng至约50g每公斤体重、约100ng至约1g每公斤体重、约1μg至约100mg每公斤体重、约1μg至约50mg每公斤体重、约1mg至约500mg每公斤体重；且约1mg至约50mg每公斤体重的剂量来施用分子。可替代地，所施用以实现治疗有效剂量的含有来那度胺(lenalidomide)的分子的量为约0.1ng、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、500mg每公斤体重或更高。

所公开的抗体可以单独施用或以与稀释剂和/或其它组分(例如IL-2、IL-15或其它细胞因子或细胞群体)组合的药物组合物形式施用。简单地说，药物组合物可包含如本文所述的靶细胞群体，以及一或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲生理盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或聚葡聚糖，甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施例中，用于所公开的方法的组合物被调配用于静脉内施用。药物组合物可以任何适当治疗MM的方式施用。施用的量和频率由例如患者的病状和患者疾病的严重程度等因素决定，但适当剂量可以通过临床试验确定。

所公开的组合物的施用可以任何适宜方式进行，包括通过注射、输注或植入进行。本文所述的组合物可以皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内向患者施用。在一些实施例中，通过皮内或皮下注射向患者施用所公开的组合物。在一些实施例中，所公开的组合物通过静脉内注射施用。组合物还可直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位处。

在某些实施例中，所公开的抗体与任何数目的相关治疗模式结合(例如在其之前、同时或之后)向患者施用，所述治疗模式包括但不限于沙立度胺(thalidomide)、地塞米松(dexamethasone)、硼替佐米(bortezomib)和来那度胺。在另外的实施例中，所公开的抗体可与化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其它免疫消融剂(如CAM PATH)、抗CD3抗体或其它抗体治疗、细胞毒素(cytoxin)、氟达拉滨(fludaribine)、环孢素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射组合使用。在一些实施例中，所公开的抗体与下述结合(例如在其之前、同时或之后)向患者施用：骨髓移植、使用化疗剂(如氟达拉滨)、外部光束放疗(XRT)、环磷酰胺或抗体(如OKT3或CAMPATH)的T细胞消融疗法。在另一实施例中，本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法，如与CD20反应的药剂，例如美罗华(Rituxan)之后施用。例如，在一些实施例中，受试者可经历伴随大剂量化疗的标准治疗，继之以周边血液干细胞移植。在某些实施例中，在移植之后，受试者接受本发明的扩增免疫细胞的输注。在额外实施例中，扩增细胞在手术之前或之后施用。

所公开的方法的癌症可以是受试者中经历不受调控生长、侵袭或癌转移的表达SSTR2的细胞。在一些实施例中，表达SSTR2的癌症为神经内分泌(NE)癌。神经内分泌肿瘤(NETs)为由内分泌(激素)和神经系统的细胞产生的赘瘤。许多为良性的，而一些则为恶性的。传统上，神经内分泌肿瘤已经通过其来源的解剖部位分类。在身体的许多不同区域中可产生NET。其最通常在肠道中出现，其中其通常被称为类癌肿瘤，但其也发现于胰腺、肺和身体的其余部分中。NETs包括胃肠道和胰岛细胞的某些肿瘤、某些胸腺和肺肿瘤以及甲状腺滤泡旁细胞的髓质癌。

在一些实施例中，所公开的抗体可以与检查点抑制剂组合使用。两种已知抑制检查点路径涉及通过细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡1(PD-1)受体的信号传导。这些蛋白质为在T细胞功能的所有阶段中发挥重要作用的协同信号传导分子的CD28-B7家族的成员。PD-1受体(也称为CD279)在活化T细胞的表面上表达。其配位体PD-L1(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)在APC(如树突状细胞或巨噬细胞)的表面上表达。PD-L1是主要配位体，而PD-L2具有更多限制的表达模式。当配位体结合至PD-1时，抑制性信号传输至T细胞中，这降低细胞因子产生且抑制T细胞增殖。检查点抑制剂包括但不限于阻断阻断PD-1的抗体(纳武单抗(Nivolumab)(BMS-936558或MDX1106)、CT-011、MK-3475)、PD-L1(MDX-1105(BMS-936559)、MPDL3280A、MSB0010718C)、PD-L2(rHIgM12B7)、CTLA-4(伊匹单抗(Ipilimumab)(MDX-010)、曲美单抗(Tremelimumab)(CP-675,206))、IDO、B7-H3(MGA271)、B7-H4、TIM3、LAG-3(BMS-986016)。

针对程序性死亡1(PD-1)的人类单克隆抗体和单独使用抗PD-1抗体或与其它免疫治疗组合治疗癌症的方法描述于美国专利第8,008,449号中，其并入作为这些抗体的参考。抗PD-L1抗体和其用途描述于美国专利第8,552,154号中，其并入作为这些抗体的参考。包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂描述于美国专利第8,617,546号中，其并入作为这些抗体的参考。

在一些实施例中，PDL1抑制剂包含特异性结合PDL1的抗体，如BMS-936559(百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb))或MPDL3280A(罗氏(Roche))。在一些实施例中，PD1抑制剂包含特异性结合PD1的抗体，如拉立珠单抗(默克(Merck))、纳武单抗(百时美施贵宝)或MEDI4736(阿斯利康公司(AstraZeneca))。针对PD-1的人类单克隆抗体和单独使用抗PD-1抗体或与其它免疫治治疗组合治疗癌症的方法描述于美国专利第8,008,449号中，其并入作为这些抗体的参考。抗PD-L1抗体和其用途描述于美国专利第8,552,154号中，其并入作为这些抗体的参考。包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂描述于美国专利第8,617,546号中，其并入作为这些抗体的参考。

所公开的抗体可以与其它癌症免疫治疗组合使用。存在两种不同类型的免疫治疗：被动免疫治疗使用免疫系统的组分来引导针对癌细胞的靶向细胞毒性活性，而不一定引发患者的免疫反应，而主动免疫治疗则主动地触发内源性免疫反应。被动策略包括使用由B细胞响应于特定抗原而产生的单克隆抗体(mAb)。1970年代杂交瘤技术的发展和肿瘤特异性抗原的鉴别允许mAbs的药物开发，所述mAbs可特异性地靶向肿瘤细胞以被免疫系统破坏。到目前为止，mAbs已经成为免疫治疗中最成功的案例；2012年中最畅销的前三种抗癌药物为mAbs。其中一种为利妥昔单抗(rituximab)(美罗华，基因泰克公司(Genentech))，其结合至在B细胞恶性肿瘤的表面上高度表达的CD20蛋白质，所述B细胞恶性肿瘤如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)。利妥昔单抗经FDA批准与化疗组合用于治疗NHL和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。另一重要mAb为曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin)；基因泰克公司)，其通过靶向HER2的表达来彻底改变HER2(人类表皮生长因子受体2)阳性乳癌的治疗。

产生最优“杀伤”CD8 T细胞反应还需要T细胞受体活化加共刺激，其可以通过肿瘤坏死因子受体家族成员的连接来提供，所述肿瘤坏死因子受体家族成员包括OX40(CD134)和4-1BB(CD137)。OX40备受关注，因与活化(促效剂)抗OX40 mAb治疗增强了T细胞分化和细胞溶解功能，这引起增强的针对多种肿瘤的抗肿瘤免疫性。

