技术领域
本发明涉及用于预防或治疗肝病的药物组合物。
背景技术
肝病是由多方面原因引起的，如病毒或细菌感染、酒精、各种药物、有毒化学物质、脂肪或重金属过度积累、免疫反应异常等。由于这些原因，会发生病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、中毒性肝炎和自身免疫性肝病等。此外，缓慢进展的慢性肝病随着肝纤维化(hepatic fibrosis)逐渐进展而未被意识到而进展为肝硬化和肝癌。在韩国，肝硬化的病因主要是病毒性肝炎或酒精性肝病。如果因任何原因不断重复肝损害，无论有无症状，发展为肝硬化、肝纤维化或肝癌的风险很高。一旦发生肝硬化，即使经过治疗也很难将硬化的肝脏恢复到原来的状态。
脂肪肝本身并不是一种病理状态，而是一种可逆的症状，当病因物质被去除后会自然恢复。但是，如果肝脏组织中脂肪堆积过多的状态持续下去，就会发生脂肪性肝炎，从而反复发生肝细胞坏死和再生，在这个过程中，纤维细胞外基质(extracellular matrix,ECM)增加，导致肝纤维化。在这个过程中，内毒素血症(endotoxemia)、氧化应激、肝脏再生能力下降等起着重要作用。特别是，已知涉及到中性粒细胞浸润(neutrophilinfiltration)、坏死(necrosis)、凋亡(apoptosis)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的产生，促炎细胞因子(proinflammatory cytokine)和趋化因子(chemokine)的增加(Bedossa P,Paradis V,JPathol,200,504-515,2003)。特别是，肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)被各种细胞因子、生长因子、可溶性介质(soluble mediator)激活，合成胶原蛋白，并在细胞外基质中积累，以增加纤维化(fibrogenesis)。
当肝损伤达到一定阶段并转为慢性时，无论病原体种类如何，ECM的积累都会增加，并且由于肝细胞的不断破坏和再生，形成再生结节，从而导致不可逆的肝硬化。然而，尽管进行了大量研究，但脂肪肝这一相对良性的可逆性疾病在肝病病程中恶化为不可逆肝纤维化或肝硬化的机制仍尚不清楚。此外，目前尚无有效的治疗肝纤维化和肝硬化的药物。
目前对肝纤维化和肝硬化的治疗是尽量减缓症状的进展，并尽可能地防止由此导致的肝功能下降。在肝硬化的情况下，根据病因，使用聚乙二醇干扰素(Peginterferon)或抗病毒药物等药物，在严重的情况下，存在通过肝移植达到治愈的方法。然而，在药物治疗的情况下，可能会出现治疗耐药性，而在肝移植的情况下，由于供体短缺和手术相关的风险和成本等限制，因此需要一种新的治疗方法。
使用干细胞的肝再生疗法是近来备受关注的疗法，已知注射的干细胞在受损肝脏中分化和重建功能性肝细胞，从而显示出治疗效果。迄今为止，干细胞在体外高效分化为功能性肝细胞的结果已有报道(韩国专利第10-1542849号)。然而，当干细胞被移植到动物模型或人体内时，存在肝细胞分化效率低下的问题。此外，由于肝干细胞的精确标记尚未确定，因此存在无法准确了解干细胞增殖和分化为肝细胞的缺点。
此外，传统的干细胞治疗的最大问题是，细胞在体内的植入率和存活率因患者而异，因此无法确定准确的疗效。干细胞发生癌变的可能性也不能排除。因此，需要开发一种新的治疗方法，以解决使用干细胞治疗肝病的问题。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供用于预防或治疗肝病的药物组合物。
解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于预防或治疗肝病的药物组合物，包括含有间充质干细胞(mesenchymal stem cell)的生物植入物。
有益效果
本发明的含有间充质干细胞的生物植入物可以在肝纤维化动物模型中一次皮下或腹腔内植入，以降低作为肝损伤指标的AST和ALT水平，并减少肝实质中被胶原纤维占用的面积比例、退化的肝细胞的数量、以及浸润的炎症细胞的数量，并可有效地再生肝脏，抑制肝纤维化，增加生长因子的表达，并因此可以有益地用于预防或治疗肝病。
附图简要说明
图1是示出根据含有脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cell,ASC)的生物植入物(以下称为INBS-ASC-Ther)的培养时间测量HGF分泌浓度的结果图。
图2是示出根据INBS-ASC-Ther的培养时间测量VEGF分泌浓度的结果图。
图3是示出在向肝纤维化动物模型施用INBS-ASC-Ther后第1、5、12和18天测量的血清AST水平的图。
(G1：正常组；
G2～G4：给药DMN诱导肝损伤的实验组；
G2：未处理组；
G3：在缺氧条件下培养的INBS-ASC-Ther处理组；
G4：未在缺氧条件下培养的INBS-ASC-Ther处理组)。
图4是示出在向肝纤维化动物模型施用INBS-ASC-Ther后第1、5、12和18天测量的血清ALT水平的图。
图5是示出在向肝纤维化动物模型施用INBS-ASC-Ther后第1、5、12和18天测量的血清TG水平的图。
图6是示出在向用H&E(苏木精-伊红，hematoxylin-eosin)和马松三色(Masson'strichrome)染色的肝纤维化动物模型施用INBS-ASC-Ther后第18天提取的肝组织图像的一组照片。
(H&E：X40；马松三色：X200；
