一种提高非洲猪瘟病毒增殖能力的方法

摘要

本发明提供了一种提高非洲猪瘟病毒增殖能力的方法，属于微生物应用领域。本发明方法包括如下步骤：S1、将猪原代肺泡巨噬细胞的细胞悬液接种于细胞培养板中，静置3～5h待其贴壁；S2、将非洲猪瘟病毒液和洁酸键稀释液均匀混合，24～26℃条件下孵育0～4h，加入培养基，得到混合液；用所得混合液替换细胞培养板中的培养液，培养1.5～2.5h；S3、用含10％胎牛血清的培养基再次替换细胞培养板中的培养液，培养4～6d。该方法不仅能够增强非洲猪瘟病毒的感染效率，节约实验室猪原代肺泡巨噬细胞的制备时间和成本，还能为高效地进行非洲猪瘟病毒的分离、疫情监测、疫苗的研发和生产提供基础数据支持。

说明书

技术领域

本发明属于微生物应用领域病毒培养技术，具体涉及一种提高非洲猪瘟病毒增殖能力的方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV) 引起的一种急性、热性、出血性的猪传染病，急性感染死亡率为100％。ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的法定动物疫病之一，我国将其列为一类动物疫病。ASFV是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，在病毒分类中属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，也是目前已知的唯一的虫媒性DNA病毒。ASFV 基因组全长约为170～190kb，有151～167个开放阅读框(Open readingframes，ORFs)。ASF 表现出多种临床表型，急性和亚急性ASF常在多种器官上表现出严重的血管性病变，如肾脏出血、淋巴结弥漫性出血、肺水肿、脾脏充血性肿大、弥散性血管内凝血和血小板减少等。其主要临床症状是高热、皮肤发绀、出血点、呕吐、腹泻和便血等。

1921年，在非洲的肯尼亚地区首次发现ASF。1957年，欧洲的葡萄牙第一次暴发ASF疫情，经过一段时间沉默后，于1960年在欧洲的一些国家出现并逐渐传播，2007年底进入俄罗斯。近年来东欧一些国家不断发生疫情，国际疫情形势十分严峻。2018年8月3日，农业农村部公布了辽宁省出现我国首例ASF疫情，两年多来给我国养猪行业带来巨大的危害，大大限制了猪产品的生产和贸易往来，同时也给生猪相关产业造成了巨大的经济损失。

有研究表明，ASFV感染周期起始于病毒吸附并进入宿主细胞。早期研究发现ASFV入侵猪肺泡巨噬细胞是通过受体介导的内吞作用机制，呈低pH和温度依赖性。目前，除个别细胞适应株，如BA71V、Georgia2007/1等病毒株能够在非洲绿猴肾细胞Vero细胞中复制外，绝大多数的ASFV毒株只能在来源于外周血或各种组织的巨噬细胞(如肺泡巨噬细胞)和单核细胞中进行复制和增殖。这些原代细胞因制备成本昂贵、制备过程繁琐耗时，在实验室尤为珍贵。这一特点为ASFV活病毒的体外检测提高了成本、加大了病毒相关研究的难度。此外，ASF疫情监测主要包括ASFV的核酸检测和病毒分离，ASF病毒分离是ASF病原学监测的重要基础，能够及时发现病毒的变异情况，在病毒的疫苗研发中起着十分重要的作用。因此提高ASFV的增殖效率将为病毒机制的研究、疫情的流行病学监测、疫苗的研发和生产提供重要的基础。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种提高非洲猪瘟病毒增殖能力的方法。该方法成本低廉，易于操作。

一种提高非洲猪瘟病毒增殖能力的方法，包括如下步骤：

S1、将猪原代肺泡巨噬细胞的细胞悬液接种于细胞培养板中，静置3～5h待其贴壁；

S2、将非洲猪瘟病毒液和洁酸键稀释液均匀混合，24～26℃条件下孵育0～4h，加入培养基，得到混合液；用所得混合液替换细胞培养板中的培养液，培养1.5～2.5h；