在一些实施例中，此类额外治疗剂可以选自抗代谢物，如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉宾、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(dacarbazine)、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉瑞滨。

在一些实施例中，此类额外治疗剂可以选自烷基化剂，如氮芥、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其它铂衍生物，如卡铂。

在一些实施例中，此类额外治疗剂可以选自抗有丝分裂剂，如紫杉烷(例如多西他赛)和紫杉醇；和长春花生物碱，例如长春地辛、长春新碱、长春碱和长春瑞滨。

在一些实施例中，此类额外治疗剂可以选自拓扑异构酶抑制剂，如拓扑替康或伊立替康；或细胞生长抑制药物，如依托泊苷和替尼泊苷。

在一些实施例中，此类额外治疗剂可以选自生长因子抑制剂，如ErbBl(EGFR)的抑制剂(如EGFR抗体，例如扎芦木单抗(zalutumumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)或尼妥珠单抗(nimotuzumab)或其它EGFR抑制剂，如吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib))、ErbB2的另一种抑制剂(HER2/neu)(如HER2抗体，例如曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM l或帕妥珠单抗(pertuzumab))或EGFR和HER2两者的抑制剂，如拉帕替尼(lapatinib))。

在一些实施例中，此类额外治疗剂可以选自酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼(imatinib)(Glivec,Gleevec STI571)或拉帕替尼。

因此，在一些实施例中，所公开的抗体与以下各者组合使用：奥法木单抗(ofatumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、达雷木单抗(daratumumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、尼妥珠单抗、帕尼单抗、Hu806、达克珠单抗(daclizumab)(Zenapax)、巴利昔单抗(basiliximab)(Simulect)、英利昔单抗(infliximab)(Remicade)、阿达木单抗(adalimumab)(Humira)、那他珠单抗(natalizumab)(Tysabri)、奥马珠单抗(omalizumab)(Xolair)、依法利珠单抗(efalizumab)(Raptiva)和/或利妥昔单抗。

在一些实施例中，与用于治疗如上文所描述的病症的所公开的抗体组合使用的治疗剂可以是抗癌细胞因子、趋化因子或其组合。合适的细胞因子和生长因子的实例包括IFNy、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNa(例如INFa2b)、IFN、GM-CSF、CD40L、Flt3配位体、干细胞因子、安塞司亭(ancestim)和TNFa。合适的趋化因子可包括Glu-Leu-Arg(ELR)-负趋化因子，如来自人类CXC和C-C趋化因子家族的IP-10、MCP-3、MIG和SDF-la。合适的细胞因子包括细胞因子衍生物、细胞因子变异体、细胞因子片段和细胞因子融合蛋白。

在一些实施例中，与用于治疗如上文所描述的病症的所公开的抗体组合使用的治疗剂可以是细胞周期控制/细胞凋亡调节剂(或“调节剂(regulating agent)”)。细胞周期控制/细胞凋亡调节剂可以包括靶向和调节细胞周期控制/细胞凋亡调节剂的分子，如(i)cdc-25(如NSC663284)、(ii)过度刺激细胞周期的细胞周期蛋白依赖性激酶(如夫拉平度(flavopiridol)(L868275、HMR1275)、7-羟基星形孢菌素(UCN-01，KW-2401)和罗斯维汀(roscovitine)(R-roscovitine，CYC202)))和(iii)端粒酶调节剂(如BIBR1532、SOT-095、GRN163和例如描述于US6,440,735和US 6,713,055中的组合物)。干扰细胞凋亡路径的分子的非限制性实例包括TNF相关细胞凋亡诱导配位体(TRAIL)/细胞凋亡-2配位体(Apo-2L)、活化TRAIL受体的抗体、IFN和反义Bcl-2。

在一些实施例中，与用于治疗如上文所描述的病症的所公开的抗体组合使用的治疗剂可以是激素调节剂，如适用于抗雄激素和抗雌激素治疗的药剂。此类激素调节剂的实例为他莫昔芬(tamoxifen)、艾多昔芬(idoxifene)、氟维司群(fulvestrant)、屈洛昔芬(droloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、炔雌醇(ethinyl estradiol/estinyl)、抗雄激素(antiandrogen)(如氟他胺(flutaminde/eulexin))、孕酮(progestin)(如己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、甲羟孕酮(medroxy-progesterone/provera)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate/megace)、肾上腺皮质类固醇(如氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone))、促黄体激素释放激素(和其类似物和其它LHRH激动剂，如布舍瑞林(buserelin)和戈舍瑞林(goserelin))、芳香酶抑制剂(如阿那曲唑(anastrazole/arimidex)、氨鲁米特(aminoglutethimide/cytraden)、依西美坦(exemestane))或激素抑制剂(如奥曲肽(octreotide/sandostatin))。

在一些实施例中，与用于治疗如上文所描述的病症的所公开的抗体组合使用的治疗剂可以是抗癌核酸或抗癌抑制性RNA分子。

如上文所述，组合施用可以同时、单独或依序施用。对于同时施用，药剂可以按需要以一种组合物或以分开的组合物施用。

在一些实施例中，所公开的抗体与放疗组合施用。放疗可包括放射或向患者提供放射性药物的相关施用。放射源可以在所治疗的患者的外部或内部(放射治疗可以例如呈外射束放疗(EBRT)或近接疗法(BT)的形式)。可用于实践此类方法的放射性元素包括例如镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘化物-123、碘化物-131和铟-111。

在一些实施例中，所公开的抗体与手术组合施用。

已描述本发明的多个实施例。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其它实施例在所附权利要求书的范围内。

实例

实例1：总体设计

大部分NE癌过度表达生长抑素受体(SSTR)，其中SSTR2亚型主要发现于70-100％的NE肿瘤中的细胞表面上(Pinchot SN等人,肿瘤学家200813(12):1255-6；Zatelli MC等人,临床内分泌学与新陈代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab.)200186(5):2161-9；SunLC等人,当代药物递送(Curr Drug Deliv.)20118(1):2-10)。更确切地说，NETs中的SSTR2的表面表达水平比正常细胞中的SSTR2的表面表达水平高约20倍(Pinchot SN等人,肿瘤学家200813(12):1255-6；Zatelli MC等人,临床内分泌学与新陈代谢杂志200186(5):2161-9；Sun LC等人,当代药物递送20118(1):2-10)。因此，抗SSTR2单克隆抗体和抗体药物缀合物(ADC)已被开发作为NE癌靶向治疗剂，所述治疗剂调节肿瘤进展并将细胞毒性剂直接递送至表达SSTR2的NET细胞同时限制全身性毒性(图1)。

已经开发如单克隆抗体(mAb)和ADC的靶向治疗以有效治疗实体肿瘤，同时使对正常细胞的副作用降到最低(24-30)，但这些治疗都未应用于治疗NE癌。作为抗癌生物药剂的ADC集成了mAb的优点，其可以特异性结合肿瘤相关的表面受体且调节受体相关的细胞内信号传导路径和小分子化学治疗剂的有效细胞毒性(图1)。mAb能够使得所递送的药物循环通过血流直到其与肿瘤特定表面抗原结合。在结合之后，ADC经由受体介导的内吞作用而被内化，形成晚期内体，发生溶酶体降解，随后细胞毒性药物释放到细胞质中，且此引起癌细胞死亡。

