在不进行细胞纯化的情况下进行微生物分析

摘要

本发明提供了用于在不进行样本制备的情况下直接从患者样本中快速自动化鉴定微生物和抗微生物剂敏感性测试的系统和方法。将样本装载到分析盒中以进行处理。分析盒预装载有用于鉴定和枚举该样本中的微生物的物种特异性标记。如分析仪等仪器可以用于与分析盒相互作用以完全在该盒内执行本发明的方法。

说明书

技术领域

本公开涉及感染的检测、感染性微生物病原体的鉴定以及针对这些感染的有效抗微生物剂治疗的确定。

背景技术

由抗生素耐药性细菌引起的威胁生命的感染的流行加剧了全球性医疗保健危机。该问题部分地由当前诊断方法需要很多天来确定用于治疗感染的最优抗微生物剂治疗的事实驱动。由缓慢测试引起的延误导致次优治疗、不良结果以及对引起抗生素耐药性扩散的强力广谱抗生素的过度使用。由于由耐药性细菌引起的感染造成的死亡率正在急剧增加。《对抗微生物剂耐药性的综述(Review onAntimicrobial Resistance)》的2014报告估计，到2050年，抗微生物剂耐药性将是每年大于1000万死亡的原因。

使用针对引起感染的特定病原体的最佳有效抗生素进行的早期治疗可以极大改善医疗结果，包含预防死亡。不幸的是，当前用于鉴定有效针对性抗生素的方法(被称为抗微生物剂敏感性测试(AST)方法)需要很多天来递送结果。当前抗微生物剂敏感性测试花费这么长时间的一个原因是测试需要大量——大约几百万经过纯化的病原体细胞。其需要一天或更多天使用130多年用于通过在皮氏培养皿中培养来纯化此数目的细胞的集落纯化方法。一旦经过纯化的细胞可用，其就通常花费一天或更多天来鉴定病原体并确定哪种抗生素将有效治疗该患者。

与此同时，“凭经验”用杀死可能引起感染的广泛范围的病原体的广谱抗生素治疗患者。尽管这些药物可以治疗广泛范围的病原体，但是这些药物通常既不是用于患者的特定病原体的最优疗法，而且也不能完全有效地治疗该患者。对广谱抗生素的经验使用还使抗生素耐药性扩散。这些作用广泛的药物不仅引起对致病病原体的耐药性，而且还引起对栖息于人体的上万亿个良性微生物的耐药性。进一步加剧抗生素耐药性扩散的事实是，在不存在确定哪些患者实际上患有感染的快速诊断的情况下，不必要用引起耐药性的抗生素频繁地治疗未经感染的患者。

确定哪些抗微生物剂治疗将比可能使用当前方法更有效不仅将改善医疗结果，而且其可能降低医疗保健的成本。例如，常见的威胁生命的医院获得性感染(如外科手术部位感染和呼吸机获得性肺炎)是美国将近100亿美元医疗保健成本的原因。住院时间使可归因于这些感染的成本最大化。获得患者的更接近症状发作的最优抗微生物剂疗法可以显著加速患者恢复并减少冗长且昂贵的住院治疗。

总之，当前方法需要很多天来确定患者是否患有感染，并且如果确定患者患有感染，则确定哪些抗微生物剂可能最有效。这些方法在很大程度上需要由耗时的细胞纯化步骤引起的延误。当患者呈现有症状时，在不存在及时诊断信息的情况下，凭经验用广谱抗生素治疗这些患者，这可能是次优的并且可能引起耐药性扩散。因为这些抗生素在诊断结果可用之前被开出，所以甚至未经感染的患者被不必要地治疗并且获得耐药性。

发明内容

本发明解决了对检测感染并确定比当前方法更快速的有效抗微生物剂治疗的诊断测试的需求。本发明消除了当今用于产生大量经过纯化的细胞的方法所需的耗时步骤。与当前方法所需的天数相比，本发明的方法可以在若干个小时内检测感染、鉴定感染性病原体和有效抗微生物剂。通过检测感染并鉴定更接近症状发作的有效针对性抗微生物剂，本发明能够极大地改善医疗结果并使用引起耐药性的广谱抗生素进行的经验治疗最小化。

用有效抗生素治疗接近症状发作的患者极大地改善了医疗结果，从而挽救了生命并节省了医疗保健成本。与当前方法所需的天数相比，本发明的系统和方法使得可以在若干个小时内递送抗微生物剂敏感性测试结果。早几天施用有效抗生素可以改善医疗结果并帮助减弱对凭经验开出的使耐药性扩散的广谱抗生素的过度使用。

用于确定有效治疗的常规方法(被称为抗微生物剂敏感性测试方法)需要很多天来递送结果，部分地因为这些方法需要数百万个经过纯化的病原体细胞。用于产生这些经过纯化的细胞的过程使用用于在皮氏培养皿上培养致病病原体的耗时的集落纯化方法。集落纯化通常花费一天或更多天来完成。在集落纯化之后，通常需要另外一天或更多天来鉴定病原体物种并进行抗微生物剂敏感性测试以确定哪些抗微生物剂应当用于治疗该患者。

本发明提供了用于在不进行集落或细胞纯化的情况下从样本中鉴定病原体或确定抗微生物剂敏感性的方法。与当前方法相比，本发明的方法对得出结果的时间的显著改善来自于本发明在不需要用于制备大量经过纯化的病原体细胞的耗时步骤的情况下直接分析患者样本的能力。

抗微生物剂敏感性测试可以被视为逐步过程。目标是确定一组抗微生物剂的哪些成员对引起患者感染的特定病原体菌株有效。通常，当检测到感染时，首先鉴定病原体的物种。鉴定病原体的物种对于选择抗微生物剂和通常可以用于治疗该物种的剂量是有用的。然而，因为引起该感染的特定病原体菌株可能已经对抗微生物剂中的任何抗微生物剂具有耐药性，因此必须进行抗微生物剂敏感性测试以确定该病原体实际对哪种潜在治疗敏感。

在物种鉴定之后，将来自患者样本的病原体细胞进行分配或等分到含有营养素生长培养基、不同浓度的各种抗微生物剂的一系列液体溶液中。然后，允许等分试样在有助于微生物复制的温度(通常35-37摄氏度)下温育。如果该病原体对抗微生物剂敏感，则该病原体可以正常复制，即在不存在抗微生物剂的情况下病原体细胞的数量会增加，正如其在微生物生长培养基中进行的那样。如果该病原体对抗微生物剂敏感，则该病原体无法复制、更小程度地复制或示出指示抗微生物剂的有效性的形态异常或其它异常。最终，在各种等分试样中评估病原体细胞的复制以确定哪种抗微生物剂是有效的。将一组病原体对一系列抗微生物剂的抗微生物剂敏感性/耐药性结果称为其抗微生物剂敏感性特性。

用于抗微生物剂敏感性测试的常规方法和本发明的方法遵循以上步骤，但是本发明的方法在若干小时内确定了病原体的抗微生物剂敏感性特性，而常规方法需要若干天。使用本发明的方法的快速抗微生物剂敏感性测试结果产生于新方法直接测试患者样本的能力，而无需耗时的基于培养的预富集生长以实现高浓度的纯细胞。该富集和纯化最常见地在培养皿上使用集落纯化进行。

对于常规方法，首先使用生化、微生物、核酸方法或基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)对在集落纯化之后回收的细胞进行鉴定。一旦知道病原体物种的身份，就可以选择适当的抗微生物剂和浓度，该适当的抗微生物剂和浓度适于确定该物种的病原体的抗微生物剂敏感性特性。

本发明的系统和方法的若干新颖方面能够使其快速递送直接来自患者样本的抗微生物剂敏感性结果。

首先，患者样本通常含有的细胞比传统抗微生物剂敏感性测试所需的细胞少几个数量级。与当前培养-预富集依赖性方法相比，本发明的方法可以通过使用非放大数字成像进行敏感单细胞计数来枚举少量的病原体细胞。此外，因为该方法枚举少量单独细胞，因此该方法可以非常迅速地-仅在几代细菌中-确定含有抗微生物剂和生长培养基的等分试样中的细胞数量是否增加。

其次，患者样本含有样品基质和与传染性病原体不相关的共生微生物。常规方法的指南(如来自临床实验室标准研究所(Clinical Laboratories Standards Institute，CLSI)或欧洲抗微生物剂敏感性测试委员会(European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing，ECAST)要求由集落在培养皿中在基于琼脂的生长培养基上克隆生长产生的经过纯化的培养细胞。这些细胞仅含有单个微生物物种且没有样品基质。

如上所述，必须知道病原体物种的身份以便正确解释抗微生物剂敏感性测试结果以得出有效的临床治疗选项。这是为什么常规和最新兴的抗微生物剂敏感性测试方法需要细胞的纯培养物的潜在的关键原因。

如上所述，为了确定抗微生物剂敏感性特性，常规的和最新兴的方法评估不同浓度下的不同抗微生物剂对靶病原体生长的影响。为什么这些方法需要所鉴定的纯细胞群来解释抗微生物剂敏感性测试结果的原因是这些方法使用非特异性方法(例如，光散射或显微镜检查)来评估含有抗微生物剂的等分试样的生长。考虑到如果存在多于一个物种的情况，例如为人微生物组的一部分的正常微生物的病原体和物种-这是大多数主要患者样本的情况。如果在含有抗微生物剂的等分试样中观察到生长，则使用用于检测生长的一般方法将不可能判定致病病原体或共生物种中的一种或多种是否具有耐药性和生长能力。

与常规方法和需要经过纯化的病原体细胞的其它方法相比，因为这些方法使用非特异性方法来检测病原体是否在存在抗微生物剂的情况下生长，本发明的方法使用病原体特异性检测来评估在存在各种抗微生物剂的情况下病原体的生长。因为在温育步骤之后仅枚举了致病病原体细胞(没有枚举任何共生微生物)，因此本发明的方法可以用于直接确定含有一种或多种共生微生物物种的非灭菌原始样本中的抗微生物剂敏感性。

用于病原体鉴定的本发明的系统和方法可以用于确定样本是否含有足够数量的怀疑引起感染的病原体物种的细胞。

用于抗微生物剂敏感性测试的本发明的系统和方法可以用于确定一种或多种抗微生物剂中的哪种抗微生物剂可以预防怀疑引起感染的病原体在患者样本中的正常细胞复制。这种抗微生物剂可以潜在地用于有效治疗患者的感染。

在用于抗微生物剂敏感性测试的本发明的方法的优选实施例中，将样本分到含有营养生长培养基的单独部分中以促进微生物细胞复制或生长。所述部分中的一个或多个部分可以用作参考或基线部分，在促进生长的温度下温育之前，通过本发明的方法对该参考或基线部分直接进行处理和分析以确定病原体细胞的数量和质量。

可以在促进病原体细胞生长的温度下温育所述部分中的一个或多个部分以确定这些病原体细胞是否存活。可以温育所述部分中的各自另外含有在特定浓度下的一种或多种抗微生物剂的其它部分以确定抗微生物剂对病原体细胞复制的影响。

本发明的系统和方法然后用于分析经过温育的部分中的病原体细胞数量和质量并将这些结果与未经温育的参考部分中的病原体细胞的数量和质量进行比较。如果病原体细胞在含有特定抗微生物剂的部分中正常复制的能力显著受损，则病原体被分析软件评分为对该部分中的一定浓度下的抗微生物剂敏感。可替代地，如果该部分中的正常生长未显著受损，则病原体被分析软件评分为对该部分中的一定浓度下的抗微生物剂不敏感。

本发明的系统和方法包含评估标准，通过该评估标准评估细胞复制以确定含有一种或多种抗微生物剂的部分中的病原体或微生物靶标的抗微生物剂敏感性或耐药性。这些标准可以确定参数的特定组合，这些参数包含但不限于靶微生物的物种、样本类型、抗微生物剂、生长培养基组成、温度和温育时间。

