一种粘弹性水凝胶及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种水凝胶。具体地，本发明提供了一种通过可注射方式形成的具有可调节粘弹性的水凝胶，所述水凝胶通过第一聚合物和第二聚合物经交联反应形成；其中，所述的第一聚合物包括叠氮基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯；所述的第二聚合物包括环状炔基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯。本发明的生物安全的水凝胶可在复杂组织缺损部位高度契合，有利于干细胞的粘附生长，诱导干细胞向不同组织细胞方向进行分化，从而促进组织修复过程，提高修复质量，是一种具有临床应用前景的组织修复材料。

说明书

技术领域

本发明涉及材料科学及医学领域，具体涉及一种基于点击化学的体内环境自交联的可通过注射形成的粘弹性水凝胶及其制备方法和应用。特别是用于复杂结构的组织缺损修复的填充材料。

背景技术

由于先天性疾病、意外伤害、肿瘤切除等原因造成的组织缺损情况与日俱增，这不仅使得组织修复材料市场需求巨大，同时对现有的修复材料在手术操作、力学性能与生物活性上具有越来越高的要求，特别是不同部位的组织缺损需要材料具备不同的力学性能。其中，高强度水凝胶凭借其力学性能，使其能在缺损部位起到一定的支撑作用，防止因外界应力引起的变形、坍塌甚至破碎。

聚癸二酸甘油酯(PGS)是目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准的一种生物弹性体，其具备的良好弹性使其在临床应用中具有潜力。然而，其体外成型固化的特点使得材料的植入需要靠手术来实现，复杂的手术过程与二次创伤对医生和患者而言是不利的；并且，PGS材料过高的模量使得生长在材料表面的细胞内应力难以释放，这阻碍了细胞的铺展、增殖与分化。鉴于聚乙二醇(PEG)分子链段具有良好的柔性和亲水性，将其引入PGS链段中，不仅能使材料更亲水，还能调节材料的力学性能，使其从高弹体转变为粘弹性，更有利于细胞的粘附与铺展，从而促进组织修复。

基于上述，本领域亟需设计一种粘弹性可调节的、粘附力强的、可通过注射形式形成的水凝胶，用以微创地全方位满足不同组织缺损的修复。

发明内容

本发明的目的就是提供一种粘弹性可调节的、粘附力强的、可通过注射形式形成的水凝胶。

在本发明的第一方面，提供了一种粘弹性水凝胶，其特征在于，所述粘弹性水凝胶通过第一聚合物和第二聚合物经交联反应形成；

其中，所述的第一聚合物包括叠氮基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯；

所述的第二聚合物包括环状炔基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯。

在另一优选例中，所述的粘弹性水凝胶通过包括第一聚合物的水凝胶前体溶液A和包括第二聚合物的水凝胶前体溶液B经交联反应形成。

在另一优选例中，所述的第一聚合物和所述的第二聚合物通过叠氮基和环状炔基的环加成反应结合。

在另一优选例中，所述的第一聚合物和所述的第二聚合物通过点击化学形成所述水凝胶。

在另一优选例中，所述的第一聚合物和第二聚合物的质量比为0.5～2：0.5～2，优选0.8～1.2：0.8～1.2，更优选1：1。

在另一优选例中，所述的第一聚合物为本发明第四方面所述的聚合物。

在另一优选例中，所述的第一聚合物为叠氮基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯，包括如式Ia或Ib所示的结构单元：

其中，

式Ia中，X

式Ib中，X

在另一优选例中，所述的第一聚合物的一个结构单元中，平均包括至少1.2个

其中

在另一优选例中，所述的

在另一优选例中，所述的第一聚合物是以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)为主链，侧链末端修饰叠氮基的聚合物。

在另一优选例中，所述的第一聚合物是以侧链羧基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-COOH)，通过酰胺键接枝叠氮基胺得到的。

在另一优选例中，所述的第一聚合物以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)为主体聚合物，侧链羧基化后，通过酰胺键接枝叠氮基胺得到。

在另一优选例中，所述的侧链羧基化试剂为C4-C8的二酸酐，优选C4-C6的二酸酐，例如丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐。

在另一优选例中，所述的二酸酐的接枝率至少80％，优选至少90％，例如95％、97％、100％。

在另一优选例中，所述的接枝叠氮基胺的试剂为C0-C5叠氮基胺，优选3-叠氮基丙胺(Az)、4-叠氮基-1-丁胺。

在另一优选例中，所述的第一聚合物中，X

在另一优选例中，所述的第一聚合物包括如式IV所示的结构单元：

其中，3-叠氮基丙胺(Az)的接枝率超过60％，优选超过80％，例如90％、100％；

a

在另一优选例中，所述的第一聚合物具有以下一个或多个特征：

(a)每个结构单元平均至少包括1.2个叠氮基，优选至少1.6个，更优选至少1.8个；

(b)数均分子量为3.0-100.0kDa，优选6.0-50.0kDa，更优选7.0-20.0kDa；

(c)分散系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7。

在另一优选例中，所述的第一聚合物中叠氮基的接枝率可用于调节所述粘弹性水凝胶的交联度。

在另一优选例中，所述的第二聚合物为本发明第六方面所述的第二聚合物。

在另一优选例中，所述的第二聚合物为环状炔基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯，包括如式IIa或IIb所示的结构单元：

其中，式IIa中，Y

式IIb中，Y

“

在另一优选例中，所述的第二聚合物的一个结构单元中，平均包括至少1.2个

其中，“

在另一优选例中，所述的

在另一优选例中，所述的

在另一优选例中，所述的

在另一优选例中，所述的第二聚合物是以多羟基的聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)为主链，侧链末端修饰环状炔基的聚合物。

在另一优选例中，所述的第二聚合物是以侧链羧基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-COOH)，通过酰胺键接枝氨基化的环炔得到。

在另一优选例中，所述的第二聚合物以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯为主体聚合物，侧链羧基化后，通过酰胺键接枝氨基化的环炔得到。

在另一优选例中，所述的第二聚合物以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯为主体聚合物，侧链羧基化后，通过酰胺键接枝氨基化的二苯并环辛炔得到。

在另一优选例中，所述的侧链羧基化试剂为C4-C8的二酸酐，优选C4-C6的二酸酐，例如丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐。

在另一优选例中，所述的二酸酐的接枝率至少80％，优选至少90％，例如95％、97％、100％。

在另一优选例中，所述的氨基化的二苯并环辛炔选自下组：DBCO-胺(DBCO-Amine)、DBCO-PEG(3-12)-胺(DBCO-PEG(3-12)-Amine)、磺酸DBCO-胺(Sulfo DBCO-Amine)。

在另一优选例中，所述的第二聚合物是以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯直接接枝羧基化的二苯并环辛炔得到。

在另一优选例中，所述的羧基化的二苯并环辛炔选自下组：DBCO-酸(DBCO-Acid)、DBCO-(C

在另一优选例中，所述的第二聚合物中，Y

在另一优选例中，所述的第二聚合物包括如式V所示的结构单元：

其中，氨基化二苯并环辛炔(DBCO)的接枝率超过60％，优选超过80％，例如90％、100％；

c

在另一优选例中，所述的第二聚合物具有以下一个或多个特征：

(a)每个结构单元平均至少包括1.2个环状炔基，优选至少1.6个，更优选至少1.8个；

(b)数均分子量为3.0-100.0kDa，优选6.0-50.0kDa，更优选7.0-20.0kDa；

(c)分散系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7。

在另一优选例中，所述的a

所述的b

在另一优选例中，a

在另一优选例中，所述的第一聚合物和所述的第二聚合物使用相同的侧链羧基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-COOH)，分别接枝叠氮基和环状炔基得到。

