用于抑制和/或治疗生长相关疾病和/或其临床病症的组合物和方法

摘要

公开了包含抑制CXXC5‑DVL相互作用面的一种或更多种药剂的治疗组合物，以及施用这些治疗组合物以对与生长或其有关临床病症相关的病症/疾病进行建模、治疗、降低治疗抗性、预防以及诊断的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月15日提交的韩国申请No.KR10-2018-0122511、于2019年2月1日提交的美国临时申请No.62/799,921、于2019年2月1日提交的美国临时申请No.62/799,912、于2019年3月28日提交的美国临时申请No.62/825,363和于2019年9月20日提交的美国临时申请No.62/903,068的权益，其中所有的全部公开内容在此通过引用明确并入本文。

技术领域

本文中公开的多个方面和实施方案总体上涉及对与生长或其相关临床病症相关的病症/疾病进行建模、治疗、降低治疗抗性、预防以及诊断。一些实施方案包括用于治疗所述病症/疾病的组合物和方法，其包括向对象提供本文中公开的化合物和/或组合物的至少一个治疗有效剂量。另一些实施方案包括用于在对象中改变和/或抑制CXXC5-DVL相互作用面(CXXC5-DVL interface)活性的方法。

背景技术

纵向骨生长发生在生长板中，所述生长板包含瞬时软骨组织的薄层。该软骨层中的软骨细胞增殖并经历肥大性分化，此后凋亡并随后重塑成骨组织，从而导致骨伸长。纵向骨生长在胎儿发育和儿童早期期间迅速发生；骨生长逐渐减慢，并最终在青春期结束时停止，部分是由于生长板衰老(growth plate senescence)。目前，许多儿童提前经历青春期发育，这导致更早的生长板衰老。这些现象(被称为性早熟)揭示了纵向骨生长的过早终止，其导致成年身材矮小。目前尚不清楚涉及调节生长板衰老的确切机制。

一些研究报道了Wnt/β联蛋白信号传导与生长板成熟的关联。CXXC指蛋白5(CXXCfinger protein 5，CXXC5)是Wnt/β联蛋白信号传导的负调节剂，其通过与细胞质中散乱蛋白(dishevelled，DVL)的PDZ结构域相互作用而发挥作用。抑制CXXC5-DVL相互作用改善了涉及Wnt/β联蛋白信号传导的数种病理生理表型，包括骨质疏松、皮肤伤口和由Wnt/β联蛋白活化引起的毛发脱落(hair loss)。由于涉及调节生长板衰老和/或其相关病症的过程的复杂性，非常需要开发会在对象中增强纵向骨生长的新治疗方案。

发明内容

鉴于CXXC5作为Wnt/β联蛋白信号传导的负调节剂的作用，其是用于开发可干扰Wnt/β联蛋白信号传导活性的化合物的有吸引力的靶标。本公开内容的一些方面包括干扰CXXC5-DVL相互作用面的化合物以及使用该化合物影响对象生长的方法。

本申请的一些实施方案涉及用于在对象中治疗与生长或其有关临床病症相关的病症和/或疾病的组合物和方法。在某些实施方案中，本文中公开的组合物和方法涉及抑制治疗方案的一种或更多种副作用。另一些实施方案涉及用于治疗被诊断为患有疾病或患有涉及青春期早期发育之病症的对象的组合物和方法，所述疾病或病症至少部分由较早的生长板衰老引起。

在第一方面中，本文中公开的组合物包含在对象中抑制CXXC5-DVL相互作用面(CXXC指蛋白5(CXXC5)与散乱蛋白(DVL)之间的相互作用面)的至少一种药剂。在一些实施方案中，抑制CXXC5-DVL相互作用面的至少一种药剂包含与散乱蛋白(DVL)的PDZ结构域和/或DVL结合基序结合的至少一种药剂，和/或至少一种GSK3β抑制剂，或其组合。

第一实施方案包括式I化合物，

其中X是任选地被R

R

R

第二实施方案包括根据第一实施方案所述的化合物的化合物，其中X是O。

第三实施方案包括这样的化合物，其是根据根据第一实施方案所述的化合物的化合物，其中X是N并且R

第四实施方案包括根据第一至第三实施方案中任一个所述的化合物的化合物，其中R

第五实施方案包括根据第一至第四实施方案中任一个所述的化合物的化合物，其中所述化合物是图14、图15、图16、表6、表7和/或表8中公开的化合物中的任一种。

第六实施方案包括根据第一至第五实施方案中任一个所述的化合物，其中所述化合物是包含以下的至少一种化合物：

第七实施方案包括式II化合物，

其中R

R

或者

R

R

R

每个R

X

第八实施方案包括根据第七实施方案所述的化合物，其中R

第九实施方案包括根据第七至第八实施方案中任一个所述的化合物，其中R

第十实施方案包括根据第七至第九实施方案中任一个所述的化合物，其中所述化合物为

第十一实施方案包括式III化合物，

其中每个R

X

第十二实施方案包括根据第十一实施方案所述的化合物，其中每个R

第十三实施方案包括根据第十一至第十二实施方案中任一个所述的化合物，其中所述化合物为

第十四实施方案包括式IV化合物，

其中每个R

第十五实施方案包括根据第十四实施方案所述的化合物，其中R

第十六实施方案包括根据第十四至第十五实施方案中任一个所述的化合物，其中每个R

第十七实施方案包括根据第十四至第十六实施方案中任一个所述的化合物，其中所述化合物为

第十八实施方案包括式V化合物，

其中每个R’和每个R”独立地是氢；卤素；任选地被氢、卤素、羟基或烷氧基取代的卤代烷基；任选地被氢、卤素、羟基、烷氧基或卤代烷基取代的烷基；任选地被氢、卤素、羟基、烷氧基或卤代烷基取代的烷氧基；任选地被氢、卤素、羟基、烷氧基或卤代烷基取代的烯基；或者任选地被氢、卤素、羟基、烷氧基或卤代烷基取代的炔基。

第十九实施方案包括根据第十八实施方案所述的化合物，其中每个R’和每个R”独立地是氢、卤素、羟基、烷基、烯基、烷氧基或卤代烷基。

第二十实施方案包括根据第十八至第十九实施方案中任一个所述的化合物，其中所述化合物为

第二十一实施方案包括式VI化合物，

其中每个R

第二十二实施方案包括根据第二十一实施方案所述的化合物，其中每个R

第二十三实施方案包括根据第二十一至第二十二实施方案中任一个所述的化合物，其中所述化合物为

第二十四实施方案包括根据第一至第二十三实施方案中任一个所述的化合物中的至少一种，其中所述化合物抑制或降低CXXC5-DVL相互作用面、CXXC5与DVL之间的相互作用和/或CXXC5和/或CXXC5-DVL相互作用面的活性。

第二十五实施方案包括根据前述实施方案中任一个所述的化合物中的至少一种，其中所述化合物通过与CXXC5直接竞争DVL中的结合位点，通过与DVL直接结合，和/或通过与DVL的PZD结构域直接结合而抑制或降低CXXC5与DVL之间的相互作用。

第二十六实施方案包括包含至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或其可药用的水合物、盐、代谢物或载体的药物组合物。

在第二方面中，本文中公开的方法包括治疗至少一种临床病症的方法，其包括向对象施用本文中公开的任何组合物的至少一个治疗有效剂量。对象可被诊断为患有选自以下和/或包含以下的临床病症：生长相关疾病或其类似病症。在某些实施方案中，本文中公开的方法还包括向对象施用多个治疗有效剂量的本文中公开的任何组合物。

第二十七实施方案包括治疗生长相关疾病或类似病症的方法，其包括：向对象施用至少一种抑制或降低CXXC5-DVL相互作用面、CXXC5与DVL之间的相互作用、和/或CXXC5和/或CXXC5-DVL相互作用面的活性的药剂的至少一个治疗有效剂量；和/或向对象施用至少一种包含以下的药剂的至少一个治疗有效剂量：至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物。

第二十八实施方案包括根据第二十七实施方案所述的方法，其还包括以下步骤：在对象中检测CXXC5的表达上调。

第二十九实施方案包括根据第二十七至第二十八实施方案中任一个所述的方法，其还包括以下步骤：鉴定处于生长相关疾病或类似病症的风险中的对象。

第三十实施方案包括根据第二十七至第二十九实施方案中任一个所述的方法中的至少一种，其中所述生长相关疾病或类似病症包括选自以下或包含以下的至少一种病症：生长障碍、人生长激素缺乏(human growth hormone deficiency)、库欣综合症(Cushing's Syndrome)、甲状腺功能减退、营养性身材矮小(nutritional shortstature)、宫内生长迟缓、拉塞尔-西尔弗综合征(Russell Silver syndrome)、不成比例性身材矮小、软骨发育不全、生长相关病症、营养不良(poor nutrition)和全身性疾病、骨病症和/或性早熟。