A：G1(正常组)；
B：G2(未处理组)；
C：G3(在缺氧条件下培养的INBS-ASC-Ther处理组)；
D：G4(未在缺氧条件下培养的INBS-ASC-Ther处理组)；
CV：中央静脉(central vein)；
PT：肝门三联管区(portal triad region)；
比例尺：100μm)。
图7a是示出使用引入微RNA的ASC富集培养基处理时与肝再生相关的、与细胞增殖相关的因子p-STAT、HGF和PCNA在肝细胞系中的表达的图，通过蛋白质印迹测量。
图7b是确认使用引入微RNA的ASC富集培养基处理时与肝再生相关的因子p-STAT在肝细胞系中的表达增加的图。
图7c是确认使用引入微RNA的ASC富集培养基处理时与肝再生相关的因子HGF在肝细胞系中的表达增加的图。
图7d是确认使用引入微RNA的ASC富集培养基处理时与肝再生相关的因子PCNA在肝细胞系中的表达增加的图。
图8a是示出使用引入微RNA的ASC富集培养基处理时α-SMA(与肝纤维化相关的因子)和TIMP(纤维化抑制因子)在肝星状细胞系中的表达的图，通过蛋白质印迹测量。
图8b是确认使用引入微RNA的ASC富集培养基处理时α-SMA(与肝纤维化相关的因子)在肝星状细胞系中的表达降低的图。
图8c是确认使用引入微RNA的ASC富集培养基处理时TIMP(纤维化抑制因子)在肝星状细胞系中的表达增加的图。
图9a是示出使用引入miR-24的ASC富集培养基处理时与肝纤维化相关的因子α-SMA、MMP2和TGF-β1在肝星状细胞系中的表达的图，通过蛋白质印迹测量。
图9b是确认使用引入miR-24的ASC富集培养基处理时MMP2在肝星状细胞系中表达降低的图。
图9c是确认使用引入miR-24的ASC富集培养基处理时SMA在肝星状细胞系中的表达降低的图。
图9d是确认使用引入miR-24的ASC富集培养基处理时TGF在肝星状细胞系中的表达降低的图。
图10a是示出使用引入miR-39的ASC富集培养基处理时与肝纤维化相关的因子MMP2和α-SMA在肝星状细胞系中的表达的图，通过蛋白质印迹测量。
图10b是确认使用引入miR-39的ASC富集培养基处理时MMP2在肝星状细胞系中的表达降低的图。
图10c是确认使用引入miR-39的ASC富集培养基处理时α-SMA在肝星状细胞系中的表达降低的图。
图11a是示出使用引入miR-150的ASC富集培养基处理时与肝纤维化相关的因子α-SMA和TIMP-1在肝星状细胞系中的表达的图，通过蛋白质印迹测量。
图11b是确认使用引入miR-150的ASC富集培养基处理时α-SMA在肝星状细胞系中的表达降低的图。
图11c是确认使用引入miR-150的ASC富集培养基处理时TIMP-1在肝星状细胞系中的表达增加的图。
图12是与含有ASC的生物植入物相比，确认含有引入miR-24的ASC的生物植入物、含有引入miR-39的ASC的生物植入物、以及含有引入miR-150的ASC的生物植入物中生长因子VEGF的分泌增加的图。
图13是与含有ASC的生物植入物相比，确认含有引入miR-24的ASC的生物植入物、含有引入miR-39的ASC的生物植入物、以及含有引入miR-150的ASC的生物植入物中生长因子HGF的分泌增加的图。
图14是与含有ASC的生物植入物相比，确认含有引入miR-24的ASC的生物植入物、含有引入miR-39的ASC的生物植入物、以及含有引入miR-150的ASC的生物植入物中肝病标志物乳酸脱氢酶(LDH)的分泌降低的图。
图15a是示出与仅用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，腹膜内施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中AST水平降低的图。
图15b是示出与仅用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，腹膜内施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中ALT水平降低的图。
图15c是示出与仅用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，皮下施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中AST水平降低的图。
图15d是示出与仅用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，皮下施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中ALT水平降低的图。
图16是示出与仅用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中，通过蛋白质印迹测量肝纤维化诱导因子MMP2和肝纤维化抑制剂TIMP1的表达的图。施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组通过降低MMP2的表达并增加TIMP1的表达由TAA调节纤维化因子，显示出抗纤维化作用。
图17是通过H&E和马松三色染色确认在实验组中肝组织的纤维化程度的一组照片。与仅用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，在腹膜内施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中MMP2的表达降低，导致TAA诱导的纤维蛋白的减少。