在另一优选例中，所述的第二聚合物的环状炔基团的接枝率可用于调节所述粘弹性水凝胶的交联度。

在另一优选例中，所述的粘弹性水凝胶的交联度为50％～100％。

在另一优选例中，所述的粘弹性水凝胶的粘弹性能、力学性能可通过多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯中聚乙二醇段的分子量长度调节。

在另一优选例中，所述的粘弹性水凝胶具有以下一个或多个特征：

(1)弹性模量在0.01～3MPa之间，优选在0.01～2MPa之间；

(2)蠕变时间在50～2500s之间，优选在100～2000s之间；

(3)半松弛时间在10～2000s之间，优选在20～1000s之间。

在另一优选例中，所述的粘弹性水凝胶的杨氏模量为1.575-0.011MPa，蠕变时间在1819.63-110.34s，半松弛时间在1132-20s。

在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(a)提供包括第一聚合物的水凝胶前体溶液A和包括第二聚合物的水凝胶前体溶液B；

(b)将所述的水凝胶前体溶液A和水凝胶前体溶液B进行混合，经快速交联，得到所述的粘弹性水凝胶。

在另一优选例中，所述的混合通过双针筒注射器将所述的水凝胶前体溶液A和水凝胶前体溶液B注射至相关部位，从而进行混合并形成所述的粘弹性水凝胶。

在另一优选例中，基于第一聚合物与溶剂的总质量，所述第一聚合物在水凝胶前体溶液A中的含量为总质量的10wt％-100wt％，优选10wt％-20wt％，例如20wt％、15wt％、10wt％。

在另一优选例中，基于第二聚合物与溶剂的总质量，所述第二聚合物在水凝胶前体溶液B中的含量为总质量的10wt％-100wt％，优选10wt％-20wt％，例如20wt％、15wt％、10wt％。

在另一优选例中，所述的水凝胶前体溶液A和水凝胶前体溶液B的溶剂为水。

在另一优选例中，所述的水凝胶前体溶液A和水凝胶前体溶液B的溶剂为PBS水溶液。

在另一优选例中，所述的步骤(b)中，在10℃-40℃，更佳为25℃-37℃；最佳为37℃进行反应。

在本发明的第三方面，提供了一种用于制备本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶的混合物，所述混合物包括水凝胶前体溶液A和水凝胶前体溶液B。

在另一优选例中，所述的混合物的成胶时间为30～150s，优选30～90s，例如70s、60s、45s。

在另一优选例中，所述的混合物的成胶时间可通过第一聚合物和/或第二聚合物中聚乙二醇段的分子量进行调节。

在另一优选例中，所述的混合物在10～40℃成胶，优选25～37℃。

在另一优选例中，所述的混合物的储存模量为1-5Pa，优选1-2Pa，损耗模量为5-11Pa，优选6-10Pa，储存模量低于损耗模量，满足可注射要求。

在本发明的第四方面，提供了一种聚合物，所述的聚合物为叠氮基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯，包括如式Ia或Ib所示的结构单元：

其中，式Ia中，X

式Ib中，X

“

在另一优选例中，所述的聚合物的一个结构单元中，平均包括至少1.2个

在另一优选例中，所述的

在另一优选例中，所述的聚合物包括如式IV所示的结构单元：

其中，3-叠氮基丙胺(Az)的接枝率超过60％，优选超过80％，例如90％、100％；

a

在另一优选例中，所述的聚合物具有以下一个或多个特征：

(a)每个结构单元平均至少包括1.2个叠氮基，优选至少1.6个，更优选至少1.8个；

(b)数均分子量为3.0-100.0kDa，优选6.0-50.0kDa，更优选7.0-20.0kDa；

(c)分散系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7。

在另一优选例中，所述的聚合物中叠氮基的接枝率可用于调节所述粘弹性水凝胶的交联度。

在另一优选例中，所述的聚合物为本发明第一方面中的第一聚合物。

在另一优选例中，所述的聚合物用于制备本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶。

在本发明的第五方面，提供了本发明第四方面所述的聚合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(i)在惰性溶剂存在下，将多羟基的聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)与二酸酐混合，得到羧基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-COOH)；

(ii)将步骤(i)得到的PEGS-COOH与叠氮基胺混合，进行接枝反应，得到所述聚合物。

在另一优选例中，所述的步骤(i)中，二酸酐与PEGS-OH中羟基的量的摩尔比为1～2:1，优选1.2～1.5:1。

在另一优选例中，所述的步骤(i)中，反应在90-120℃下进行，优选100℃。

在另一优选例中，所述的步骤(i)中，反应进行0.5-3h，优选1-2h。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，还包括：将步骤(i)得到的PEGS-COOH与三乙胺(TEA)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、叠氮基胺混合，进行接枝反应，得到权利要求6所述的聚合物。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，叠氮基胺为PEGS-COOH中羧基的摩尔量的50％～120％，优选60％～100％，例如60％、80％、100％。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，反应在室温下进行，优选20～45℃，更优选地为37℃。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，反应进行2-18h，优选6-10h。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，N,N’-二异丙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.8～1.2:0.8～1.2，优选1：1。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，N,N’-二异丙基碳二亚胺与PEGS-COOH中羧基的量的摩尔比为1.0-1.5：1，优选1.2-1.3：1。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)还包括：

(ii-1)将步骤(i)得到的PEGS-COOH与N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，进行活化；

(ii-2)将步骤(ii-1)得到的反应混合物加入三乙胺(TEA)，再加入叠氮基胺，进行接枝反应；

(ii-3)将步骤(ii-2)得到的反应混合物进行后处理，得到权利要求6所述的聚合物。

在另一优选例中，所述的步骤(ii-1)中，反应进行1-5h，优选2-3h。

在另一优选例中，所述的步骤(ii-2)中，反应加入三乙胺调节pH为8.0。

在另一优选例中，所述的步骤(ii-2)中，反应进行8-18h，优选12h。

在另一优选例中，所述的步骤(ii-3)中，后处理包括透析、真空干燥的步骤。

在另一优选例中，所述的制备方法在保护气体氛围下进行。

在另一优选例中，所述的制备方法在保护气体氛围的手套箱中进行。

在本发明的第六方面，提供了一种聚合物，所述的聚合物为环状炔基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯，包括如式IIa或IIb所示的结构单元：

其中，式IIa中，Y

式IIb中，Y

“

在另一优选例中，所述的聚合物的一个结构单元中，平均包括至少1.2个

其中，“

在另一优选例中，所述的

在另一优选例中，所述的

其中，所述的取代是指被选自下组的一个或多个基团取代：卤素、C1-C6烷氧基、卤代的C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、羟基、-NH