第三十一实施方案包括根据第二十七至第三十实施方案中任一个所述的方法中的至少一种，其中所述对象表现出异常生长板衰老。与这些实施方案一致，异常生长板衰老包括对象中的早于正常生长板衰老和/或对象中治疗诱导的生长板衰老。

第三十二实施方案包括根据第二十七至第三十一实施方案中任一个所述的方法中的至少一种，其中所述对象被诊断为患有生长障碍和/或性早熟。

第三十三实施方案包括根据第二十七至第三十二实施方案中任一个所述的方法中的至少一种，其中至少一种抑制CXXC5-DVL相互作用面、抑制CXXC5与DVL之间的相互作用和/或抑制CXXC5和/或CXXC5-DVL相互作用面的活性的药剂包含至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物。

第三十四实施方案包括根据第三十三实施方案所述的方法中的至少一种，其中所述方法还包括以下步骤：施用至少一种另外的药剂的至少一个治疗有效剂量，其包含GSK3β抑制剂和/或Wnt/β联蛋白途径的抑制剂。

第三十五实施方案包括根据第二十七至第三十四实施方案中任一个所述的方法中的至少一种，其中所述对象是成人、人类儿童和/或动物。

第三十六实施方案包括根据第二十七至第三十五实施方案中任一个所述的方法中的至少一种，其中所述至少一种药剂和/或所述至少一种另外的药剂是经口或静脉内施用的。

第三十七实施方案包括根据第二十七至第三十六实施方案中任一个所述的方法中的至少一种，其中至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物的治疗有效剂量为约5mg至约2000mg的量级，并且所述化合物的剂量以至少一次/天施用于对象。在一些实施方案中，至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物的治疗有效剂量包括但不限于以下量级：约10mg至约1900mg、约15mg至约1800mg、约15mg至约1700mg、约20mg至约1600mg、约25mg至约1500mg、约30mg至约1000mg、约50mg至约1000mg、约50mg至约800mg、约100mg至约800mg、约300mg至约800mg、约500mg至约800mg、约5mg至约50mg、约1000mg至约1700mg、约1200mg至约1700mg、约1500mg至约1700mg、约10mg至约1000mg、约10mg至约30mg、约1500mg至约2000mg、约100mg至约200mg、约100mg至约150mg；和/或其任何组合。与这些实施方案一致，至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物的治疗有效剂量包括但不限于以下量级：约1mg/m2至约1500mg/m2、约10mg/m2至约1000mg/m2、约20mg/m2至约800mg/m2、约10mg/m2至约50mg/m2、约800mg/m2至约1200mg/m2、约50mg/m2至约500mg/m2、约500mg/m2至约1000mg/m2、约80mg/m2至约150mg/m2、约80mg/m2至约120mg/m2；和/或其任何组合。

第三十八实施方案包括根据第二十七至第三十六实施方案中任一个所述的方法中的至少一种，其中至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物的治疗有效剂量为约0.01mg至约200mg的量级，并且所述化合物的剂量以至少一次/天向施用于对象。在一些实施方案中，至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物的治疗有效剂量包括但不限于以下量级：约0.01mg至约150mg、约0.01mg至约100mg、约0.01mg至约80mg、约0.01mg至约60mg、约0.05mg至约100mg、约0.05mg至约80mg、约0.05mg至约50mg、约0.1mg至约100mg、约0.1mg至约50mg、约0.2mg至约100mg、约0.2mg至约50mg、约0.5mg至约100mg、约0.5mg至约50mg、约100mg至约200mg、约100mg至约150mg；和/或其任何组合。在这些实施方案的一些中，至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物的治疗有效剂量包括但不限于以下量级：约0.01mg/m

在第三方面中，本申请提供的方法降低和/或抑制治疗方案的副作用，所述方法包括向对象施用在对象中抑制或降低CXXC5-DVL相互作用面的至少一种药剂的至少一个治疗有效剂量；和/或向对象施用包含至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物的至少一种药剂的至少一个治疗有效剂量；其中所述对象已接受选自生长激素和/或性激素治疗，手术治疗和/或其组合的至少一种治疗方案，并且其中所述对象由于所述治疗方案而经历至少一种副作用。与这些实施方案一致，副作用可包括但不限于药物抗性、复发、炎症或其任何组合。

第三十九实施方案包括检测一种或更多种生长相关疾病标志物的方法，其包括：提供来自怀疑患有生长相关疾病或病症的对象的血液、细胞或组织的样品；以及在样品中检测一种或更多种标志物的上调，其中所述一种或更多种标志物包含雌激素和/或CXXC5。

第四十实施方案包括根据第三十九实施方案所述的方法，其中所述生长相关疾病包括选自以下或包含以下的至少一种病症：生长障碍、人生长激素缺乏、库欣综合症、甲状腺功能减退、营养性身材矮小、宫内生长迟缓、拉塞尔-西尔弗综合征、不成比例性身材矮小、软骨发育不全、生长相关病症、营养不良和全身性疾病、骨病症和/或性早熟。与这些实施方案一致，与已知未患有生长相关疾病的正常对象的CXXC5相比，CXXC5在对象的生长板中过表达至少约10％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％，和/或约1000％，或其任何组合；和/或与已知未患有生长相关疾病的正常对象的CXXC5相比，CXXC5在对象的生长板中过表达至少约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约50倍和/或约100倍，或其任何组合。

第四十一实施方案包括根据第三十九至第四十实施方案所述的方法中的至少一种，其还包括以下步骤：使用至少一种根据第二十七至第三十八实施方案中任一个所述的方法来治疗对象。

第四十二实施方案包括抑制CXXC5活性的方法，其包括以下步骤：向对象提供至少一种根据第一至第二十五实施方案所述的化合物或可药用盐或其代谢物的至少一个治疗有效剂量。

第四十三实施方案包括根据第四十二实施方案所述的方法，其中所述对象包含人、动物、细胞和/或组织。与这些实施方案一致，细胞包括至少一种类型的细胞，包括软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和骨祖细胞(或成骨细胞)。

第四十四实施方案包括用于进行本文中公开的前述方法中任一种的药盒。所述药盒的组分包括但不限于一种或更多种的本文中公开的药剂/组合物、试剂、容器、设备和/或用于使用所述药盒的说明。

第四十五实施方案包括根据第四十四实施方案所述的药盒，其中所述一种或更多种的药剂/组合物包括至少一种根据第一至第二十五实施方案中任一个所述的化合物和/或至少一种根据第二十六实施方案所述的组合物。

第四十六实施方案包括在对象中确定生长相关疾病之存在的方法，所述方法包括测定与参考值相比升高的CXXC5基因的表达水平和/或CXXC5蛋白的表达水平。

第四十七实施方案包括根据第四十六实施方案所述的方法，其中所述生长相关疾病包括选自以下或包含以下的至少一种病症：生长障碍、人生长激素缺乏、库欣综合症、甲状腺功能减退、营养性身材矮小、宫内生长迟缓、拉塞尔-西尔弗综合征、不成比例性身材矮小、软骨发育不全、生长相关病症、营养不良和全身性疾病、骨病症和/或性早熟；其中所述生长相关疾病包括选自以下或包含以下的至少一种病症：生长相关病症、营养不良和全身性疾病、骨病症和/或性早熟；和/或其中所述生长相关疾病包括性早熟。

第四十八实施方案包括根据第四十六至第四十七实施方案中任一个所述的方法，其中所述参考值是已知未患有生长相关疾病的正常对象中CXXC5基因的表达水平或CXXC5蛋白的表达水平。

第四十九实施方案包括根据第四十六至第四十八实施方案中任一个所述的方法，其中在对象、对象的生长板和/或对象的生长板中的软骨细胞中，CXXC5基因的表达水平和/或CXXC5蛋白的表达水平升高。

第五十实施方案包括根据第四十六至第四十九实施方案中任一个所述的方法，其中与参考值相比，CXXC5基因的表达水平和/或CXXC5蛋白的表达水平升高了至少约10％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％和/或约1000％，或其任何组合；和/或其中与参考值相比，CXXC5基因的表达水平和/或CXXC5蛋白的表达水平升高了至少约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约50倍和/或约100倍，或其任何组合。

第五十一实施方案包括根据第四十六至第五十实施方案中任一个所述的方法，其还包括：使用至少一种根据第二十七至第三十八实施方案中任一个所述的方法来治疗对象。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明某些实施方案。可通过单独地或与所呈现的具体实施方案的详细描述组合参考这些附图中的一个或更多个，更好地理解一些实施方案。

