一种基于生物转化制备的γ-癸内酯及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于生物转化制备的γ‑癸内酯及其制备方法，且该γ‑癸内酯是以解脂耶氏酵母接种于发酵培养基中，获得的发酵液转化接种于转化培养基，进行转化培养，在此过程中分批次加入油酸和油酸水合酶，继续进行转化培养而获得的。且本发明以废弃油脂混合物为底物的生物发酵和转化技术生产γ‑癸内酯，以废弃油脂混合物为底物以解决现有生物转化技术当中底物较为单一的问题，且废弃油脂混合物来源丰富，实现了废物利用，经济环保；同时以格氏乳球菌基因组DNA为模板，经过PCR扩增获得油酸水合酶，提高该油酸水合酶的活性，提高了γ‑癸内酯的生产产率。

说明书

技术领域

本发明属于香料加工技术领域，具体地，涉及一种基于生物转化制备的γ-癸内酯及其制备方法。

背景技术

γ-癸内酯(γ-decalactone，GDL)是一种天然存在于草莓、桃子等水果中的内酯类香料，具有较低的香气阈值，是国际公认的安全的食品添加剂，广泛用于调配椰子、草莓、桃等香料，在人造奶油、冰淇淋、软饮料、糖果、焙烤食品及调味料中大量应用，市场需求量非常大。随着对美味食品、饮料等消费的不断增长，天然食品香料添加剂的需求不断增加。

现阶段γ-癸内酯的获取方式有三种方法:天然提取、化学合成和生物法制备。γ-癸内酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，因此可以从水果中提取得到γ-癸内酯，但其在水果中的含量极少，经济效益低。化学合成法也可以得到γ-癸内酯，但其合成的γ-癸内酯主要为无旋光的外消旋体，没有从水果中提取出的具有光学活性的γ-癸内酯具有优势，且无法满足人们对天然产物的追求。生物法制备γ-癸内酯以其天然性及原料的廉价性日益成为中内外学者关注的焦点，以弥补传统的天然提取法产量低下的缺点，具有广泛的研究前景。

微生物法生产γ-癸内酯可分为生物合成法、生物转化法和生物催化法。其中，生物转化即外源性化学物经过了微生物体内代谢路径中的酶催化进行转化是目前研究最多的。在过去二十年的研究中，采用微生物转化法制备γ-癸内酯取得了突破性进展，解脂耶氏酵母是目前使用最成功的微生物转化菌株之一。常用的转化底物有蓖麻油、蓖麻油酸、蓖麻油酸甲酯，底物先经过多步的β-氧化使碳链缩短，最后再环化形成γ-癸内酯。该方法存在转化底物较为单一，蓖麻油酸对酵母细胞的毒性、酵母对蓖麻油酸的利用率低、转化周期长、γ-癸内酯产量低、生产成本较高等问题。

因此，本发明提供一种基于生物转化制备的γ-癸内酯及其制备方法，用以解决以上提到的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于生物转化制备的γ-癸内酯及其制备方法，以解决现有生物转化技术当中底物较为单一，蓖麻油酸对酵母细胞的毒性、酵母对蓖麻油酸的利用率低、转化周期长、γ-癸内酯产量低、生产成本较高等问题；以及利用油酸为底物的生物发酵和转化技术生产γ-癸内酯，以提高γ-癸内酯的产率。

本发明的目的可以通过以下技术方案解决:

该γ-癸内酯是以解脂耶氏酵母接种于发酵培养基中，获得的发酵液转化接种于转化培养基，进行转化培养，在此过程中分批次加入废弃油脂混合物和油酸水合酶，继续进行转化培养而获得的，具体包括以下步骤:

步骤一:将解脂耶氏酵母菌悬液接种至发酵培养基中，25-35℃培养，培养12-24h，获得发酵液；

步骤二:将步骤一获得的发酵液以体积浓度为10％的接种量接种于转化培养基当中，在25-30℃、200r/min下振荡培养，在解脂耶氏酵母发酵5-7h时第一次向转化培养液中加入废弃油脂混合物，无水乙醇，油酸水合酶，在解脂耶氏酵母发酵13-15h时第二次加入废弃油脂混合物，无水乙醇，油酸水合酶，继续培养，总培养时间为4d-5d，然后对转化液进行分离纯化，获得一种基于生物转化制备的γ-癸内酯。