在另一优选例中，所述的

在另一优选例中，所述的聚合物包括如式V所示的结构单元：

其中，氨基化二苯并环辛炔的接枝率超过60％，优选超过80％，例如90％、100％；

c

在另一优选例中，所述的聚合物具有以下一个或多个特征：

(a)每个结构单元平均至少包括1.2个环状炔基，优选至少1.6个，更优选至少1.8个；

(b)数均分子量为3.0-100.0kDa，优选6.0-50.0kDa，更优选7.0-20.0kDa；

(c)分散系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7。

在另一优选例中，所述的聚合物的环状炔基的接枝率可用于调节所述粘弹性水凝胶的交联度。

在另一优选例中，所述的聚合物为本发明第一方面中的第二聚合物。

在另一优选例中，所述聚合物用于制备如本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶。

在另一优选例中，本发明第四方面所述的聚合物和本发明第六方面所述的聚合物使用相同的侧链羧基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-COOH)，分别接枝叠氮基和环状炔基得到。

在本发明的第七方面，提供了本发明第六方面所述的聚合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(i)在保护气体氛围下，在惰性溶剂存在下，将多羟基的聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)与二酸酐混合，得到羧基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-COOH)；

(ii)将步骤(i)得到的PEGS-COOH与氨基化的环炔混合，进行接枝反应，得到所述聚合物。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，氨基化的环炔为氨基化的二苯并环辛炔。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，氨基化的环炔为PEGS-COOH中羧基的摩尔量的50％～120％，优选60％～100％，例如60％、80％、100％。

在另一优选例中，所述的制备方法同本发明第五方面所述的制备方法，不同之处在于，将氨基化的环炔替换叠氮基胺。

在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的第一聚合物；

(b)第二容器，以及位于所述容器内的第二聚合物。

在另一优选例中，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的第一聚合物，所述的第一聚合物可以粉末或分散在溶液的形式存在；

(b)第二容器，以及位于所述容器内的第二聚合物，所述的第二聚合物可以粉末或分散在溶液的形式存在。

在另一优选例中，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的前体溶液A，所述的前体溶液A包括权利要求1中所述的水凝胶前体溶液A；

(b)第二容器，以及位于所述容器内的前体溶液B，所述的前体溶液B包括权利要求1中所述的水凝胶前体溶液B。

在本发明的第八方面，提供了一种本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶的用途，(a)用于制备一医用材料，所述的医用材料用于生长因子和/或药物的负载、或用于组织缺损填充和/或引导组织再生；(b)或用于制备一医疗美容材料。

在本发明的第九方面，提供了一种医用涂层，所述的医用涂层包括本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶。

在本发明的第十方面，提供了一种医用材料，所述的医用材料包括本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶。

在另一优选例中，所述的医用材料选自下组：医用缺损组织填充剂，医用药物载体。

在另一优选例中，所述的医用材料为生长因子、药物的负载基质或载体。

在本发明的第十一方面，提供了一种填充组织缺损和/或引导组织再生的方法，所述方法包括将本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶施用于需治疗的部位。

在本发明的第十二方面，提供了一种负载生长因子和/或药物和/或细胞的方法，所述方法包括将本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶与所述需负载的生长因子和/或药物和/或细胞进行混合。

在本发明的第十三方面，提供了一种聚合物，所述聚合物为多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)，包括如式IIIa或IIIb所示的结构单元：

其中，

式IIIa中，m

式IIIb中，m

在另一优选例中，所述的聚合物具有以下一个或多个特征：

(a)数均分子量为3.0-100.0kDa，优选6.0-50.0kDa，更优选7.0-20.0kDa，例如10.0kDa、15.5kDa、16.0kDa；

(b)分散性系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7。

在另一优选例中，所述的聚合物的数均分子量由聚合反应的反应时间决定。

在另一优选例中，所述的聚合物具有以下一个或多个特征：

(c)玻璃化转变温度为-180℃～-110℃；

(d)结晶温度为-160℃～-100℃；

(e)熔点为-90℃～-20℃；

(f)热降解温度为350℃～450℃。

在另一优选例中，所述的聚合物的玻璃化转变温度为-140.78℃，结晶温度为-128.48℃，熔点为-54.92℃，热降解温度为401.04℃。

在另一优选例中，所述的聚合物的一个结构单元包括：一个癸二酸组份，一个聚乙二醇组份与两个甘油组份。

在另一优选例中，所述聚合物相对于聚乙二醇、癸二酸、甘油直接缩聚得到的无规支化PEGS具有更多的羟基以及更高的结构规整度。

在另一优选例中，所述的聚合物能溶解在水、二甲基亚砜、N,N’-二甲基甲酰胺、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氢呋喃以及二氯甲烷中。

在另一优选例中，所述的聚合物不溶解于乙醚与正己烷中。

在本发明的第十三方面，提供了本发明第十二方面所述的聚合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(s1)在保护气体氛围下，在惰性溶剂存在下，将癸二酸二缩水甘油酯(单体1)、羧基化聚乙二醇(单体2)与双四正丁基氢氧化铵PEG盐(催化剂1)进行聚合反应，得到如式Ia所示的多羟基的聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯；

或，(s2)在保护气体氛围下，在惰性溶剂存在下，将癸二酸(单体3)、聚乙二醇二缩水甘油酯(单体4)与双四正丁基氢氧化铵癸二酸盐(催化剂2)进行聚合反应，得到如式Ib所示的多羟基的聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)中，单体2如式A所示：

其中，m

在另一优选例中，所述的步骤(s1)中，单体2的PEG段的分子量为200～700Da，优选250～600Da，例如250Da、500Da、600Da。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)中，催化剂1为双四正丁基氢氧化铵与羧基化聚乙二醇(COOH-PEG-COOH)成盐所得，结构如下式B所示：

其中，m为1-20的整数。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)中，单体1与单体2的摩尔比为0.8～1.2：0.8～1.2，优选1:1；

所述的催化剂1与单体1的摩尔比为0.004～0.008:1，优选0.005～0.006:1。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)在90-120℃下进行，优选100℃。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)进行12-96h，优选24-72h，例如24h、48h、72h。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)中，惰性溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺，优选无水N,N’-二甲基甲酰胺。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)中，保护气体为氩气和/或高纯氮气。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)在充满氩气氛围的手套箱中进行。

在另一优选例中，所述的的步骤(s1)中，还包括乙醚沉降、透析纯化的后处理步骤。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)中，单体2为分子量250Da的羧基化聚乙二醇；催化剂1为双四正丁基氢氧化铵盐催化剂(其中铵盐的羧酸部分为分子量250Da的羧基化聚乙二醇)。

在另一优选例中，所述的步骤(s1)中，单体2为分子量600Da的羧基化聚乙二醇；催化剂1为双四正丁基氢氧化铵盐催化剂(其中铵盐的羧酸部分为分子量600Da的羧基化聚乙二醇)。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)中，单体4如式C所示：

其中，m

在另一优选例中，所述的步骤(s2)中，单体4的PEG段的分子量为200～700Da，优选250～600Da，例如250Da、500Da、600Da。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)中，催化剂2为双四正丁基氢氧化铵与癸二酸成盐所得。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)中，单体3与单体4的摩尔比为0.8～1.2：0.8～1.2，优选1:1；