利用所公开的mAb的ADC可以实现NETs中的特异性靶向和高效细胞毒性，同时使全身性毒性降到最低。抗体药物缀合物(ADC)开发为NE癌靶向治疗剂。mAb的高度特异性靶向能力对于改进ADC的临床功效是必不可少的。通过使用纯化的全SSTR2蛋白作为免疫原开发了仅有的市售人类抗SSTR2 mAb，但所述mAb在NET表面上并未显示出与SSTR2的高结合亲和力。使用两种细胞外肽作为抗原开发的所公开的抗SSTR2 mAb在靶向NETs方面更有效。此抗SSTR2mAb的高特异性确保药物的成功递送且能够选择具有高细胞毒性效力的小分子(如MMAE)。尽管MMAE在体外有效，但其需要肿瘤靶向递送以在体内实现具有临床意义的治疗指数。

被开发以模拟人类NE癌中所观测到的肿瘤进展和微环境的创新肝癌转移鼠类模型或NET皮下异种移植物模型，能够实现mAb和ADC的完全表征，且能够通过体内系统验证NE癌对ADC和mAb的反应。偶发性MTC小鼠模型可以用于研究mAb介导的免疫反应(Pozo K等人,癌细胞(Cancer Cell)201324(4):499-511；Pozo K等人,肿瘤标靶(Oncotarget)2015；6(14):12080-93)。

先进的体外和体内成像技术能够直接观测mAb和ADC的特异性靶向和生物分布。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)的多色活细胞成像技术能够使得我们在细胞水平上监测用Alexa Fluor 647标记的mAb ADC的特异性结合以及内化和裂解。使用正电子发射断层扫描(PET)设备的动态核成像技术对活体动物体内生物分布和肿瘤特异性靶向进行评估。

实例2：生成特异性靶向NETs的抗体药物缀合物(ADC)。

表面受体识别和评估：转录水平上SSTR2的定量检测到胰腺NET(PanNET)细胞(BON)中的SSTR2表达高于非癌细胞(WI38成纤维细胞)中的SSTR2表达(图2A)。另外，PanNET(BON和QGP)、肺NET(H727)和非癌细胞(917和WI38成纤维细胞)的蛋白质印迹分析证实NE癌中的高SSTR2表达，但在非癌细胞中近乎没有表达(图2B)。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和高亲和力多克隆抗体，我们测定SSTR2在BON细胞、BON异种移植物和PanNET人体组织中的强膜阳性(图2C)。

抗SSTR2 mAb开发：尚无市售抗SSTR2 mAb出于治疗目的来靶向表面SSTR2。为实现与NET细胞的高亲和力和特异性结合，我们使用杂交瘤技术开发且完全评估五种小鼠抗人类SSTR2 mAb，这些mAb分别靶向第2细胞外结构域(cQTEPYYDLTSNA，SEQ ID NO:14)、第4细胞外结构域(c cALVHWPFGKAICRVV，SEQ ID NO:15)或第2细胞外结构域和第4细胞外结构域两者。我们使用基于肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞测量术和活细胞CLSM筛选40多个克隆。

重组mAb产生：由于杂交瘤细胞系可能随时间推移而变得不稳定且mAb产率极低，因此对来自杂交瘤的RNA分离物进行测序以测定重链和轻链可变区。使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来克隆和表达嵌合顶级mAb。在具有精确过程控制的7-L搅拌槽生物反应器中进行具有营养供给的分批进料细胞培养。如我们的先前公开(Xu N等人,生物化学工程杂志(Biochem Eng J.)2017；124:122-9)中所述的恒定过程控制应用至mAb生产，即，温度为37℃且在第3天转变为36℃，pH为6.8，DO为50％，以75rpm搅拌和气体喷射为0.01VVM。

ADC构建：ADC通过将抗体经由再桥接双肽Mc-Val-Cit-PABC-PNP接头与高效抗有丝分裂单甲基奥利他E(MMAE；ADC的模型药物)缀合来产生(Xu N等人,化学科学与工程前沿(Frontiers of Chemical Science&Engineering.)20179(3):376-80；Willuda J等人,分子癌症治疗学(Mol Cancer Ther.)201716(5):893-904；McCombs JR等人,美国制药科学家协会(AAPS J.)201517(2):339-51)。首先，再桥接接头通过在100℃下在20mL乙酸中混合3.91mmol 6-氨基己酸与3.91mmol 3,4-二溴苯呋喃-2,5-二酮18小时来合成，且通过硅胶用二氯甲烷/乙酸乙酯的0-40％洗脱溶液来纯化。其次，通过在0.25mL二氯甲烷中混合13.55μmol N,N'-二异丙基碳化二亚胺、13.55μmol N,N-二异丙基乙胺和33.85μmol，随后添加13.55μmol MMAE来合成再桥连接头-MMAE。在混合16小时之后，接头-MMAE用配备有反相C

实例3：体外评估ADC的抗NET毒性和机制。

评估mAb的NET特异性靶向和抗NET特性：体内成像系统(IVIS)确认AF488标记的抗SSTR2 mAb特异性靶向源自BON-Luc细胞的NET皮下异种移植物(图3A)。流式细胞测量术分析显示mAb具有与BON细胞极强的表面结合(99.7％)(图3B)。因此，我们的新颖抗SSTR2mAb具有极大的潜力作为以ADC形式的药物递送载剂。蛋白质印迹显示mAb下调PI3K/AKT(细胞增殖)、细胞周期蛋白D1(致癌基因)和p21(细胞周期停滞)，且显著降低CgA和ASCL1(NET标记)的表达(图4A)。使用流式细胞测量术，我们分析了我们的SSTR2 mAb对在与mAb培育2天后CD3/CD28刺激的人类CD8+T细胞中细胞因子的表达的影响。如图4B所示，SSTR2 mAb使IL2表达增加1.6倍且使IFNγ增加2.2倍。

评估ADC的抗NET毒性：3天MTT细胞增殖分析显示用原位再桥接构建的ADC不仅保留mAb的结构完整性和生物功能，且对NET细胞具有高细胞毒性，其中对BON的IC

实例4：表征ADC在体内的抗癌功效。

为了建立类似动物模型，将NET细胞皮下注射至裸鼠(即，皮下异种移植物)中，且此模型用于研究ADC的抗癌功效。MTD研究显示，剂量≤20mg/kgBW的mAb-MMAE治疗并未引起体重或存活率的任何显著变化。剂量为8mg/kgBW的抗癌研究显示，与用生理盐水治疗的对照组相比，肿瘤体积减少约60％(图6)。此外，对治疗的小鼠的不同器官(肝、脑、心和腿)的H&E染色切片的病理学评估并未显示任何急性或慢性炎症或细胞凋亡和坏死区域的迹象，表明此治疗对除NET结节外的其它器官是安全的，且正常组织对ADC的潜在脱靶摄取不会造成可检测的损伤。

实例5：用于神经内分泌癌治疗的抗体药物缀合物

神经内分泌(NE)癌包括由内分泌和神经系统产生的多种激素分泌性赘瘤。目前的化疗和放疗的疗效微乎其微。本研究旨在开发一种新颖药物缀合物(ADC)以有效地治疗NE肿瘤(NETs)。

