一种利用黑曲霉去除水体中微塑料的方法

摘要

本发明公开了一种利用黑曲霉去除水体中微塑料的方法，其具体步骤为：将黑曲霉孢子接种于絮凝培养基中，摇床震荡培养至菌丝球形成，其中絮凝培养基的配方为：葡萄糖10 g、NaCl 24 g、NH4Cl 1 g、MgSO4×7H2O 0.5 g、酵母粉 0.6 g、K2HPO4×3H2O 6.5 g、KH2PO4 2 g和1 L蒸馏水；分别将菌丝球和发酵液加入到微塑料水体中并不断震荡，采用黑曲霉菌丝球对水体中微塑料的包裹效果实现对水体中微塑料的快速去除。本发明采用黑曲霉菌丝球对水体中微塑料的包裹效果实现对水体中微塑料的去除，与其它清除微塑料的方法相比，作用效果更高、时间更短、应用潜力更大，为水体中微塑料的去除提供有效的依据和新的选择。

说明书

技术领域

本发明属于水环境保护与治理技术领域，具体涉及一种利用黑曲霉去除水体中微塑料的方法。

背景技术

微塑料(Microplastic)指的是直径小于5mm的塑料碎片和颗粒，最早由汤普森等在《Science》杂志上发表的关于海洋水体和沉积物中塑料碎片一文首次提出微塑料概念，主要包括水环境中的塑料颗粒工业产品和经过物理、化学和生物过程造成分裂而成的塑料颗粒。微塑料分布广泛，包括淡水水体、海洋、极地地区、海岛、深海大洋底部。并且微塑料的化学性质稳定，难以降解，会在水体中存在数百年以上。微塑料对水生生物的健康造成巨大威胁，可被浮游动物摄入体内，降低浮游动物摄食量，造成营养不良，还会影响海洋浮游动物的产卵量和繁殖能力。微塑料还可以与其它化学物质联合作用，对海洋生物造成严重威胁。食物链的顶端生物是人类，人类在富集的作用下，会累积大量的微塑料在体内，这些难以消化的小颗粒对人产生难以预测的危害。

微塑料作为一种新型水体污染物，广泛分布于各种水体环境，已经成为国际社会普遍关注的热点环境问题，如何解决水体中微塑料的污染问题成为当前水环境保护与治理领域的重点和难点。关于微塑料降解的研究已有不少报道，主要集中于利用各种微生物，如细菌、真菌、放线菌、原生动物等对微塑料的降解，以期降低水体中微塑料的含量，从而减少微塑料对环境的危害。但是，由于微塑料的化学性质稳定，微生物对微塑料的降解效果较差，降解时间很长，很难将微生物应用于降解微塑料的实际应用中。而微塑料个体很小，在水环境中呈悬浮状态，通过常规的打捞、过滤等物理方法很难对微塑料进行收集。因此，需要开发一种简单、高效地方法在实际生产中解决水体中微塑料的污染问题。

黑曲霉是一种有益真菌，常被用于生产各种风味食品。其孢子在液体培养条件下萌发，形成菌丝球，而菌丝球能够在短时间内包裹水体中的微塑料，再收集菌丝球，从而实现微塑料的快速去除。本发明能够填补水体中微塑料去除的空白，有效地解决微塑料污染问题，具有很高的应用价值和较高的潜力。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种利用黑曲霉去除水体中微塑料的方法，该方法能够实现水体中微塑料的快速去除。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用黑曲霉去除水体中微塑料的方法，其特征在于具体步骤为：

步骤S1：将黑曲霉孢子接种于絮凝培养基中，摇床震荡培养至菌丝球形成，其中絮凝培养基的配方为：葡萄糖10g、NaCl 24g、NH

步骤S2：分别将菌丝球和发酵液加入到微塑料水体中并不断震荡，采用黑曲霉菌丝球对水体中微塑料的包裹效果实现对水体中微塑料的快速去除。

进一步限定，步骤S1的具体过程为：将浓度为3×10

进一步限定，步骤S2的具体过程为：将直径为0.4-0.6cm的菌丝球和发酵液上清分别按照10个/mL和5wt％的添加量加入到微塑料水体中，并于150rpm摇床震荡数天即可实现水体中微塑料的快速去除。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明提供了一种利用黑曲霉去除水体中微塑料的方法，采用黑曲霉菌丝球对水体中微塑料的包裹效果实现对水体中微塑料的去除，与其它清除微塑料的方法相比，作用效果更高、时间更短、应用潜力更大，为水体中微塑料的去除提供有效的依据和新的选择。

附图说明

图1是黑曲霉的进化树和菌丝形态图；

图2是成熟菌丝球对聚乙烯的去除效果图；

图3是成熟菌丝球对聚氯乙烯的去除效果图；

图4是发酵液中菌丝萌发过程中对聚乙烯的去除效果图；

图5是发酵液中菌丝萌发过程中对聚氯乙烯的去除效果图；

图6是显微观察发酵液中菌丝萌发过程中对聚氯乙烯的去除效果图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