所述的催化剂2与单体3的摩尔比为0.004～0.008:1，优选0.005～0.006:1。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)在90-120℃下进行，优选100℃。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)进行12-96h，优选24-72h，例如24h、48h、72h。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)中，惰性溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺，优选无水N,N’-二甲基甲酰胺。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)中，保护气体为氩气和/或高纯氮气。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)在充满氩气氛围的手套箱中进行。

在另一优选例中，所述的的步骤(s2)中，还包括乙醚沉降、透析纯化的后处理步骤。

在另一优选例中，所述的步骤(s2)中，单体4为分子量500Da的聚乙二醇二缩水甘油酯。

在另一优选例中，所述的制备方法包括步骤：

(a1)在氩气的氛围保护下，将摩尔比为1∶1的二酸和二缩水甘油酯溶于溶剂中(其中二酸可为癸二酸、分子量250Da的羧基化聚乙二醇或分子量600Da的羧基化聚乙二醇；二缩水甘油酯可为癸二酸二缩水甘油酯或分子量500Da的聚乙二醇二缩水甘油酯)，加入摩尔比为0.6mol％的双四正丁基氢氧化铵盐催化剂(其中铵盐的羧酸部分可为癸二酸、分子量250Da的羧基化聚乙二醇或分子量600Da的羧基化聚乙二醇)，在90-120℃(更佳地100℃)反应1-3天；

(b1)将步骤(a1)的产物于乙醚中沉降后，在室温下真空干燥6-12小时(更佳地10-12小时)；

(c1)透析纯化步骤(b1)获得的多羟基PEGS高分子得到纯化的所述如式a1所示的PEGS-OH。

在另一优选例中，所述的单体1的制备方法包括：

(s0)在保护气体氛围下，在催化剂存在下，环氧丙醇和癸二酰氯进行反应，得到癸二酸二缩水甘油酯。

在另一优选例中，所述的步骤(s0)中，催化剂为碱性催化剂，优选三乙胺。

在另一优选例中，所述的步骤(s0)中，环氧丙醇和癸二酰氯的摩尔比为2～3：1，优选2：1。

在另一优选例中，所述的步骤(s0)在-20～0℃下进行，优选-10～-5℃。

在另一优选例中，所述的步骤(s0)进行3-12h，优选4-8h，例如5h、6h。

在另一优选例中，所述的单体1的制备方法包括：

在保护气体氛围下，将癸二酰氯溶液滴加到环氧丙醇和催化剂的混合溶液中，得到癸二酸二缩水甘油酯。

在另一优选例中，所述溶液的溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺。

在本发明的第十四方面，提供了本发明的第十二方面所述的聚合物的用途，用于制备一材料，所述材料包括生物弹性体、水凝胶、3D打印材料、响应性高分子、导电高分子。

在另一优选例中，所述的聚合物经改性和/或接枝后，用于制备一材料，所述材料包括生物弹性体、水凝胶、3D打印材料、响应性高分子、导电高分子。

在另一优选例中，所述的聚合物用于制备一聚合物，所述的聚合物为本发明第四方面所述的聚合物。

在另一优选例中，所述的聚合物用于制备一聚合物，所述的聚合物为本发明第六方面所述的聚合物。

在另一优选例中，所述的聚合物用于制备一聚合物，所述的聚合物用于制备本发明第一方面所述的粘弹性水凝胶。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明中多羟基PEGS高分子的合成路线(A)；多羟基PEGS高分子的核磁共振氢谱图(B)；多羟基PEGS高分子(PEGS-OH，下)与缩聚制备的支化PEGS高分子(PEGS，上)的傅里叶变换红外光谱图(C)；不同PEG嵌段分子量的多羟基PEGS高分子的分子量随反应时间变化规律(D)。

图2显示了本发明的粘弹性可调的本发明的水凝胶的示意图(A)；本发明的水凝胶的合成路线(B)；单组份PEGS-COOH的核磁共振氢谱(C)；单组份PEGS-Az的核磁共振氢谱(D)；单组份PEGS-DBCO的核磁共振氢谱(E)；傅里叶变换红外光谱图(F)：自上而下为：PEGS-COOH、PEGS-COOH、PEGS-Az、PEGS-DBCO。

图3显示了本发明的水凝胶的成胶时间随温度的变化(A)：从左至右依次为37℃、25℃、10℃；本发明的水凝胶的成胶时间随聚合物浓度的变化(B)：从左至右依次为20wt％、15wt％、10wt％；本发明的水凝胶的溶胶凝胶转变的实物照片(C)；本发明的水凝胶的微观形貌示意图(D)。

图4显示了本发明的水凝胶的初始模量随PEG嵌段分子量与交联程度的变化(A)；蠕变时间随PEG嵌段分子量与交联程度的变化(B)；半松弛时间随PEG嵌段分子量与交联程度的变化(C)。

图5显示了骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同PEG嵌段分子量与交联程度的本发明的水凝胶上荧光图。

图6显示了本发明的水凝胶固载辣根过氧化物酶(HRP)释放曲线(A)；前24小时释放的HRP活性(B)；在水凝胶中3D培养的BMSCs随时间增殖的荧光染色图(C)。

图7显示了本发明的使用PEGS

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种具备优异的流变性能，具有粘弹性，体内环境下能实现快速自交联，可填充复杂的缺损结构的可通过注射方式形成的水凝胶。

具体地，所述的水凝胶引入了粘弹性可调的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)作为水凝胶的基体，构建了基于点击化学的PEGS的可注射水凝胶体系。所述水凝胶注射性能优良，可在体内环境下快速固化成型，无需催化剂，且交联过程温和，对宿主生物体无明显毒性，为生长因子的负载提供了可能。

本发明的水凝胶不仅具有优异的粘弹性和生物活性，以及良好的细胞相容性和促分化性能，而且具备理想的组织修复效果和临床适用性，使得该材料的植入无需开放性手术，方便了医生操作的同时减少了患者的痛苦，为微创治疗组织再生技术提供了新的可选择材料和设计思路。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“PEG”、“聚乙二醇”可互换使用。

如本文所用，术语“PGS”、“聚癸二酸甘油酯”可互换使用。

如本文所用，术语“PEGS”、“PEG化聚癸二酸甘油酯”、“聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯”、“PEGS高分子”可互换使用。

如本文所用，术语“PGS-OH”代表不含PEG组分的由癸二酸(二酸单体)与癸二酸二缩水甘油酯(二缩水甘油单体)聚合得到的共聚物。

如本文所用，术语“PEG-OH”代表不含癸二酸组分的由聚乙二醇二羧酸(二酸单体)与聚乙二醇二缩水甘油酯(二缩水甘油酯单体)聚合得到的共聚物。

如本文所用，术语“PEGS-COOH”、“羧基化PEGS-OH”可互换使用，是指侧链羧基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯。

如本文所用，术语“Az”、“NH

如本文所用，术语“PEGS-Az”是指向羧基化PEGS-OH上接枝3-叠氮基丙胺得到的侧链含叠氮基的羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯。

如本文所用，术语“DBCO”、“二苯并环辛炔”可互换使用。

如本文所用，术语“NH

如本文所用，术语“PEGS-DBCO”是指向羧基化PEGS-OH上接枝氨基化二苯并环辛炔得到的侧链含二苯并环辛炔基的羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯。