该评估标准可以优选地通过与用于抗微生物剂敏感性测试的接受的参考方法相关凭经验确定。一种标准参考方法是肉汤微稀释(BMD)，一种在其它地方(参见Patel,2015,M07-A10,CLSI 35(2)，其通过引用并入)完整描述并被本领域技术人员所熟知的方法。肉汤微稀释是一种方法，通过该方法在标准条件下评估微生物菌株对抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。在所限定的浓度下将靶微生物的经过纯化的细胞添加到含有各种抗微生物剂的系列2倍稀释液的所限定的营养生长培养基的一系列部分或等分试样中。在所限定的生长温育时间段之后，在视觉评估各个部分的浊度之后确定微生物菌株的抗微生物剂敏感性。与不含抗微生物剂的部分相比，视觉上不存在浊度或浊度显著降低的抗微生物剂的最低浓度被称为最小抑制浓度(MIC)。确定抗微生物剂敏感性测试的标准的机构(例如，CLSI或EUCAST)已经使特定微生物物种和特定抗微生物剂的组合的MIC值与临床实践中的抗微生物剂的特定治疗剂量的功效相关。MIC值通常被分为以下分类范围：敏感、中等耐药性和耐药性。这些被称为SIR或分类抗微生物剂敏感性测试结果。以此方式，特定抗微生物剂的特定物种的特定菌株的MIC可以被报告为SIR或分类结果。用于确定的其它标准方法包含-Bauer或纸片扩散和琼脂稀释。这些方法描述于CLSI和EUCAST文件中并且被本领域技术人员所熟知。

通过使用本发明评估各种浓度的特定抗微生物剂中的特定物种的各种菌株的细胞复制的程度和质量来凭经验确定用于使用本发明的方法和系统确定抗微生物剂敏感性测试结果的评估标准，这类似于肉汤微稀释方法。用于将抗微生物剂敏感性测试结果(通常为MIC或SIR分类结果)分配到特定抗微生物剂的特定物种的菌株的标准被选择成使得使用本发明使各种菌株的结果与参考肉汤微稀释方法的结果一致地相关。例如，可以被本发明的系统和方法使用来确定抗微生物剂敏感性测试结果的标准是在存在各种浓度的某种抗微生物剂的情况下在某一温育时间段内评估某一物种的靶微生物在某一温度下在营养生长培养基中的生长倍数(许多靶细胞的增加倍数)。在此情况下，用于确定用于评估抗微生物剂敏感性的本发明的系统和方法的有效标准的经验研究将评估各种浓度的抗微生物剂中的物种的各个菌株的生长倍数。生长倍数的阈值可以被选择成使得如果使用本发明测量的菌株的生长倍数与在存在相同抗微生物剂的情况下生长的相同菌株的肉汤微稀释的结果相关。使用靶物种的各种菌株凭经验选择阈值，使得如果菌株的生长倍数超过阈值，则该菌株被本发明分类为在存在抗微生物剂的情况下在该浓度下显著生长。如果菌株的生长倍数小于生长倍数阈值，则该菌株被本发明分类为未显著生长。因此，在此实例中，生长倍数的阈值被选择成使得参考肉汤微稀释方法和本发明的方法两者返回关于各种菌株是否在各种抗微生物剂浓度下被确定为显著生长或未显著生长的相同结果。

本发明的系统和方法也可以使用其它评估标准来确定抗微生物剂敏感性测试结果。例如，对反映由在抗微生物剂中温育引起的正常细胞复制扰动的形态学特性进行评估。作为另一个实例，与不含抗生素的部分相比，可以在温育步骤之后评估含有抗微生物剂的部分中的生长抑制的程度。也可以协同使用多种评估标准来确定抗微生物剂在特定浓度下是否引起靶细胞的正常细胞复制显著扰动。

因此，本发明的方法可以直接从患者样本中检测感染，鉴定感染性病原体并确定哪些抗微生物剂对治疗将是有效的。

在不需要用户制备任何样本的情况下，将如尿液、粪便、呼吸、伤口、脑脊髓液或血液等患者样本优选地直接转移到分析盒中以进行微生物分析。因此，优选地不需要用户执行用于分离大量纯病原体细胞的集落纯化、核酸扩增或其它时间或劳动密集型样本制备方案。在不进行任何预富集或清除的情况下，将样本优选地直接装载到测试盒中以例如去除生物碎屑。盒含有用于本公开的微生物定量和鉴定以及抗微生物剂敏感性测试的试剂。步骤(如对样本中的微生物进行物种特异性标记和成像)全部发生在盒上，样本已经直接装载到该盒中。这些盒包含如荧光探针等靶细胞特异性标记，这些靶细胞特异性标记用于通过本发明的系统和方法鉴定样本中的微生物。为了鉴定微生物，分析仪优选地包含用于对盒中的经过标记的微生物进行成像的成像子系统。

与需要冗长培养步骤的常规方法相比，使用本发明的系统和方法快速检测感染、鉴定病原体和确定抗微生物剂敏感性提供递送可动作结果以更快地引导有效治疗患者感染的潜力。本发明的系统和方法可以向临床医生提供在约30分钟内检测感染并鉴定感染性病原体并且通过简单地将患者样本直接转移到分析盒中并将盒装载到仪器中在若干个小时内确定抗微生物剂敏感性测试结果的能力。

本发明的实施例包含直接从患者样本中进行微生物检测并鉴定有效治疗。

在某些方面，本公开提供了一种用于抗微生物剂敏感性测试的方法。该方法包含：获得多种微生物样本；将该样本分配到孔中，其中这些孔中的至少一些孔包含不同药剂或不同浓度的一种或多种药剂；温育这些孔中的该样本以允许响应于该不同药剂或不同浓度的药剂的差异生长；以及对每个孔中的特异性物种的单独细胞进行计数以鉴定抑制该特异性物种生长的药剂或药剂的浓度。该方法可以包含对不含抗微生物剂的对照孔中的细胞进行计数(例如，在介于30摄氏度与40摄氏度之间的所限定的温度下温育对照孔持续介于1-12小时之间的限定时间段之后)。该方法可以包含将在每个孔中计数的细胞数量与来自该对照孔的计数进行比较以确定在暴露于该不同药剂或不同浓度的药剂时微生物的活力。该温育步骤可以包含以物种特异性方法对这些微生物进行荧光标记，并且该计数步骤可以包含对每个孔进行成像并且对图像中的荧光斑点进行计数。该标记可以使用靶特异性荧光团标记的核酸或核酸类似物探针，并且该计数可以依赖于荧光原位杂交。优选地，这些步骤不包含核酸扩增。该温育步骤可以持续小于约一小时并且可以在低于约40摄氏度的温度下在生长培养基中进行。

在某些实施例中，该分配、温育和计数步骤使用包含这些孔的盒进行。该方法可以包含将该样本的一部分转移到该盒中并且将该盒装载到分析仪中。该盒可以包含微生物结合性磁珠，并且该分析仪可以使用磁体将这些微生物与该样本的其它部分分离并且使用成像子系统执行该计数步骤。在一些实施例中，该分析仪使用气动子系统在该盒内执行该分配步骤——这些孔位于该盒内并且预装载有不同药剂或不同浓度的药剂——并且在该分配步骤和该温育步骤之后，该分析仪将这些孔中的内含物转移到对应的试剂孔以将其中经过温育的样本暴露于这些微生物结合性磁珠和物种特异性可检测标记。该分析仪可以使用磁体将这些微生物结合性磁珠和所结合的单独微生物拉到该盒内的检测表面。

在一些实施例中，该磁体拉动这些微生物结合性磁珠穿过从该检测表面排除未经结合的可检测标记的染料垫。该分析仪可以使用转盘和/或机械盒输送工具将该盒转移到成像子系统以执行该计数步骤。在一些实施例中，这些物种特异性可检测标记包含荧光核酸探针，这些荧光核酸探针与特异性微生物物种的靶核酸杂交。该温育和计数步骤可以实现基本上在生理温度下在该分析仪内的荧光原位杂交(FISH)分析。

鉴定抑制该微生物生长的该抗微生物剂可以涉及将该经过温育的样本中的复合物的数量与未经温育的样本中的复合物的数量进行比较。在该差异生长之后，该分析仪可以使用该盒对这些单独微生物执行物种特异性计数。

在某些实施例中，这些孔位于盒内，并且该方法包含将该样本中的一些样本转移到该盒中，并且将该盒装载到该分析仪中。该分析仪操纵该盒以执行该分配、温育和计数步骤。在该转移步骤之前，该样本不需要用户执行任何化学或分子样品制备技术。该转移步骤可以通过将该样本中的一些样本从收集器皿吸移到该盒上的样品孔中进行。

在一些方面，本公开提供了一种微生物分析方法。该方法包含：获得包括微生物的样本；在不使用任何集落或细胞纯化或培养步骤的情况下，将该样本的一部分转移到孔中，该孔包括物种特异性可检测标记和微生物结合性磁珠；使用磁体收集成像表面上的这些珠；以及对该成像表面上的这些可检测标记进行成像以由此确定该样本的该一部分中的该物种的细胞的存在。在该转移步骤之前，该样本不需要用户执行任何化学或分子样品制备技术。该方法可以进一步包含：使用该孔中的这些物种特异性可检测标记来标记靶微生物；以及将微生物与这些微生物结合性磁珠结合，其中观察步骤包括在不洗掉未经结合的可检测标记的情况下对经过标记的结合磁体的细胞进行成像。该方法可以进一步包含对这些经过标记的结合磁体的细胞中的单独细胞进行计数。

在某些实施例中，该孔设置在盒内，并且该收集和成像步骤在这些珠和这些细胞位于该盒内时发生。该方法可以包含将该盒装载到执行该收集和成像步骤的分析仪中。该分析仪可以包含：多个子系统，该多个子系统至少包含用于对经过标记的微生物进行成像的成像子系统；以及转盘，该转盘能操作以在子系统之间运输测试盒。

该转移步骤可以包含将该样本转移到该盒的收纳孔中，在此之后，该分析仪可以将该样本分配到该盒内的多个分配孔中(该孔是这些分配孔中的一个分配孔)。这些物种特异性可检测标记可以包含荧光标记的寡核苷酸探针，该荧光标记的寡核苷酸探针特异性地与该物种的这些细胞的核酸杂交。该成像步骤可以包含在恒定生理温度下在该盒内进行荧光原位杂交(FISH)分析。

在一些实施例中，收集该成像表面上的这些珠包括在染料垫从该成像表面排除未经结合的可检测标记时磁性地拉动这些珠穿过该孔中的该染料垫。优选地，在约30分钟的该转移步骤内确定该物种的这些细胞存在于该样本中。

在某些方面，本发明提供了鉴定微生物。在无需样本制备步骤的情况下，直接从患者样本中实现微生物鉴定，这些患者样本如全血、血浆、血清、尿液、痰液、唾液、粪便、脑脊髓液、羊水、腹膜液、脓汁、淋巴液、阴道分泌物、鼻分泌物、呕吐物、汗液和组织。例如，该方法可以涉及将尿液样本直接转移到分析盒装置中以进行微生物鉴定。在一些实施例中，该方法包含将患者样本直接转移到分析盒的样品孔中以及操作该盒以便以物种特异性方式标记微生物、对经过标记的微生物进行成像并且鉴定经过标记的微生物。标记微生物包含将该样本暴露于物种特异性标记。这些标记可以包括靶特异性磁性标签和可检测标记。这些可检测标记可以包括物种特异性荧光探针。该探针可以仅与微生物物种的核酸互补。当暴露于特异性微生物物种时，该探针仅与允许检测微生物物种的物种杂交。如此，可以鉴定样本中的多个微生物物种，并且可以在单个分析盒中测试对不同抗微生物剂或其它治疗的敏感性。在一些实施例中，操作该盒可以包含将该盒装载到仪器中以鉴定该盒内的患者样本中的微生物。本发明提供了分析盒和仪器，仪器能够在该盒内直接接受并处理患者样本以鉴定微生物和/或确定治疗敏感性和功效。

本发明的系统和方法包含仪器或分析仪，该仪器或分析仪可以用于与分析盒相互作用以执行本发明的方法。该仪器可以包含用于执行本发明的方法的多个子系统。该分析盒可以装载到该仪器中，该仪器具有用于处理该盒内的样本的多个子系统。在优选的实施例中，该多个子系统中的一个子系统可以是用于对该盒内的经过标记的微生物进行成像的成像子系统。该仪器的子系统还可以包含气动子系统、磁性子系统和废物子系统。该仪器还可以包含用于移动和操纵该仪器内的盒的转盘、机械盒输送工具和任务调度器。该仪器能够在恒定温度下执行所有处理步骤。