NET患者组织微阵列(TMA)以分析受体表达。组织微阵列是由大学病理学研究中心准备的。患者组织通过机构审查委员会(Institutional Review Board，IRB)批准的方案从大学手术肿瘤库获得。TMA由三十八个胰腺神经内分泌患者组织核心和五个阴性对照核心组成，所述阴性对照核心包括来自肝脏、脾脏、胎盘、前列腺和扁桃体的组织。所有组织均为石蜡包埋的。

用以分析SSTR2分布的多个人体器官正常组织阵列。33个器官组织微阵列载玻片(目录号：FDA662a)购自马里兰州罗克维尔的美国生物底物公司(US Biomax,Rockville,MD)。进行IHC染色(程序在以下章节中详细描述)以分析这些器官中的细胞表面SSTR2表达。33个器官为大脑、小脑、外周神经、肾上腺、甲状腺、脾脏、胸腺、骨髓、淋巴结、扁桃体、胰腺、肝、食道、胃、小肠、结肠、肺、唾液、咽、肾、膀胱、睾丸、前列腺、阴茎、卵巢、输卵管、乳腺、子宫内膜、子宫颈、心肌、骨骼肌、间皮和皮肤。作为阳性对照，还在相同条件下使用我们开发的抗SSTR2 mAb对NET患者组织进行染色。

NET细胞系和接种培养物。多种人类NET细胞系用于体外或体内研究，包括BON-1(胰腺NET)、QGP-1(胰腺NET)、携带萤火虫荧光素酶报告基因的BON-1细胞系(BON-Luc)、MZ-CRC-1(甲状腺NET)和TT(甲状腺NET)。BON-1和MZ-CRC-1细胞系维持在补充有10％胎牛血清(FBS)和4mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12基础培养基中；TT细胞系维持在补充有20％FBS和4mML-谷氨酰胺的RPMI-1640中。包括WI-38(肺成纤维细胞)和917(包皮成纤维细胞)的非癌性阴性对照细胞系维持于补充有10％FBS、1％非必需氨基酸和1％丙酮酸钠的MEM-E培养基中。所有细胞系在T25或T75烧瓶中在37℃和5％CO

杂交瘤细胞系和接种培养物。产生抗SSTR2 mAb的杂交瘤克隆的贴壁培养物维持在补充有10％FBS的DMEM的T形烧瓶中，其用于流式细胞测量术和共聚焦显微镜成像中的克隆评估。为了在搅拌槽生物反应器中产生大规模mAb，将前四种杂交瘤克隆从贴壁培养物调整为无血清悬浮液培养物，且将细胞在补充有4mM L-谷氨酰胺和1％抗结块剂(v/v)的杂交瘤-SFM培养基中在37℃、5％CO

抗SSTR2 mAb的开发。人类SSTR2(同种型A，UniProtKB P30874)和小鼠SSTR2(同种型A，UniProtKB P30875)两者均为具有相同拓扑的整体膜糖蛋白，所述拓扑包括四个细胞外拓扑结构域、七个螺旋跨膜和四个细胞质拓扑结构域。蛋白质blast分析显示四个细胞外结构域分别具有81％、100％、100％和90％的相似性。为开发一种可以靶向人类和小鼠SSTR2两者的单克隆抗体，我们使用杂交瘤技术开发了一种靶向第1细胞外结构域(cQTEPYYDLTSNA，aa 33-44，SEQ ID NO:14)和第2细胞外结构域(cALVHWPFGKAICRVV，aa104-118，SEQ ID NO:15)的抗人类SSTR2 mAb。将合成抗原肽静脉内(i.v.)注射至五只balb/c小鼠中进行免疫接种，且每两周接种一次，连续接种十周(五次注射)，此通过ProMab按照标准方案进行。使用基于抗原肽的夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹对从免疫小鼠采集的血清(免疫前血清和抗SSTR2血清两者)中的抗SSTR2 mAb进行滴定。来自具有最佳抗SSTR2抗体滴度的小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合以获得杂交瘤克隆。

mAb产生杂交瘤克隆体的筛选。总共100个亚克隆产生，在筛选的前两个阶段期间在96孔板中培育。使用混合抗原双结构域基于SSTR2 mAb体积生产力(即最终滴度)进行初级克隆筛选，产生前40个克隆。在二次筛选中，使用基于肽(第1或第2细胞外结构域)的ELISA筛选前4个克隆。在三次筛选中，我们将前四个克隆在无血清悬浮培养物中进行调整且在摇瓶中进行分批培养。使用蛋白质A试剂盒纯化mAb，且按照制造方案用AF647标记以评估流式细胞测量术和共聚焦显微镜成像中的癌症表面结合。具有与NET(BON-1)强细胞表面结合、与非癌性H727对照细胞弱结合的前导克隆被定义用於进一步评价和构建ADC。

ELISA。在早期免疫接种和杂交瘤克隆筛选中使用ELISA。简言之，96孔板用在pH为9.6的50mM碳酸盐中稀释的抗原涂布且在4℃下培育过夜。以每孔100μL添加含有mAb的废培养基或稀释于阻断缓冲剂中的纯化mAb，且在室温(RT)下培育1小时。抗SSTR2 mAb是通过每孔添加50μL以1:10,000稀释于阻断缓冲剂中的HRP标记的的抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO，目录号：RABHRP2-10UL)来捕获并检测。含有0.1M Na

同型评估。市售小鼠抗体同型试剂盒用于测定所开发的mAb的同型。具体来说，山羊抗小鼠IgG、IgA和IgM用于涂布板。在添加mAb样品之后，添加子类别特异性兔抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、κ和λ。HRP标记的抗兔IgG和底物溶液用来显色。

抗SSTR2 mAb生产。产生前导SSTR2 mAb的杂交瘤克隆维持于125-mL摇瓶中。以工作体积为1L且以80rpm搅拌，将接种列按比例扩大到3-L旋转烧瓶。在以温度为37℃，pH为7.0，DO为50％，以70rpm搅拌控制的5-L搅拌槽生物反应器细胞培养物中进行mAb生产。具体而言，在生物反应器中将分批生产培养物以0.3-0.5×10

mAb纯化。先前开发的使用NGC系统的两步抗体纯化方案(Ou J等人,公共科学图书馆·综合(PLoS One.)2018 10月23日13(10):e0206246；Xu N等人,生物化学工程改造杂志(Biochemical Engineering Journal.)2018145:177-85)用于纯化抗SSTR2 mAb。具体来说，进行主要蛋白质A亲和力纯化以捕获UNOsphere SUPrA柱中的mAb，所述柱用包含0.02M磷酸钠和0.02M柠檬酸钠的pH为7.5的缓冲剂平衡。在洗涤柱之后，mAb用含有0.02M柠檬酸钠和0.1M氯化钠的pH为3.0的缓冲剂洗脱，且用1M Tris溶液中和至7.0。使用阳离子交换柱Foresight Nuvia S进行抛光纯化，且使用20mM至200mM氯化钠溶液洗脱mAb。纯化的mAb使用NGC滴定，并且使用如以下章节中所述的SDS-PAGE、蛋白质印迹、流式细胞测量术和共焦显微镜进行表征。