黑曲霉的分子鉴定及菌丝形态观察

1)将黑曲霉的孢子接种于絮凝培养基，37℃温度下150rpm摇床震荡培养3-5d。提取菌丝基因组DNA，对其ITS序列进行PCR扩增，PCR引物为ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTCTTGATATGC)。PCR反应的条件为94℃，3min；94℃，30s；50℃，2s；4℃，30s(30循环)；20℃，3min。PCR产物纯化后送公司测序。将测序结果与NCBI的GenBank数据库进行比对，选取与所测序列相似性较高的种。应用MEGA 5生物软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树(图1A)。

2)取培养好的菌丝置于载玻片上，于光学显微镜下观察菌丝形态(图1B)。

3)取培养好的菌丝加入1mL的DMSO(含有5μL终浓度为0.1mg/mL尼罗红染色液)中，染色一段时间。将染色后的菌丝置于载玻片上，在荧光显微镜下观察菌丝脂质形成情况(图1C)。其中激发光波长为543nm，发射光波长为555-650nm。

实施例2

成熟菌丝球对聚乙烯的去除效果研究

1)将直径约为0.5cm的菌丝球按照10个/mL添加量加入到含有聚乙烯的悬液中，并于150rpm摇床震荡数天，每隔一定时间取样。

2)取悬液加入比色皿中，通过分光光度计测定样品在450nm波长下的吸光度值，以表征悬液中的聚乙烯含量(图2)。

3)取悬液加于载玻片上，在光学显微镜下观察悬液中聚乙烯的分布和形态特征。

4)取部分菌丝球置于载玻片，在光学显微镜下观察菌丝球中聚乙烯的分布特征。

5)成熟菌丝球对聚乙烯有一定的去除作用，在菌丝球内部发现大量直径在5μm左右的聚乙烯(图2C)，而直径在50μm左右的聚乙烯无法进入到菌丝球内部。但是在菌丝球作用下，聚乙烯在菌丝球外部絮凝成团(图2D)，表明成熟菌丝球对于聚乙烯颗粒有一定的促絮凝作用。

实施例3

成熟菌丝球对聚氯乙烯的去除效果研究

1)将直径约为0.5cm的菌丝球按照10个/mL添加量加入到含有聚氯乙烯的悬液中，并于150rpm摇床震荡数天，每隔一定时间取样。

2)在培养不同时间后，分别取未添加黑曲霉和添加黑曲霉的聚氯乙烯悬液，滴加在载玻片中，并通过光学显微镜对样品中聚氯乙烯的数量进行计数(图3)。

3)取悬液加于载玻片上，在光学显微镜下观察悬液中聚氯乙烯的分布和形态特征。

4)取部分菌丝球置于载玻片，在光学显微镜下观察菌丝球中聚氯乙烯的分布特征。

5)聚氯乙烯个体在100μm以上，无法进入到菌丝球内部，在菌丝球内部几乎没有聚氯乙烯，表明成熟菌丝球对聚氯乙烯几乎没有作用。

实施例4

发酵液中菌丝萌发过程中对聚乙烯的去除效果研究

1)将培养好的黑曲霉发酵液按照5wt％的添加量，加入聚乙烯悬液中，震荡一段时间。

2)取不同时间的样品，置于载玻片中，在光学显微镜下观察菌丝中聚乙烯的分布及菌丝对聚乙烯的去除效果(图4)。

3)黑曲霉发酵液中存在大量的孢子和菌丝碎片，加入聚乙烯悬液后，菌丝附着在微塑料上逐渐萌发，并把微塑料包裹在内。萌发后的菌丝内发现大量聚乙烯颗粒，表明发酵液中菌丝萌发过程中能够将微塑料包裹从而降低水体中微塑料的含量，对于清除水体中的微塑料有一定作用。

实施例5

发酵液中菌丝萌发过程中对聚氯乙烯的去除效果研究

1)将培养好的黑曲霉发酵液按照5wt％的添加量，加入聚氯乙烯悬液中，震荡一段时间。

2)在培养不同时间后，分别取未添加黑曲霉和添加黑曲霉的聚氯乙烯悬液，滴加在载玻片中，并通过光学显微镜对样品中聚氯乙烯的数量进行计数(图5)。

3)取不同时间的样品，置于载玻片中，在光学显微镜下观察菌丝中聚氯乙烯的分布及菌丝对聚氯乙烯的去除效果(图6)。

4)在发酵液中菌丝萌发过程中能够包裹大量聚氯乙烯，通过对悬液中聚氯乙烯的数量进行计数发现，在菌丝萌发过程中，悬液中聚氯乙烯的数量显著下降。菌丝萌发过程中对聚氯乙烯的清除率达到90％以上，且仅需要4天即可完成水体中聚氯乙烯的清除。表明，菌丝萌发对于水体中聚氯乙烯的清除有显著的效果。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

序列表

<110> 河南师范大学

<120> 一种利用黑曲霉去除水体中微塑料的方法

<130> 2021

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

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