如本文所用，术语“DIC”、“N,N’-二异丙基碳二亚胺”可互换使用。

如本文所用，术语“NHS”、“N-羟基琥珀酰亚胺”可互换使用。

如本文所用，术语“TEA”、“三乙胺”可互换使用。

如本文所用，术语“环氧丙醇”、“缩水甘油”可互换使用。

如本文所用，术语“磷酸盐缓冲液”、“PBS”可互换使用。

如本文所用，术语“骨髓间充质干细胞”、“BMSCs”可互换使用。

如本文所用，术语“辣根过氧化物酶”、“HRP”可互换使用。

如本文所用，术语“番红固绿组织切片染色”、“Safranin-O”可互换使用。

多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)

如本文所用，术语“PEGS-OH”、“多羟基的PEG化聚癸二酸甘油酯”、“多羟基的聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯”、“多羟基PEGS”可互换使用，是指本发明制备的具有高羟基含量的聚乙二醇、癸二酸、甘油的三组分嵌段共聚(交替共聚)的高度规整的线性聚合物，其中-OH代表多羟基的高分子。PEGS

所述的聚合物包括两种结构，PEGS-OH-1和/或PEGS-OH-2，分别如式IIIa和式Ib所示：

其中，式Ia中，m

式Ib中，m

所述的聚合物的一个结构单元包括一个癸二酸组份，一个聚乙二醇组份与两个甘油组份，高含量的甘油组份使得其羟基含量大幅提升，同时大大地扩大了其接枝改性的可能。

所述的聚合物相对于聚乙二醇、癸二酸、甘油直接缩聚得到的无规支化PEGS具有更多的羟基以及更高的结构规整度，更低的分子量分布。

所述的聚合物的PEG嵌段的分子量可进行调节，优选为200～700Da，更优选250～600Da，例如250Da、500Da、600Da。

所述的聚合物具有以下一个或多个特征：

(a)数均分子量为6.0-20.0kDa，优选7.0-16.0kDa，更优选10.0-15.5kDa；

(b)分散性系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7。

所述的聚合物能溶解在水、二甲基亚砜、N,N’-二甲基甲酰胺、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氢呋喃以及二氯甲烷中。

所述的聚合物不溶解于乙醚与正己烷中。

所述的聚合物的数均分子量由聚合反应的反应时间决定。

所述的聚合物以癸二酸的羧基单体和聚乙二醇的缩水甘油酯单体(PEGS-OH-1)，或以癸二酸的缩水甘油酯单体和聚乙二醇的羧基单体(PEGS-OH-2)制备在催化剂作用下进行制备的。

所述的聚合物使用酸诱导环氧开环聚合，在酸催化剂作用下，羧酸根与缩水甘油酯中的环氧基反应，反应活性高，因此鲜有支化反应发生。且羧基单体之间和缩水甘油酯单体之间无法发生聚合物反应，因此，只需将两种单体与催化剂直接混合，即可获得规整的交替共聚(即嵌段共聚)线性聚合物。

所述的聚合物是一种同时具备弹性链段PGS和柔性链段PEG的嵌段结构，其分子量、分子量分布、羟基含量、热力学性能可通过反应时间，PEG链段长度进行调控和优化。多羟基PEGS具有许多侧羟基，能够接枝改性使其具备不同的性能，用于不同的领域，是一种具有广泛应用前景的高分子材料。

所述的聚合物同时具备聚癸二酸甘油酯的高弹性和聚乙二醇的柔性和亲水性，因此是制备水凝胶的优异的基体材料。

多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯的制备方法

本发明提供了一种多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯的制备方法，包括如下步骤：

(i)提供二羧基与二缩水甘油酯为单体、双四正丁基氢氧化铵盐为催化剂、N,N’-二甲基甲酰胺为溶剂；

(ii)在手套箱中，将单体与催化剂溶解在溶剂中，惰性气体条件下加热搅拌一段时间得到多羟基PEGS高分子；

在所述步骤(i)中，二缩水甘油酯单体：癸二酸二缩水甘油酯(单体1)分子量为314.37Da，PEG二缩水甘油酯(单体4)分子量为500Da；

二羧基单体：羧基化PEG(单体2)分子量为250Da或600Da，癸二酸(单体3)分子量为202.25Da；

催化剂双四正丁基氢氧化铵盐中，羧酸成分可以为羧基化PEG(催化剂1)，分子量250Da或600Da；癸二酸(催化剂2)，分子量202.25Da。

在所述步骤(i)中，

单体1、单体2、催化剂1同时加入反应体系中，从而得到如式Ia所示的PEGS-OH-1；

单体3、单体4、催化剂2同时加入反应体系中，从而得到如式Ib所示的PEGS-OH-2。

在所述步骤(ii)中，

单体投料摩尔比为1:1，催化剂用量为0.6mol％；

惰性氛围气体可以为氩气或高纯氮气；

反应温度为100℃，反应时间为1-3天。

所述多羟基PEGS高分子随着反应时间的延长，分子量在6.0-15.5kDa可调，PDI为1.1-2.0。

所述的制备方法包括如下步骤：

(a1)在氩气的氛围保护下，将摩尔比为1∶1的二酸和二缩水甘油酯溶于溶剂中(其中二酸可为癸二酸、分子量250Da的羧基化PEG或分子量600Da的羧基化PEG；二缩水甘油酯可为癸二酸二缩水甘油酯或分子量500Da的聚乙二醇二缩水甘油酯)，加入摩尔比为0.6mol％的双四正丁基氢氧化铵盐催化剂(其中铵盐的羧酸部分可为癸二酸、分子量250Da的羧基化PEG或分子量600Da的羧基化PEG)，在90-120℃(更佳地100℃)反应1-3天；

(b1)将步骤(a1)的产物于于乙醚中沉降后，在室温下真空干燥6-12小时(更佳地10-12小时)，得到多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯高分子；

(c1)透析纯化步骤(b1)获得的PEGS高分子得到纯化的所述聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯。

叠氮基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(第一聚合物)

本发明所述的叠氮基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯是指侧链修饰叠氮基的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯聚合物。

如本文所用，术语“叠氮基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯”、“第一聚合物”可互换使用，是指用于制备本发明的水凝胶前体溶液A的组分。

根据多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)的两种结构，所述的第一聚合物可包括如式Ia和/或Ib所示的结构单元：

其中，

式Ia中，X

式Ib中，X

“

所述的

所述的

所述的第一聚合物是以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯为主链，侧链末端修饰叠氮基的聚合物。

所述的第一聚合物以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)为主体聚合物，侧链羧基化后，通过酰胺键接枝叠氮基胺得到。

所述的侧链羧基化试剂为C4-C8的二酸酐、C2-C8的二酸，优选C4-C6的二酸酐，例如丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐。

所述的二酸酐的接枝率至少80％，优选至少90％，例如95％、97％、100％。

所述的接枝叠氮基胺的试剂为C0-C6叠氮基胺，优选3-叠氮基丙胺(Az)、4-叠氮基-1-丁胺。

所述的使用丁二酸酐为侧链羧基化试剂，3-叠氮基丙胺(Az)为接枝叠氮基胺的试剂得到的第一聚合物(PEGS-Az)包括如式IV所示的结构单元：

其中，3-叠氮基丙胺(Az)的接枝率超过60％，优选超过80％，例如90％、100％；

a

所述的第一聚合物具有以下一个或多个特征：

(a)每个结构单元平均至少包括1.2个叠氮基，优选至少1.6个，更优选至少1.8个；

(b)数均分子量为6.0-20.0kDa，优选7.0-16.0kDa，更优选10.0-15.5kDa；

(c)分散系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7。

所述的第一聚合物中叠氮基的接枝率可用于调节本发明的水凝胶的交联度。

环状炔基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(第二聚合物)