图1A：示出了针对Wnt/β联蛋白信号传导激活的基因特征(gene signature)，来自3和12周龄大鼠生长板增殖区的微阵列转录组数据(GEO：GSE16981)的基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)(上，MSigDB：M11722和下，MSigDB：M2680)(n＝5)的图。NES，归一化富集评分(normalized enrichment score)；ES，富集评分(enrichmentscore)；FDR，错误发现率(false discovery rate)。

图1B：示出了3、6、9和12周龄大鼠生长板中，Cxxc5的相对表达变化(GEO：GSE16981)(平均值±s.e.m.，n＝5，*P＜0.05和**P＜0.005，其与3周龄相比)的图。

图1C：示出了3、6、9、12周龄小鼠的近胫骨的生长板中Cxxc5和Runx2的相对mRNA表达的qRT-PCR分析(平均值±s.e.m.，n＝3，

图1D：示出了3、6、9和12周龄小鼠的近胫骨生长板中所示蛋白质表达的免疫印迹分析。

图1E：示出了3、6、9和12周龄小鼠的近胫骨生长板中所示蛋白质表达的免疫组织化学分析(左)和定量分析(平均值±s.e.m.，n＝3，*或#P＜0.05，以及**P＜0.005，其与3周龄相比)(右)。比例尺，50μm。

图1F：示出了在用pEGFP-N1或GFP-CXXC5转染之后48小时，用50ng/ml重组WNT3A在藻酸盐珠(alginate bead)中培养的ATDC5细胞中Wnt/β联蛋白途径靶基因和软骨形成分化标志物的mRNA水平的qRT-PCR分析(平均值±s.e.m.，n＝3，*P＜0.05和**P＜0.005)的图。

图2A：示出了用100nM E

图2B：示出了用100nM E

图2C：生长变化的在第6天时的代表性图片(左)和定量分析(平均值±S.e.m.，n＝5，***P＜0.0005)(右)。比例尺，1mm。用100nM E

图2D：生长板中每个区域高度的苏木精和伊红(H&E)染色(左)以及定量(平均值±s.e.m.，n＝5，*P＜0.05和**P＜0.005)(右)。RZ，静息区(resting zone)；PZ，增殖区(proliferative zone)；HZ，肥大区(hypertrophic zone)。比例尺，200μm。用100nM E

图2E：β联蛋白和CXXC5的免疫组织化学分析。比例尺，50μm。用100nM E

图2F：近胫骨生长板中BrdU、β联蛋白和CXXC5的H&E染色和免疫组织化学分析的代表性图像。将3周龄的Cxxc5

图3A：12周龄Cxxc5

图3B：示出了3、6、9和12周龄Cxxc5

图3C：3、6、9和12周龄的Cxxc5

图3D：示出了3、6、9和12周龄的Cxxc5

图3E：示出了9和12周龄Cxxc5

图3F：示出了11周龄Cxxc5

图3G：示出了9周龄Cxxc5

图3H：示出了在经处理小鼠中存在PTD-DBMP的体内荧光成像(H)。将PTD-DBMP(1mg/kg)通过每天腹膜内(i.p.)注射施用于7周龄小鼠，持续2周(n＝3)。白色箭头指示胫骨的生长板区域。

图3I：示出了近胫骨生长板中β联蛋白和RUNX2的免疫组织化学分析的H&E染色。

图3J：示出了对生长板的RZ、PZ和HZ中细胞数目的定量分析(平均值±s.e.m.，n＝3，*P＜0.05和**P＜0.005)的图。比例尺，50μm。

图4A：KY19382的化学结构。

图4B：示出了体外结合测定以分析KY19382对CXXC5-DVL相互作用的作用(平均值±s.e.m.，n＝3)的图。从剂量响应曲线确定IC

图4C：示出了体外激酶测定以分析KY19382对GSK3β激酶活性的作用(平均值±s.e.m.，n＝3)的图。从剂量响应曲线确定IC

图4D：示出了在以所示浓度的KY19382培养18小时的HEK293报道细胞中TOPFlash活性的分析(平均值±s.e.m.，n＝4，**P＜0.005和***P＜0.0005，其相对于经DMSO处理的对照)的图。

图4E：示出了用I3O或KY19382处理24小时的ATDC5细胞中所示蛋白质表达的免疫印迹分析。

图4F：在用pCMV-FLAG-DVL1和pcDNA3.1-CXXC5-Myc转染之后，用0.1μM KY19382处理4小时的ATDC5细胞中，用抗Myc免疫沉淀的全细胞裂解物的免疫印迹分析。

图4G：示出了对用0.1μM KY19382处理48小时的ATDC5细胞中β联蛋白水平的作用的免疫细胞化学染色(左)和定量分析(平均值±s.e.m.，n＝3，**P＜0.005)(右)。比例尺，100μm。

图5A：示出了用所示抗体进行的免疫组织化学分析的H&E染色。通过每天腹膜内注射向7周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。比例尺，50μm。

图5B：示出了对近胫骨生长板中静息区和增殖区(RZ&PZ)和肥大区(HZ)的细胞数目/柱的定量分析(平均值±s.e.m.，n＝7，***P＜0.0005)的图。通过每天腹膜内注射向7周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。

图5C：示出了生长板中BrdU阳性细胞的定量分析(平均值±s.e.m.，n＝5，***P＜0.0005)的图。通过每天腹膜内注射向7周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。

图5D：示出了沿软骨/骨界面250μm处的TRAP阳性灶的数目的定量分析(平均值±s.e.m.，n＝3，*P＜0.05)的图。通过每天腹膜内注射向7周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。

图5E：示出了用KY19382处理的小鼠的近胫骨生长板中所示蛋白质表达的免疫印迹分析。通过每天腹膜内注射向7周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。

图5F：用KY19382处理的近胫骨生长板中的TRAP染色(A，F)。TRAP，酒石酸抗性酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase)。通过每天腹膜内注射向3周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。比例尺，50μm。

图5G：示出了对近胫骨生长板中静息区和增殖区(RZ&PZ)和肥大区(HZ)的高度的定量分析(平均值±s.e.m.，n＝7，***P＜0.0005)的图。通过每天腹膜内注射向3周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。

图5H：示出了生长板中BrdU阳性细胞的定量分析(平均值±s.e.m.，n＝5，***P＜0.0005)的图。通过每天腹膜内注射向3周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。

图5I：示出了沿软骨/骨界面250μm处的TRAP阳性灶的数目的定量分析(平均值±s.e.m.，n＝3，*P＜0.05)的图。通过每天腹膜内注射向3周龄小鼠施用KY19382(0.1mg/kg)，持续2周(n＝7)。n.s.，无显著性。

图5J：示出了代表性射线照片(左)，并测量了胫骨长度(右)(平均值±s.e.m.，n＝7至15，***P＜0.0005)。虚线内的区域指示生长板区域。将3周龄小鼠每天腹膜内注射KY19382(0.1mg/kg)，持续10周。

图6A：示出了CXXC5在生长板衰老中的作用的拟议模型的示意图。随着青春期进展，在性成熟期间提高的雌激素诱导CXXC5表达，并随后通过DVL结合抑制Wnt/β联蛋白途径，导致生长板衰老。

图6B：示出了KY19382用于刺激纵向骨生长的工作模型的示意图。在激活Wnt/β联蛋白信号传导中，KY19382通过(1)使GSK3β失活和(2)抑制CXXC5-DVL相互作用来用作双靶向化合物，这导致延迟生长板衰老并促进纵向骨生长。PPI，蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction)。

图7A：示出了来自微阵列数据(GEO：GSE9160)的对青春期期间人生长板中CXXC5和CXXC4的相对mRNA表达的分析(平均值±s.e.m.，n＝2，*P＜0.05和**P＜0.005)的图。

图7B：示出了来自微阵列数据(GEO：GSE16981)的对青春期期间大鼠生长板中CXXC5和CXXC4的相对mRNA表达的分析(平均值±s.e.m.，n＝5，***P＜0.0005)的图。

图8：示出了小分子的筛选结果的图。对2,280种化合物(30μM)进行体外结合测定，以鉴定出CXXC5-DVL相互作用的抑制剂。通过相对于经DMSO处理的对照归一化的荧光强度的百分比比率来计算结合值。

图9A：示出了表示为棍状模型(stick model)的对接在DVL PDZ(PDB：2KAW)上的BIO或13O的结合模式的示意图。BIO-DVL PDZ复合物的结构模拟显示，残基F261、I262、I264、1266、L321和V325参与与BIO的结合：非键相互作用(F261、I262、I266、L321和V325)和氢键(I264)。

图9B：示出了显示残基H260、I262和V325参与与I3O的结合：非键相互作用(I262和V325)和氢键(H260)的I3O-DVL PDZ复合物的结构模拟的示意图(B)。BE，结合能(BindingEnergy)。