进一步地，步骤一中，发酵培养基是由葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80和去离子水配置而成，并将所得的溶液的pH调节至7.0-7.5，然后于110-120℃灭菌30min，其中，葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80和去离子水的加入质量比为1.4-1.6:0.3-0.4:1.25-1.45:0.6-0.7:0.07-0.08:0.20-0.23:1。

进一步地，所述解脂耶氏酵母菌悬液OD600值为0.1。

进一步地，步骤二中，转化培养基是由吐温80、豆粉、硝酸铵、硫酸亚铁和去离子水配置而成，并将所得的溶液的pH调节至7.5-8.0，其中，吐温80、豆粉、硝酸铵、硫酸亚铁和去离水的加入质量比为0.20-0.23:3.21-3.46:1.25-1.35:0.16-0.18:1。

进一步地，步骤二中，第一次加入废弃油脂混合物、无水乙醇、油酸水合酶的加入量和第二次加入废弃油脂混合物、无水乙醇、油酸水合酶的加入量相等，且加入量为加入物质的体积或质量与培养基的体积比：废弃油脂混合物加入的质量浓度为28-30g/L，乙醇加入的体积浓度为3.5-5.0％，油酸水合酶加入的体积浓度为6.0-7.0％。

进一步地，废弃油脂混合物为油酸和废弃油脂的混合物，且二者的质量比为90-100:1-10，废弃油脂来源于餐厨废弃油脂。

进一步地，步骤二中，油酸水合酶是以格氏乳球菌基因组DNA为模板，经过PCR扩增获得，具体的方法如下:

步骤A:格氏乳球菌基因组DNA的提取:将培养过夜的格氏乳球菌菌液加入EP管中以11000-12000rpm转速离心1-3min，然后控干培养基，再向EP管中加380-420μL TrisEDTA，然后混匀，再加入8-15μL的溶菌酶(100mg/mL)，37℃保温20min，加入核酸酶5μL和10％聚丙烯酰胺凝胶125μL，35-37℃水浴30min，再加入蛋白酶K 20μL，50-55℃水浴30min，直至不粘稠，然后用苯酚、氯仿按照体积比1:1混合液进行抽提，混匀后，分层后取上层，再次重复操作，直至混合液不再分层为止，加入混合液体积的1/5的醋酸钠(3M)和混合溶液体积的2.5的乙醇，沉淀60min后挑取DNA丝，然后使用70％乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清液，并真空干燥后加入200μL Tris EDTA中，3-5℃保存；

步骤B:目的基因PCR扩增:将步骤A获得的格氏乳球菌基因组DNA 1μL、前引物(10μM)1μL、后引物(10μM)1μL、10×Easy Taq Buffer 5μL、dNTPs(2.5mM)4μL、Easy-tap DNAPolymerase 1μL、双蒸发水37μL配置成50μL反应溶液，将反应溶液加热到95-97℃，保温5min，然后90-95℃保温30s，将反应溶液降温至50-65℃，保温30s，然后将反应溶液温度加热至72℃，保温2-10min，循环30-40次，纯化，获得油酸水合酶。

进一步地，步骤B中，前引物的序列为5'TTTCCATGGTGCGTTATACAAACGGAAATT3'。

进一步地，步骤B中，后引物的序列为5'TTTCTCGAGAAGTAGCCCTGCATCTTTAA3'。

一种基于生物转化制备的γ-癸内酯的制备方法，包括以下步骤:

步骤一:将解脂耶氏酵母菌悬液接种至发酵培养基中，25-35℃培养，培养12-24h，获得发酵液；

步骤二:将步骤一获得的发酵液以体积浓度为10％的接种量接种于转化培养基当中，在25-30℃、200r/min下振荡培养，在解脂耶氏酵母发酵5-7h时第一次向转化培养液中加入废弃油脂混合物，无水乙醇，油酸水合酶，在解脂耶氏酵母发酵13-15h时第二次加入废弃油脂混合物，无水乙醇，油酸水合酶，继续培养，总培养时间为4d-5d，然后对转化液进行分离纯化，获得一种基于生物转化制备的γ-癸内酯。