图18是确认通过免疫组织化学染色的实验组中MMP2的表达的一组照片。与仅用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，在腹膜内施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中肝纤维化诱导因子MMP2的表达降低，导致TAA诱导的纤维蛋白的减少。
优选实施方式的描述
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供了一种用于预防或治疗肝病的药物组合物，包括含有间充质干细胞(mesenchymal stem cell)的生物植入物。
所述生物植入物可以是由体内生物相容性膜制成的薄膜聚合物腔室。生物植入物是一种用于体内植入的容器，即移植容器，具有注射干细胞的空间，可将干细胞产生的物质特别是细胞因子通过薄膜分泌到植入物外。生物植入物可以保护干细胞免受接受者的排斥，并具有血管生成功能，在皮下植入时诱导靠近膜的毛细血管的形成。通过这种血管生成功能，生物植入物可以为薄膜中的干细胞提供营养物质和血液。生物植入物可由生物友好型材料制成，即不诱导免疫反应的材料，如聚氨酯，但不限于此。生物植入物可以具有多孔表面，其中多个微孔位于表面上。在这种情况下，孔的大小可以不允许诸如细胞这样的大物质通过，但可以允许蛋白质或营养物质通过。因此，通过孔注入植入物的干细胞无法从植入物中出来，从而防止干细胞诱发的癌症。另一方面，生长促进因子，也就是干细胞的分泌物，被释放到血液中，并在其周围形成血管，以便为植入物提供氧气和营养物质。即使在移植后很长一段时间后，生物植入物也能够很容易地取出。生物植入物可以通过购买满足上述条件的市售产品来使用，或者制造和使用，生物植入物可以具体为TheraCyte
所述间充质干细胞可以是脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cell，ASC)，但不限于此。
所述间充质干细胞可以分泌能够预防或治疗肝病的因子。通过将间充质干细胞包含在生物植入物中，可以保护间充质干细胞免受对干细胞的排斥反应。间充质干细胞在施用到活体后自我更新(renewal)而不分散，在植入物内积累，对活体肝损伤的信号做出反应，更能持续分泌能够预防或治疗肝病的因子。此外，通过调节间充质干细胞的培养条件，有可能获得更适合治疗或预防肝病的干细胞。
在生物植入物中，可以包括1×10
所述肝病可以是选自由肝炎、肝纤维化和肝硬化组成的组中的任何一种或多种。
所述间充质干细胞是引入了miRNA(microRNA)的间充质干细胞。
所述miRNA是指调节各种基因表达的非编码RNA，可以通过抑制mRNA的翻译或诱导mRNA的降解来抑制转录后阶段基因的表达或诱导靶RNA的降解。在需要准确且精确的基因表达(例如细胞内信号)的过程中，转录后调节被用作强有力的调控方法。由于外部刺激引起的基因表达变化中约有一半是在转录后阶段进行调控的，因此有报道称转录后调节在整个基因的表达调控中起着非常重要的作用。多项研究表明，miRNA在细胞分化、增殖、凋亡、发育、免疫、代谢和干细胞维持等许多生物学过程中起着重要的控制作用。与肽或抗体疗法不同，miRNA具有开发周期短的优点，理论上只要确定了某些疾病的靶基因，就可以开发出针对所有疾病的治疗方法。此外，miRNA通常通过同时调节多个靶基因的表达而不是一个靶基因的表达而具有非常高的特异性和有效性。
所述miRNA可以是miR-24、miR-39或miR-150，但不限于此。
所述组合物增加PCNA、HGF或p-STAT3的表达。
所述PCNA、HGF或p-STAT3是与肝再生相关的因子，当其表达增加时，可以确定受损肝细胞得到改善。
所述组合物降低α-SMA、MMP、TGF-β1或TIMP-1的表达。
所述α-SMA、MMP、TGF-β1或TIMP-1是肝纤维化诱导剂，当其表达降低时，可以确定肝纤维化受到抑制。
所述组合物增加血管内皮生长因子(VEGF)或肝细胞生长因子(HGF)的分泌量。
当血管内皮生长因子(VEGF)或肝细胞生长因子(HGF)的分泌量增加时，可以确定受损的肝组织已再生。
所述组合物降低乳酸脱氢酶(LDH)的分泌量。
当细胞被破坏时，血液中的乳酸脱氢酶(LDH)水平升高，在恶性肿瘤、肝病、心脏病、血液病中往往具有很高的乳酸脱氢酶(LDH)活性。在因肝病导致LDH分泌量升高的情况下，可以确定当LDH分泌量降低时肝病有所好转。
所述组合物可降低因肝损伤而升高的ALT水平。此外，所述组合物可降低肝实质中胶原纤维所占的面积比例，并可减少退化肝细胞的数量或浸润的炎症细胞的数量。
所述组合物可以皮下注射。尤其是可以在背部皮下注射，但注射部位不受限制。
在本发明的优选实施方案中，将脂肪来源干细胞注射到TheraCyte
本发明人证实，当采用三种类型的引入miRNA的脂肪来源干细胞富集的培养基处理肝细胞系时，与肝再生相关的因子PCNA、HGF和p-STAT3的表达增加(参见图7a至图7d)，与肝纤维化相关的因子α-SMA的表达降低，纤维化抑制因子TIMP的表达增加(参见图8a至图8c)。此外，证实了当分别用引入miR-24的脂肪来源干细胞、引入miR-39的脂肪来源干细胞以及引入miR-150的脂肪来源干细胞处理肝星状细胞时，与肝纤维化相关的因子α-SMA和MMP2的表达降低(参见图9a至图11c)。还证实，通过将引入miR-24、miR-39或miR-150的脂肪来源干细胞注射到TheraCyte