本发明所述的环状炔基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯是指侧链修饰环状炔基的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯聚合物。

如本文所用，术语“环状炔基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯”、“第二聚合物”可互换使用，是指用于制备本发明的水凝胶前体溶液B的组分。

根据多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)的两种结构，所述的第二聚合物可包括如式IIa和/或IIb所示的结构单元：

其中，式IIa中，Y

式IIb中，Y

“

所述的

所述的

所述的

所述的

所述的第二聚合物是以多羟基的聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)为主链，侧链末端修饰环状炔基的聚合物。

所述的第二聚合物以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯为主体聚合物，侧链羧基化后，通过酰胺键接枝氨基化的环炔得到。

所述的第二聚合物以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯为主体聚合物，侧链羧基化后，通过酰胺键接枝氨基化的二苯并环辛炔得到。

所述的侧链羧基化试剂为C4-C8的二酸酐，优选C4-C6的二酸酐，例如丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐。

所述的二酸酐的接枝率至少80％，优选至少90％，例如95％、97％、100％。

所述的氨基化的二苯并环辛炔选自下组：

DBCO-胺(DBCO-Amine)，其化学结构式为：

DBCO-PEG(3-12)-胺(DBCO-PEG(3-12)-Amine)，其化学结构式为：

磺酸DBCO-胺(Sulfo DBCO-Amine)，其化学结构式为：

所述的第二聚合物是以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯直接接枝羧基化的二苯并环辛炔得到。

所述的羧基化的二苯并环辛炔选自下组：

DBCO-酸(DBCO-Acid)，其化学结构式为：

DBCO-(C

DBCO-PEG(3-12)-酸(DBCO-PEG(3-12)-Acid)，其化学结构式为：

所述的第二聚合物中，Y

所述的使用丁二酸酐为侧链羧基化试剂，接枝氨基化的二苯并环辛炔得到的第二聚合物包括如式V所示的结构单元：

其中，氨基化二苯并环辛炔的接枝率超过60％，优选超过80％，例如90％、100％；

c

所述的第二聚合物具有以下一个或多个特征：

(a)每个结构单元平均至少包括1.2个环状炔基，优选至少1.6个，更优选至少1.8个；

(b)数均分子量为6.0-20.0kDa，优选7.0-16.0kDa，更优选10.0-15.5kDa；

(c)分散系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7。

所述的第二聚合物的环状炔基的接枝率可用于调节所述粘弹性水凝胶的交联度。

所述的a

所述的a

所述的b

所述的第一聚合物和所述的第二聚合物使用相同的侧链羧基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-COOH)，分别接枝叠氮基和环状炔基得到。

本发明的水凝胶

水凝胶是一类能够吸收并保有大量水分的具有三维交联网络的聚合物材料。本发明提供了一种粘弹性可调的、粘附力强的可通过注射形式形成的水凝胶。

如本文所用，术语“粘弹性水凝胶”、“本发明的水凝胶”、“PEGS水凝胶”、“可注射水凝胶”可互换使用，是指以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)为主要基体材料，由本发明使用水凝胶前体溶液A和水凝胶前体溶液B，可通过双针筒注射器注射的方式注射至相关部位从而混合，快速交联成胶得到具有可调节的粘弹性的水凝胶材料。

本发明所述的水凝胶通过包括第一聚合物的水凝胶前体溶液A和包括第二聚合物的水凝胶前体溶液B经交联反应形成；

其中，所述的第一聚合物包括叠氮基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯；

所述的第二聚合物包括环状炔基化的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯；

所述的第一聚合物和第二聚合物的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2，优选1：1。

本发明所述的水凝胶通过第一聚合物和第二聚合物之间的点击化学反应，快速交联得到。

基于第一聚合物与溶剂的总质量，所述第一聚合物在水凝胶前体溶液A中的含量为总质量的10wt％-100wt％，优选10wt％-20wt％，例如20wt％、15wt％、10wt％。

基于第二聚合物与溶剂的总质量，所述第二聚合物在水凝胶前体溶液B中的含量为总质量的10wt％-100wt％，优选10wt％-20wt％，例如20wt％、15wt％、10wt％。

所述的水凝胶的交联度为50％～100％，优选60％～100％。

所述的水凝胶的交联度由叠氮基和/或环状炔基的接枝率调节；其中，所述的叠氮基和/或环状炔基的接枝率由相应接枝试剂的投料比(投料量占侧链羧基化PEGS-OH的比例)调节。

所述的粘弹性水凝胶的粘弹性能、力学性能可通过多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯中PEG嵌段分子量(PEG嵌段长度)进行调节和优化。

本发明中的水凝胶的流变性能、力学性质、凝胶时间、细胞行为和组织修复能力均可通过调控聚合物中聚乙二醇嵌段的分子量和水凝胶的交联程度进行优化

所述的粘弹性水凝胶具有以下一个或多个特征：

(1)弹性模量在0.01～3MPa之间，优选在0.01～2MPa之间；

(2)蠕变时间在50～2500s之间，优选在100～2000s之间；

(3)半松弛时间在10～2000s之间，优选在20～1000s之间。

所述的粘弹性水凝胶的杨氏模量为1.575-0.011MPa，蠕变时间在1819.63-110.34s，半松弛时间在1132-20s。

所述的水凝胶的粘弹性可通过多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯主链中PEG嵌段的分子量和/或水凝胶的交联度进行调节。PEG嵌段分子量越低，相对的PGS嵌段越长，或水凝胶的交联度越高，该水凝胶的弹性越好；PEG嵌段分子量越大，相对的PGS嵌段越段，或水凝胶的交联度越低，该水凝胶的粘性越好。

本发明的水凝胶的制备方法

本发明提供了一种制备本发明所述的粘弹性水凝胶的方法，包括如下步骤：

(a)在手套箱中，向PEGS-OH高分子中加入丁二酸酐使其羧基化，再以N,N’-二异丙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺为催化剂，分别向羧基化PEGS-OH上接枝3-叠氮基丙胺与氨基化二苯并环辛炔，形成PEGS-Az与PEGS-DBCO双组份；

(b)将双组份取等质量分别填充进双针筒注射器中，注射后形成粘弹性固体—PEGS水凝胶。

在所述步骤(i)中，

丁二酸酐的量为PEGS-OH中羟基摩尔量的1.2倍，溶剂为无水N,N’-二甲基甲酰胺，反应温度为100℃，反应时间为1小时；

N,N’-二异丙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺投料量为PEGS-COOH中羧基摩尔量的1.2倍；

3-叠氮基丙胺与氨基化二苯并环辛炔投料量为PEGS-COOH中羧基摩尔量的100％，80％，60％；

加入三乙胺调节pH为8.0，反应温度为37℃，反应时间为6小时。

在所述步骤(ii)中，高分子溶液浓度为20wt％、15wt％、10wt％；凝胶温度为37℃、25℃、10℃。

所述制备方法包括以下步骤：

(i)提供多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯高分子(多羟基PEGS)、丁二酸酐、3-叠氮基丙胺(NH