S3、用含10％胎牛血清(FBS)的培养基再次替换细胞培养板中的培养液，培养4～6d。

步骤S1中所述的猪原代肺泡巨噬细胞的细胞悬液的细胞密度为10

步骤S1中所述的静置的时间优选为4h。

步骤S1中所述的静置的条件优选为37℃，5％CO

步骤S2中所述的非洲猪瘟病毒液的TCID

步骤S2中所述的洁酸键稀释液的pH为2.75。

步骤S2和S3中所述的培养基优选为RPMI 1640培养基。

步骤S2中所述的孵育的时间优选为0h。

步骤S2中所述的培养的时间优选为2h。

步骤S3中所述的培养的时间优选为5d。

步骤S2和S3中所述的培养的条件为37℃，5％CO

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过对ASFV增殖条件进行优化，筛选出最佳室温孵育时间，有效地提高了ASFV 的分离效果。利用该技术能够提高ASFV的增殖效率，节约实验室猪原代肺泡巨噬细胞制备的时间和成本，在ASF的流行病学研究中提升ASF监测的工作效率和监测质量，为ASF疫情防控和疫苗制备提供基础数据。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

除特殊说明，下述实施例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为市售得到。

洁酸键购自广东腾骏生物营养科技有限公司，产品标准编号：Q/TJ28-2019。

ASFV病毒为“中国非洲猪瘟区域实验室(广州)”保存毒株ASFV/China/GZ201801，已在专利CN110964849A中公开。

肺泡巨噬细胞来源于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)抗原抗体检测均为阴性的健康仔猪。其制备方法为：预冷含2×青链霉素的PBS，每个肺脏约2 L。高压蒸汽灭菌1L烧杯、刀片、剪刀、止血钳、镊子、纱布若干。解剖4周龄蓝耳伪狂双阴性猪直至暴露气管，小心地将气管周围的血管和组织剥离以避免血液污染，使用两把止血钳相向固定住气管后，用刀片切掉止血钳上方多余的气管；在保证肺部完整的情况下将肺脏从猪的胸腔取出，并迅速放入预冷的含2×青链霉素的PBS中以保持肺部湿润。转入生物安全柜中操作：将预冷的2×青链霉素的PBS通过气管缓慢灌入肺中，同时轻柔拍打按摩直至整个肺部充盈并可以看到灌洗液在气管处液面不再下降为止；将肺部灌洗液经70μM细胞滤器转移到50mL离心管中，500g，4℃条件下离心10min；弃去上清液，用5mL PBS重悬细胞并将9管细胞合为一管，500g，4℃条件下离心10min。弃去上清液，用10mL RPMI1640 培养基重悬细胞，并将每个肺灌洗下的细胞最终合为一管；对每个肺的细胞进行计数后以(2～ 4)×10

实施例1

(1)将洁酸键用蒸馏水稀释到1:2000后测定pH值。

(2)从液氮罐中取出细胞冻存管，直接浸入37℃恒温水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化；融化后打开盖子，将细胞悬液移入离心管中，并加入10倍以上RPMI 1640培养基后混匀；800g离心5min后弃去上清液，加入含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度至10

(3)每个试验组分别加入2400μL RPMI 1640培养基，使猪原代肺泡巨噬细胞能够正常生长，同时保证ASFV能够在细胞中复制。将24孔细胞板中培养液吸出，把上述四个试验组的混合液分别加入相应孔中，每组接种3个孔，每孔500μL。然后置于37℃，5％CO

(4)每天观察细胞状态，分别在5d收取细胞及其培养液，提取DNA后，采用中华人民共和国国家标准GB/T18648-2020《非洲猪瘟诊断技术》中推荐的荧光定量PCR方法测定 Ct值。

鉴定引物及探针序列分别为：

CADC-rPCR-F：5’-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3’

CADC-rPCR-R：5’-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3’

CADC-Probe：5’-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3’

反应体系为：20μL：Universal U+Probe Master Mix V2 10μL，上下游引物(10μmol/L) 各0.4μL，探针引物0.2μL，模板2μL，灭菌蒸馏水补足至20μL。

反应条件为：37℃2min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，45个循环；72℃延伸5min。

在步骤1中，浓度为1:2000洁酸键现配现用，其pH值测定结果为2.75。

在步骤4中，各试验组经荧光定量PCR方法测定Ct值分别为：空白对照组Ct值：37.20；消毒药阴性对照组Ct值：36.52；消毒药试验组Ct值：18.53；阳性对照组Ct值：26.13。结果表明，与阳性对照组相比，当病毒与洁酸键室温条件下孵育0h可显著提高病毒的增殖能力。