此外，当腹膜内和皮下施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物时，证实了降低AST和ALT水平的效果(图15a至图15d)。还证实，与单独用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组，通过降低MMP2的表达而增加TIMP1的表达，通过TAA调节纤维化因子显示出抗纤维化作用(图16)。
此外，证实了与仅用TAA处理诱导肝纤维化的组相比，腹膜内施用含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中MMP2的表达降低，导致TAA诱导的纤维蛋白的减少(图17和图18)。
因此，本发明的含有间充质干细胞的生物植入物或含有引入mi-RNA的间充质干细胞的生物植入物可以有效地用于肝病的预防或治疗。
根据本发明的药物组合物可以包含生物植入物，所述生物植入物含有作为活性成分的间充质干细胞，所述间充质干细胞的浓度为基于所述组合物总重量的10重量％至95重量％。此外，除上述活性成分外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种具有相同或相似功能的活性成分。
本发明的药物组合物可包含生物制剂中常用的载体、稀释剂、赋形剂或其混合物。可以使用任何药学上可接受的载体，只要其能够在活体内递送本发明的组合物，以在MerckIndex，第 13 版，Merck& Co. Inc.中描述的载体为例，如生理盐水、无菌水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或其混合物，但不限于此。此外，可根据需要另外添加常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。
在配制所述组合物时，可以添加常用的稀释剂或赋形剂，如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、稀释剂和表面活性剂。
本发明的组合物可以配制成口服制剂或肠胃外制剂。口服制剂可包括固体制剂和液体制剂。固体制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂或锭剂。这种固体制剂可以通过向所述组合物中加入至少一种赋形剂来制备。所述赋形剂可以是淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶或其混合物。此外，固体制剂可包含润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。液体制剂可以是混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂。在这种情况下，液体制剂可以包括赋形剂如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。
肠胃外制剂可包括注射剂、栓剂、用于呼吸吸入的粉剂、喷雾的气雾剂、粉剂和乳膏剂等。注射剂可包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮液、乳液等。在这种情况下，作为非水性溶剂或悬浮液，可以使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油，或可注射的酯如油酸乙酯。
本发明的组合物可根据所需方法口服或肠胃外给药。肠胃外给药可包括腹腔内注射、直肠注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射或胸腔内注射。
所述组合物可以按药学有效量给药。所述有效量可以根据疾病的类型、严重程度、药物活性、患者对药物的敏感性、给药时间、给药途径、治疗周期、同时使用的药物等来确定。然而，为了达到预期效果，根据本发明的药物组合物所包含的间充质干细胞的数量可以是1×10
本发明的组合物可以单独给药或与其他治疗剂联合给药。当联合给药时，可以是相继给药或同时给药。
实施例的详细描述
在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。
然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不受以下实施例的限制。
按照分离脂肪来源干细胞的一般方法，通过进行清洗、小鼠实验(micing)、消化(digestion)、中和、离心、过滤等，在手术室从来自健康人的脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞(ASC, Adipose derived Stem Cell)，并进行培养。通过流式细胞仪(flowcytometry)确认细胞形态。此后，通过传代培养获得大量脂肪来源干细胞(脂肪干细胞)。将获得的脂肪干细胞在含有DMEM培养基(低葡萄糖(Low glucose)，10％FBS，1％P/S)的T75烧瓶中培养至70％至80％，并用于后续实验。
将实施例1中培养的脂肪来源干细胞注射到生物植入物TheraCyte
具体地，将实施例1中培养的脂肪来源干细胞分成两个实验组。在一个实验组中，将实施例1中培养的1×10
将实施例2中制备的两个实验组的INBS-ASC-Ther放置并浸入100mm含DMEM培养基(低葡萄糖(Low glucose)、10％FBS、1％P/S)的板中，培养7天。在培养的第1天、第3天和第7天取500μl培养液后，分别使用ELISA试剂盒测定HGF和VEGF的分泌量。