图10A：示出了通过对靛玉红骨架的R1和R2位处的官能团进行修饰来指导用于激活Wnt/β联蛋白信号传导的靛玉红衍生物的集中设计的示意图。合成的衍生物通过三种测定进行分析：(1)体外CXXC5-DVL结合测定，(2)体外GSK3β激酶测定和(3)TOPFlash Wnt报道子测定。

图10B：示出了表示为棍状模型的对接在DVL PDZ(PDB：2KAW)上的KY19382的结合模式的示意图(左)。在KY19382-DVL PDZ的基于结构的药效团特征(青色，疏水物；绿色，氢键接纳体；紫色，氢键供体)中，DVL PDZ的静电表面表示为蓝色，带正电荷；红色，带负电荷；白色，中性残基(右)。该模型显示DVL PDZ残基G263、I264、I266、L321、R322和V325参与与KY19382的结合：非键相互作用(I266、L321、R322和V325)和氢键(G263、I264和V325)。BE，结合能。

图11A：示出了KY19382对软骨细胞增殖和分化的作用的免疫荧光染色。在收获之前，将用0.01或0.1μM浓度的KY19382处理的ATDC5细胞孵育48小时，随后用50μm BrdU处理12小时。通过使用特异性BrdU抗体进行免疫荧光染色，使BrdU并入显现(左)。对BrdU阳性细胞进行定量(平均值±s.e.m.，n＝3，*P＜0.05和***P＜0.0005)(右)。比例尺，100μm。

图11B：示出了在用对照siRNA或Ctnnb1 siRNA转染之后在三维藻酸盐珠中用0.1μM KY19382孵育3天的ATDC5细胞中软骨形成分化标志物的mRNA水平的qRT-PCR分析(平均值±s.e.m.，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.005和***P＜0.0005)的图。

图11C：示出了在三维藻酸盐珠中，用1μM KY19382孵育3天的C28/I2细胞中软骨形成分化标志物的mRNA水平的qRT-PCR分析(平均值±s.e.m.，n＝3，*P＜0.05和***P＜0.0005)的图。

图12：示出了用0.01或0.1μM浓度的KY19382处理4小时的ATDC5细胞中途径特异性靶基因的mRNA水平的qRT-PCR分析(平均值±s.em.，n＝3，*P＜0.05和**P＜0.005，其与经DMSO处理的对照相比)的图。n.s，与经DMSO处理的对照相比无显著性。

图13A：示出了KY19382对关节软骨的作用的H&E染色。比例尺，100μm。

图13B：示出了KY19382对肝组织的作用的H&E染色。比例尺，100μm。

图13C：示出了KY19382对重量的作用的图。在处理期间，每5至7天测量小鼠重量(平均值±s.e.m.，n＝7至15)。n.s，与载剂(对照)相比无显著性。

图14：本文中公开的靛玉红类似物的一些实例的化学结构。

图15：本文中公开的靛玉红类似物的一些实例的化学结构。

图16：本文中公开的靛玉红类似物的一些实例的化学结构。

“约/大约”是指值的范围正负10％，例如，约1.0涵盖0.9至1.1的值。

“CXXC5-DVL相互作用面”是指CXXC5(CXXC指蛋白5)与DVL(散乱蛋白)之间的相互作用和/或缔合，其可诱导本领域已知的生物活性。相互作用和/或缔合可以是将激活对象内CXXC5-DVL途径的物理或化学相互作用。CXXC5-DVL相互作用面可以以复杂的形式存在。

“生长相关疾病或类似病症”可包括但不限于生长障碍、人生长激素缺乏、库欣综合症、甲状腺功能减退、营养性身材矮小、宫内生长迟缓、拉塞尔-西尔弗综合征、不成比例性身材矮小、软骨发育不全、生长相关病症、营养不良和全身性疾病、骨病症和/或性早熟。

“CXXC5-DVL相互作用面抑制剂”是指改变CXXC5-DVL相互作用面的功能和/或活性或诱导CXXC5-DVL相互作用面的构象变化的药剂。CXXC5-DVL相互作用面抑制剂的一些实例包括但不限于改变CXXC5与DVL之间缔合/解离的药剂和/或抑制CXXC5-DVL复杂装配/功能的药剂。

“可药用”是指由政府的监管机构(例如美国FDA或EMA)批准或可被其批准，或列于美国药典或其他公认的药典中的用于哺乳动物和/或动物，并且更特别地在人中。

除非另外说明或暗示，否则“可药用载剂”或“可药用载体”在本文中用于描述可包含在制剂中的除活性成分之外的任何成分。载体的选择在很大程度上将取决于以下因素，例如施用方式、载体对溶解度和稳定性的作用以及剂型的性质。

“药物组合物”是指CXXC5-DVL相互作用面的治疗活性抑制剂或GSKβ的治疗活性抑制剂，以及至少一种可药用的载剂/载体，通过所述可药用的载剂/载体向对象施用CXXC5-DVL相互作用面抑制剂和/或GSKβ的抑制剂。

“对象”是指人(成人和/或儿童)、动物、牲畜、细胞和/或组织。

“治疗有效量”是指当施用于对象用于治疗疾病或疾病的至少一种临床症状时，足以影响疾病或其症状的这样的治疗的CXXC5-DVL相互作用面抑制剂或GSKβ抑制剂的量。“治疗有效量”可取决于例如以下而变化：CXXC5-DVL相互作用面抑制剂、GSKβ抑制剂、疾病和/或疾病症状、疾病和/或疾病症状或病症的严重程度、待治疗的对象的年龄、重量和/或健康以及开处方医师的判断。

“治疗有效剂量”是指在对象中提供对疾病或病症的有效治疗的剂量。治疗有效剂量可在化合物之间，以及对象之间变化，并且可取决于因素，例如对象的病症和递送途径。

“治疗方案(therapeutic regime)”和/或“治疗方案(therapeutic regimen)”包括但不限于生长激素治疗、性激素治疗和/或手术。

任何疾病的“治疗”及其变化形式是指逆转、减轻、阻止或改善疾病或疾病的至少一种临床症状，降低罹患疾病或疾病的至少一种临床症状的风险，抑制疾病或疾病的至少一种临床症状的进展，或降低发生疾病或疾病的至少一种临床症状的风险。在一些实施方案中，“治疗”及其变化形式还指在身体上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)或在二者上抑制疾病，以及抑制对于对象可辨别或无法辨别的至少一个物理参数。在某些实施方案中，“治疗”及其变化形式是指在可能暴露于疾病或预先倾向于疾病的对象(即使该对象尚未经历或未显示出该疾病的症状)中延迟疾病或其至少一种或更多种症状的发作。

具体实施方式

出于促进对新技术原理的理解的目的，现在将参考其优选实施方案，并且将使用特定语言来描述该实施方案。然而，将理解的是，由此并不旨在限制新技术的范围，预期如对于该新技术所涉及的本领域中的技术人员将通常会想到的该新技术的原理的这样的改变、修改和另外的应用在本公开内容和权利要求的范围之内。

纵向骨生长在胎儿发育和儿童早期期间迅速发生，但随后其逐渐减慢，并最终在青春期结束时随着生长板衰老而停止。

用于调节生长板衰老的机制尚未完全理解。近年来，来自基础和临床研究的越来越多的证据揭示，软骨细胞活性和状态直接受生长板内旁分泌信号传导的调节。此外，Wnt/β联蛋白信号传导已成为生长板成熟中的关键作用因素，并且参与调节Wnt/β联蛋白信号传导的基因的突变经常导致骨生长受损。例如，编码β联蛋白的Ctnnb1的软骨特异性缺失导致纵向骨生长缺陷。另外，用糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)(使β联蛋白不稳定的丝氨酸/苏氨酸激酶)的抑制剂进行处理，导致在离体培养系统中，胫骨伸长。此外，对全基因组关联研究的一项大荟萃分析鉴定了促进成年人高度的常见变化的423个基因座，并且发现了参与Wnt/β联蛋白途径的基因，例如AXIN2、WNT4和CTNNB1。

CXXC指蛋白5(CXXC5)是Wnt/β联蛋白信号传导的负调节剂，其通过与细胞质中散乱蛋白(PDL)的PDZ结构域相互作用而发挥作用。抑制CXXC5-DVL相互作用改善了涉及Wnt/β联蛋白信号传导的数种病理生理表型，包括骨质疏松、皮肤伤口和通过激活Wnt/β联蛋白信号传导引起的毛发脱落。

在本公开内容中，发现在经历生长板衰老的软骨细胞中，CXXC5表达渐进性提高。此外，雌激素(在青春期期间升高的性激素)诱导了CXXC5表达，随后软骨细胞中的β联蛋白降低。Cxxc5