本发明的有益效果:

本发明利用了废弃油脂混合物为底物的生物发酵和转化技术生产γ-癸内酯，以废弃油脂混合物为底物以解决现有生物转化技术当中底物较为单一的问题，且废弃油脂混合物来源丰富，实现了废物利用，经济环保；同时以格氏乳球菌基因组DNA为模板，经过PCR扩增获得油酸水合酶，提高了该油酸水合酶的活性。

具体实施方式

对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1:

一种基于生物转化制备的γ-癸内酯，是以解脂耶氏酵母接种于发酵培养基中，获得的发酵液转化接种于转化培养基，进行转化培养，在此过程中分批次加入废弃油脂混合物和油酸水合酶，继续进行转化培养而获得的，具体包括以下步骤:

步骤一:将解脂耶氏酵母菌悬液接种至发酵培养基中，35℃培养，培养12h，获得发酵液，其中，解脂耶氏酵母菌悬液接OD600值为0.1，发酵培养基是由葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80和去离子水配置而成，并将所得的溶液的pH调节至7.5，然后于110℃灭菌30min，其中，葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80和去离子水的加入质量比为1.4:0.3:1.25:0.6:0.07:0.2:1；

步骤二:将步骤一获得的发酵液以体积浓度为10％的接种量接种于转化培养基当中，在28℃振荡(200r/min)培养，在解脂耶氏酵母发酵5h时向转化培养液中第一次加入油酸，无水乙醇，油酸水合酶，在解脂耶氏酵母发酵13h时第二次加入油酸，无水乙醇，油酸水合酶，继续培养，总培养时间为5d，然后对转化液进行分离纯化，获得一种基于生物转化制备的γ-癸内酯，其中，转化培养基是由吐温80、豆粉、硝酸铵、硫酸亚铁和去离子水配置而成，并将所得的溶液的pH调节至7.5-8.0，其中，吐温80、豆粉、硝酸铵、硫酸亚铁和去离水的加入质量比为0.2:3.21:1.25:0.16:1，第一次加入废弃油脂混合物、无水乙醇、油酸水合酶的加入量和第二次加入废弃油脂混合物、无水乙醇、油酸水合酶的加入量相等，且加入量为加入物质的体积或质量与培养基的体积比：废弃油脂混合物加入的质量浓度为28g/L，乙醇加入的体积浓度为3.5％，油酸水合酶加入的体积浓度为6.0％，废弃油脂混合物为油酸和废弃油脂的混合物，且二者的质量比为90:10。

其中，油酸水合酶是以格氏乳球菌基因组DNA为模板，经过PCR扩增获得，具体的方法如下:

步骤A:格氏乳球菌基因组DNA的提取:将培养过夜的格氏乳球菌菌液加入EP管中以12000rpm转速离心3min，然后控干培养基，再向EP管中加380μL Tris EDTA，然后混匀，再加入8μL的溶菌酶(100mg/mL)，37℃保温20min，加入核酸酶5μL和10％聚丙烯酰胺凝胶125μL，35℃水浴30min，再加入蛋白酶K20μL，50℃水浴30min，直至不粘稠，然后用苯酚、氯仿按照体积比1:1混合液进行抽提，混匀后，分层后取上层，再次重复操作，直至混合液不再分层为止，加入混合液体积的1/5的醋酸钠(3M)和混合溶液体积的2.5的乙醇，沉淀60min后挑取DNA丝，然后使用70％乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清液，并真空干燥后加入200μLTris EDTA中，3℃保存；

步骤B:目的基因PCR扩增:将步骤A获得的格氏乳球菌基因组DNA 1μL、前引物(10μM)1μL、后引物(10μM)1μL、10×Easy Taq Buffer 5μL、dNTPs(2.5mM)4μL、Easy-tap DNAPolymerase 1μL、双蒸发水37μL配置成50μL反应溶液，将反应溶液加热到95℃，保温5min，然后95℃保温30s，将反应溶液降温至65℃，保温30s，然后将反应溶液温度加热至72℃，保温10min，循环35次，纯化，获得油酸水合酶,其中，前引物的序列为5'TTTCCATGGTGCGTTATACAAACGGAAATT3'，后引物的序列为5'TTTCTCGAGAAGTAGCCCTGCATCTTTAA3'。