包含仪器和装置的本发明的系统和方法可以执行广泛范围的诊断功能，这些诊断功能包含：检测感染；检测、鉴定和定量所有类型的病原体细胞；确定抗微生物剂敏感性；检测和定量毒素、病毒和生物标志物(包含宿主应答因子)；以及检测和定量诊断信息性人或宿主细胞。本发明的系统和方法能够单独地或组合地对单个装置(例如，分析盒)中的单个样本同时执行此类诊断功能。本发明的系统和方法包含随机存取处理的能力，使得可以同时在单个仪器上处理执行不同类型的诊断测试(例如，针对泌尿道感染、血液感染和呼吸道感染)的多个此类装置。如此，本文所描述的仪器和盒提供此类功能并且可以被操纵以相应地处理装置内的样本。

本发明的方法和系统可以包含通过仪器内的转盘将分析盒运输到仪器的多个子系统。在本发明的一些实施例中，仪器内的机械输送机构在仪器的转盘与各个子系统之间转移分析盒中的每个分析盒。机械盒输送工具施加推力以将盒转移到转盘上并从该转盘上移除该盒。在一些实施例中，该仪器包含任务调度器，该任务调度器用于管理分析盒中的每个分析盒在多个子系统中的运输和转移。

在一些实施例中，可以由仪器内的任务调度器执行管理分析盒中的每个分析盒在仪器内的移动，包含每个盒在子系统中花费的时间。该方法可以包含根据需要储备各个子系统针对这些盒中的每个盒的时间。该方法还可以包含操作机器盒输送工具以将该盒从子系统中的一个子系统转移到转盘并使转盘旋转以将该盒定位成邻近子系统中的另一个子系统。在本发明的一些实施例中，任务调度器可以通过鉴定盒的内含物来管理分析盒的移动(即待执行的分析的步骤/参数)。盒的内含物和所需处理可以与盒上的标签相关联。在本发明的一些实施例中，分析盒中的每个分析盒包含可由仪器读取的标签。该仪器可以通过条形码分析仪读取标签并且将该标签与任务调度器执行的特定指令集相关联。该标签可以是条形码并且对仪器中的样本可以是特定的/唯一的。

本发明的系统和方法包含气动地将样本分配在盒内。在一些实施例中，方法包含将样本从样品孔分配到该盒内的多个孔。该方法进一步涉及通过操作该盒内的多个阀来控制样本的分配。在本发明的某些实施例中，方法包含将盒运输到仪器的气动子系统以及操作该子系统以将样本从样品孔分配到该盒内的多个孔。

本发明的系统和方法用于标记微生物。标记微生物的方法包含将样本直接装载到分析盒中，该分析盒含有特定于根据本发明的方法处理样本的试剂。这些试剂可以包含例如物种特异性标记、生长培养基、抗微生物剂和染料。这些试剂可以呈液体形式或优选地冻干，并且可以装载在分析盒(例如，测试装置)内的某些孔中。这些试剂可以对测试具有特异性，如此，该盒可以是测试特异性的。本发明的方法包含通过将样本暴露于预装载在盒内的物种特异性磁性标签和可检测标记来标记微生物。该样本可以通过气动分配暴露于该盒的孔内的磁性标签和可检测标记。可检测标记可以包含结合靶标的荧光寡核苷酸或抗体探针、特异性和非特异性配体、凝集素、染色剂和染料。在某些实施例中，磁性标签与该可检测标记组合使用以在磁性选择靶微生物并对这些靶微生物进行成像之前与这些靶微生物结合。在一些实施例中，可检测标记可以是与微生物物种的核酸特异性杂交的荧光探针。在优选的实施例中，可检测标记是与特异性微生物物种杂交的荧光rRNA靶向荧光寡核苷酸探针。在某些实施例中，标记和成像方法包含用于标记分子靶标的荧光原位杂交(FISH)和磁性选择经过标记的分子靶标以将经过标记的靶标沉积在检测表面上以进行成像和分析。在某些实施例中，标记和磁性选择步骤在恒定温度下发生。在一些优选的实施例中，这些步骤全部在介于约36摄氏度与39摄氏度之间的温度下执行。

在本发明的某些实施例中，方法包含将盒运输到仪器的磁性子系统以及操作该磁性子系统以将经过标记的微生物吸引到该盒内的检测表面穿过不透明、致密、水性染料垫层。染料垫层可以被设计成将未经结合的荧光标记和样本基质与检测表面光学隔离。这可以消除对洗涤步骤的需求以去除尚未与靶细胞结合的荧光标记、增加信噪比并最小化或消除对样品制备步骤的需求。该方法包含在达到检测表面之前吸引经过标记的微生物穿过染料垫层。

本发明的系统和方法提供了对样本的成像分析。在盒内对样本直接进行处理并成像以确定存在于样本中的微生物的身份。具体地，对盒的检测表面进行成像，并且成像分析鉴定样本中的微生物。鉴定微生物的方法还可以包含对微生物进行定量。在本发明的某些实施例中，方法包含通过操作转盘并操作子系统来将盒运输到仪器的成像子系统以对盒的检测表面进行成像和分析。数字非放大技术可以用于鉴定和定量微生物。

还可以在存在抗微生物剂或各种类型的其它治疗的情况下在成像之前在各种浓度下温育样本。温育可以在相同分析盒或不同分析盒中发生。无论如何，可以在恒定温度下处理如本文所述经过处理的样本，包含本文所描述的温育步骤。恒定温度可以是哺乳动物的生理温度。生理温度可以是低于40摄氏度的温度。在优选的实施例中，温度介于36摄氏度与39摄氏度之间。

本发明的系统和方法可以用于鉴定微生物并测试样本中的微生物的抗微生物剂敏感性。可以在单独的分析盒中或在相同的盒内执行本发明的方法。在本发明的优选实施例中，分析盒直接接收样本并且在内部将样本分配到单独的部分中，其中这些部分中的一个或多个部分可以暴露于一个或多个物种特异性可检测标记。对这些部分进行处理和成像以鉴定这些部分中的每个部分中的微生物。在某些实施例中，可以在相同装置中对相同样本执行鉴定和抗微生物剂敏感性测试。

本发明的方法包含对多种微生物样本进行抗微生物剂敏感性测试。方法包含将来自受试者的多种微生物样本分配到多个分隔中。这些分隔中的一个或多个分隔可以含有不同的抗微生物剂，并且可以在存在不同抗微生物剂的情况下进行温育以确定经过温育的部分中的差异生长。这些分隔中的一个或多个分隔可以不暴露于抗微生物剂以提供用于确定其它分隔中的变化的基线。还可以在存在生长培养基的情况下温育这些分隔。将这些分隔暴露于物种特异性可检测标记。对这些分隔进行成像以鉴定和定量这些分隔中的每个分隔中的微生物。分析这些分隔中的每个分隔中的多种微生物鉴定每种抗微生物剂减少或甚至预防病原体药剂生长的有效性。通过对这些分隔中的每个分隔中的多种微生物进行计数和比较来确定治疗的有效性。在一些实施例中，方法包含将经过温育的分隔中的多种微生物与基线分隔中的多种微生物进行比较。在某些方面，可以通过将样本直接沉积到分析盒中来执行抗微生物剂敏感性测试方法。分析盒将样本分配到盒内的多个分隔中以执行抗微生物剂敏感性测试。在将盒引入到仪器中数小时内并且优选地约4小时内执行抗微生物剂敏感性测试方法。

在某些方面，本发明提供了用于鉴定和确定样本中的微生物的抗微生物剂敏感性的系统。优选的系统包含：分析盒，该分析盒可操作以接收患者样本；以及仪器，该仪器可操作以接收分析盒。在某些实施例中，用于鉴定、抗微生物剂敏感性测试的分析盒设置有、预装载有试剂，如对各种微生物具有特异性的物种特异性标记、抗微生物剂和生长培养基。在一些实施例中，分析盒含有该盒内的多个孔(或分隔)。该盒内的多个孔可以至少包含样品孔、分配孔和成像孔。在一些实施例中，本发明的系统将样本从样品孔分配到该盒内的多个孔。在某些方面，将样本从样品孔分配到预装载有抗微生物剂和生长培养基的多个分配孔以进行温育。然后可以将经过温育的样本从分配孔转移到试剂孔以将经过温育的样本暴露于物种特异性标记以形成复合物。

用户可以选择适当的专用盒并且直接将患者样本转移到其中以执行特定诊断测试和分析。该盒可以加载到仪器中以根据适用的分析处理该样本。该仪器可以通过扫描该盒上的标签(如条形码)来鉴定所需的处理步骤，其中标签对待执行的分析是特定的。

使用本发明的系统和方法获得的结果可以用于通知治疗决策。方法可以包含向患者施用鉴定为有效减少鉴定为病原体药剂的微生物的生长或活力的治疗。

附图说明

图1图解了抗微生物剂敏感性测试方法。

图2示出了盒。

图3图解了本发明的另一个示例性方法的步骤。

图4示出了仪器。

图5是仪器内的组件的顶视图。

图6是用于执行抗微生物剂敏感性测试的工作流的实例。

图7示出将样本转移到盒的样品孔中。

图8示出了装载到装载盘的盒。

图9示出了所计数的单独大肠杆菌(E.coli)细胞的数量。

图10示出了所计数的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)细胞的数量。

图11给出了测试结果。

图12示出了另一个测试的结果。

图13描绘了生长结果。

图14示出了所示大肠杆菌ATCC 19138的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为89CFU/测定，并且LoD为284CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即9,467CFU/ml。

图15示出了所示铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC 9721的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为104CFU/测定，并且LoD为506CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即16,867CFU/ml。

图16示出了所示肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC 700603的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为109CFU/测定，并且LoD为319CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即10,633CFU/ml。

图17是在该实例中使用的探针序列的表。

图18示出针对输入细胞浓度为大约600个CFU/测定(浅灰色条)和3000个CFU/测定(深灰色条)的11个大肠杆菌菌株绘制的平均信号(n＝3)。在图的左侧示出了源自无细胞对照(空白)的信号。误差条表示1标准偏差。

图19示出针对11个大肠杆菌菌株中的每个菌株示出的检测到的(如通过板计数所确定的)输入细胞的百分比。每个条表示6种确定方式的平均值，3种来自两个不同输入细胞水平中的每一个。细胞检测百分比计算为[(测定信号-背景信号)/输入细胞]

图20是给出4种另外的细菌的包容性结果的表。

图21是给出在该实例中使用的探针序列的表。

图22是示出对检测的大肠杆菌的特异性进行测试的挑战细菌的表。

图23是示出在该实例中使用的探针序列的表。

图24示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种挑战细菌。

图25示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种另外的挑战细菌。

图26是示出使用CCD成像方法和4种不同荧光团(每个荧光团针对每种细菌)在4个不同颜色通道中拍摄的相同视场的图像。可以在单个孔中检测到所有四种细菌。

图27是在该实例4中使用的探针序列的表。

图28示出了在存在呋喃妥因(Nitrofurantoin)的情况下的BIUR0017。

图29示出了在存在头孢唑啉的情况下的BIUR047。

图30示出了在存在环丙沙星的情况下的BIUR057。

图31示出了在存在甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(Trimethoprim/Sulfamethoxazole)的情况下的BIUR052。

图32是在该实例6中使用的探针序列的表。

图33是正常细菌(左图)与丝状细菌(右图)的视觉比较。

图34示出了在0.25μg/mL下调用通过本发明中描述的新颖快速AST方法产生的MIC。

图35是在该实例中测试的所有细菌和抗生素的AST结果的表。

图36是在该实例7中使用的探针序列的表。

图37示出了MulitPath

图38是示出被测的抗生素浓度的表。

图39是在该实例8中使用的寡核苷酸的表。

图40示出了BIUR0067结果。

图41示出了BIUR0084结果。

图42是所有生物体、抗生素和接种水平的总体基本一致性和分类一致性的汇总。

图43示出了与常规BMD方法相比，使用在此所描述的新方法产生的各种接种水平的MIC结果。

图44是产生的各种接种水平的MIC结果的汇总。

图45是在该实例9中使用的探针序列的表。

图46示出在存在金黄色葡萄球菌的不同接种物的情况下与上文所述的方法保持一致的大肠杆菌的MIC，而BMD的MIC随着金黄色葡萄球菌的增加而增加。

图47示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性的汇总。

图48示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii))的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。