本公开内容尤其(inter alia)提供了用于开发被认为负影响例如经历生长板衰老的软骨细胞中Wnt/β联蛋白途径的CXXC5-DVL相互作用面的治疗抑制剂的发现平台。在一些实施方案中，通过使用监测显示PTD-DBMP(蛋白质转导结构域融合的DVL结合基序肽)的结合的荧光强度的体外筛选系统获得通过抑制CXXC5-DVL相互作用面而激活Wnt/β联蛋白途径的小分子，所述PTD-DBMP包含与DVL结合的CXXC5的序列并与FITC缀合到DVL的PZD结构域上。参见例如Kim HY，等(2016)，Small molecule inhibitors of the Dishevelled-CXXC5 interaction are new drug candidates for bone anabolic osteoporosistherapy.EMBO Mol Med 8：375-387。令人感兴趣地，数种GSK3β抑制剂，包括6-溴代靛玉红3’-肟(BIO)和靛玉红3’-羟肟(I3O)被鉴定为初始命中物(initial hit)。此外，本公开内容提供了有效地抑制GSK3β激酶活性和CXXC5-DVL相互作用二者的功能上改善的、以及新合成的靛玉红衍生物KY19382。这些功能通过分别动力学测量GSK3β酶活性和体外CXXC5-DVL结合得以确定。因此，KY19382通过至少一种以下功能有效地激活了Wnt/β联蛋白信号传导：(1)通过抑制GSK3β进行初始激活和/或(2)通过干扰CXXC5-DVL相互作用增强信号传导。此外，KY19382通过延迟生长板衰老，显著增强了软骨细胞的增殖和分化，并诱导了青春期小鼠的纵向胫骨生长。通过鉴定这种CXXC5-DVL诱导的生长板衰老的机制，本公开内容提供了用于通过与包含DVL结合基序的CXXC5-DVL相互作用面结合来筛选针对CXXC5与DVL特异性相互作用的抑制剂的化合物文库的平台。

本文中公开的一些实施方案涉及用于在对象中治疗与生长或其有关临床病症相关的病症和/或疾病的组合物和方法。在某些实施方案中，本文中公开的组合物和方法涉及抑制治疗方案的副作用。另一些实施方案涉及用于治疗被诊断为患有生长相关疾病或患有促进以下的病症的对象的组合物和方法：生长障碍、人生长激素缺乏、库欣综合症、甲状腺功能减退、营养性身材矮小、宫内生长迟缓、拉塞尔-西尔弗综合征、不成比例性身材矮小、软骨发育不全、生长相关病症、营养不良和全身性疾病、骨病症和/或性早熟。

本文中公开的一些方法包括治疗临床病症的方法，其包括向对象施用本文中公开的化合物和/或组合物中的任一种的至少一个治疗有效剂量。对象可被诊断为患有选自以下和/或包含以下的临床病症：生长相关疾病或其类似病症。在某些实施方案中，本文中公开的方法还包括向对象施用多个治疗有效剂量的本文中公开的化合物和/或组合物中的任一种。

在一些实施方案中，本文中公开的组合物包含在对象中抑制CXXC5-DVL相互作用面的至少一种药剂。与这些实施方案一致，抑制或降低CXXC5-DVL相互作用面的至少一种药剂包含至少一种本文中公开的化合物。在一些实施方案中，抑制或降低CXXC5-DVL相互作用面的至少一种药剂可在物理和/或化学上破坏CXXC5-DVL相互作用面的构象。

药物组合物

通过本公开内容提供的药物组合物可包含治疗有效量的本文中公开的一种或更多种组合物，以及合适量的一种或更多种可药用载剂，以提供用于向对象适当施用的组合物。合适的药物载剂在本领域中描述。

适合于经口施用的本公开内容的药物组合物可作为以下存在：各自包含预定量的活性成分的离散单元，例如胶囊剂、扁囊剂、片剂或锭剂；作为粉末或颗粒剂；作为在水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂(例如糖浆剂、酏剂或顿服剂)；或作为水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。所述组合物也可作为大丸剂、药糖剂或糊剂存在。可通过将活性成分与可药用载体一起压制或模制来制备片剂。压制片剂可通过在合适的机器中将与例如黏合剂、惰性稀释剂、润滑剂、崩解剂和/或表面活性剂混合的以自由流动形式(例如粉末或颗粒)的活性成分进行压缩来制备。模制片剂可通过在合适的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物进行模制来制备。片剂可任选地被包衣或刻痕，并且可被配制为提供对活性成分的缓释或控释。

适合于肠胃外施用的本公开内容的药物组合物包含水性和非水性无菌注射溶液剂，并且还可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与接受者的血液等张的溶液剂、以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含例如助悬剂和增稠剂。所述制剂可存在于单单位剂量或多剂量容器中，并且可在需要在使用之前添加无菌液体载体的冻干条件下储存。

可药用盐包括安全且有效地用于哺乳动物并且具有所期望治疗活性的由本公开内容提供的化合物的盐。可药用盐包括存在于由本公开内容提供的化合物中的酸性或碱性基团的盐。可药用的酸加成盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐(glucaronate)、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(pamoate)(即1，1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐。某些公开的化合物可与多种氨基酸形成可药用盐。合适的碱式盐包括但不限于铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌和二乙醇胺盐。关于可用于实践本文中所述方法的一些可药用盐的另外的信息，请查阅文章例如Berge，等.，66J.PHARM.SCI.1-19(1977)，Haynes，等，J.Pharma.Sci.，Vol.94，No.10，Oct.2005，pgs.2111-2120等。

在一些实施方案中，所述组合物可包含可药用润滑剂。可药用润滑剂防止药物组合物的组分凝集在一起并防止黏附至产生所公开组合物的颗粒压制器(pellet press)。润滑剂还确保颗粒形成以及其从颗粒压制器喷出，在组合物与模压器(die press)壁之间低摩擦的情况下发生。在一些实施方案中，向药物组合物添加润滑剂以改善过程特征，例如以帮助提高组合物的柔性，从而降低破损。

可用于所公开药物组合物中的润滑剂的类型可以变化。在一些实施方案中，可药用润滑剂选自滑石、二氧化硅、植物脂(vegetable stearin)、硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸钙、山嵛酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、矿物油、聚乙二醇、硬脂富马酸钠、月桂基硫酸钠、植物油、硬脂酸锌，及其组合。在一些实施方案中，可药用润滑剂是硬脂酸。

可用于所公开药物组合物中的载剂的类型可以变化。在一些实施方案中，可药用载剂选自黏合剂、填充剂，及其组合。在一些实施方案中，可药用载剂选自抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮K-30(聚维酮K-30)、单硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate，GMS)或单硬脂酸甘油酯盐、山嵛酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、糖、右旋糖酐、玉米淀粉、磷酸氢钙、磷酸氢钙二水合物、硫酸钙、磷酸二钙、磷酸三钙、乳糖、纤维素包括微晶纤维素、甘露糖醇、氯化钠、干淀粉、预胶化淀粉、可压缩糖、甘露糖醇、乳糖一水合物、淀粉、磷酸氢钙二水合物、硫酸钙、磷酸二钙、磷酸三钙、粉末状纤维素、微晶纤维素、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、右旋糖、半乳糖、相应的糖醇和另一些糖醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇，以及前述中任一种的组合。在一些实施方案中，可药用载剂是聚乙烯吡咯烷酮K-30，也称为聚维酮K-30。在一些实施方案中，可药用载剂是聚乙烯吡咯烷酮K-30，也称为聚维酮K-30，其平均分子量MW为40,000(CAS 9003-39-8)。在一些实施方案中，可药用载剂选自单硬脂酸甘油酯(GMS)或单硬脂酸甘油酯盐、山嵛酸甘油酯和棕榈硬脂酸甘油酯。在一些实施方案中，可药用载剂是单硬脂酸甘油酯(GMS)或单硬脂酸甘油酯盐。在一些实施方案中，可药用载剂是山嵛酸甘油酯。在一些实施方案中，可药用载剂是棕榈硬脂酸甘油酯。

在一些实施方案中，抗氧化剂防止所公开组合物的其他组分的氧化。氧化可能在例如其中产生自由基的灭菌期间发生。抗氧化剂或自由基清除剂的添加显著降低了氧化，并使所述组合物更可药用的用于对象。