ADC构建。已公开的基于半胱氨酸的缀合程序平台(Ou J等人,公共科学图书馆·综合201810月23日13(10):e0206246)用于构建ADC。首先，再桥接接头通过在60℃下将6-氨基己酸与3,4-二溴苯呋喃-2,5-二酮以1:1的摩尔比混合30分钟来合成，在100℃下加热18小时，且通过硅胶用0-40％二氯甲烷/乙酸乙酯作为洗脱溶液纯化。第二，在25℃下，将N,N-二异丙基碳化二亚胺、N,N-二异丙基乙胺和再桥连接头以1:1:2.5的摩尔比在二氯甲烷中混合1小时。然后，添加相同摩尔浓度的MMAE，且频繁混合16小时以合成接头-有效负载，其通过配备有5μm C18(2)

体外抗癌毒性(IC

SDS-PAGE和蛋白质印迹。使用Mem-PER加膜蛋白质提取试剂盒提取用于表面受体评估的膜蛋白质。蛋白质浓度按照制造方案通过皮尔斯BCA分析测定。非还原SDS-PAGE使用具有4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶的NuPAGE

流式细胞测量术以定量表面受体密度和mAb结合。纯化的抗SSTR2 mAb用AlexaFluor

共焦成像以评估ADC结合和内化。将层粘连蛋白以10μg/mL的浓度涂布于玻璃盖玻片(康涅狄格州汉登的华纳仪器公司(Warner Instruments,Hamden,CT))上以增强粘合效率且在4℃下培育24小时。在24孔板中，以5×10

异种移植物小鼠模型生成和抗NET功效研究。BON-Luc接种培养物在按比例扩大之前以无支原体形式进行测试。将细胞浓缩并且以1×10

通过体内成像系统(IVIS)进行生物分布。使用以上方法产生异种移植物小鼠模型。在异种移植后第7天，选择具有100-150mm

药代动力学研究。为研究ADC的代谢速率，将5种不同浓度(4、8、12、16、20mg/kgBW)的ADC注射至5组随机小鼠(n＝4)中。注射后2、5、24、48、72、120小时(总共6个时间点)从尾部收集血液样品。将血液在2,000g下离心5分钟以使细胞沉淀，并且收集上清液以用于ELISA分析。标准夹心ELISA用于定量小鼠血浆中保持的ADC。利用SSTR2肽涂布96孔板。辣根过氧化酶缀合的山羊抗小鼠IgG抗体和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)用于显色。将血浆中的ADC稀释且使用检测范围为0-300ng/mL的ELISA进行滴定。使用先前开发的PK模型(参考)计算建议剂量(D)和给药间隔(τ)：D＝C

苏木精和伊红(H&E)染色。在染色之前将切片去石蜡。添加200μL的苏木精溶液以将切片染色，随后在25℃下培育5分钟。通过反向流动的自来水将染料洗掉。将切片在PBS中冲洗5分钟。随后，将切片在400μL的伊红Y溶液中染色30秒并且使用流动的自来水洗涤。将切片在无水乙醇中通过两次2分钟的反应进行脱水并且在二甲苯中进行澄清。

免疫组织化学(IHC)染色。福尔马林固定且石蜡包埋的NET组织由UAB病理学系的基于组织的转化研究实验室进行制备且切片。正常器官TMA购自美国生物底物公司。将切片澄清并且使用二甲苯和乙醇再水合。玻片接着浸没于柠檬酸盐缓冲剂(BioGenex,Fermont,CA)中持续十分钟压力锅循环以实现抗原回收。通过在3％过氧化氢中培育玻片持续十分钟来淬灭内源性过氧化酶活性。用3％的山羊血清和0.3％的Triton-X100在PBS中在室温下阻断1小时。SSTR2使用1.8mg/mL的抗SSTR2 mAb，在4℃下的培育过夜进行检测。使用经抗小鼠生物素标记的二级抗体，接着与HRP抗生蛋白链菌素一起培育30分钟。玻片用DAB色原体(丹科液体DAB+底物K3468)染色并且用苏木精反向染色。在盖片滑动和成像之前，将玻片脱水并且使用乙醇和二甲苯澄清。

统计。所有数据均呈现为平均值±平均值的标准误差(SEM)。双尾学生t检验用于测定两组之间的显著性。使用单因素方差分析接着事后(邓尼特(Dunnett))分析进行多组当中的比较。通过先前研究和公开的ADC治疗研究(68)测定动物研究的样品大小。所有试验均考虑了***P值<0.001的统计显著性。

研究批准。NET患者的肿瘤组织样品通过机构审查委员会(IRB)批准的方案从UAB手术肿瘤库获得。用依序分配的数字替换识别患者的信息。正常人类器官组织购自美国生物底物公司。动物研究按照UAB IACUC(IACUC-20422)制定的研究动物的护理和使用指南进行。

SSTR2在NET患者肿瘤组织中过度表达，但不在正常器官中过度表达。为评估患者的NET组织的细胞表面上SSTR2的表达水平，对组织微阵列(TMA)进行免疫组织化学(IHC)染色分析。TMA由来自不同患者的38个福尔马林固定且石蜡包埋的胰腺NET的核心(图7中第2-9列)和作为阴性对照的5个正常非癌性组织(包括脾脏、肝、前列腺、胎盘和扁桃体)的核心(图7中第1列)组成。首先使用苏木精和伊红(H&E)对TMA进行染色，以指示每个核心中NET细胞的存在和位置(图7A)。IHC染色表明约71％的患者核心对SSTR2呈阳性，且具有强细胞膜定位(图7B)。此外，SSTR2的表达仅仅见于NET组织中，但在5个正常组织中并未检测到。

人类Atlas项目数据库报道了脑部、肺、肝、肌肉、皮肤、胎盘、前列腺、扁桃体和胰腺中的高水平SSTR2 mRNA。高水平mRNA不总是与蛋白质的高表达相关，而SSTR2的表面表达对于开发靶向治疗更为重要。因此，使用抗SSTR2 mAb进行IHC染色，研究SSTR2在这些正常组织和其它正常组织中的蛋白表达。市售的多器官TMA(US Biomax,FDA662a,冷冻样品)用于IHC染色，其含有33类正常人类器官组织，包括大脑、小脑、外周神经、肾上腺、甲状腺、脾脏、胸腺、骨髓、淋巴结、扁桃体、胰腺、肝、食道、胃、小肠、结肠、肺、唾液、咽、肾、膀胱、睾丸、前列腺、阴茎、卵巢、输卵管、乳腺、子宫内膜、子宫颈、心肌、骨骼肌、间皮和皮肤。如图8A中所示，在除显示弱阳性信号的胰腺和皮肤以外的大多数正常人类组织中未检测到SSTR2表达(图8A和表1)。图8B中的脑部、肝、肺、肌肉、皮肤、扁桃体、前列腺和胰腺的高分辨率图像清楚地显示最小或检测不到的表面SSTR2受体。作为阳性对照，与正常组织相比，使用我们的mAb的NET患者组织显示出阳性和强信号。