图49示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、极小棒状杆菌(Corynebacteriumminutissimum))的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。

图50示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(肺炎克雷伯菌)的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。

图51是在该实例10中使用的探针序列的表。

图52是在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯的情况下，对用于确定大肠杆菌的亚胺培南(Imipenem)MIC的新颖快速AST和BMD方法的比较。

图53示出了在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯的不同接种物的情况下与上文所述的方法保持一致的大肠杆菌的MIC，而标准BMD现在也是如此。

图54是在该实例11中使用的探针序列的表。

图55示出了15份尿液的基本一致性。

图56示出了15份掺有培养阴性临床UTI尿液样品中的每份与标准BMD的100％基本一致性和100％分类一致性。*头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑。

图57示出了与标准BMD方法(“符合CLSI”)相比，掺有如通过新颖AST方法所确定的大肠杆菌的15份尿液样品的MIC。浓度以μg/ml为单位。

图58是在该实例12中使用的探针序列的表。

图59示出了在该实例中使用的环丙沙星敏感性菌株和环丙沙星耐药性菌株。

图60是在该实例13中使用的探针序列表的前半部分。

图61是在该实例13中使用的探针序列表的后半部分。

图62示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的基本一致性。如下文所示，上文所描述的AST方法产生了与标准BMD 100％的基本一致性。

图63示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的分类一致性。如下文所示，上文所描述的AST方法产生了与标准BMD 100％的分类一致性。

图64示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。

图65示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。

图66示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。

图67是示出检测到靶病原体而未检测到其它非靶病原体的表“实例14的表A”。

图68是示出在该实例14中使用的探针序列的表“实例14的表B”。

具体实施方式

本发明提供了用于在不进行样本制备的情况下对微生物进行快速自动化分析的系统和方法。本发明的系统和方法提供直接从患者样本进行微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试(AST)。可以在存在各种抗微生物剂的情况下分析样本中的微生物的差异生长。样本操纵、温育、处理和分析步骤全部在单个分析盒内执行。可以在约三十分钟内完成鉴定分析，并且可以在约四个半小时内完成抗微生物剂敏感性测试。本发明的系统和方法使用物种特异性标记和非放大数字成像和图像分析来鉴定靶标(如微生物)以准确且快速地鉴定和定量样本中的靶标。本发明的系统和方法优选地对尚未处理的样本进行微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试分析以纯化靶病原体细胞并且优选地无需用户手动制备样本。使用户与样本相互作用的需求最小化，相比于常规技术所需要的很多天，本发明的系统和方法分别在几分钟和几小时内直接从患者样本提供微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试分析结果。分析盒可以由仪器自动处理以执行鉴定微生物和执行抗微生物剂敏感性测试分析必需的步骤中的每个步骤。

图1图解了抗微生物剂敏感性测试方法101。方法101包含获得多种微生物样本105。在不进行任何样品制备、集落纯化或其它方法的情况下，将原始样本分配109到孔中。这些孔中的至少一些孔包含不同药剂或不同浓度的一种或多种药剂。方法101包含温育115这些孔中的该样本以允许响应于该不同药剂或不同浓度的药剂的差异生长。最后，对每个孔中的特异性物种的单独细胞进行计数121以鉴定抑制特异性物种生长的药剂或药剂的浓度。对抗微生物剂敏感性测试方法重要的是：(i)无细胞/集落纯化；(ii)多种微生物样品；(iii)差异生长；(iv)物种特异性检测；以及(v)对单独细胞的计数。不涉及细胞或集落纯化也意指，样本(血液或另一种体液)可以直接输入到方法中——将原始样本分配109到孔中并用不同药剂或不同浓度的一种或多种药剂进行温育115。方法101对多种微生物样品无关紧要并且将提供物种特异性结果，无论是否存在其它微生物。通过物种特异性探针(如与特异性物种的rRNA杂交的荧光标记的寡核苷酸)操作物种特异性检测。差异生长意指特异性物种的细胞将在不同孔中差异生长，取决于不同抗微生物剂的存在或其浓度。最后，在标记之后，本公开的方法和装置可用于在进行放大的情况下对单独细胞进行计数。温育115步骤可以包含以物种特异性方法对这些微生物进行荧光标记，并且计数121步骤可以包含对每个孔进行成像并且对图像中的荧光斑点进行计数。该标记可以使用靶特异性荧光团标记的核酸或核酸类似物探针，并且该计数可以依赖于荧光原位杂交。值得注意的是，这些步骤不需要核酸萃取、纯化或扩增。在某些实施例中，分配109、温育115和计数121步骤在包含这些孔的盒内进行。

图2示出了示例性盒201(例如，分析盒、测试装置)。盒201包含样品孔203，该样品孔通过通道215连接到分配孔205。每个分配孔可通过通道连接到对应的试剂孔209穿过滑动阀207。试剂孔209可以包含一种或任何数量的试剂，该一种或任何数量的试剂可以存在于颗粒241中，这些颗粒可以为例如冻干珠。每个试剂孔209可以流体地连接到对应的成像孔211。成像孔211中的一个或多个成像孔可以包含染料垫215。盒任选地包含稀释剂储器221，当按下按钮227时，该稀释剂储器使稀释剂(例如，生长培养基，如胰蛋白酶大豆肉汤或盐水)流到分配孔孔205中。盒可以通常根据长度l、高度h和宽度w尺寸(例如，l为约6cm，h为约4cm并且2为约2cm)进行描述。分析盒201可手动或结合仪器(例如，分析仪)操作以将样本暴露于例如物种特异性可检测标记和磁性标签，这些物种特异性可检测标记和磁性标签一起可以与样本中的靶标形成三元复合物以进行成像。例如，物种特异性可检测标记可以是可通过本领域已知的成像检测的任何合适的标记。在优选的实施例中，可检测标记是与微生物物种所独有的核糖体RNA序列互补的荧光团标记的寡核苷酸探针。可以通过使用分析盒201上的磁场将复合物拉动到盒201内的表面来将复合物与未经结合的标记分离。然后可以对微生物复合物进行成像，并且可以对图像进行分析(手动或通过计算装置)以鉴定存在于样本中的微生物。可以生成报告。该报告可以给出例如微生物靶标和/或图像的身份。该报告可以包含定性结果(“检测到的感染”)。该报告可以指示结果高于还是低于一组病原体靶标的阈值水平。报告可以给出抗微生物剂敏感性曲线。在各个实施例中，如微生物鉴定实施例，分析盒201可以预装载有一个或多个物种特异性标记，使得已经怀疑样本含有一种或多种微生物的用户可以选择预包装的分析盒进行微生物鉴定。在抗微生物剂敏感性测试实施例中，样本105可以分配到盒201内的部分中，其中每个部分可以含有不同试剂，如不同抗微生物剂或不同浓度的一种或多种抗微生物剂。

可检测标记可以包含荧光分子、放射性同位素、质谱的质量标签或化学发光分子。可检测标记可以包括物种特异性部分以与特异性微生物物种优先结合。物种特异性结合分子可以包含例如靶特异性分子或抗原的抗体或与物种特异性核酸序列互补的寡核苷酸或多核苷酸探针。在优选的实施例中，对微生物的可检测标记包括荧光原位杂交(FISH)。FISH分析使用包括核酸(或核酸类似物)探针部分和荧光团探针部分的荧光探针来通过与物种特异性核酸序列重新关联而结合，使得微生物物种然后可以被光学检测到。例如，可以使用靶向物种特异性16S rRNA的探针来选择性地标记并检测微生物。参见Volkhard等人,2000,荧光原位杂交允许快速鉴定血液培养物中的微生物(Fluorescent In SituHybridization Allows Rapid Identification of Microorganisms in BloodCultures),《临床微生物学杂志(J Clin Microbiol)》,38(2):830-838，其通过引用并入。在优选的实施例中，可检测标记是与微生物物种所独有的核糖体RNA互补的荧光标记的探针寡核苷酸。

根据本领域已知的方法设计物种特异性探针。例如，可以通过使用如ARB、PRIMROSE和mathFISH等软件以及如probeBASE、RDP和SILVA等可公开获得的数据库来设计物种特异性探针。涉及鉴定样本中的微生物的本发明的实施例可以包含许多可检测标记(如不同的物种特异性荧光探针)以独立地鉴定单个样本中的多个不同微生物物种。不同荧光探针可以包括不同的核酸探针部分，这些不同的核酸探针部分被设计成使得在测定重新关联的条件下，荧光探针的核酸探针部分优选地与不同微生物物种的物种特异性核酸序列重新关联。

不同荧光探针上的荧光团可以具有不同光子信号，使得测定中不同微生物物种的荧光信号可以由其不同光子信号区分。用于区分多种不同光子信号的成像方法是熟悉本领域的技术人员已知的。例如，可以使用对应于不同荧光团的动作光谱的不同对的激发和发射滤光片来获取多个成像。因此，可以测试在单个处理和成像孔中单个样本部分的多个特异性靶细胞或微生物的存在。磁性标签可以是本领域中已知的任何磁性标签，包含顺磁性颗粒。靶特异性磁性标签可以与一类微生物(例如，仅细菌)特异性地结合。

在某些实施例中，使用FISH分析在恒定温度下进行对样本中的微生物的鉴定，其中分析不需要细胞固定、用户在分析期间添加另外的试剂并且不需要去除未经结合的荧光标记的洗涤，因此允许在约30分钟或更少时间内在开始反应与获得成像结果之间在单个盒内进行自动样本处理。

磁性标签和可检测标记优选地与存在于样本中的靶细胞形成复合物。可以将磁场施加到磁性颗粒以物理分离溶液中已经结合的可检测标记与未经结合的可检测标记，无需洗涤步骤。染料垫层(例如通过引用并入本文中的美国专利第9,643,180中所描述的染料垫层)可以与磁性颗粒和磁场结合使用以拉动微生物穿过致密、不透明、水性染料垫层并将其沉积在分析盒的孔中的检测表面上以进行成像分析。优选地选择染料垫层中的染料以吸收仪器所使用的激发和发射的光以进行成像。因此，来自染料垫层(“测定层”)上方的未经结合的可检测标记的信号不会显著干扰检测来自磁性沉积在检测表面上的经过标记的靶细胞或微生物复合物的信号。类似地，使用染料垫可以防止来自样本基质的任何自发荧光(也包含在测定层中)显著干扰检测来自所沉积的经过标记的靶细胞或微生物复合物的信号。染料垫的这些属性可以使检测微生物成为可能，而不需要用户制备样本并且也不需要从盒中去除未经结合的标记的洗涤步骤。

非放大数字成像优选地用于检测已经沉积在检测表面上的经过标记的靶细胞。在优选荧光标记的情况下，可以使用各种透镜、照明源、激发光源和滤光片。成像系统可以包含能够产生溶液中或被拉到盒的孔中的检测表面的可检测标记的靶微生物的数字图像的任何装置。成像系统可以包含在本文所描述的仪器的子系统中。成像系统可以包含例如CCD相机、CMOS相机、线扫描相机、CMOS雪崩光电二极管(APD)、光电二极管阵列、光电倍增管阵列或其它类型的数字成像检测器。成像可以在单组条件下执行，或者光源、滤光片和/或透镜可以在图像之间变化以检测不同的光学可区分的标记(例如，对应于不同微生物的不同荧光探针)。在美国专利第9,643,180号和第8,021,848号中所描述的成像技术、分析仪和仪器(这两个美国专利通过引用并入)可以允许鉴定并枚举单独细菌或其它靶细胞。