(ii)在手套箱中，将多羟基PEGS溶解在溶剂中，加入丁二酸酐100℃反应1小时得到羧基化PEGS-OH；

(iii)在手套箱中，将上述羧基化PEGS-OH溶解在溶剂中，依次加入TEA、DIC、NHS、NH

(iv)将上述PEGS-Az与PEGS-DBCO配成水溶液分别填充至双针筒注射器中，得到本发明的水凝胶。

所述羧基化PEGS-OH接枝率为100％。

所述PEGS-Az接枝率为100％、80％、60％。

所述PEGS-DBCO接枝率为100％、80％、60％。

所述溶剂均为无水状态。

所述步骤(ii)中，手套箱操作包括下列步骤：

(a)打开手套箱真空泵与照明，打开高纯氮气瓶。

(b)在控制面板中，选择大传递舱、充气操作，使得大传递舱气压由负压恢复到常压状态；

(c)在手套箱外打开大传递舱，将所需物品放入，并关紧大传递舱；

(d)在控制面板中，选择大传递舱、真空操作，使得大传递舱内气压降至真空状态。再选择充气操作，使气压恢复至常压状态；

(e)重复d步骤三次，充分洗净大传递舱内空气；

(f)待大传递舱处于常压状态，在手套箱内部打开大传递舱，并取出所放物品；

(g)手套箱内称量并添加试剂，待实验结束后，密封反应容器；

(h)重复步骤b，将物品从手套箱内放入大传递舱；

(i)将手套箱内压调至4-1MPa，从手套箱外打开大传递舱并取出物品；

(j)关闭大传递舱并在控制面板中，选择大传递舱、真空操作，使得大传递舱内气压降至真空状态。

本发明的主要优点包括：

1)本发明所述的粘弹性水凝胶具有优异的可注射性、粘弹性和力学强度；

2)本发明所述的粘弹性水凝胶的混合物可通过注射至所需部位原位成胶，其成胶时间在30-150s之间可调节；

3)本发明所述的粘弹性水凝胶的流变性能、注射性能、力学性质、细胞行为和组织修复活性可通过对PEG嵌段的分子量和交联程度进行调控和优化；

4)本发明所述的粘弹性水凝胶可自由填充缺损部位，可在缺损处高度契合；

5)本发明所述的粘弹性水凝胶所具备的粘弹性有利于骨髓间充质干细胞的粘附与铺展，促进了组织再生，提高了修复质量；

6)本发明所述的粘弹性水凝胶所具备的微创属性让其在临床应用上具有可观的前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是摩尔百分比和摩尔份数。

合成路线如图1中A所示，具体包括以下步骤：

(a)取4.68mL的环氧丙醇和18.9mL三乙胺溶解于100mL甲苯中。在氩气氛围下，加入三口烧瓶中，并常温搅拌使其混合均匀；

(b)取6.08mL癸二酰氯溶解于8mL甲苯中，在氩气氛围下添加入恒压漏斗中；

(c)将反应装置转移至-5℃乙醇浴，并打开恒压漏斗的活塞，使(b)中癸二酰氯溶液滴加入(a)中混合溶液中。该反应中癸二酰氯相对于环氧丙醇的摩尔含量为50％，即反应的酰氯与羟基的摩尔比为1：1。

(d)反应6小时后，抽滤除去三乙胺盐酸盐，并旋蒸除去溶剂。通过柱层析纯化得到癸二酸二缩水甘油酯。

(e)在充满氩气氛围的手套箱中，称取2.39g癸二酸二缩水甘油酯、2.5g羧基化PEG，溶于DMF中，在100℃下加热搅拌1-3天。

(f)将预聚产物通过乙醇溶解-超纯水透析操作进行纯化，除去未反应的单体和小分子，得到纯化的多羟基PEGS高分子。

通过使用不同分子量的羧基化PEG(数均分子量分别为250Da、500Da、600Da)得到不同的多羟基PEGS高分子，分别命名为PEGS

其中，使用数均分子量为250Da的羧基化PEG得到的PEGS

所得多羟基PEGS高分子的核磁共振氢谱如图1中B所示，峰位置符合PEGS氢原子的理论结构。且在化学位移3.00ppm处，没有观察到环氧官能团的出峰，说明所有的环氧官能团被反应消耗完全，反应彻底。

所得多羟基PEGS高分子的傅里叶变换红外光谱如图1中C所示，其在3500cm

图1中D显示了通过凝胶渗透色谱对不同PEG嵌段分子量的多羟基PEGS高分子的分子量随反应时间的变化图，结果表明，PEGS-OH数均分子量随着反应时间的延长而增加，且受PEG嵌段分子量影响不明显，均在12kDa左右。

如图2中A所示，多羟基PEGS经化学接枝得到PEGS-Az与PEGS-DBCO，在注射过程中混合，并发生点击化学反应，得到一定交联程度的本发明的水凝胶。

其具体合成路线如图2中B所示，包括以下步骤：

(a)在手套箱中，取多羟基PEGS 7.03g，与丁二酸酐2.00g，充分溶解于DMF中，并混合搅拌均匀；

(b)装置密封并转移出手套箱，100℃加热1h；

(c)反应完毕后将产物透析除杂，并真空干燥过夜，得到黄色液体PEGS-COOH；

(d)在手套箱中，取上述PEGS-COOH 9.03g，并加入DIC 252.4g，NHS 230.18g，溶解于DMSO，室温活化3h；

(e)活化结束后，向步骤(d)的反应物中加入80μL三乙胺，混合均匀，并等分为两份；

(f)向其中一份加入25mg 3-叠氮基丙胺，向另一份加入50mg氨基化二苯并环辛炔，室温反应过夜；

(g)反应结束后，透析除去小分子与溶剂，随后真空干燥，分别得到PEGS-Az与PEGS-DBCO；

(h)将(g)中PEGS-Az与PEGS-DBCO等质量混合，得到本发明的水凝胶。

通过在合成过程中控制叠氮基/环状炔基的官能团接枝率即控制投料比的不同比例，即可得到具有不同交联度的本发明的水凝胶。例如，制备60％交联的本发明的水凝胶时，控制3-叠氮基丙胺投料量为PEGS-COOH羧基摩尔量的60％，氨基化二苯并环辛炔的投料量亦为PEGS-COOH羧基摩尔量的60％。

图2中C-E通过核磁共振氢谱对合成的PEGS-COOH、PEGS-Az以及PEGS-DBCO进行了结构的分析，可以看出，C中测量得到PEGS-COOH中无羟基峰，说明羧基接枝率达到了100％。D中测量得到PEGS-Az在标i、j、k(化学位移分别为3.45、1.91与1.40ppm)处有明显的-C

图2中F显示了全反射傅里叶红外光谱。首先在进行羧基化改性以后，PEGS-COOH对于PEGS-OH而言，其官能团出峰没有明显变化，这是因为羧基与羟基皆在3500cm