此外，在NET细胞系中也证实SSTR2的高水平表达。定量蛋白质印迹分析显示在两种胰腺NET细胞系(BON-1和QGP-1)和肺NET细胞系(H727)中SSTR2的高水平表达，但在非癌、成纤维细胞细胞系(917和WI-38)中存在最小表达(图15A)。此外，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)还揭露BON-1异种移植物和NET患者组织两者中的SSTR2的强膜阳性(图15B)。从患者肿瘤组织、正常器官和细胞系收集的所有数据表明SSTR2为用于NET治疗的理想标靶。

标靶NETs的抗SSTR2 mAb。为有效靶向NETs中的表面受体SSTR2，使用杂交瘤技术开发了靶向第1细胞外结构域(cQTEPYYDLTSNA，aa 33-44，SEQ ID NO:14)和第2细胞外结构域(cALVHWPFGKAICRVV，aa 104-118，SEQ ID NO:15)的小鼠抗人类SSTR2 mAb。首先使用酶联免疫吸附分析(ELISA)，基于抗体滴度筛选出抗SSTR2 mAb的杂交瘤亚克隆。基于mAb对SSTR2的第1结构域和第2结构域的结合效率，对前40个克隆进行分级(图9A)。选择四个克隆用于进一步评估，包括与第2结构域具有最强结合但与第1结构域具有低结合的克隆1；与第1结构域具有最高结合但与第2结构域具有低结合的克隆2；以及与第1和第2细胞外结构域具有高结合的克隆3和克隆4。

通过测试由这4个克隆产生的抗SSTR2 mAb与NET细胞系的表面结合来进一步评估所述抗SSTR2 mAb。同型分析显示，克隆1-4分别为IgG1κ、IgG2aκ、IgG1κ和IgG1κ。为了定义前导克隆，使用流式细胞测量术比较每个mAb对于BON-1细胞中的SSTR2的结合能力并且进行分级。如图9B中所示，克隆1-4的表面结合百分比分别为50％、80％、90％和98％。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析证实，由这四个克隆产生的相应抗SSTR2mAb的分子量为约150kDa(图9C)。基于mAb表达和SSTR2特异性结合能力的结果，克隆4被选择为最佳克隆并且因此被定义为“前导克隆”。如图9D中所呈现，进一步评估显示，前导抗SSTR2 mAb具有与NET细胞系BON-1和QGP-1的高表面结合(>90％)和与成纤维细胞细胞系917和WI-38的低结合(<7.5％)。因此，此前导杂交瘤克隆在本研究的其余部分中贯穿使用，用于大规模mAb生产和ADC构建。

为了最优地按比例扩大并且生产高质量的抗SSTR2 mAb，我们将杂交瘤细胞从T形烧瓶中的贴壁培养物调整为旋转烧瓶和搅拌槽生物反应器中的悬浮培养物。在补充有6g/L葡萄糖、6mM L-谷氨酰胺、3.5g/L Cell Boost#6和1％抗结块剂(v/v)的Gibco杂交瘤SFM培养基中进行mAb生产(图9E)。在T形烧瓶、旋转烧瓶和搅拌槽生物反应器中的培养物分别以0.016、0.024和0.035h

抗SSTR2 mAb显示在体外和体内对NET的高表面结合。为评估抗SSTR2 mAb对SSTR2的体外NET特异性靶向，使用NET细胞系进行动态活细胞CLSM成像和流式细胞测量术。为观察和追踪表面结合过程，用BacMam GFP对照转染BON-1细胞，并将Alexa Fluor 647染料(AF647，标记为红色，ex./em.650/665nm)与抗SSTR2 mAb缀合。如图10A中所示，在与细胞一起培育之后20分钟，抗SSTR2 mAb由于免疫亲和力而积聚在BON-1细胞表面上，显示为“圆形”。然后mAb通过内吞作用内化并且在40分钟内定位于细胞质中。用流式细胞测量术比较开发的mAb与市售mAb(安迪生物公司)的表面结合能力。如图10B中所述，在相同染色条件下，在本研究中开发的mAb与市售mAb相比对BON-1细胞的表面结合要强得多，为95％比38％。此外，共焦成像显示抗SSTR2 mAb在培育后70分钟内与PanNET细胞系(BON-1)和MTC细胞系(TT和MZ-CRC-1)结合并被它们完全内化(图10C)。

此外，使用NET异种移植小鼠模型评估抗SSTR2 mAb的体内靶向能力。小鼠模型携带用萤火虫荧光素酶(一种生物发光报告基因)转染的BON-1-Luc细胞。在注射mAb后4-8小时的IVIS成像指示Cy7-mAb在BON-Luc异种移植物中的强积聚，但在鼠循环系统中也有少量的mAb剩余。24小时成像证实来自BON-Luc异种移植物的生物发光信号和来自Cy7-mAb的荧光信号的完全共定位(图11A)。收集BON-Luc异种移植物、肝和脑，并且将它们切片以使用CLSM测试mAb结合。发现未检测到Cy7-mAb与肝或脑的非特异性结合，但在BON-Luc异种移植物的切片上检测到强荧光信号。总之，本文中进行的体外和体内研究都证实，开发的抗SSTR2 mAb可以靶向过度表达SSTR2的NET细胞系、异种移植物和患者组织。因此，显而易见的是，新型mAb有潜力以ADC的形式靶向并且递送高效的小分子。

抗SSTR2 mAb检测人和小鼠SSTR2两者。在人类中，SSTR2在细胞膜上内源性表达为具有四个细胞外结构域、七个螺旋跨膜结构域和四个细胞质结构域的糖蛋白(Yamada Y等人,美国国家科学院院刊199289(1):251-5；Petersenn S等人,分子细胞内分泌学(MolCell Endocrinol.)1999157(1-2):75-85；Ota T等人,自然遗传学(Nat Genet.)200436(1):40-5)。如表2中所概述，UniProtKB数据库显示人类SSTR2(UniProt P30874)和小鼠SSTR2(UniProt P30875)的同种型A具有相同拓扑。所公开的小鼠抗人类SSTR2 mAb使用来自人类SSTR2的与小鼠SSTR2具有100％相似性的第1和第2细胞外结构域来产生。利用此设计，预期所公开的抗SSTR2 mAb可检测人和小鼠SSTR2两者。为测试这一假设而进行了蛋白质印迹，其显示所公开的抗SSTR2 mAb可检测到BON-1异种移植物中和来自自发性MTC小鼠模型的分离的甲状腺髓样癌(MTC)细胞中存在的SSTR2(图11C)。此MTC模型先前被开发为第一个可靠且临床上准确的条件MTC小鼠模型(Pozo K等人,癌细胞2013 24(4):499-511；Pozo K等人,肿瘤标靶2015；6(14):12080-93)。双转基因小鼠系经工程化以允许在神经特异性烯醇化酶(NSE)启动子的控制下的p25(p25OE)的多西环素(doxycycline)依赖性抑制。本研究显示抗SSTR2 mAb可检测到人类和小鼠SSTR2受体两者。

ADC构建和表征。已确立的基于半胱氨酸的缀合程序平台(Ou J等人,公共科学图书馆·综合201810月23日13(10):e0206246)用于构建ADC。在此，基于再桥接肽的接头合成出以维持mAb的高完整性(图12A)，与抗有丝分裂单甲基奥瑞他汀E(MMAE)缀合，并且使用沃特斯高效液相色谱(HPLC)纯化。使用安捷伦6500Q-TOF LC/MS对接头的结构进行表征(图12B)，并且使用SDS-PAGE确认ADC结构的完整性(图12C)。所构建的ADC的平均药物抗体比率(DAR)为约4.0。