图3图解了本发明的另一个示例性方法301的步骤。可以将患者样本105(例如，多种微生物样本)直接引入107到分析盒201中并且不需要任何处理前步骤。分析盒201可手动或与仪器结合操作以将样本105分配111到分析盒201内的多个部分113(例如，分隔)中。一个或多个部分113可以不暴露于抗微生物剂或可以不进行温育。最左边路径示出未暴露于抗微生物剂和/或未温育并成像123的样本150的一部分113以在生长温育(“时间0计数”)之前产生存在于部分中的许多靶细胞。可以在存在不同抗微生物剂的情况下温育117部分113，这些不同抗微生物剂可能已经存在于分析盒201中并且可以基于怀疑或已知存在于样本105中的靶细胞或微生物进行选择。例如，可能怀疑与泌尿道感染相关的细菌物种(例如，埃希氏菌(Escherichia spp.)(例如，大肠杆菌)、克雷伯菌(Klebsiella spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)或假单胞菌(Pseudomonas spp.))存在于样本中。

样本105可以在将样本105引入107到分析盒201与温育115之间的任何点与盒201内的一定量的生长培养基混合。温育115步骤可以持续适合的时间量(如约4小时)以允许可测量样本105中的微生物的差异生长。基于样本105中待分析的微生物，可以选择生长培养基和/或抗微生物剂并将其包含在盒201中。例如，可以选择已知支持经过鉴定的微生物的生长的生长培养基以及通常用于处理经过鉴定的微生物的治疗剂或抗微生物剂。在优选实施例中，对于某个靶标，分析盒可以预装载有生长培养基和治疗剂，使得已经鉴定样本中的微生物(例如，已经确定患者感染的来源)的用户可以选择适当的预包装分析盒对经过鉴定的靶微生物进行抗微生物剂敏感性测试分析。

在温育115之后，可以将经过温育的部分117暴露于例如可以与部分中的特异性微生物形成119复合物的物种特异性磁性标签和可检测标记以进行成像123。微生物121复合物然后可以在部分中进行成像123，并且可以(手动或通过计算装置)分析127图像125以定量存在于每个部分中的微生物121的量。通过将在存在各种抗微生物剂的情况下已经温育的部分中的微生物的数量进行比较，可以确定那些药剂中的哪一种抑制生长。比较优选地包含靶细胞数量与在不进行温育的情况下已经从原始样本分配、处理和成像的“时间零计数”生长参考部分的比较。可以用分析127的结果生成报告129，并且该报告可以包含图像125和治疗推荐。

设想使用本发明的系统和方法进行测试的靶微生物和细胞包含病毒或细菌。靶微生物优选地是通常引起正在研究的特定类型的感染的靶微生物。例如，对于泌尿道感染，靶病原体可以包含炭疽杆菌(Bacillus antracis)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌或铜绿假单胞菌。

在存在细菌靶标的情况下，例如，可以在存在各种抗菌剂的情况下温育样本，并且可以分析那些药剂对样本中的靶细菌生长的效应以确定有效性。本文所描述的系统和方法可以同样应用于测量化疗剂对癌细胞的细胞毒性效应并且测量各种抗病毒剂对样本中的病毒载量的有效性。各种靶细胞和微生物可能所需的仅有变化是靶特异性结合分子(例如，细菌细胞表面特异性抗体、病毒特异性寡核苷酸探针或细胞特异性染料)、正在测试的治疗(例如，抗病毒剂、抗菌剂或癌症疗法)、温育时间以及在一些情况下在图像分析中正在分析的特性(例如，CFU定量、病毒载量或细胞数量、形态学或功能)。

盒201包含用于接收样本的入口或样品孔203、分配孔205、试剂孔209、成像孔211和用于在孔之间移动样本的通道213以及用于控制该移动的阀207。当与仪器(如分析仪)介接时，盒201可操作以接收样品孔203中的样本并通过通道213将样本分配到分配孔205中的部分中。阀207可以控制流体在分配孔205与试剂孔209和成像孔211之间移动。在本发明的微生物鉴定应用中，阀207可以被配置成允许一个或多个部分越过分配孔205并且直接行进到一个或多个试剂孔209和成像孔211。试剂孔209可以预填充有用于标记微生物的试剂以进行成像。标记试剂可以被冻干以供储存并且在与流体样本部分接触时被活化。试剂孔209例如可以含有可检测标记和磁性标签，使得在样本部分穿过试剂孔209时形成微生物特异性复合物，这些微生物特异性复合物包括靶微生物、可检测标记和磁性标签。

在本发明的其它实施例中，阀207还可以被配置成允许一个或多个部分越过分配孔205并且直接行进到一个或多个试剂孔209和成像孔211以提供抗微生物剂敏感性测试的零生长参考或基线。分配孔205可以预填充有生长培养基和/或一种或多种抗微生物剂。阀207可以将样本部分保持在分配孔205中以在存在各种抗微生物剂的情况下在任何时间段内进行温育。

图4示出了用于对盒201内的样本执行微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试的示例性仪器601(例如，分析仪)。仪器601可以用于与盒201相互作用以对样本执行靶细胞鉴定和抗微生物剂敏感性测试。仪器601包含至少一个用户接口603(例如，触摸屏)以显示提示、结果、报告并接收命令。仪器601可以包括不同功能区域和子系统。这些功能区域和子系统可以包含：用于运输和温育分析盒的转盘；提供盒流控的气动接口的流控子系统；磁体；用于容纳处理和温育设备的上部部分607；以及用于容纳电子器件、成像和气动设备的下部部分609。

图5是仪器601的上部部分607内的组件的顶视图，其示出帮助围绕仪器601移动盒201的转盘。仪器601可以包含用于接受和分类多个分析盒201的装载盘703。

仪器601还可以包含转盘605和机械盒输送工具707以接受、移动并操纵仪器601内的分析盒。仪器601还可以包含任务调度器。仪器601优选地由计算机控制以自动操纵分析盒、执行微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试并且产生结果。仪器601可以包含用于执行本发明的方法的多个子系统。

仪器601的子系统可以包含气动子系统709、磁性子系统711、成像子系统713和废物子系统715(例如，用过的盒201可以推入的一次性箱)。磁性子系统711可以包含例如永磁体或电磁体以提供磁场，以便将磁性颗粒和靶标的复合物沉积在分析盒的检测表面上以进行成像。成像子系统713可以是如美国专利第9,643,180号和第8,021,848号中所述的用于捕获微生物图像的那些成像子系统以及用于相对于仪器601的成像模块操纵分析盒201的检测表面的台，这两个美国专利通过引用并入本文中。成像子系统713可以与计算机可操作地相关联以提供图像处理、分析和显示能力。气动子系统709可操作以通过使用由气动压力或真空提供的功能操纵阀207(例如，柱塞和致动器)来驱动分析盒201内的样本105和试剂移动穿过。在一些实施例中，液压或机械装置还可以并入到气动子系统709中以实现样本105的移动。废物子系统715可以包含用于处置使用后的盒201的接收器(例如，可拆卸箱)。

仪器601还可以包含用于在温育期间保持(或储存)分析盒以进行生长和/或测定温育的一个或多个温育区域。温育区域可以包含加热和/或冷却元件和恒温器以控制该元件将温育区域维持在期望温度下以使靶细胞或微生物生长(例如，35摄氏度)或执行测定温育。

在一些实施例中，机器盒输送工具707(例如，机器输送臂)可操作以在仪器601内的各个子系统中操纵分析盒201。在本发明的一些实施例中，机器盒输送工具707在仪器的转盘605与各个子系统之间转移盒201中的每个盒。机械盒输送工具707施加推力以将盒201转移到转盘605上并从该转盘上移除该盒。转盘605旋转以将分析盒201定位成邻近子系统中的另一个子系统，并且机器盒输送工具707可以然后施加力以将分析盒201滑动到子系统上。盒201从不会被仪器601的机器盒输送工具707或任何其它元件抓住。在仪器601内滑动或推动分析盒201减少暴露于碎片。

在一些实施例中，仪器包含用于管理仪器601内的盒201的任务调度器。任务调度器可操作以控制移动，如在多个子系统中运输并转移盒201中的每个盒。在一些实施例中，每个分析盒201在子系统中花费的时间也可以由任务调度器管理。任务调度器可以根据需要在各个子系统上储备时间以对盒201中的每个盒进行分析。在本发明的一些实施例中，任务调度器可以通过鉴定盒的内含物来管理分析盒201的移动(即，待执行的分析的步骤/参数)。

在一些实施例中，仪器601还可以包含读取器，该读取器可操作以分析位于分析盒201上的独特标识符(例如，条形码)219。分析盒201的内含物和所需处理可以与分析盒201上的独特标识符219相关联。盒201中的每个盒可以包含可由仪器601读取的独特标识符。仪器601可以通过读取器读取独特标识符219并将独特标识符219与任务调度器执行的一组特定指令相关联。读取器可以位于仪器601的外部，并且可以在分析盒201从装载架703转移到转盘605之前读取独特标识符219。独特标识符219可以是条形码，并且对分析盒201中的样本可以是特定的/唯一的。

可以将样本直接插入到样品孔203中。可以将气动端口217打开以施加压力或真空，以便将样本分配给分析盒201内的孔。首先可以将样本从样品孔203分配到分配孔203，并在温育期间由阀207将该样本保持在该分配孔中并释放到试剂孔209以进行标记，并且然后释放到成像孔211以进行成像。分析盒201具有独特标识符219(例如，条形码)，当由仪器或仪器中的读取器读取时，该独特标识符将盒与指令集相关联以在仪器内进行处理。

然后，可以使盒201经受磁场(例如，放置在永磁体上)以将复合物拉到成像孔211的底部上的检测表面215。成像孔211可以含有染料垫，该染料垫形成位于如本文所描述的成像孔211中的上层(含有生物物质、可检测标记、复合物、磁性标签)下方的致密不透明水层。通过磁场拉动复合物和微生物复合物穿过染料垫层直到成像孔211上的检测表面215来迫使经过复合的磁性颗粒穿过下染料垫层并且沉积在成像孔211的检测表面215上。检测表面215可以是光学透明的以允许对微生物进行光学检测。在用磁场处理和下拉之后，可以将盒201放置在成像系统上以进行如本文所描述的图像处理。

物种特异性荧光寡核苷酸探针可以用于对靶微生物进行荧光标记，使得荧光标记的成像提供对靶微生物的鉴定和定量(例如，样本中的靶细菌的细胞计数)。分析盒可以具有任何数量的分配孔以及对应的试剂孔和成像孔。在优选实施例中，分析盒具有“时间0计数”参考部分和一种或多种抗微生物剂的差异生长分析，该一种或多种抗微生物剂各自以至少两种单独的浓度存在。在一些实施例中选择的浓度应优选地对应于由CLSI和/或EUCAST针对特定靶物种和抗微生物剂确立的被接受的抗微生物剂敏感性测试断点浓度。

尽管本文主要在分析盒具有互连孔以进行自动化处理的上下文中描述了本发明的系统和方法，但是技术也可以在任何已知的流控平台中执行，该技术包含在微量滴定板的孔中或在具有液滴功能的底物上进行手动处理。在一些实施例中，盒包括至少八个孔并且可以被加倍以包含至少十六个由至少八个孔区段构成的孔。这就是说，孔的数量优选地大(例如，一百或更多个)并仅受盒和仪器的尺寸约束所限制。

在存在各种抗微生物剂的情况下温育并与在温育之前确定的“时间0计数”参考进行比较之后，通过对存在于每个样本部分中的靶细胞或微生物的量进行定量，可以确定每种抗微生物剂对靶细胞复制的影响。通过确定哪种抗微生物剂最能抑制生长，可以确定有效疗法以治疗患者的感染。

图6是用于执行包括细菌的样本的抗微生物剂敏感性测试的工作流的实例。工作流是根据本发明的各种方法可以在分析盒中执行的温育和处理步骤的示例。样本可以与生长培养基501混合，该生长培养基可以基于对样本中存在的靶微生物的知识来选择(例如，选择阳离子调整的米勒-海顿(Mueller-Hinton)肉汤以分析样本中的大肠杆菌)。然后可以将样本和生长培养基分配503到多个(n)个分配孔中以进行温育507。分配孔中的一个或多个可以含有各种抗微生物剂。在没有温育(t0样本)505的情况下，可以对一个或多个部分进行分析以对靶微生物进行定量，以便随后与在存在或不存在抗微生物剂的情况下温育之后已经分析的样本部分进行比较。在不存在治疗剂的情况下温育可以提供重要信息，该重要信息包含例如如果已经用抗微生物剂治疗患者，则可能发生指示非活微生物。对此类经过温育的部分的分析还可以充当抑制生长干扰和试剂稳定性的内部控制。