结果，两个实验组的INBS-ASC-Ther均分泌HGF和VEGF，第7天分泌HGF或VEGF最多。此外，在缺氧条件下培养时，INBS-ASC-Ther会增加HGF和VEGF的分泌(图1和图2)。
从东方生物公司(OrientBio)购买的SD大鼠(雄性)驯化5天，DMN(dimethylnitrosamine，二甲基亚硝胺)以10mg/kg的剂量每周3次腹腔内给药，连续3天，共3周。DMN给药2周后采血，用采集的血清确认肝脏ALT(alanine aminotransferase，丙氨酸转氨酶)水平。选择诱导一定水平以上的肝纤维化的动物进行以下实验。
在实验例2中，根据ALT值的结果，随机划分实验组，使各组的平均值一致。实验组分为：未给药DMN的正常组(G1)和给药DMN的实验组。给药DMN的实验组又分为：未处理组(G2)、缺氧培养的INBS-ASC-Ther给药组(G3)、INBS-ASC-Ther给药组(G4)。在G3和G4实验组中，在DMN给药第二周结束后5天，将一个含有1×10
在施用经缺氧处理的或未经缺氧处理的INBS-ASC-Ther后的第1、5、12、18天采血，并对各实验组进行血液生化测试。在施用的第一天，在施用经缺氧处理或未经缺氧处理的INBS-ASC-Ther后的1小时后进行测试。具体地，使用注射器每次从每只动物的颈静脉取约700μl血液，将得到的血液注射到含有凝块活化剂(clot activator)的真空采血管(vacutainer tube)中，然后在室温下凝血30分钟。将凝血后的血液以3,000rpm离心10分钟以分离血清，并将血清冷冻储存直至分析。尸检当天(第18天)，通过吸入异氟醚(isoflurane)使动物模型麻醉，用注射器从后腔静脉采血。
测定所得血清中的AST(Aspartate aminotransferase，天冬氨酸氨基转移酶)、ALT(Alanine aminotransferase，丙氨酸氨基转移酶)和TG(Triglyceride，甘油三酯)的水平。
AST测量结果证实，与正常组(G1)相比，未处理组(G2)第1天AST水平显著升高(P<0.05)。在其他测量日无统计学意义，但观察到有升高的趋势。经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G3)或未经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G4)与未处理组(G2)相比在统计学上无显著差异，但观察到下降趋势至第12天(图3)。
ALT测量结果证实，与正常组(G1)相比，未处理组(G2)第1天和第12天ALT水平显著升高(P<0.05)。在其他测量日无统计学意义，但观察到有升高的趋势。经缺氧处理组(G3)与未处理组(G2)相比在统计学上无显著差异。未经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G4)与未处理组(G2)相比在统计学上无显著差异，但观察到下降趋势(图4)。
TG测量结果证实，与正常组(G1)相比，未治疗组(G2)在第5天、第12天和第18天TG水平显著降低(P<0.01)。经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G3)或未经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G4)与未处理组(G2)相比在统计学上无显著差异，但证实了除了第1天之外该水平趋于升高至正常组(G1)水平(图5)。
从以上结果证实到，与肝功能高度相关的AST和ALT水平，与正常组(G1)相比，未处理组(G2)的AST和ALT水平显著升高，表明DMN成功诱导了肝脏损伤。与未处理组(G2)相比，经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G3)表现出肝损伤指标AST和ALT水平降低的趋势，但在尸检当天该水平没有显示出任何差异，表明肝损伤没有得到改善。与未处理组(G2)相比，未经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G4)的AST水平呈下降趋势，但在尸检当天该水平没有显示出任何差异，而ALT水平呈持续下降趋势，表明肝损伤得到改善。
对各实验组进行组织病理学测试，在施用经缺氧处理或未经缺氧处理的INBS-ASC-Ther后的第18天采血，然后切开腹腔动脉和后腔静脉，放血/处死。从动物身上取出肝脏并固定在10％中性缓冲福尔马林固定剂中。固定组织委托给韩国医学院，经H&E和马松三色染色进行组织病理学测试。具体地，测定了胶原纤维占据区域、退化的肝细胞数量和炎症细胞数量。Eclipse 80i(Nikon,日本)用作显微镜，采用iSolution FL ver 9.1(i-Solution,Inc.,加拿大)程序进行分析。
结果显示，未处理组(G2)肝实质胶原纤维面积比例、退化肝细胞数量和浸润炎症细胞数量均较正常组(G1)显著增加(P<0.01)。因此，证实了DMN诱导肝损伤。经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G3)与未处理组(G2)相比在所有测试指标方面无差异，而未经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G4)与未处理组(G2)相比，所有测试指标均显著降低(P<0.05或P<0.01)。因此，证实了未经缺氧处理INBS-ASC-Ther可有效改善受损肝脏(表1和图6).