结果表明，成功制备了PEGS-Az和PEGS-DBCO，这两种聚合物可通过简单的混合，直接交联得到水凝胶。

旋转流变仪使用过程包括以下步骤：

(a)打开旋转流变仪(美国Thermo Hakke)，设定不同温度(37℃、25℃、10℃)并控温，频率设定在10Hz，应变设定在1.0％；

(b)称取等质量的PEGS-Az与PEGS-DBCO高分子，溶于PBS并配置成不同浓度的高分子溶液(20％、15％、10％)；

(c)将(b)中高分子溶液装填于双针筒注射器的针筒内待用；

(d)利用(c)中双针筒注射器向20mm直径的钢制平行板上快速注射，并立即开始进行测试；

(e)记录储存模量(G’)与损耗模量(G”)随时间的变化。

图3中A显示了本发明的水凝胶的成胶时间随温度的变化，当储存模量曲线高于损耗模量曲线，说明已成胶，从图中可以看出，在前体溶液A和前体溶液B刚开始混合时，混合物的损耗模量大于储存模量，即混合后为液态，说明满足可注射要求。并且该反应随温度的上升而加快，成胶时间显著缩短，37℃时，70s内即可发生溶胶凝胶转变；当温度低至10℃时，在10min的测试时间里几乎检测不到完全的溶胶凝胶转变发生。

图3中B显示了本发明的水凝胶的成胶时间随聚合物浓度的变化，可以得知，成胶时间随浓度的增加而缩短，将浓度控制在15％左右，可以在约70s发生溶胶凝胶转变，适于手术的操作。

图3中C显示了本发明的水凝胶的溶胶凝胶转变的实物照片，该水凝胶可以在37℃下，水溶液里，1min左右实现凝胶化，斜置小瓶，原本流动的高分子溶液不再具备流动性，证明完成了溶胶凝胶转变。图3中D显示了本发明的水凝胶的表观形貌图，明显的微米级孔洞无规地分布在水凝胶表面，这有利于细胞的迁移生长，促进组织修复过程中营养物质及氧气的输送，在成骨过程中还有利于血管的生成与长入。

由此可见，本发明的水凝胶成胶时间短，可通过注射形成，1min左右即可快速成胶，快速凝胶化防止了小分子在体内的扩散，是一类良好的可通过注射方式形成的组织修复材料。

为了考察水凝胶的拉伸模量与在拉伸状态下的粘弹性，本研究选取了不同PEG嵌段分子量(PEG嵌段长度)与交联程度(交联率)的本发明的水凝胶进行了拉伸性能的考察，每组待测样品设五个平行样，并对结果取平均值。拉伸模量测试时拉伸速率为10mm/min，直至拉断，记录应力应变曲线。

蠕变测试中，样条以50mm/min的速率被快速拉伸到恒定应力0.01MPa，并保持应力5000s，记录应变随时间的变化。

应力松弛测试中，样条同样以50mm/min的速率被快速拉伸到恒定应变5％，并保持应变10000s，记录应力随时间的变化。

从图4中A可以看出，本发明的水凝胶随PEG嵌段分子量的增加与交联程度的下降，其拉伸模量有一定程度的下降。100％交联的PGS-OH组模量达到了1.575MPa，而80％交联的PEG-OH模量低至了0.011MPa。这种力学性能的下降可能是由于柔性链段PEG的引入以及非交联点的增加所导致的。这说明PEG嵌段越短，相对的PGS嵌段越长，且交联度越高，本发明的水凝胶的力学性能越佳。

在粘弹性测试方面，从图4中B可以看出，本发明的水凝胶的蠕变时间随PEG的增加与交联程度的下降而缩短，即蠕变性能提升。80％交联的全部为PEG嵌段的PEG-OH的蠕变时间仅需110s，而100％交联的全部为PGS嵌段的PGS-OH在测试时间里达不到蠕变时间检测的要求，这说明PEG嵌段越短，相对的PGS嵌段越长，且交联度越高，该水凝胶的弹性越好；PEG嵌段越长，交联度越低，该水凝胶的粘性越好。换句话说，PGS部分与交联度有利于弹性的增加而PEG部分与非交联度有利于粘性的增加。

图4中C则表明，本发明的水凝胶的另一粘弹性参数，半松弛时间，与蠕变时间呈现了一致的规律，随着PEG嵌段长度的减少与交联度的增加，由80％交联PEG-OH组的20s上升到了在100％交联PGS-OH与PEGS

结果表明，本发明的水凝胶能够通过调节其PEG嵌段长度(PEG嵌段分子量)与交联程度，实现从弹性到粘性的转变。因此，可以得到不同粘弹性的本发明的水凝胶，用于不同组织的修复。

为研究本发明的水凝胶对细胞粘附的影响，将水凝胶注射入24孔板中，待其凝胶化后，每孔加入约10

从图5可以看到，粘性过高或过低都不利于细胞的粘附，其中80％交联的本发明的水凝胶组中检测到了最高的荧光强度，细胞的粘附性最好，即一定程度的粘弹性有利于细胞粘附。且在80％交联率的组别中，荧光强度随PEG的增加而上升，说明PEG的引入有利于改善高弹性PGS的亲水性与柔性，更有助于细胞粘附在本发明的水凝胶上。

对于本发明的水凝胶固载蛋白行为的考察，是选取辣根过氧化物酶(HRP)为模型蛋白考察水凝胶对蛋白的包裹及释放情况。在本发明的水凝胶中加入50mg/mL的HRP溶液10μL，并注射入模具中，待其固化成型，将载蛋白的水凝胶浸泡在1mL PBS中，并于37℃培养3天，每个时间点收集并更新PBS。所释放出的HRP活性以3,3',5,5'-四甲基联苯胺为底物，纯HRP为标准品进行测试。

从图6中A可以看出，在前12小时内，HRP有一定程度的突释，约释放30％，而后呈现出缓释的趋势，在72h时，释放量接近50％。且从图6中B可以看出，前24h所释放的活性与标准品接近，与标准品相比的相对活性约为100％，说明本发明的水凝胶具有良好的生物相容性，对所载蛋白的活性具有优异的维持作用。

对于本发明的水凝胶固载细胞行为的考察，则是将PEGS-Az与PEGS-DBCO溶解于α-MEM培养基，随后以10

从图6中C可以看出，BMSCs细胞在本发明的水凝胶中进行三维培养时，可随时间的推移进行增殖，说明本发明的水凝胶具有良好的细胞相容性，可以作为细胞载体应用在组织修复领域。

本发明的水凝胶的体内组织修复效果采用大鼠颅骨缺损模型进行评价。实验方案经上海市第九人民医院动物研究伦理委员会批准，符合相关准则。选取体重500g，年龄12周的雄性SD大鼠，每只单独饲养在独立控温、控光照、控湿度的笼子中。手术前，对每只大鼠进行全身麻醉，腹腔注射3.5mg/100g戊巴比妥钠。对每只大鼠头部进行剃毛，并消毒，沿颅骨中线从额骨至枕骨切开1cm长的切口，并将骨膜拨开，露出整个颅骨。待皮肤和骨膜缩回后，使用无菌生理盐水进行冲洗，在颅骨中线两侧用骨钻小心地钻出两个对称的、全厚度的临界大小5mm的颅骨缺损。将不同交联程度的PEGS

结果表明，对于PEGS

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。