优选地，已经鉴定了细菌或其它靶细胞，并且已经相应地选择了各种抗微生物剂作为例如通常用于处理所鉴定的细菌的抗微生物剂。每个分配孔可以含有单一抗微生物剂或抗微生物剂的独特组合以评估对靶细胞生长的组合效果。在不同浓度下的不同抗微生物剂可以与不同分配孔中的样本部分或等分试样组合，并且一些分配孔可以用于复制用相同抗微生物剂进行的治疗以强化结果。由于非抗微生物推断或试剂不稳定性，在一些分配孔中的样本部分或等分试样可以不与抗微生物剂组合以对未经抑制的生长进行定量和/或检测生长抑制。

在温育507之后，可以对经过温育的样本等分试样进行处理并以类似于“时间0计数”样本等分试样的方式进行成像505，并且细菌或其它微生物的计数可以相互比较、与“时间0计数”样本等分试样或与其它对照计数509进行比较以确定某些浓度抗微生物剂或其组合的有效性。优选地，推荐一定浓度的抗生素进行治疗将不允许生长。

图7示出用户将样本105直接转移到分析盒201的样品孔203中。在此实例中，将样本105从样本收集装置1001(例如，样本收集容器、拭子等)吸移到分析盒201的样品孔203中。在其它实施例中，可以将样本收集装置1001(例如，拭子)直接插入到分析盒201的样品孔203中。

图8描绘了在运输到仪器601中之前装载到装载盘703中的多个盒201。

仪器可以包含可用于执行这些方法的步骤的计算机或连接到该计算机。该计算机可操作以控制仪器601和盒201和/或处理成像结果。计算机可以包括耦接到非暂时性存储器装置的处理器。存储器优选地存储可由处理器执行的指令以使系统操纵仪器601内的盒201并获得和处理经过标记的微生物的图像。

处理器是指执行处理操作的任何装置或装置的系统。处理器将通常包含用于提供中央处理单元(CPU)的芯片，如单核或多核芯片。可以由来自英特尔公司(Intel)或AMD公司的芯片提供处理。处理器可以是任何合适的处理器，如英特尔公司(加利福尼亚州圣克拉拉)以XEON E7商标销售的微处理器或AMD公司(加利福尼亚州桑尼维尔)以OPTERON 6200商标销售的微处理器。

存储器是指以机器可读格式存储数据或指令的装置或装置的系统。存储器可以包含一组或多组指令(例如，软件)，当由计算机的处理器中的一个或多个处理器执行时，该一组或多组指令可以完成本文所描述的方法或功能中的一些或全部。优选地，计算机包含非暂时性存储器，如固态驱动器、闪存驱动器、磁盘驱动器、硬盘驱动器、订户身份模块(SIM)卡、安全数字卡(SD卡)、微型SD卡或固态驱动器(SSD)、光学和磁性介质等或其组合。在优选实施例中，该存储器包含任务调度器软件。不同任务调度器指令可以与特定独特标识符相关联。通过仪器601上或中的读取器或条形码扫描仪扫描分析盒201上的独特标识符可以使处理器执行对独特标识符特定的任务调度器指令。

输入/输出装置603是用于向计算机输入或输出数据的机构或系统。示例性输入/输出装置(如触摸屏)包含视频显示单元(例如，液晶显示器(LCD))、字母数字输入装置(例如，键盘)、光标控制装置(例如，鼠标)、条形码扫描仪、读取器、磁盘驱动单元、信号生成装置(例如，扬声器)、加速度计、麦克风、蜂窝射频天线和网络接口装置，该网络接口装置可以是例如网络接口卡(NIC)、Wi-Fi卡或蜂窝调制解调器。输入/输出装置可以用于允许用户控制仪器601并显示结果并且生成从由仪器601接收的盒的分析获得的结果。

实例

如果患者感染有四种最常见的引起UTI的微生物(即大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌和铜绿假单胞菌)中的一种，则对尿液样本进行分析以确定泌尿道感染的存在并确定四种主要抗微生物剂中的哪一种对治疗UTI将是有效的。将尿液直接添加到本发明的分析盒以进行测试并添加到生长培养基以在盒内进行温育。如果对四种UTI微生物中的一种呈阳性，则执行抗微生物剂敏感性测试。可在三十分钟内获得鉴定结果，并且可在四小时内获得抗微生物剂敏感性测试结果。使用本发明的示例性技术执行最小抑制浓度(MIC)分析。

测试尿液样本中大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌和铜绿假单胞菌的存在，其中每一种的检测极限小于或等于10,000CFU/mL(用于诊断UTI的常见阈值)。使用了物种特异性标记。在此实例中，使用等温FISH反应和通用反应稀释剂在30分钟内检测所有四种靶微生物。在不使用脱靶检测的情况下，实现了每种物种的所有菌株(10种大肠杆菌、11种肺炎克雷伯菌、10种铜绿假单胞菌和6种肠球菌)的检测。在未观察到交叉反应性的情况下，分别分析大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌和铜绿假单胞菌对15、10、10和10种不同细菌物种的FISH探针的交叉反应性。

表1中示出了4种样本使用掺有微生物大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌和铜绿假单胞菌的30％尿液的检测极限(LoD)结果，其指示引起UTI的微生物的高分析敏感性。

图9示出了使用本公开的仪器、方法和盒分析以不同数量的集落形成单位(CFU)每ml掺入到尿液中进行计数的大肠杆菌细胞的数量。

图10示出了使用本公开的仪器、方法和盒分析以不同数量的集落形成单位(CFU)每ml掺入到尿液中进行计数的粪肠球菌细胞的数量。

本文所描述的微生物检测和鉴定方法可以用于快速检测其它微生物物种，如炭疽杆菌(炭疽杆菌(B.antracis))和艰难梭菌(艰难梭菌(C.difficile或C.diff))。

在另一个实验中，使用本发明的示例性方法和常规肉汤微稀释两者使四种经过鉴定的微生物中的每一种微生物的七到十个菌株经受针对常见抗微生物剂的AST分析，并且然后将结果进行比较。

图11给出了例如大肠杆菌的菌株ATCC 2469对呋喃妥因的特定结果。下表2中示出了常规方法与本发明的方法之间的基本一致性结果。

为了测试对可变接种水平的稳健性，使用快速AST方法测试覆盖4个数量级的接种并且将其与已知MIC结果进行比较。如表3所示，观察所有被测样本的100％基本一致性(三个物种针对四种不同抗微生物剂)。

图12描绘了针对呋喃妥因MIC测试的各个接种浓度的结果。通过使样本掺有靶标大肠杆菌连同非靶标细菌来测试多种微生物样本的影响，这些非靶标细菌包含分泌NDM1的表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、极小棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯菌。分别以在MIC测试中观察到的针对5种不同抗微生物剂的100％、100％和96％基本一致性使用高浓度的le5、le6和le7 CFU/ml的非靶标细菌。在被测的84种样本中观察到大于98％的基本一致性。在存在1E7 CFU/mL的分泌肺炎克雷伯菌NDM1的碳青霉烯酶的情况下，亚胺培南的大肠杆菌MIC不受影响。

尿液样本掺有对氯法齐明敏感的大肠杆菌菌株和对氯法齐明具有耐药性的菌株。使用本文所描述的示例性系统(分析盒和仪器)对样本进行测试。在32μg/mL氯法齐明中温育样本持续四个小时。

图13描绘了生长结果，其证明本公开的方法和系统成功地区分如本文所述的大肠杆菌的氯法齐明敏感性菌株和氯法齐明耐药性菌株。

概述：以下实例表明可以使用新颖等温荧光原位杂交方法检测非常低浓度的细胞。示出了三种常见人泌尿道感染(UTI)病原体的检测极限。

实验方法：

结果：

被测的所有三种细菌都示出了低检测极限。图14、图15和图16示出了利用用于计算LoB和LoD的线性拟合产生的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的数据。可在单个反应孔中检测到的CFU中指示了LoB和LoD。

结论：在该实例中描述的新颖且快速的FISH方法示出为使用最少处理的尿液基质，每次反应的检测极限为约500CFU或更少的敏感方法。

变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。

概述：该实例表明使用本发明来检测靶向细菌物种的不同菌株。呈现了11种不同大肠杆菌菌株的原始数据，并且总结了肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和肠球菌的数据。使用等温荧光原位杂交(FISH)在30分钟内对细菌细胞靶标进行标记并在MultiPathTM基于CCD相机的检测系统上进行检测。

实验方法：

根据制造商的说明书，通过Zeba 7K MWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893或89892，取决于尿液量)首先对尿液进行处理。然后，将10μL的磁性颗粒制剂添加到该混合物中。将最终反应混合物转移到含有50μL(先前干燥的)“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板，在35℃下温育30分钟以允许同时再水合“染料垫”、标记细菌细胞并且将磁性颗粒与细菌细胞表面结合。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。

结果：图18示出了11个大肠杆菌菌株的测定信号。检测到所有11个菌株高于细胞输入为大约600个CFU每测定时的背景“无细胞”条件。图19示出了表示为检测到的细胞百分比(细胞输入孔中的总测定信号-背景测定信号/总细胞输入*100)的数据。尽管检测效率在菌株与菌株之间稍微有所变化，但这没有抑制测定检测11个不同大肠杆菌菌株中的每个菌株的能力。

图20中的表总结了以与大肠杆菌相同的方式分析的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和肠球菌的包容性结果。被测的肺炎克雷伯菌菌株是ATCC13833、CDC80、CDC44、CDC87、CDC47、CDC43、BAA2470、CDC34、CDC39、ATCC700603和BAA-2472。被测的铜绿假单胞菌菌株是CDC263、CDC242、9721、CDC236、27853、BAA-2110、CDC233、15692、CDC234、CDC246和CDC261。被测的奇异变形杆菌菌株是CDC155、CDC29、CDC159、CDC59、ATCC 7002和CDC156。被测的肠球菌菌株包含ATCC 19433、ATCC 29212、ATCC 33186、ATCC 51575、ATCC 51299和BAA-2128。

结论：在该实例中描述的新颖FISH方法检测了引起患有UTI的患者的临床症状的主要病原体中的5种不同细菌物种的被测的所有菌株。

变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。

概述：该实例表明新颖等温FISH方法特异性地检测到靶细菌，而甚至在非常高的浓度下没有检测到相关非靶细菌。该实例呈现了特异性地检测到大肠杆菌但没有检测到也引起泌尿道感染(UTI)、具有类似rRNA序列或为共生生物的16种其它细菌的测定条件。

实验方法：

结果：

图24和图25示出快速新颖FISH方法仅检测到大肠杆菌但没有检测到其它16种不同的挑战细菌。图24和图25各自示出在对大肠杆菌靶向细菌产生高测定信号的相同测定条件下没有检测到非常高浓度(每个反应1×10

结论：通过设计，该实例中描述的新颖快速FISH方法特异性地检测到大肠杆菌而没有检测到16种临床相关潜在交叉反应性细菌。这表明方法对靶UTI病原体的鉴定具有高特异性，该高特异性对感染的临床治疗非常重要。

变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。测定也已经被设计成表明对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和粪肠球菌具有高特异性。

概述：该实例表明使用对每种细菌rRNA具有特异性的荧光标记的探针，在单个反应中使用本发明同时检测到大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和产酸克雷伯菌。通过使用4种不同荧光团——每种荧光团针对每个细菌物种——在混合物中特异性地检测到每个病原体，这些荧光团具有不同的激发/发射光谱特性。

实验方法：

将细胞/杂交混合物(1mL)转移到盒中。将盒放置到分析仪(如下文所描述)上，该分析仪自动操作剩余的测定步骤和图像采集和分析。简而言之，分析仪的流体系统将反应混合物移动到每孔(先前干燥的)含有46μL“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的光学窗口中。将盒在分析仪内在35℃下温育30分钟。在该温育之后，将盒移动到磁体站(德克斯特磁站公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过再水合的“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。磁体站之后，将盒移动到分析仪内的成像站并在四个颜色通道中的每个通道中拍摄一系列图像(红色(激发635/25nm，发射680/40nm)、黄色(激发530/20nm，发射572/23nm)、绿色(激发470/40nm，发射520/40nm)、橙色(激发569/25nm，发射609/34nm))。