实施例2

(1)将洁酸键用蒸馏水稀释到1:2000后测定pH值。

(2)。从液氮罐中取出细胞冻存管，直接浸入37℃恒温水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化；融化后打开盖子，将细胞悬液移入离心管中，并加入10倍以上RPMI 1640培养基后混匀；800g离心5min后弃去上清液，加入含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度至10

(3)每个试验组分别加入2400μL RPMI 1640培养基，使猪原代肺泡巨噬细胞能够正常生长，同时保证ASFV能够在细胞中复制。将24孔细胞板中培养液吸出，把上述四个试验组的混合液分别加入相应孔中，接种3个孔，每孔500μL。然后置于37℃，5％CO

(4)每天观察细胞状态，分别在5d收取细胞及其培养液，提取DNA后，采用中华人民共和国国家标准GB/T18648-2020《非洲猪瘟诊断技术》中推荐的荧光定量PCR方法测定 Ct值。

在步骤1中，浓度为1:2000洁酸键现配现用，其pH值测定结果为2.75。

在步骤4中，各试验组经荧光定量PCR方法测定Ct值分别为：空白对照组Ct值：36.89；消毒药阴性对照组Ct值：37.11；消毒药试验组Ct值：21.02；阳性对照组Ct值：25.93。结果表明，与阳性对照组相比，当病毒与洁酸键室温条件下孵育1h可显著提高病毒的增殖能力。

实施例3

(1)将洁酸键用蒸馏水稀释到1:2000后测定pH值。

(2)从液氮罐中取出细胞冻存管，直接浸入37℃恒温水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化；融化后打开盖子，将细胞悬液移入离心管中，并加入10倍以上RPMI 1640培养基后混匀；800g离心5min后弃去上清液，加入含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度至10

(3)每个试验组分别加入2400μL RPMI 1640培养基，使猪原代肺泡巨噬细胞能够正常生长，同时保证ASFV能够在细胞中复制。将24孔细胞板中培养液吸出，把上述四个试验组的混合液分别加入相应孔中，接种3个孔，每孔500μL。然后置于37℃，5％CO

(4)每天观察细胞状态，分别在5d收取细胞及其培养液，提取DNA后，采用中华人民共和国国家标准GB/T18648-2020《非洲猪瘟诊断技术》中推荐的荧光定量PCR方法测定 Ct值。

在步骤1中，浓度为1:2000洁酸键现配现用，其pH值测定结果为2.75。

在步骤4中，各试验组经荧光定量PCR方法测定Ct值分别为：空白对照组Ct值：38.85；消毒药阴性对照组Ct值：36.20；消毒药试验组Ct值：20.49；阳性对照组Ct值：25.10。结果表明，与阳性对照组相比，当病毒与洁酸键室温条件下孵育2h可显著提高病毒的增殖能力。

实施例4

(1)将洁酸键用蒸馏水稀释到1:2000后测定pH值。

(2)从液氮罐中取出细胞冻存管，直接浸入37℃恒温水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化；融化后打开盖子，将细胞悬液移入离心管中，并加入10倍以上RPMI 1640培养基后混匀；800g离心5min后弃去上清液，加入含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度至10

(3)每个试验组分别加入2400μL RPMI 1640培养基，使猪原代肺泡巨噬细胞能够正常生长，同时保证ASFV能够在细胞中复制。将24孔细胞板中培养液吸出，把上述四个试验组的混合液分别加入相应孔中，接种3个孔，每孔500μL。然后置于37℃，5％CO

(4)每天观察细胞状态，分别在5d收取细胞及其培养液，提取DNA后，采用中华人民共和国国家标准GB/T18648-2020《非洲猪瘟诊断技术》中推荐的荧光定量PCR方法测定 Ct值。

在步骤1中，浓度为1:2000洁酸键现配现用，其pH值测定结果为2.75。

在步骤4中，各试验组经荧光定量PCR方法测定Ct值分别为：空白对照组Ct值：32.83；消毒药阴性对照组Ct值：32.48；消毒药试验组Ct值：19.01；阳性对照组Ct值：24.66。结果表明，与阳性对照组相比，当病毒与洁酸键室温条件下孵育4h可显著提高病毒的增殖能力。

实施例1-4的实验统计结果如下表1所示：

表1实施例1-4的实验统计结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120>一种提高非洲猪瘟病毒增殖能力的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CADC-rPCR-F

<400> 1

atagagatac agctcttcca g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CADC-rPCR-R

<400> 2

gtatgtaaga gctgcagaac 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CADC-Probe

<400> 3

tatcgataag attgat 16