可用于所公开药物组合物中的抗氧化剂的类型可以变化。在一些实施方案中，抗氧化剂选自对羟基苯甲酸甲酯及其盐、对羟基苯甲酸丙酯及其盐、维生素E、维生素E TPGS、没食子酸丙酯、亚硫酸盐、抗坏血酸(亦称L-抗坏血酸，也包括抗坏血酸的L-对映体、维生素C)、苯甲酸钠、柠檬酸、环糊精、过氧化物清除剂、苯甲酸、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)及其盐、链终止剂(例如硫醇和酚)、丁基化羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、丁基化羟基茴香醚(butylatedhydroxyanisole，BHA)，及其组合。

治疗用途或方法

本文中公开的方法和组合物可用于治疗患有这样的疾病、障碍、病症和症状的对象：已知CXXC5-DVL相互作用面和/或GSKβ的抑制剂为其提供或之后被发现为其提供治疗益处。

在一些实施方案中，本文中公开的方法包括治疗临床病症的方法，其包括向对象施用本文中公开的任何组合物的至少一个治疗有效剂量。对象可被诊断为患有选自以下和/或包含以下的临床病症：生长障碍、人生长激素缺乏、库欣综合症、甲状腺功能减退、营养性身材矮小、宫内生长迟缓、拉塞尔-西尔弗综合征、不成比例性身材矮小、软骨发育不全、生长相关病症、营养不良和全身性疾病、骨病症和/或性早熟，和/或与生长激素治疗和/或手术治疗相关、由其诱导或已经对其产生抗性的任何其他病症。在某些实施方案中，本文中公开的方法还包括向对象施用至少一个另外的治疗有效剂量的本文中公开的任何组合物。在一些实施方案中，本文中公开的任何组合物的至少一个治疗有效剂量可经口、肠胃外、静脉内、通过吸入和/或经皮施用。

另一些实施方案可包括用于降低治疗方案的副作用的方法，其包括向对象施用在对象中抑制或降低CXXC5-DVL相互作用面活性的至少一种药剂的至少一个治疗有效剂量；其中所述对象已经接受包含手术、生长和/或性激素治疗的至少一种治疗方案，并且其中所述对象经历了来源于所述治疗方案的至少一种副作用。与这些实施方案一致，副作用可包括但不限于药物抗性和/或复发。

药盒

在另一方面中，本公开内容提供了药盒，这样的药盒包含：一种或更多种药物组合物(每种组合物在容器内为灭菌的)，将药物组合物施用于对象的方式，以及使用说明。

一些实施方案包括用于进行本文中公开的方法的药盒。这样的药盒通常包含治疗临床病症所需的两种或更多种组分。药盒的组分包括但不限于一种或更多种的本文中公开的药剂/组合物、试剂、容器、设备和/或使用药盒的说明。因此，本文中所述的组合物和方法可通过利用本文中公开的预包装药盒来进行。

实施例

以下实施例举例说明了本公开内容的多个方面。对于本领域技术人员将明显的是，在不脱离本公开内容的范围的情况下，可以对材料和方法二者实践许多修改。

细胞培养和试剂。小鼠软骨形成细胞系ATDC5从RIKEN Cell Bank获得。人青少年肋软骨细胞细胞系C28/I2由Dr.W.U.Kim(Catholic University，Korea)提供。HEK293-TOP细胞(包含染色体并入的TOPFlash基因的HEK293细胞)由Dr.S.Oh(Kuk Min University，Korea)提供。将ATDC5细胞维持在补充有5％FBS(Gibco)的DMEM/F12(1∶1)(Gibco，GrandIsland，NY)中。为了诱导肥大性分化，将ATDC5细胞与胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸钠(insulin-transferrin-sodium selenite，ITS)补充剂(Gibco)在三维藻酸盐珠中孵育3天，如前所述。参见，例如，Kawasaki Y等.(2008)，Phosphorylation of GSK-3beta bycGMP-dependent protein kinase II promotes hypertrophic differentiation ofmurine chondrocytes.J CLIN INVEST 118：2506-2515。将C28/I2和HEK293-TOP细胞维持在包含10％FBS的DMEM(Gibco)中。将所有化学物质溶解于二甲基亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich，St Louis，MO)中用于体外研究。对于E

质粒、siRNA和转染。先前已经描述了质粒pcDNA3.1-CXXC5-Myc和GFP-CXXC5(Kim等，2015)。pCMV-FLAG-DVL1由Dr.E.H.Jho(Seoulsirip university，Korea)提供。以下siRNA序列用于ATDC5细胞：Ctnnb1(编码β联蛋白)siRNA-1，有义AUUACAAUCCGGUUGUGAACGUCCC(SEQ ID NO.1)和反义GGGACGUUCACAACCGGAUUGUAAU(SEQ IDNO.2)；Ctnnb1 siRNA-2，有义UAAUGAAGGCGAACGGCAUUCUGGG(SEQ ID NO.3)和反义CCCAGAAUGCCGUUCGCCUUCAUUA(SEQ ID NO.4)。

使用Lipofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行质粒转染，以及使用RNAiMax(Invitrogen)进行siRNA转染，根据制造商说明。

动物。在先前研究中建立了Cxxc5

射线照相和组织化学分析。使用X射线仪(KODAK DXS 4000 Pro SYSTEM；Carestream Health Rochester，NY)采集普通射线照片(plain radiograph)。将组织在4％多聚甲醛(PFA)中固定，在10％EDTA(pH 7.4)中脱钙，脱水，包埋在石蜡中，并将其切成4μm厚度(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)。将组织切片再水化并将其用于进一步分析，包括H&E、TRAP和免疫组织化学(IHC)染色。为了进行IHC染色，将切片与柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)在80℃下孵育30分钟，与0.05％胰蛋白酶工作溶液(pH 7.8)在37℃下孵育30分钟，或与0.5％胃蛋白酶(Sigma-Aldrich)在37℃下孵育15分钟。然后，将切片用PBS中的5％正常山羊血清(normal goat serum，NGS；Vector Laboratories，Burlingame，CA)和0.3％triton-x-100在室温下封闭1小时。对于3，3’-二氨基联苯胺(DAB)染色，将切片与0.345％H

免疫细胞化学。将ATDC5或C28/I2细胞接种在12孔培养板中的玻璃盖玻片上。将细胞用PBS洗涤，并将其用4％PFA在室温下固定15分钟。在用0.1％triton-X-100透化15分钟并用5％BSA封闭1小时之后，将细胞与对β联蛋白(1∶100)或CXXC5(1∶200)具有特异性的一抗在4℃下孵育过夜。将细胞在PBS中洗涤，并将其与Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 555二抗(1∶200)在室温下孵育1小时。将细胞核用DAPI复染10分钟，并在LSM700 META显微镜下使用405、488或543nm激发波长检查经染色的样品。对于BrdU测定，将经培养的细胞与BrdU溶液(25μM)孵育过夜，随后用针对BrdU的抗体(1∶100)进行免疫细胞化学染色。

免疫印迹分析。将细胞用冰冷的PBS洗涤，并将组织在液氮中用研钵和研杵进行研磨，然后在RIPA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，pH 7.4，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，1mMEDTA，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)中裂解。将蛋白质样品在8至12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)上分离，并将其转移至硝酸纤维素膜(Whatman)。免疫印迹使用以下一抗进行：抗β联蛋白(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，sc-7199；1∶3,000)，抗CXXC5(实验室制备；1∶200)抗Myc标签(MBL，Aichi，Japan，M192-3；1∶1,000)，抗FLAG(Sigma-Aldrich，F7425；1∶1,000)，抗p-GSK3β(S9；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，9336S；1∶1,000)，抗COL2A1(Santa Cruz Biotechnology，sc-28887；1∶500)，抗RUNX2(Abcam，ab23981；1∶500)，抗COL10A1(Cosmo Bio，LSL-LB-0092；1∶500)，抗MMP13(Santa CruzBiotechnology，sc-30073；1∶500)，抗ERK(Santa Cruz Biotechnology，sc-94；1∶3,000)和抗α微管蛋白(Cell Signaling Technology，3873S；1∶20,000)。然后将样品与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠(Cell Signaling Technology，7076；1∶3,000)，抗兔(Bio-Rad，1706515；1∶3,000)或抗山羊(Santa Cruz Biotechnology；sc-2020；1∶3,000)二抗孵育。使用发光图像分析仪LAS-3000(Fujifilm，Tokyo，Japan)，用增强的化学发光(ECL；AmershamBioscience，Piscataway，NJ)使蛋白质带显现。使用Multi-Gauge V3.0软件(Fujifilm)分析免疫印迹带。对来自免疫印迹带的目的点(points of interest POI)进行标记，并使用光密度对其定量，并从各个免疫印迹信号中减去背景信号。将相对光密度值表示为每种蛋白质与加载对照蛋白质(α微管蛋白或ERK)的强度比。