抗SSTR2 ADC的体外抗癌毒性显示低IC

抗SSTR2 ADC具有多种潜在的抗癌机制。为理解除递送MMAE引起的细胞毒性以外的抗SSTR2 ADC的其它潜在抗癌机制，在用ADC治疗三天的BON-1细胞中分析与细胞增殖信号传导路径相关的若干个标记物。蛋白质印迹显示单独抗SSTR2 mAb和ADC都可以阻断经由PI3K-AKT路径的细胞增殖信号传导、下调致癌基因细胞周期蛋白D1，并且诱导细胞周期停滞，如通过检测标记p21所示(图12E)。这些研究发现ADC释放的MMAE通过微管解聚合抑制NET细胞增殖(图12F)。

此外，还测试所公开的抗SSTR2 mAb对CD8+T细胞中的细胞因子产生的可能影响。CD3/CD28刺激后，人类CD8+T细胞与100nM SST类似物(奥曲肽)或100nM抗SSTR2 mAb培育2天。在培育之后，进行流式细胞测量术以分析IL-2和IFN-γ的表达。如图16中所示，抗SSTR2mAb和奥曲肽两者使IL-2表达增加了1.6倍，并且使IFN-γ表达增加了2.2倍。

综上所述，提出用于NET的抗SSTR2 ADC治疗的若干可能的作用机制(图17)。第一种机制为抗SSTR2 mAb充当针对NET细胞的药物的靶向递送运载体，且药物有效负载经由解聚合微管蛋白抑制癌细胞增殖。第二种潜在机制为PI3K-AKT增殖信号传导路径由mAb结合下调且随后阻断SSTR2。第三种潜在机制为抗SSTR2 mAb增强T细胞的细胞因子产生。

抗SSTR2 ADC的MTD未显示出副作用。为研究抗SSTR2 ADC的最大耐受剂量(MTD)，将其以5种不同浓度注射至5只野生型(非肿瘤携带)小鼠的尾静脉中：4、8、12、16和20mg/kg体重(BW)。在注射后六小时和每天两次共21天的时间里，对小鼠进行监测，未发现行为改变的迹象，如饮水、呼吸困难、体重迅速减轻、行走障碍和/或精神状态。如图13A中所示，在4-20mg/kg BW的浓度范围下的ADC对小鼠体重或总存活率没有明显的副作用。监测总共三周后，处死小鼠并且收集脑部组织用于进一步研究。如H&E染色所示(图13B)，施用抗SSTR2ADC后，脑组织未出现形态上的改变。未观测到明显的药物递送，且未观测到任何急性或慢性炎症迹象或任何细胞凋亡或坏死区域。这些结果表明抗SSTR2 ADC治疗不具有明显的脱靶效应，并且不造成体内脑部的可检测的损伤。

PK指示抗SSTR2ADC的高稳定性。将ADC以五种不同浓度通过静脉内注射至携带皮下NET异种移植物的小鼠中来进行初步药物动力学(PK)研究，所述浓度为：4、8、12、16和20mg/kg BW(n＝4)。在ADC注射后0小时、2小时、8小时、16小时、1天、2天、3天、5天和7天的时间点，从尾静脉收集血浆样品用于PK分析(各10-50μL)，且随后使用ELISA分析进行滴定(图13C)。如表3中所呈现，PK建模证实所计算的半衰期(t

抗SSTR2 ADC的体内抗癌功效。携带BON-Luc异种移植物的小鼠使用浓度为8mg/kg的抗SSTR2 ADC、作为运载体对照的生理盐水和抗SSTR2 mAb(对照，8mg/kg)分为三组(n＝6)，以4.5天的给药间隔进行治疗。图14A显示，与对照组相比，在用抗SSTR2 ADC治疗的小鼠中，肿瘤生长被显著抑制，肿瘤大小减少62-67％。肿瘤荧光通量还用IVIS成像系统测量，且显示与对照组相比，用ADC治疗的组中的肿瘤生长减少71-73％(图14B)。在研究结束时收集NET肿瘤(图14C)，且湿重也证实肿瘤生长的显著抑制(图14D)。三个组之间在总体体重上不存在明显差异(图14E)。蛋白质印迹分析显示在治疗期间NET肿瘤中存在SSTR2表达(图14F)。来自ADC治疗组肿瘤中SSTR2的表面染色似乎低于对照组中所见的染色(图14G)，很可能归因于ADC所引起的NET细胞死亡，其通过H&E染色证实(图14H)。此体内抗癌功效研究证实，抗SSTR2 mAb为一种良好的药物递送运载体，并且抗体药物缀合物可有效抑制NET生长。

SSTR2受体为理想的NET标靶。为开发有效且安全的靶向癌症治疗，必须识别和彻底表征独特生物标记，其特异性地從非癌性细胞界定癌细胞。正如本研究所报导，在38名NET患者中，约70％的患者SSTR2过度表达。其它研究也已报导，70-100％的NETs在细胞表面大量表达SSTR2(Pinchot SN等人,肿瘤学家200813(12):1255-69；Zatelli MC等人,临床内分泌学与新陈代谢杂志200186(5):2161-9；Sun LC等人,当代药物递送20118(1):2-10)。尽管有报导称SSTR2可在中枢神经系统(CNS)、胃肠道(GI)和胰腺中正常表达(Cakir M等人,细胞与分子医学杂志(J Cell Mol Med.)201014(11):2570-84)，使用本研究和文献中描述的IHC分析，在组织微阵列中观测到NET组织中SSTR2的表达比正常组织高>20倍(PinchotSN等人,肿瘤学家200813(12):1255-69；Zatelli MC等人,临床内分泌学与新陈代谢杂志200186(5):2161-9；Sun LC等人,当代药物递送20118(1):2-10)。考虑到基于mAb的ADC为剂量依赖性靶向治疗，NETs与其它组织之间的SSTR2表达的巨大差异确保可安全地利用SSTR2。

然而，并非所有患有NETs的患者都过度表达SSTR2(Righi L等人,肿瘤学年鉴(AnnOncol.)201021(3):548-55；Sherman SK等人,外科研究杂志(J Surg Res.)2014190(2):587-93)。据报导45-66％患有肺NET的患者(Righi L等人,肿瘤学年鉴201021(3):548-55)和80-95％患有胃肠胰腺NETs的患者表达SSTR2。在这一研究中进行的组织微阵列分析显示，在染色的38名患者组织中，仅约71％显示可检测的SSTR2表达。为了使缺乏SSTR2的高表达的患者受益，需努力去使用比较膜蛋白质组学和蛋白质印迹来识别NETs中的其它潜在表面标记，如癌胚相关细胞粘附分子1(CEACAM1)。我们已发现CEACAM1在两种胰腺NET细胞系(BON-1和QGP-1)中高表达，并且胰腺癌细胞系(PANC-1和MiAPaCa-1)和成纤维细胞系(WI-38)中均不表达。其它研究还报导CEACAM1在各种其它癌症中的表达，包括代表NET类型的甲状腺髓样癌细胞系(Thies A等人,临床肿瘤学杂志200220(10):2530-6；Tilki D等人,癌基因(Oncogene)200625(36):4965-74)。此发现表明，对于具有最小SSTR2密度的NET患者，CEACAM1可用作SSTR2的替代方案。