[表1]
(++：G1和G2之间存在统计学差异，P<0.01；*：与G2存在统计学差异，P<0.05；**：与G2存在统计学差异，P<0.01。)
通过上述结果证实到，当将INBS-ASC-Ther皮下注射到DMN诱导肝损伤的SD大鼠中时，经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G3)与未处理组(G2)在血液学测试和组织病理学测试中不存在差异。在未经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G4)中，证实到在尸检当天血液生化测试中肝损伤指数降低，也证实到组织病理学测试中肝损伤指数显著降低。因此，证实到未经缺氧处理INBS-ASC-Ther组(G4)对改善因肝损伤引起的肝功能受损有效。该结果表明，即使将INBS-ASC-Ther皮下注射到远离疾病部位肝脏的背部，也可以改善肝功能。
使用PubMed、miRNA base和Cochrane等生物信息学，通过文献搜索选择了报道的抑制纤维化的miRNA。
因此，选择miR-29(SEQ.ID.NO:1)、miR-34(SEQ.ID.NO:2)和miR-150(SEQ.ID.NO:3)的三个miRNA作为具有抗纤维化作用的微RNA。
[表2]
以与实施例1相同的方式和条件培养脂肪来源干细胞(ASC)。该细胞分别用miR24、miR29和miR150转染并进一步培养。此后，使用超速离心过滤器(Millipore Amicon)将引入微RNA的ASC培养基浓缩25倍。
将实施例4中培养的引入微RNA的ASC注射到TheraCyte
具体地，将在缺氧室培养24小时的1×10
肝细胞再生效果通过使用富含上述实施例4中制备的引入微RNA的ASC的培养基来证实。
具体地，将实施例4中获得的ASC富集培养基(NCM)、引入miR24的ASC富集培养基(MCM-24)、引入miR39的ASC富集培养基(MCM-39)和引入miR150的ASC富集培养基(MCM-150)处理经50mM硫代乙酰胺处理或未处理的肝细胞系(AML12、ATCC)，并通过蛋白质印迹检测肝脏再生相关因子PCNA、HGF和p-STAT3的表达水平。
对于蛋白质印迹，使用EzRIPA裂解试剂盒(Ato Corporation，东京，日本)裂解AML12细胞。使用第一抗体(1：1,000)在4℃过夜观察蛋白质，然后在25℃用HRP偶联的第二抗体(1：2,000)观察蛋白质1小时。除了HRP偶联的第二抗兔和HRP偶联的抗鼠IgGs(CellSignaling,贝弗利,马萨诸塞州)，还使用了针对肝细胞生长因子(HGF)(Abcam，剑桥，马萨诸塞州)、增殖细胞核抗原(PCNA)、p-STAT3和β-肌动蛋白的抗体。
结果，如图7a至图7d所示，证实了与仅用TAA处理的对照组和仅用ASC处理的组相比，在用微RNA引入的ASC富集培养基处理的组中，涉及细胞增殖的与肝再生相关的因子p-STAT(图7b)、HGF(图7c)和PCNA(图7d)的表达增加。
肝细胞再生效果通过使用富含上述实施例4中制备的引入微RNA的ASC的培养基来证实。
具体地，以与实验例<4-1>中描述的相同的方式和条件测定α-SMA和TIMP的表达水平，不同之处在于：使用5mM硫代乙酰胺(thioacetamide)处理，使用肝星状细胞系(LX2，韩国科学技术院Jeong教授提供)，测定α-SMA(与肝纤维化相关的因子)和TIMP(纤维化抑制因子)的表达水平。
结果，如图8a至图8c所示，与仅用TAA处理的对照组和仅用ASC处理的组相比，在用微RNA引入的ASC富集培养基处理的组中，α-SMA(与肝纤维化相关的因子)的表达水平降低(图8b)，TIMP(纤维化抑制因子)的表达水平增加(图8c)。
使用实验例4的肝星状细胞系(LX2)，分别测定引入miR-24的ASC处理组、引入miR-39的ASC处理组和引入miR-150的ASC处理组中肝纤维化相关因子的表达。
肝星状细胞(LX2)用5mM硫代乙酰胺处理或不处理，用实施例4中制备的引入miR-24的ASC富集培养基处理。然后，以与实验例<4-1>相同的方式和条件测定与肝纤维化相关的因子MMP2、SMA和TGF的表达水平。
结果，如图9a至图9d所示，与仅用TAA处理的对照组和仅用ASC处理的组相比，在引入miR-24的ASC处理组中，与肝纤维化相关的因子MMP2(图9b)、α-SMA(图9c)和TGF(图9d)的表达水平降低。因此，证实了引入miR-24的ASC具有抑制肝纤维化的作用。
肝星状细胞(LX2)用5mM硫代乙酰胺处理或不处理，用实施例4中制备的引入miR-39的ASC富集培养基处理。然后，以与实验例<4-1>相同的方式和条件测定与肝纤维化相关的因子MMP2和α-SMA的表达水平。