免疫沉淀。免疫沉淀如先前所述(Kim等，2015)进行。为了监测蛋白质-蛋白质相互作用，将1mg WCL与抗DVL1和蛋白G琼脂糖珠(GenDEPOT，Katy，TX)或抗Myc和蛋白A琼脂糖珠(GenDEPOT)在4℃下孵育16小时，并随后将珠在RIPA缓冲液中洗涤3次。通过SDS-PAGE求解所得免疫复合物，并用所示抗体进行免疫印迹。

胫骨器官培养。从胚胎第15.5天(e15.5)小鼠中分离胫骨，在将其在包含抗坏血酸、β-甘油磷酸、BSA、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的不含酚红的α-MEM(Gibco)中培养6天，如前所述(Gillespie等，2011)。在解剖之后，将胫骨在培养基中孵育过夜，并随后用E

报道子测定。将HEK293-TOP细胞接种到24孔板的每个孔中。将细胞用所示浓度的单独化合物进行处理，并将其培养18小时。然后收获细胞，并在60μl报道子裂解缓冲液(Reporter Lysis Buffer)(Promega，Madison，WI)中根据制造商说明进行裂解。在离心之后，将20μl上清液用于测量萤光素酶活性。将相对萤光素酶活性相对于经DMSO处理的对照的活性归一化。

逆转录和定量实时PCR。使用Trizol试剂(Invitrogen)根据制造商说明提取总RNA。使用200单位的逆转录酶(Invitrogen)在37℃下进行的40μl反应中，对2μg RNA进行逆转录，持续1小时。对于定量实时PCR分析(qRT-PCR)，将所得cDNA(1μl)在包含iQ SYBRGreen Supermix(Qiagen，Germantown，MD)、10pmol引物组(Bioneer)的10μl反应混合物中进行扩增。使用比较循环阈值(CT)法，并将编码β肌动蛋白的ACTB或GAPDH用作内源性对照。使用以下引物组：

表1：引物表

表2：引物表

途径特异性靶基因的引物组描述于先前研究(Kim等，2016)中。

GSK3β激酶测定。将GSK3β(人)与8mM MOPS(pH 7.0)，0.2mM EDTA，20μMYRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(p)EDEEE(磷酸-GS2肽)(SEQ ID NO.37)，10mM乙酸Mg和[γ-33P-ATP](比活性约500cpm/pmol，浓度按照需要)孵育。通过添加Mg-ATP混合物来引发反应。在室温下孵育40分钟之后，通过添加3％磷酸溶液来终止反应。然后将10μl反应物点样到P30滤垫上，并将其在50mM磷酸中洗涤3次，持续5分钟，并在甲醇中洗涤一次，然后进行干燥和闪烁计数(scintillation counting)。

数据库。基因表达谱结果存储在NCBI的基因表达综合数据库(Gene ExpressionOmnibus database，GEO)(http：//www.ncbi.nlmnih.gov/geo/)中，并且可通过GEO登录号GSE16981、GSE14007、GSE9160进行访问。

信号强度的定量。对于DAB免疫染色，使用自动数字图像分析软件ImageJ(National Institutes of Health，Bethesda，MD)和IHC Profiler插件(Varghese等，2014)进行免疫组织化学评分(H评分)的验证。对于免疫荧光染色，使用NIS Elements V3.2软件(Nikon)分析强度。将蓝色通道用作显现核的参考，并且为红色、绿色或蓝色通道限定阈值。分别在红色和绿色通道中计算平均强度，并从三个独立实验的分析估算平均值。

统计学分析。将所有数据均表示为平均值±s.e.m.，并将样品数目在每个图例中指出。统计学显著性差异使用未配对的双尾Studentt检验进行评估。示出的结果表示至少三个独立实验。统计学显著性在图中指示如下：*或

筛选抑制CXXC5-DVL相互作用的化合物。为了初始鉴定抑制CXXC5-DVL相互作用的小分子，通过先前描述(Kim等，2016)的体外结合测定筛选了化学物质文库(2,280种化合物：1,000种来自ChemDiv，1,280种来自SigmaLOPAC)。简言之，将5mg/ml纯化的DVL PDZ结构域在96孔Maxibinding Immunoplate(SPL)的每个孔中于4℃下孵育16小时。在向每个孔中添加10μM经FITC标记的PTD-DBMP之后，将化学物质文库中的每种化合物或对照(DMSO)以30μM的终浓度处理至孔。使用Fluorstar Optima微板阅读器(BGM Lab Technologies，Ortenberg，Germany)测量荧光强度。将结合值作为相对于经DMSO处理的对照归一化的荧光强度的百分比比率计算。19种化合物的CXXC5-DVL相互作用表现出低于10％。在这些化合物中，鉴定了靛玉红类似物，包括BIO和I3O。高通量筛选结果的总结提供于表3中。

表3：高通量筛选结果的总结

计算机上对接(in silico docking)(柔性对接)。具有已知配体舒林酸的DVL PDZ结构域的NMR结构从蛋白质数据库(Protein Data Bank)(PDB代码：2KAW)获得。通过在采用CHARMm力场的Discovery Studio软件(Dassault Systèmes BIOVIA，Discovery StudioModeling Environment，Release 2017，San Diego：Dassault Systemes，2016)中使用柔性对接方法，将BIO、I3O和KY19382与PDZ结构域的舒林酸结合位点对接。对于对接分析，将活性位点限定在以配体为中心的

5，6-二氯靛玉红-3’-甲肟(KY19382)的合成

方案1：试剂：(a)Na

向3-乙酰氧基吲哚(405mg，2.32mmol)在甲醇(0.025M)中的溶液添加5，6-二氯靛红(500mg，2.32mmol)和碳酸钠(613mg，5.79mmol)。将反应混合物回流过夜。将深色沉淀过滤，并用乙醇水溶液洗涤，并通过乙醇和H2O溶液(1∶1(v/v))再结晶。将期望的化合物5，6-二氯-靛玉红在真空中干燥，以63％产率得到紫色固体。

接下来，向5，6-二氯-靛玉红(200mg，0.61mmol)在吡啶(0.15M)中的溶液添加无水羟胺盐酸盐(509mg，6.1mmol)。将反应混合物回流(120℃)过夜。在完成反应之后，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在声处理下完全溶解于乙酸乙酯和水中。将反应混合物使用乙酸乙酯(100ml×2)萃取，并将其用饱和水性碳酸氢钠溶液(200ml)洗涤，经无水MgSO

5-甲氧基靛玉红-3’-肟(A3334)的合成

中间产物5’-甲氧基-[2，3’-联吲哚啉亚基]-2’，3-二酮的合成

将5-甲氧基靛红(1000mg，5.65mmol)添加至250mL圆底烧瓶，并溶解于甲醇(225mL)中，随后添加乙酸吲哚酚(989mg，5.65mmol)和碳酸钠(Na

A3334的合成

将5’-甲氧基-[2，3’-联吲哚啉亚基]-2’，3-二酮(670mg，2.29mmol)添加至100mL圆底烧瓶，并溶解于吡啶(27ml)中，随后添加H

靛玉红-3’-肟(I3O或IO)

5，6-二氯靛玉红-3’-丙基肟(A3486)

5.6-氯靛玉红-3’-苄基肟(A3538)

(Z)-5’-溴-6’-硝基-[2，3’-联吲哚啉亚基]-2’，3-二酮(A2785)

6-硝基-5-三氟甲氧基靛玉红-3’-甲肟(A2794)

KY19382的体内药动学。动物研究已由KRIBB的机构动物护理和使用委员会批准。简言之，将购自Koatech Co.(Kyeonggi，Republic of Korea)的特定无病原体雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(10周龄，体重298至315g)静脉内(iv，1mg/kg，n＝3)或腹膜内(ip，5mg/kg，n＝3)给予单剂量的KY19382。给药溶液在二甲基乙酰胺(dimethylacetamide，DMAC)/聚乙二醇400(PEG400)(20/80，v/v％)中制备以用于施用，并分别以对于iv和ip的5和10mL/kg的给药体积施用。制备每个血浆样品的100μl等分试样，并添加三倍体积的包含卡马西平(carbamazepine)的冰冷乙腈(内标)。将混合物以910g离心10分钟，并对上清液进行LC-MS/MS分析。使用Kinetica 4.4.1(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Woburn，MA，USA)，通过血浆浓度-时间谱的标准非房室分析来计算药动学参数。血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)通过线性梯形法来计算。全身血浆清除率(CLP)如下计算：CLP＝剂量/AUCinf。末端消除半衰期(t1/2)通过以下方程计算：t1/2＝0.693/λZ，其中λZ是末端沉积速率常数。稳态时的分布体积(volume of distribution at steady state，VSS)如下计算：