所公开的抗SSTR2 mAb为一种有效的药物递送运载体。此研究表明SSTR2为NET治疗的合适标靶。与使用全SSTR2膜蛋白作为免疫原开发的市售抗SSTR2 mAb不同，在本研究中开发的新型抗SSTR2mAb是使用SSTR2的两个细胞外结构域作为免疫原来产生。因此，它显示与NET细胞的结合能力是市售抗SSTR2 mAb的5倍以上。

人类Atlas项目报道了多个正常人类组织中的SSTR2的高mRNA水平，但SSTR2的表面蛋白表达水平为靶向癌症治疗的主要考虑因素，而非转录水平。此研究分析了多个正常人体器官组织阵列(总共33个器官)，包括大部分所报道的具有高mRNA的组织，证实这些组织的细胞表面上的SSTR2蛋白表达低或检测不到。活体动物IVIS成像证实，我们的抗SSTR2mAb只在NET异种移植物中积聚。因为所公开的mAb可以靶向人类和小鼠SSTR2两者，所以小鼠模型中对NET的体内特异性靶向可以指示患者中的特异性靶向。另外，评估抗SSTR2 ADC对小鼠、特别是对脑组织的可能毒性。MTD数据显示，剂量高达20mg ADC/kg BW并未引起小鼠的任何体重或行为变化。重要的是，鼠脑组织的H&E染色没有显示出任何损伤或细胞形态改变的证据。因此，所公开的抗SSTR2 mAb为一种潜在安全的药物递送运载体。

有效治疗NET的创新靶向治疗。mTOR抑制剂(依维莫司)、多激酶抑制剂(舒尼替尼)和SST类似物(例如奥曲肽和兰瑞肽(Lanreotide)已被开发用于治疗NET(Brown KT等人,血管与介入放射学杂志199910(4):397-403；Isozaki T等人,内科医学199938(1):17-21；Eriksson B等人,神经内分泌学200887(1):8-19；Lal A等人,肿瘤学现代观点2006 18(1):9-15；Lehnert T.器官移植199866(10):1307-12；Zhang R等人,内分泌学1999 140(5):2152-8；Boudreaux JP等人,外科学年鉴2005241(6):839-45；Nguyen C等人,核医学杂志200445(10):1660-8；Fiorentini G等人,化疗杂志200416(3):293-7；Zuetenhorst JM等人,内分泌相关癌症200411(3):553-61；Oberg K等人,肿瘤学年鉴200415(6):966-73)，但这些药物的治疗效果有限。在本研究中，首次以单克隆抗体药物缀合物的形式开发了SSTR2靶向治疗以靶向NET。ADC具有包括以下的优点：经由强表面结合增强的细胞吸收、递送至癌细胞的小分子有效负载的高细胞毒性，和最小副作用。此体内抗癌功效研究证实，肿瘤生长在用抗SSTR2 ADC治疗后显著降低，这表明所公开的mAb可以有效地靶向NET细胞并且递送缀合的毒性药物。此外，所公开的抗SSTR2mAb可用于标记脂质体和外泌体的表面，以促进其它药物的靶向递送。还可以克隆单链可变片段(scFv)以构建CAR-T细胞用于进行NET免疫治疗。

抗SSTR2 mAb和抗SSTR2 ADC的协同治疗。其它研究已报导可驱动由SSTR2介导的抗肿瘤作用的多个直接和间接机制。例如，直接的抗细胞增殖机制包括细胞凋亡(uillermet J等人,美国国家科学院院刊2003100(1):155-60)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的调节，和细胞增殖信号的抑制(Lahlou H等人,纽约科学院年报(Ann N Y AcadSci.)20041014:121-31)。潜在间接抗肿瘤作用包括抑制生长因子和激素释放、抗血管生成作用(Woltering EA.癌症生物治疗和放射性药物(Cancer Biother Radiopharm.)200318(4):601-9)和免疫反应调节(Elliott DE等人,欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)199929(8):2454-63)。在本研究中进行的体外评估显示所公开的抗SSTR2mAb下调与细胞增殖相关的PI3K/AKT信号传导，下调致癌基因细胞周期蛋白D1的表达，上调与细胞周期停滞相关的p21表达，且通过增加细胞因子产生来活化CD8+T细胞。这些发现指示此基于抗SSTR2mAb的ADC可充当具有临床潜力的多用途生物制剂，如：通过将细胞毒性有效负载释放至细胞质中直接引起细胞死亡；经由SSTR2介导的信号传导级联调节抑制肿瘤细胞生长；和通过增加细胞因子产生来再活化T细胞功能。需要进一步使用偶发性MTC小鼠模型、人源化小鼠模型和肝癌转移小鼠模型研究以更好地理解抗SSTR2 mAb和ADC对于体内NET治疗的可能协同作用。

所公开的靶向治疗的影响。所公开的抗SSTR2 ADC与治疗转移性NE癌的传统化疗、放疗和手术相比具有优势。与外科手术相比，抗SSTR2 ADC可以靶向并且治疗转移性结节。与化疗相比，此治疗可降低非所要的副作用且提高抗癌治疗功效。与FDA批准用于靶向治疗的其它受体类似，SSTR2不是绝对NET特异性受体，因此有必要进一步评估其潜在的副作用。结合在NET中SSTR2的表达高于正常组织，SSTR2在大多数正常器官中几乎没有或检测不到表面表达的事实，并且ADC是一种剂量依赖性治疗策略，可以最大限度地减少可能的脱靶副作用。本研究开发的靶向治疗与其它治疗方法相结合，对提高NE癌患者的生活质量和生存率具有极大的潜力。

除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与所公开的本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。本文所引用的出版物以及其所引用的材料通过引用具体并入。

所属领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所描述的本发明的具体实施例的许多等效物。这类等效物意图由以下权利要求书涵盖。

序列表

<110> UAB研究基金会(The UAB Research Foundation)

<120> 神经内分泌癌靶向治疗

<130> 222104-2890

<150> US 62/742,56

<151> 2018-10-08

<160> 30

<170> PatentIn版本3.5

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Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys

100 105 110

Ser Gln Ser Thr Arg Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu

145 150 155 160

Asn Gly Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

165 170 175

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe

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Thr Phe Thr Asp Tyr His Leu Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys

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Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu Ile Arg Asn Lys Arg Tyr Gly Tyr Arg

210 215 220

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Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu

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<210> 24

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 24

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1 5 10 15

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115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Leu Pro Val Arg Leu

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Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

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260 265 270

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<210> 25

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

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50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Pro Val Thr Leu Leu

145 150 155 160

Asn Gly Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

165 170 175

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe

180 185 190

Thr Phe Thr Asp Tyr His Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys

195 200 205

Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Arg

210 215 220

Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

225 230 235 240

Asn Ser Gln Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu

245 250 255

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Phe Tyr Asp Pro Phe Ala

260 265 270

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

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<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

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1 5 10 15

Ile Gln Cys

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<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 30

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1 5 10 15

Ser Ser Ser