实施例2:

一种基于生物转化制备的γ-癸内酯，是以解脂耶氏酵母接种于发酵培养基中，获得的发酵液转化接种于转化培养基，进行转化培养，在此过程中分批次加入废弃油脂混合物和油酸水合酶，继续进行转化培养而获得的，具体包括以下步骤:

步骤一:将解脂耶氏酵母菌悬液接种至发酵培养基中，35℃培养，培养12h，获得发酵液，其中，解脂耶氏酵母菌悬液接OD600值为0.1，发酵培养基是由葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80和去离子水配置而成，并将所得的溶液的pH调节至7.5，然后于110℃灭菌30min，其中，葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80和去离子水的加入质量比为1.5:0.35:1.32:0.65:0.0758:0.21:1；

步骤二:将步骤一获得的发酵液以体积浓度为10％的接种量接种于转化培养基当中，在28℃振荡(200r/min)培养，在解脂耶氏酵母发酵5h时向转化培养液中第一次加入油酸，无水乙醇，油酸水合酶，在解脂耶氏酵母发酵13h时第二次加入油酸，无水乙醇，油酸水合酶，继续培养，总培养时间为5d，然后对转化液进行分离纯化，获得一种基于生物转化制备的γ-癸内酯，其中，转化培养基是由吐温80、豆粉、硝酸铵、硫酸亚铁和去离子水配置而成，并将所得的溶液的pH调节至7.5-8.0，其中，吐温80、豆粉、硝酸铵、硫酸亚铁和去离水的加入质量比为0.21:3.35:1.26:0.17:1，第一次加入废弃油脂混合物、无水乙醇、油酸水合酶的加入量和第二次加入废弃油脂混合物、无水乙醇、油酸水合酶的加入量相等，且加入量为加入物质的体积或质量与培养基的体积比：废弃油脂混合物加入的质量浓度为29g/L，乙醇加入的体积浓度为4.0％，油酸水合酶加入的体积浓度为6.5％，废弃油脂混合物为油酸和废弃油脂的混合物，且二者的质量比为95:5。

其中，油酸水合酶是以格氏乳球菌基因组DNA为模板，经过PCR扩增获得，具体的方法如下:

步骤A:格氏乳球菌基因组DNA的提取:将培养过夜的格氏乳球菌菌液加入EP管中以12000rpm转速离心3min，然后控干培养基，再向EP管中加380μL Tris EDTA，然后混匀，再加入8μL的溶菌酶(100mg/m L)，37℃保温20min，加入核酸酶5μL和10％聚丙烯酰胺凝胶125μL，35℃水浴30min，再加入蛋白酶K 20μL，50℃水浴30min，直至不粘稠，然后用苯酚、氯仿按照体积比1:1混合液进行抽提，混匀后，分层后取上层，再次重复操作，直至混合液不再分层为止，加入混合液体积的1/5的醋酸钠(3M)和混合溶液体积的2.5的乙醇，沉淀60min后挑取DNA丝，然后使用70％乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清液，并真空干燥后加入200μLTris EDTA中，3℃保存；

步骤B:目的基因PCR扩增:将步骤A获得的格氏乳球菌基因组DNA 1μL、前引物(10μM)1μL、后引物(10μM)1μL、10×Easy Taq Buffer 5μL、dNTPs(2.5mM)4μL、Easy-tap DNAPolymerase 1μL、双蒸发水37μL配置成50μL反应溶液，将反应溶液加热到95℃，保温5min，然后95℃保温30s，将反应溶液降温至65℃，保温30s，然后将反应溶液温度加热至72℃，保温10min，循环35次，纯化，获得油酸水合酶，其中，前引物的序列为5'TTTCCATGGTGCGTTATACAAACGGAAATT3'，后引物的序列为5'TTTCTCGAGAAGTAGCCCTGCATCTTTAA3'。