结果：图26示出了完整采集的图像的一部分，在该完整采集的图像中，在4个颜色通道中的每个通道中检测到荧光，每个通道对4种输入细菌中的一种输入细菌具有特异性。每个斑点对应于单细胞或细胞群。算法用于鉴定不同于伪影(例如，碎片)的有意义的对象并将那些对象计数为细胞。如每种细菌的插入物中所示，检测到如所预期的类似数量的细胞，因为输入细胞浓度大约相同。当被覆盖时，如所预期的具有4种不同细菌靶标的这些斑点不对应，这指示在每个通道中观察到不同的对象。

结论：该方法允许单一快速FISH方法以同时检测并定量盒的单个孔中的四种不同的细菌。

变型：

该实例说明了该新颖FISH方法的多重能力并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)和替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌和非细菌病原体。

概述：该实例表明使用本发明的系统、装置和方法在无需细胞纯化的情况下在4小时内确定靶向细菌病原体(在该实例中的大肠杆菌)的抗微生物剂敏感性。在差异生长之后，使用非放大数字成像，实例使用协同FISH方法来标记和磁性选择并定量特异性靶细胞该新方法与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法具有相当的性能。

实验方法：

结果：

图28到图31示出了表明该方法如何可以用于在与黄金标准肉汤微稀释方法相匹配的三种单独的尿液中产生MIC的三个来自较大数据集的实例。图28示出了针对单一药物(呋喃妥因)的单个临床尿液样品(BIUR0017)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。图29示出了针对单一药物(头孢唑啉)的单个临床尿液样品(BIUR0047)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。图30示出了针对单一药物(环丙沙星)的单个临床尿液样品(BIUR0057)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。图31示出了针对单一药物(甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑)的单个临床尿液样品(BIUR0052)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。

结论：该新颖方法示出可以用仅4个小时的最少处理的尿液临床样本的差异生长得到准确的AST结果(MIC确定)，特别是没有冗长的集落纯化步骤。不管是否报告为MIC分类抗生素敏感性结果，AST结果与黄金标准肉汤微稀释方法相比是有利的。

变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它抗生素、生物样本和其它细菌和非细菌病原体。

概述：该实例表明在将已知抗生素敏感性特性添加到不含细菌的尿液中情况下利用本发明来准确地确定病原体的抗微生物剂敏感性。在含有抗微生物剂的微生物培养基中进行差异生长，然后评估生长，使用本发明的协同FISH方法在仅4.5小时内进行所需的靶特异性细胞定量。该新方法与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法具有相当的性能。

实验方法：

此外，对于针对头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)测试的细菌，独有丝状细菌(如用眼睛可以容易地区分，图33将左边(正常细菌)与右边(丝状细菌)进行比较)的存在作为在该抗生素浓度中即将发生细胞死亡的指示，并且在适当的时候对MIC浓度相应地进行调整。在针对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SXT)测试的细菌的情况下，阈值是基于抑制倍数而产生的(含有细菌但不含抗生素的孔中的测定信号被含有抗生素和细菌两者的孔分开)。

结果：图34示出该方法如何可以在存在与CDC或CLSI公布的MIC相匹配的尿液基质的情况下用于在单独的细菌上产生MIC。实例示出了针对单一药物(环丙沙星)的单一细菌(肺炎克雷伯菌CDC0126)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。公布的MIC(≥0.25μg/mL)与通过本发明所述的新颖快速AST方法确定的MIC精确匹配。通过水平灰线示出了生长倍数的阈值(在该实例中为20)。

图35中的表示出了被测的所有菌株中的整体性能。如果通过新颖AST方法确定的MIC精确匹配或是在公布的值的2倍稀释内，则被测的MIC基本上一致。除了两种情况外，所有细菌/抗生素组合具有100％的基本一致性。

结论：该新颖方法示出在样品基质的上下文中用仅4个小时可以作出与具有多种药物耐药性机制的细菌的高度表征菌株的公布的值相匹配的MIC确定。

变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它抗生素、生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌。

概述：该实例表明使用本发明的系统和方法在4小时内自动确定临床尿液样品中的病原体的AST结果，无需冗长的细胞纯化步骤。自动化仪器执行含有试剂的盒中所需的步骤以在恒定的生理温度下确定抗微生物剂敏感性。温度与微生物生长和用于检测并定量靶细胞的本发明的方法两者相兼容。使用基于FISH的标记、磁性颗粒和非放大数字成像对本发明的系统执行后一种方法。

使用仪器的气动子系统自动地将盒中的样本分配到含有各种浓度的各种抗微生物剂加上微生物培养基的部分或等分试样中。这些部分中的一部分用于定量生长温育之前的病原体细胞。系统温育盒持续4小时，并且然后对含有抗微生物剂的孔中的靶细胞的数量进行定量。将含有抗微生物剂的温育部分中的细胞的数量与在温育之前测量的细胞的数量进行比较用于确定各种抗体中的病原体的抗微生物剂敏感性。

实例示出了使用本发明的自动化系统、装置和方法直接在来自尿液中具有大肠杆菌的医院患者的临床样本中进行快速且自动化抗微生物剂敏感性测试的结果。与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法相比，本发明在仅4小时内递送准确的性能。

实验方法：

通过将25uL 4X MHB II(天惠华公司，目录号101320-356)分配到8个单独的生长孔中的每个生长孔中(参见图37中的盒示意图)来制备盒之前的天数。生长孔1和2用于时间零点测量(参见下文的描述)，因此仅生长培养基包含在生长孔中。生长孔3和4也仅包含培养基。这些孔充当阳性对照以确保超过四个小时观察到生长。将2种浓度的抗生素添加到生长孔5和6以及7和8中。为此，将比以微克每毫升为单位的目标浓度更浓22.2倍的4.5μL抗生素沉积到适当的生长孔中。盒含有2种浓度的环丙沙星(CIP)和呋喃妥因(NIT)两者或头孢唑啉(CFZ)和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SXT)。对于盒中的每种抗生素的最终浓度，参见图38。然后将培养基和抗生素在40℃的对流烘箱中干燥16到20小时。

制备了含有以下的杂交缓冲液：3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠，pH 7.5)(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)和0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)。将海藻糖(西格玛公司，目录号T9449)溶解在该混合物中直到最终浓度为10％w/v。将该杂交缓冲液-海藻糖混合物冻干在8.3μL体积珠中。将两个8.3uL珠放置到8个试剂孔中的每个试剂孔中(关于盒上的位置，参见图37)。

将聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中直到浓度为2.75×1014个颗粒/mL，最终浓度为10％w/v海藻糖(西格玛，目录号T9449)。为了该稀释，将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。在立即用于最小化聚合之前，对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。然后将混合物冻干在10μL体积珠(2.64×10个颗粒每反应)中。将一个磁性颗粒冻干珠与2个杂交混合珠放置在8个试剂孔中的每个试剂孔中。

在测试之前，使用尺寸排阻色谱法去除尿液防腐剂和其它潜在干扰化合物。根据制造商的说明书，将每份2.5mL的临床阳性尿液样品应用于预洗涤Zeba

将750μL的每种经过处理的尿液样品与1705μL的水和45μL物种特异性DNA寡核苷酸荧光原位杂交(FISH)探针和未经标记的DNA辅助探针进行组合以制备含有30％尿液v/v最终浓度的溶液。可以在图39中找到用于每种细菌的寡核苷酸的浓度和染料标记。将1mL的混合物添加到盒的样品罐中并将盒放置到分析仪上。

在然后将盒放置在仪器上之后，除了数据分析之外的所有随后动作都是自动执行的。首先将尿液/水/FISH探针混合物(样品)在真空下引导到盒顶部的8个生长孔中。然后将前两个生长孔中的样品立即重新定位到反应孔中，从而再水合杂交缓冲液/FISH探针混合物和所冻干的磁性颗粒。然后样品继续到含有46μL脱水的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的成像窗口，在60℃下在对流烤箱中干燥3小时并在35℃下在分析仪上温育30分钟。在该温育之后，然后将盒重新定位到磁体站并放置在强大的永磁体(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)顶部持续4分钟以使经过标记的和磁性颗粒相互作用的细菌细胞邻近成像表面。最后，将盒移动到成像站并且使用下文所描述的非放大CCD成像仪进行成像。

将剩余的六个生长孔中的样品保持在该位置中，并且在存在或不存在抗生素的情况下允许细菌在35℃下在再水合的培养基中生长4小时。在生长之后，将细胞悬浮液如时间零点测定一样重新定位到试剂孔中，并且如上文所描述的执行完全相同的杂交反应、磁性下拉和成像。

MultiPath分析仪成像系统是能够从MultiPath盒的所选孔中自动捕获图像数据作为完全自动化测试的定制仪器和软件。使用定制设计的精度3轴定位系统将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。分析仪可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。

结果：图40示出了含有临床尿液样品BIUR0067的两个盒中的四种复制品的平均生长倍数，该临床尿液样品含有大肠杆菌菌株。图示出了在2个不同盒中的4种复制品中的环丙沙星和呋喃妥因中的每一种在2个浓度中的每个浓度下的平均生长倍数。使用生长倍数值为2的两种抗生素，MulitPath测定将两种环丙沙星(CIP)浓度调用为生长并且将两种呋喃妥因(NIT)浓度调用为未生长。因此，通过MulitPath，BIUR0067对环丙沙星具有耐药性并且对呋喃妥因敏感。将大肠杆菌从该尿液中分离出来并在与这些敏感/耐药性调用相匹配的CLSI标准肉汤微稀释中进行测试。

图41出了含有临床尿液样品BIUR0084的两个盒中的四种复制品的平均生长倍数，该临床尿液样品含有肺炎克雷伯菌菌株。图示出了在2个不同盒中的4种复制品中的头孢唑啉和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑中的每一种在2个浓度中的每个浓度下的平均生长倍数。使用生长倍数值为2的两种抗生素，MulitPath测定将头孢唑啉和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑两者的所有抗生素浓度调用为生长。因此，肺炎克雷伯菌的该菌株对两种抗生素具有耐药性。这与在内部进行的CLSI标准肉汤微稀释相匹配。

结论：实例示出了使用本发明的自动化系统、装置和方法直接在来自尿液中具有大肠杆菌的医院患者的临床样本中进行快速且自动化抗微生物剂敏感性测试的结果。与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法相比，本发明在仅4小时内递送准确的性能。

变型：该实例说明了该新颖AST方法在盒上的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序以及对反应物和抗微生物稳定的改变、不同细菌靶标、不同抗微生物剂等。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。

概述：对可变接种物浓度的稳健性对快速AST方法很重要，因为当直接从样本中测试样本时，靶细胞浓度是未知的。该实例表明，当针对覆盖宽范围的靶细胞浓度的人为样本时，使用本发明直接从尿液样本提供准确且一致的结果。该实例表明，与用于AST的肉汤微稀释(BMD)黄金标准相比，在存在10％尿液的情况下大肠杆菌BAA-2469、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和肺炎克雷伯菌CDC-0043的可变细胞输入递送准确的AST结果。

实验程序：

结果：

图42到图45示出当与黄金标准肉汤微稀释方法匹配时，该方法如何对不同接种水平而言是稳健的。图42将用新颖AST方法获得的结果与在单一浓度下执行的针对被测的所有药物的标准BMD的结果进行比较。列3将通过新颖AST方法和黄金标准BMD获得的MIC进行比较。所有MIC调用均在符合CLSI的BMD的2倍稀释(基本一致性)内。列4将基于MIC(分类一致性)的分类抗生素敏感性结果(S＝敏感性，I＝中等，R＝耐药性)进行比较。尽管在肉汤微稀释中的克雷伯菌属浓度的子集给出了不同于MIC的分类调用，但是通过标准AST方法将所有这些仅分类为微小的错误。图44示出与标准肉汤微稀释方法(24小时BMD，虚线)相比，对于大肠杆菌BAA-2469的所有接种水平利用上文所描述的新颖4小时方法(实心圆圈)产生的MIC。利用该新颖方法确定的所有MIC都基本一致(阴影区域)。图45示出了图43的原始数据。