结果，如图10a至图10c所示，与仅用TAA处理的对照组和仅用ASC处理的组相比，在引入miR-39的ASC处理组中，与肝纤维化相关的因子MMP2(图10b)和α-SMA(图10c)的表达水平降低。因此，证实了引入miR-39的ASC具有抑制肝纤维化的作用。
肝星状细胞(LX2)用5mM硫代乙酰胺处理或不处理，用实施例4中制备的引入miR-150的ASC富集培养基处理。然后，以与实验例<4-1>相同的方式和条件测定与肝纤维化相关的因子α-SMA和TIMP-1的表达水平。
结果，如图11a至图11c所示，与仅用TAA处理的对照组和仅用ASC处理的组相比，在引入miR-150的ASC处理组中，与肝纤维化相关的因子α-SMA的表达水平降低(图11b)，肝纤维化抑制因子TIMP-1的表达水平增加(图11c)。因此，证实了引入miR-150的ASC具有抑制肝纤维化的作用。
通过测定实施例5制备的含有引入miR-24、miR-39和miR-150的ASC的生物植入物中血管上皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)和乳酸脱氢酶(LDH)的分泌量以确认肝再生效果。
具体地，培养基中VEGF、HGF和LDH的分泌量通过制造商推荐的方法使用ELISA试剂盒(Biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚)测定。
结果，如图12所示，证实了与含有ASC的生物植入物相比，含有引入miR-24的ASC的生物植入物、含有引入miR-39的ASC的生物植入物和含有引入miR-150的ASC的生物植入物中生长因子VEGF的分泌增加。在含有引入miR-150的ASC的生物植入物中VEGF分泌量增加的效果最好。
如图13所示，证实了与含有ASC的生物植入物相比，含有引入miR-24的ASC的生物植入物、含有引入miR-39的ASC的生物植入物和含有引入miR-150的ASC的生物植入物中生长因子HGF的分泌增加。在含有引入miR-150的ASC的生物植入物中HGF分泌量增加的效果最好。
如图14所示，证实了与含有ASC的生物植入物相比，含有引入miR-24的ASC的生物植入物、含有引入miR-39的ASC的生物植入物和含有引入miR-150的ASC的生物植入物中肝病标志物LDH的分泌降低。在含有引入miR-150的ASC的生物植入物中LDH分泌量降低的效果最好。
对7-8周龄小鼠(BALB/c)进行腹膜内给药TAA(200mg/kg)，每周3次，连续5周，以诱导肝纤维化。
肝纤维化诱导6周后，对小鼠肝组织进行RT-PCR、蛋白质印迹和免疫染色以确认肝纤维化的诱导。
将实验组分为：①未经任何处理的对照组(对照)，②仅用硫代乙酰胺(TAA)处理诱导肝纤维化的组(仅TAA)，③通过TAA处理诱导肝纤维化并且附上含有ASC的生物植入物的组(TAA+ASC+Theracyte)，④通过TAA处理诱导肝纤维化并且附上含有引入miR24的ASC的生物植入物的组(miR24-ASC+Theracyte+腹腔)，⑤通过TAA处理诱导肝纤维化并且附上含有引入miR39的ASC的生物植入物的组(miR39-ASC+Theracyte+腹腔)，⑥通过TAA处理诱导肝纤维化并且附上含有引入miR150的ASC的生物植入物的组(miR150-ASC+Theracyte+腹腔)，⑦通过TAA处理诱导肝纤维化并且附上含有引入miR24的ASC的生物植入物的组(miR24-ASC+Theracyte+皮下)，⑧通过TAA处理诱导肝纤维化并且附上含有引入miR39的ASC的生物植入物的组(miR39-ASC+Theracyte+皮下)，⑨通过TAA处理诱导肝纤维化并且附上含有引入miR150的ASC的生物植入物的组(miR150-ASC+Theracyte+皮下)。
此后，将含有引入微RNA的ASCs的生物植入物移植到肝纤维化动物模型的表皮上，测定肝酶水平、纤维化指数、肝功能再生和恢复因子的变化，并进行组织病理学分析。
天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)作为由于肝细胞破坏分泌的酶，是用于确定肝病的指标，在①至⑨的实验组中，对AST和ALT水平进行测定。
具体地，收集血清并使用Idexx VetTest化学分析仪测定作为肝损伤指标的氨基酸转移酶天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的浓度。
结果，与仅通过TAA处理诱导肝纤维化的组相比，在腹腔内或皮下给予含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中AST和ALT水平下降。因此，证实了由TAA引起的肝功能下降得到恢复(图15a至图15d)。