实施例3:

一种基于生物转化制备的γ-癸内酯，是以解脂耶氏酵母接种于发酵培养基中，获得的发酵液转化接种于转化培养基，进行转化培养，在此过程中分批次加入废弃油脂混合物和油酸水合酶，继续进行转化培养而获得的，具体包括以下步骤:

步骤一:将解脂耶氏酵母菌悬液接种至发酵培养基中，35℃培养，培养12h，获得发酵液，其中，解脂耶氏酵母菌悬液接OD600值为0.1，发酵培养基是由葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80和去离子水配置而成，并将所得的溶液的pH调节至7.5，然后于110℃灭菌30min，其中，葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温80和去离子水的加入质量比为1.6:0.4:1.45:0.7:0.08:0.23:1；

步骤二:将步骤一获得的发酵液以体积浓度为10％的接种量接种于转化培养基当中，在28℃振荡(200r/min)培养，在解脂耶氏酵母发酵5h时向转化培养液中第一次加入油酸，无水乙醇，油酸水合酶，在解脂耶氏酵母发酵13h时第二次加入油酸，无水乙醇，油酸水合酶，继续培养，总培养时间为5d，然后对转化液进行分离纯化，获得一种基于生物转化制备的γ-癸内酯，其中，转化培养基是由吐温80、豆粉、硝酸铵、硫酸亚铁和去离子水配置而成，并将所得的溶液的pH调节至7.5-8.0，其中，吐温80、豆粉、硝酸铵、硫酸亚铁和去离水的加入质量比为0.23:3.46:1.35:0.18:1，第一次加入废弃油脂混合物、无水乙醇、油酸水合酶的加入量和第二次加入废弃油脂混合物、无水乙醇、油酸水合酶的加入量相等，且加入量为加入物质的体积或质量与培养基的体积比：废弃油脂混合物加入的质量浓度为30g/L，乙醇加入的体积浓度为5.0％，油酸水合酶加入的体积浓度为7.0％，废弃油脂混合物为油酸和废弃油脂的混合物，且二者的质量比为90:10。

其中，油酸水合酶是以格氏乳球菌基因组DNA为模板，经过PCR扩增获得，具体的方法如下:

步骤A:格氏乳球菌基因组DNA的提取:将培养过夜的格氏乳球菌菌液加入EP管中以12000rpm转速离心3min，然后控干培养基，再向EP管中加380μL Tris EDTA，然后混匀，再加入8μL的溶菌酶(100mg/mL)，37℃保温20min，加入核酸酶5μL和10％聚丙烯酰胺凝胶125μL，35℃水浴30min，再加入蛋白酶K20μL，50℃水浴30min，直至不粘稠，然后用苯酚、氯仿按照体积比1:1混合液进行抽提，混匀后，分层后取上层，再次重复操作，直至混合液不再分层为止，加入混合液体积的1/5的醋酸钠(3M)和混合溶液体积的2.5的乙醇，沉淀60min后挑取DNA丝，然后使用70％乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清液，并真空干燥后加入200μLTris EDTA中，3℃保存；

步骤B:目的基因PCR扩增:将步骤A获得的格氏乳球菌基因组DNA 1μL、前引物(10μM)1μL、后引物(10μM)1μL、10×Easy Taq Buffer 5μL、dNTPs(2.5mM)4μL、Easy-tap DNAPolymerase 1μL、双蒸发水37μL配置成50μL反应溶液，将反应溶液加热到95℃，保温5min，然后95℃保温30s，将反应溶液降温至65℃，保温30s，然后将反应溶液温度加热至72℃，保温10min，循环35次，纯化，获得油酸水合酶，其中，前引物的序列为5'TTTCCATGGTGCGTTATACAAACGGAAATT3'，后引物的序列为5'TTTCTCGAGAAGTAGCCCTGCATCTTTAA3'。

将上述实施例1-3获得的γ-癸内酯进行产率计算和油酸转化率，其中γ-癸内酯的产率分别为4.61g/L、4.68g/L、4.68g/L，油酸转化率分别为25.8％、26.2％、26.3％。

在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。