结论：在此呈现的快速4小时AST方法对超过宽范围的靶细胞浓度的初始细胞浓度而言是稳健的。对可变接种物浓度的稳健性对快速AST方法很重要，因为当直接从样本中测试样本时，靶细胞浓度是未知的。

变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌和非细菌病原体以及其它抗微生物剂或化学剂。

概述：当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含其它微生物的靶病原体群。通常方法(即集落纯化)需要2到5天递送结果。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。

当前方法需要冗长的细胞纯化过程，因为这些方法使用非特异性检测方法，如增加浊度以确定哪些抗微生物剂抑制微生物培养基中的靶病原体的生长。当使用细胞复制品的非特异性测量时，仅可以在仅含有靶病原体的细胞的情况下知道所示生长是由于靶病原体引起的。当前抗微生物剂敏感性测试方法必须经历细胞纯化，因为大多数医学样本是非无菌的。样本通常含有构成人微生物组的微生物、填充人身体的良性正常细菌群。

相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需集落纯化步骤。该方法与当前方法的不同之处在于，其特异性地评估靶病原体在含有抗微生物剂的微生物培养基中的生长。

该实例表明，在包括15份不同培养阴性尿液样品的尿液基质(10％)的人为样品中，快速抗微生物剂敏感性测试方法准确地确定了大肠杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)。在此示出，使用新方法(即抗微生物剂敏感性测试结果)是准确的并且不会受到含有高浓度的其它微生物物种的尿液样品中的脱靶细菌的显著影响。

实验程序：

结果：

示出的数据表明上文所描述的4小时AST方法对于非无菌样品是稳健的，而对其中存在额外细菌的CLSI BMD方法则不稳健。图46示出在存在呋喃妥因的情况下并且在金黄色葡萄球菌ATCC 25923浓度增加最多超过100倍时大肠杆菌BAA-2469的数据。CLSI样肉汤微稀释方法中的大肠杆菌MIC受到添加金黄色葡萄球菌菌株(在图中以X标记)的影响，其中MIC从不存在金黄色葡萄球菌时的8增加到黄色葡萄球菌过量100倍时的32。相比之下，不论金黄色葡萄球菌细胞的量如何，本发明所述的新颖4小时AST测定(MulitPath，圆圈)具有相同的MIC(8)(虚线)。

图48到图50示出与仅存在大肠杆菌BAA-2469的CLSI肉汤微稀释相比，使用该新颖方法(MulitPath)确定的原始MIC值。图47中的表示出在存在增加的脱靶细菌的情况下大肠杆菌的总体基本一致性。仅1e7弗氏柠檬酸杆菌与呋喃妥因的单一条件导致缺乏基本一致性，但这没有改变在所有抗生素和所有脱靶细菌中有100％一致性的分类敏感/中等/耐药性确定。

结论：实例表明，使用本发明的抗微生物剂敏感性测试，在含有甚至大量的其它物种的其它微生物的样品中实现靶病原体的准确抗微生物剂敏感性测试结果不需要细胞纯化。

变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。

概述：当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含其它微生物的靶病原体群。通常方法(即集落纯化)需要2到5天递送结果。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。

一个原因是，当前方法需要冗长的细胞纯化过程，因为这些方法使用非特异性检测方法，如增加浊度以确定哪些抗微生物剂抑制微生物培养基中的靶病原体的生长。当使用细胞复制品的非特异性测量时，仅可以在仅含有靶病原体的细胞的情况下知道所示生长是由于靶病原体引起的。

相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需集落纯化步骤。该方法与当前方法的不同之处在于，其特异性地评估靶病原体在含有抗微生物剂的微生物培养基中的生长。在另一个实例中表明，在存在大量来自脱靶物种的细胞的情况下，本发明的方法是准确的。在该实例中，通过在存在脱靶物种的情况下执行靶病原体的抗微生物剂敏感性测试来解决可能引起的另一个挑战。在此表明，在含有大量的使已知的酶分解正在测试的抗微生物剂的脱靶物种的人为尿液样本中，本发明的方法递送靶病原体的准确抗微生物剂敏感性测试结果。理论上，这可以潜在地显著改变抗微生物剂的浓度以改变抗微生物剂敏感性测试结果。

在该实例中，表明在存在大量的产生分解该类型的抗微生物剂的酶的脱靶病原体的情况下，快速抗微生物剂敏感性测试实现了两种碳青霉烯抗生素(美罗培南和亚胺培南)的准确抗微生物剂敏感性测试结果。

实验程序：

结果：图52示出了在存在通过产生使亚胺培南抗生素降解的β-内酰胺酶而对亚胺培南抗生素具有耐药性的肺炎克雷伯菌菌株的量增加的情况下，对亚胺培南敏感的大肠杆菌菌株的MIC。将本发明的新颖快速AST方法与BMD方法进行比较。新颖4.5小时AST方法不受甚至高浓度的β-内酰胺酶存在的影响，该β-内酰胺酶产生MIC始终小于1μg/mL亚胺培南的肺炎克雷伯菌。相比之下，BMD方法在16到24小时生长之后示出敏感大肠杆菌菌株的MIC随着肺炎克雷伯菌水平的增加而增加，该菌株将被错误地确定为对该抗生素具有耐药性。图53示出了内酰胺类抗生素美罗培南的类似结果。

结论：本发明的新颖4.5小时AST方法示出，即使在存在表达使抗生素降解的碳青霉烯酶的高浓度耐药性细菌的情况下，对碳青霉烯抗微生物剂敏感的细菌的MIC确定是准确的。

变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以扩展到另外的内酰胺敏感配对和表达细菌的β-内酰胺酶。

概述：当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含样本本身的仅病原体细胞群。因此，指示哪种抗生素对杀死引起感染的病原体最佳的抗微生物剂敏感性测试结果在2到5天内尚不可用。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。

相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需冗长的集落纯化步骤。在此示出当在没有集落纯化的情况下测试尿液样品中的细菌时，新抗微生物剂敏感性测试结果没有受到显著影响。该实例表明，在包括15份不同培养阴性尿液样品的尿液基质(10％)的人为样品中，快速抗微生物剂敏感性测试方法准确地确定了大肠杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)。

实验程序：

结果：图55到图57在此示出基质对AST结果几乎没有影响。图55示出了通过新颖AST方法(黑色圆圈)确定的大肠杆菌BAA-2469的MIC与在不存在针对左氧氟沙星的尿液的情况下(虚线)通过黄金标准CLSI BMD方法确定的MIC的比较。阴影区域是基本一致性区域，该区域通常被认为是在符合CLSI的BMD过程的可接受误差范围内。使用与CLSI方法精确匹配的新颖AST方法确定针对大肠杆菌BAA-2469的大多数左氧氟沙星的MIC，并且剩余两个落在2倍基本一致性区的范围内。图56总结了获得的所有5种抗生素的结果。使用新颖AST方法在15份培养阴性临床尿液样品中观察到与标准BMD的100％基本一致性和100％分类一致性。图57示出使用新颖AST方法确定的掺有大肠杆菌的15份培养阴性临床尿液样品的MIC与在被测的5种抗生素中的符合CLSI的BMD过程中观察到的MIC的比较。

图56示出了左氧氟沙星与15份掺入标准BMD中的培养阴性临床UTI尿液样品中的每份的100％基本一致性。

结论：本发明的方法准确地确定了(在相对于黄金标准BMD方法的基本一致性区内)在所有15种不同的尿液基质中测试的所有5种抗生素的UTI病原体(大肠杆菌)的MIC。因此，该新颖4小时抗微生物剂敏感性测试有能力提供直接来自尿液样本的准确结果，而不需冗长的基于生长的集落纯化，从而节省大量时间。通过允许快速启动正确、有效的抗生素治疗并避免加剧抗生素耐药性扩散，快速AST结果可以改善患者护理。

变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)和尿液浓度。该方法还可以清楚地应用于其它细菌和非细菌病原体以及尿液之外的最少处理的临床基质。

概述：多种微生物感染在包含伤口的许多类型的感染中很常见。对于此类可能威胁生命的感染，确定哪些抗微生物剂可能对每种传染性病原体有效是至关重要的。当前的抗微生物剂敏感性测试方法需要2到5天来纯化多种微生物感染中的大量的每种传染性病原体，之后对该传染性病原体进行分析。

该实例表明本发明的系统和方法在仅4.5小时内直接从患者样本中产生快速AST结果，而无需冗长的集落纯化的潜力。与肉汤微稀释参考标准结果相比，该方法在人为的2种靶多种微生物混合物中实现了针对每个靶物种的AST结果(MIC值)。

实验程序：

结果：图59、图60和图61总结了所有48种不同的成对组合与抗生素环丙沙星的结果。图59示出不论是否存在第二敏感或耐药性细菌，通过新颖4.5小时AST方法确定的靶细菌的所有MIC在2倍容差范围内，被针对每种靶细菌的(在不存在第二细菌的情况下确定的)黄金标准BMD方法(称为基本一致性)所接受。图62和图63示出通过新AST方法对每种靶细菌的敏感和耐药性确定不受这些成对组合的影响并且与BMD确定100％一致。

结论：本发明的AST方法可以在4.5小时内准确地确定多种微生物样品中的每个物种的抗生素敏感性，而无需当前方法所需的耗时的集落纯化。结果示出本发明确定抗微生物剂可以在仅数小时内而不是当今方法所需的数天内有效地治疗威胁生命的多种微生物感染的潜力。

变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)和替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本、其它细菌和其它抗生素。

概述：多种微生物感染(即由多于一个细菌物种引起的感染)是常见的。当前用于鉴定病原体的基于培养和基于MALDI-TOF的方法需要冗长的集落纯化步骤以单独纯化每个靶标物种的大量细胞。该实例表明，本发明的FISH方法用于在30分钟内在含有所有测定试剂的一次性消耗盒内部的自动化分析仪上检测并鉴定人为尿液样品中存在的靶病原体的多个物种。实例示出了本发明的系统和方法快速并特异性地鉴定多种微生物感染中的多种靶病原体的潜力。

实验程序：

结果：数据表明在单个样品中成功鉴定2个靶病原体，而没有检测到不存在的病原体(即FISH探针对非靶细菌无交叉反应性)。图64示出了在对大肠杆菌/肺炎克雷伯菌混合的样品进行测试的盒运行(N＝10)。图65示出了在对大肠杆菌/铜绿假单胞菌混合的样品进行测试的盒运行(N＝10)。图66示出了对肺炎克雷伯菌/铜绿假单胞菌混合的样品进行测试的盒(N＝10)。由于该盒失效，将肺炎克雷伯菌/铜绿假单胞菌盒6号从分析中去除以产生有效结果。另外，在大肠杆菌/铜绿假单胞菌盒9号的A3中观察到伪影，该伪影使孔中的信号看起来异常地高，因此该单个复制品被消除。该排除点(孔A4)的复制品没有该伪影，因此将肺炎克雷伯菌仍然分类为未检测到。尽管测定信号在不同的盒中有所不同，在除了那些已经描述的情况之外的所有情况中，检测到添加到培养阴性尿液中的两种细菌，而在含有没有被添加的细菌的探针的孔中观察到非常低的信号。

结论：该实例表明，本发明的利用可消耗盒内部的稳定试剂在自动化分析仪上执行的等温FISH方法可以特异性地鉴定人为尿液样品中的多个靶细菌物种。这示出了在多种微生物感染中鉴定多种病原体的方法的潜力。实例还表明了方法的特异性，因为没有观察到跨物种检测。

变型：该实例说明了该新颖FISH方法在盒上的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序以及对反应物稳定的改变(组分的冻干)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。

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根据本文档的全部内容，包含对本文所引用的科学专利文献的参考，除了那些在本文中示出并且描述的内容之外，本发明的各种修改及其许多另外实施例对于本领域技术人员将变得显而易见。本文的主题包含重要信息、例证以及指导，它们可以适合于在本发明的不同的实施例及其等效物中实践本发明。