检测梅毒螺旋体的引物和试剂盒

摘要

本发明公开了检测梅毒的引物，其特征在于，所述引物包括：扩增梅毒的扩增引物和测序引物，测序引物与扩增引物相同；其碱基序列为：TV F1：CTGGTCTCGGCACACTCCTT；TV R1：GAGCGAAGCCAACGATGAAGAA。本发明具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点。

说明书

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及检测梅毒的引物和试剂盒。

背景技术

梅毒在全世界流行，据WHO估计，全球每年约有1200万新发病例，主要 集中在南亚、东南亚和次撒哈拉非洲。所报告的梅毒中，潜伏梅毒占多数，一、 二期梅毒也较为常见，先天梅毒报告病例数也在增加。

梅毒患者的皮肤、黏膜中含梅毒螺旋体，未患病者在与梅毒患者的性接触中， 皮肤或黏膜若有细微破损则可得病。极少数可通过输血或途径传染。获得性梅毒 早期梅毒病人是传染源，95％以上是通过危险的或无保护的性行为传染，少数通 过接亲吻、输血、污染的衣物等传染。而且梅毒还可通过患梅毒的孕妇传染，传 染给胎儿的几率相当高。因此对梅毒螺旋体需要早发现早治疗。

通常实验室通过显微镜，暗视野下检测可见到运动的梅毒螺旋体，该方法需 要检测人员具有丰富的经验。或是通过梅毒血清学试验，如快速血浆反应素环状 卡片试验(RPR)、甲苯胺红不加热血清学试验(TRUST)、梅毒螺旋体颗粒凝 集试验(TPPA)、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验(TP-ELISA)等用于TP感染 的确证，免疫学方法有一定的窗口期。

本发明采用一代测序法检测，可以对梅毒螺旋体高度保守区域47kDa膜抗 原基因(tpp47基因)、39kDa碱性蛋白基因(bmp基因)，TPF1蛋白基因或 TYF1蛋白基因和TmpA基因进行特异性片段扩增，对扩增产物进行测序，测序 数据与标准序列比对，以鉴定是否为螺旋体，以及其变型情况进行鉴定。

发明内容

鉴于核酸检测是直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期 等优点。本发明提供了一种一代测序检测梅毒螺旋体的引物和试剂盒，用于检测 梅毒螺旋体核酸。

一种检测梅毒螺旋体的引物，其特征在于所述引物包括：扩增梅毒螺旋体的 扩增引物和测序引物，测序引物与扩增引物相同；其碱基序列为：

TV F1 CTGGTCTCGGCACACTCCTT

TV R1 GAGCGAAGCCAACGATGAAGAA。

供检测梅毒螺旋体的方法，包括以下步骤：

(1)用PCR扩增已提取的DNA；

(2)对步骤1中的扩增产物进行测序；

(3)对测序结果进行判断，鉴定梅毒螺旋体；

本发明的第二个目的是提供一种检测梅毒螺旋体的试剂盒，所述试剂盒包括 检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其特征在于，所述检测体系PCR 扩增反应液包括一对扩增引物TV F1、TV R1，所述测序体系反应液包括一对测 序引物TV F1、TV R1，其序列均为：

TV F1 CTGGTCTCGGCACACTCCTT

TV R1 GAGCGAAGCCAACGATGAAGAA。

进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括10×PCR Buffer；2mM dNTPs；KODFX DNA Polymerase(1U/μl)。

进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％ 乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；阳性对照品含TV 阳性质粒，序列如下：

cctcggcggtggcacaggcgctggtctcggcacactccttctcaacaagctccgtgaagagtacccagatcgtatcctctc cacatactccatcgtcccatctccaaaggtttctgatacagtcgtcgagccatacaactgcacactctccgtccaccag ctcgtcgaatctgctgatgaagttttctgcattgataacgaagctctttacgatatctgcttccgtacactcaagctcacaacac caacatacggcgatc ttaaccaccttgtttccatggttatgtccggcacaacatggctctccgc；

阴性对照品为去离子水。

有益效果：本发明设计了梅毒螺旋体的引物，采用PCR技术，构建了稳定 的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。

附图说明

图1是已知阴性样本T1S3、T1S4、T1S5、T1S6、T1S7、T1S8已知阳性样 本T1S1、T1S3、T1S9电泳图。

图2是样本T1S1、T1S2、T1S9一代测序检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中 未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥 斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所 建议的步骤和条件。

实施例1

检测梅毒螺旋体的试剂盒，包括

(1)检测体系PCR扩增反应液。包括：10×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；检测TV上、下游引物TV F1/R1(10μm)。

(2)测序体系反应液，包括测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA (125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测 TV的上、下游引物分别为TV F1/R1(3.2μm)。

(3)阳性对照品和阴性对照品。

TV上、下游引物序列为：

TV F1 CTGGTCTCGGCACACTCCTT

TV R1 GAGCGAAGCCAACGATGAAGAA。

阳性对照品含TV阳性质粒，序列如下：

cctcggcggtggcacaggcgctggtctcggcacactccttctcaacaagctccgtgaagagtacccagatcgtatc ctctccacatactccatcgtcccatctccaaaggtttctgatacagtcgtcgagccatacaactgcacactctccgtccaccag ctcgtcgaatctgctgatgaagttttctgcattgataacgaagctctttacgatatctgcttccgtacactcaagctcacaacac caaca tacggcgatc ttaaccaccttgtttccatggttatgtccggcacaacatggctctccgc

阴性对照品为去离子水。

实施例2

试剂配置：配制10个配检测体系PCR反应液，每份16μl分装。

加样：加入检测体系PCR反应液中4μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加4μl 阳性对照品和阴性对照品；空白对照加4μl生理盐水或不加任何物质。

1、PCR体系如下所示：体系20ul

2、PCR扩增程序

其中，引物序列为：

TV F1 CTGGTCTCGGCACACTCCTT

TV R1 GAGCGAAGCCAACGATGAAGAA

Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入 15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入 50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金 属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

结果判断：分别将测序结果与TV参考序列(GenBank:L05468.1)进行比 对，根据实际对结果进行报告。

图1是已知阴性样本T1S3、T1S4、T1S5、T1S6、T1S7、T1S8已知阳性样 本T1S1、T1S3、T1S9电泳图。

图2是样本T1S1、T1S2、T1S9一代测序检测结果。

序列表

<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司

<120> 检测梅毒螺旋体的引物和试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

ctggtctcgg cacactcctt 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gagcgaagcc aacgatgaag aa 22

<210> 3

<211> 309

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

cctcggcggt ggcacaggcg ctggtctcgg cacactcctt ctcaacaagc tccgtgaaga 60

gtacccagat cgtatcctct ccacatactc catcgtccca tctccaaagg tttctgatac 120

agtcgtcgag ccatacaact gcacactctc cgtccaccag ctcgtcgaat ctgctgatga 180

agttttctgc attgataacg aagctcttta cgatatctgc ttccgtacac tcaagctcac 240

aacaccaaca tacggcgatc ttaaccacct tgtttccatg gttatgtccg gcacaacatg 300

gctctccgc 309