从①到⑨实验组中获得肝组织，通过蛋白质印迹证实了作为纤维化指标的MMP2和作为肝纤维化抑制因子的TIMP-1的表达水平的变化。
具体地，使用EzRIPA裂解试剂盒(Ato Corporation，日本，东京)裂解肝组织，以12,000rpm离心15分钟，并收集上清液。肝组织用裂解缓冲液(美国印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏诊断生命科学公司(Roche Diagnostics Life Sciences))裂解。使用Bradford试剂(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)测定裂解物中的蛋白质浓度。用SDS-PAGE分离每孔等量的蛋白质(30μg)，电转移到硝酸纤维素膜上，室温下用5％脱脂牛奶封闭1小时。将板用针对TIMP2、原胶原、TGF-β1、HGF、PCNA、p-STAT3、Bcl-2和β-肌动蛋白的第一抗体(1:1,000)在4℃下孵育过夜。将板用HRP偶联的第二抗兔和抗鼠IgGs(1:2,000)在室温下孵育1小时(Cell Signaling，Beverly，MA，USA)。使用蛋白质印迹加化学发光试剂(Millipore)检测特定的免疫复合物。
结果，与仅通过TAA处理诱导肝纤维化的组相比，给予含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入的组通过降低MMP2的表达并增加TIMP1的表达观察到通过TAA调节纤维化因子，显示出抗纤维化作用(图16)。
从每个实验组的动物中取出肝脏并固定在10％中性缓冲福尔马林固定剂中。对固定组织进行H&E染色、马松三色染色和MMP2免疫化学染色，以进行形态学分析。
具体地，将取出的肝组织用含0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2，Sigma)的10％福尔马林固定，包埋在石蜡中，然后制备切片。将制备好的石蜡切片(4μm厚)脱蜡、水合，用0.01％蛋白酶XXIV(Sigma)在磷酸盐缓冲盐水中37℃处理20分钟，并用苏木精和伊红染色。
对于马松三色染色，将石蜡包埋的组织处理成5μm厚的切片，脱蜡，于乙醇中再水化，自来水洗涤，56℃于布因溶液再固定1小时。在流动的自来水中漂洗10分钟并用Weigert铁苏木精工作液染色10分钟后，将切片用Biebrich猩红色品红溶液染色15分钟，然后用自来水洗涤。片段在磷钼-磷钨酸溶液中分化15分钟，转移到苯胺蓝溶液中，染色10分钟。在自来水中短暂冲洗后，将切片与1％乙酸溶液反应5分钟。使用数字图像分析(MetaMorph版本4.6r5，Universal Imaging Corp.，Downingtown，PA，USA)确定染色强度的半定量值，在400倍放大率下检查每个片段中至少5个区域。
通过免疫组化分析MMP2。为此，福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片在二甲苯中脱石蜡，并根据酒精水平再水化。通过标准程序回收抗原。本发明的第一抗体是PCNA抗体(1:300；Abcam)。组织切片用苏木精复染。通过在激光扫描显微镜(Eclipse TE300，Nikon，东京，日本)下对20个随机视野中的细胞进行手动计数来确定MMP2阳性细胞的数量。
结果，如图17所示，作为进行H&E和马松三色染色的结果，与仅通过TAA处理而引起肝纤维化(蓝色染色区域)的组相比，在通过腹腔内给予含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中，蓝色染色区域减少。如图18所示，与仅用TAA处理使肝纤维化诱导物MMP2的表达增加的情况相比，在通过腹腔内给予含有引入miR24、miR39或miR150的ASC的生物植入物的组中MMP2的表达降低，表明TAA诱导的纤维蛋白降低。
Sequence listing
<110> 图特科技有限公司
<120> 用于预防或治疗肝病的包括含有间充质干细胞的生物植入物的药物组合物
<130> 2021FPO-04-00/US
<150> KR 1020180162386
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ucucccaacc cuuguaccag ug 22
机译： 用于预防或治疗肝病的药物组合物，包括具有间充质干细胞的生物植入物
机译： 用于预防或治疗肝病的药物组合物，其包含移植植入物和间充质干细胞
机译： 用于预防或治疗肝病的药物组合物，包含包含间充质干细胞的生物脂质剂