VSS＝剂量× AUMCinf/(AUCinf)2

，其中AUMCinf是外推至无穷大的血浆浓度-时间曲线的第一时刻下的面积。生物利用度(F)如下计算：

F(％)＝(AUCip/AUCiv)(doseiv/doseip)×100。

生长板衰老的标志包括随着静息、增殖和肥大性软骨细胞/柱的数目降低生长板总高度下降，以及邻近软骨细胞柱(chondrocyte column)之间的间隔提高。与通常指特定细胞程序的“衰老”不同，术语“生长板衰老”表示随着年龄增长而发生的生理功能丧失。参见例如，Gafni RI，等.(2001)Catch-up growth is associated with delayedsenescence of the growth plate in rabbits.PEDIATR RES 50：618-623和Nilsson，等.(2004)Fundamental limits on longitudinal bone growth：growth plate senescenceand epiphyseal fusion.TRENDS ENDOCRINOL METAB 15：370-374。尽管许多儿童由于性早熟而经历了早期的生长板衰老，并在成年期时达到了矮小的身高，但对这些现象的机制理解甚少。最近的研究表明，生长板活性主要受旁分泌因子调节，所述因子直接在生长板内的软骨细胞上发挥其功能。Wnt/β联蛋白信号传导与这些功能有关；然而，控制生长板衰老的分子机制和因素仍未探索。

在本公开内容中，发现在青春期后期，Wnt/β联蛋白途径的负反馈调节剂CXXC5随着生长板软骨细胞中β联蛋白的抑制而逐渐地提高。此外，CXXC5的上调部分由雌激素(可随着青春期进展而提高的性激素)介导。

在青春期后期，CXXC5表达在生长板中渐进性提高。为了阐明Wnt/β联蛋白信号传导参与生长板衰老，使用了基因集富集分析，并且对3周龄(青春期之前和青春期早期)和12周龄(早期成年期)大鼠的生长板中Wnt响应基因的表达谱(GEO：GSE16981)进行研究。现在参考图1A，在12周龄大鼠的生长板中，Wnt/β联蛋白信号传导激活的基因的特征显著下调。此外，在青春期进展期间，Cxxc5(Wnt/β联蛋白信号传导的负调节剂)的mRNA水平逐渐升高(GEO：GSE16981)(图1B)，显示与Wnt/β联蛋白信号传导的另一些抑制剂(Apcdd1、Cxxc4、Dkk2、Igfbp4、Sfrp family、Shisa家族、Sost和Wif1)(表4)相比，在12周时统计学上显著地提高。

表4：Wnt抑制剂的mRNA表达水平的分析

当与CXXC5相比时，在人或大鼠的生长板区域中在青春期时，未显著诱导CXXC4，即还用作Wnt/β联蛋白信号传导的负调节剂的CXXC5的结构和功能类似物(图7A和7B)。

为了更详细地检查青春期时期，收集来自3、6、9和12周龄小鼠的近胫骨的生长板，并进行另外的分析。现在参考图1C，通过与3周龄小鼠相比，在青春期进展的后期进行的qRT-PCR分析确定了Cxxc5的上调和Runx2(Wnt/β联蛋白信号传导靶向软骨形成分化标志物)的下调。免疫印迹分析还显示，在经历青春期进展的小鼠的生长板中，随着β联蛋白和软骨形成标志物(包括COL2A1、RUNX2、COL10A1和MMP13)的降低，CXXC5逐渐提高(图1D)。CXXC5与Wnt/β联蛋白信号传导之间的负相关通过免疫组织化学分析得以验证，其显示在3至12周龄小鼠的生长板中，随着核β联蛋白及其靶标RUNX2逐渐降低而细胞质CXXC5渐进性提高(图1E)。接下来，检查了在细胞水平中CXXC5对Wnt/β联蛋白途径和软骨形成分化的抑制作用。现在参考图1F，CXXC5过表达抑制了WNT3A诱导的Wnt/β联蛋白信号传导靶基因Axin2和Wisp1的提高。此外，CXXC5过表达也抑制了WNT3A诱导的软骨形成分化标志物(例如Runx2、Alp和Mmp13)的转录提高。

CXXC5介导由性激素(雌激素)诱导的生长板衰老。已知雌激素(参与性成熟的激素)在青春期会升高，并可以在生长板衰老中发挥作用。在人软骨细胞细胞系C28/I2中，检查了17β-雌二醇(E2)(循环中的主要雌激素)对CXXC5表达的作用。现在参考图2A，E

为了验证雌激素参与CXXC5表达和生长板衰老，在6周龄的Cxxc5

CXXC5在晚期青春期在抑制纵向骨生长中发挥关键作用。为了进一步确定在青春期进展期间CXXC5在生长板衰老中的作用，评估了Cxxc5

CXXC5可通过与DVL结合而用作Wnt/β联蛋白途径的负调节剂。测试干扰CXXC5-DVL相互作用的蛋白质转导结构域融合的DVL结合基序肽(PTD-DBMP)(Kim等.，2015)其是否会发挥与Cxxc5损失对生长板衰老的相似的作用。现在参考图3H，将PTD-DBMP注射到7周龄小鼠(青春期后期)的生长板中，提高了静息、增殖和肥大性软骨细胞/柱的数目。注射PTD-DBMP还使生长板软骨细胞中的β联蛋白和RUNX2水平提高(图3I和3J)。总体而言，这些结果表明CXXC5在生长板的结构衰老中发挥作用，这可通过抑制CXXC5-DVL相互作用来获得。

KY19382通过对CXXC5-DVL相互作用和GSK3β活性二者的抑制作用激活Wnnt/β联蛋白信号传导。为了鉴定模仿PTD-DBMP功能并延迟生长板衰老的小分子，采用监测CXXC5-DVL相互作用的体外测定系统(Kim等，2016)，从化学物质文库中筛选出2,280种化合物(1,000种来自ChemDiv，以及1,280种来自SigmaLOPAC)(图8)。在该筛选体系中，已知作为GSK3β抑制剂的靛玉红类似物6-溴靛玉红-3’-肟(下文中称为“BIO”)(化合物8)和靛玉红-3’-肟(下文中称为“I3O”)(化合物12)被鉴定为最前排序的阳性初始命中物(还参见表3和5)。参见，例如，Meijer L，等.(2003)GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purpleindirubins.CHEM BIOL 10：1255-1266。如图9中所示，在计算机上对接建模中，BIO和I3O与DVL PDZ结构域(蛋白质数据库[PDB]：2KAW)相互作用。

表5：通过包含2,280种小分子的化学物质文库进行的体外结合测定筛选出的最前排序的化合物表

表6：显示至少部分抑制CXXC5-DVL活性的化学合成化合物表。C：对照

表7：显示至少部分抑制CXXC5-DVL活性的化学合成化合物表。C：对照

表8：显示至少部分抑制CXXC5-DVL活性的化学合成化合物表

为了获得功能上改善的化合物，通过替代基于BIO和13O的结构的靛玉红骨架的R

使用计算机上对接程序进一步表征了DVL PDZ结构域(Protein Data Bank[PDB]：2KAW)上KY19382的可能结合位点(图10B)。KY19382-DVL PDZ复合物的结构模拟显示，参与与KY19382相互作用的残基类似于DBMP结合位点(Kim等，2016)。与BIO或I3O相比，KY19382-DVL PDZ复合物的估计结合能改善(BIO＝-81.80kcal mol

现在参考图4，通过随着GSK3β失活(图4E)和CXXC5-DVL相互作用中断(图4F)而使β联蛋白提高，导致β联蛋白在ATDC5细胞中的核转位升高(图4G)，进一步验证了KY19382在Wnt/β联蛋白信号传导途径中的作用。尽管不希望受到任何理论的束缚，但通过KY19382处理激活β联蛋白途径可能依赖于GSK3β失活和CXXC5-DVL相互作用中断二者。

KY19382延迟生长板衰老并促进纵向骨生长。为了研究KY19382对生长板衰老的作用，每天将0.1mg/kg KY19382腹膜内注射到7周龄小鼠(青春期后期)的生长板中，持续2周。现在参考图5，通过KY19382处理，通过COL2A1免疫染色监测的总生长板高度显著提高(图5A)。该作用分别由BrdU-和RUNX2-阳性细胞评估的增殖和肥大性软骨细胞/柱二者的数目提高得以确定(图5A至5C)。连同这些作用，通过KY19382处理，在生长板软骨细胞中核β联蛋白显著提高(图5A)：免疫印迹分析还显示，KY19382在生长板中提高了β联蛋白和软骨形成标志物，例如COL2A1、RUNX2和MMP13(图5E)。这些功能和结构变化表明KY19382延迟生长板衰老的能力。

接下来，在快速生长的年轻小鼠中通过在3周龄(青春期早期)时每天施用0.1mg/kg KY19382，持续2周测试了KY19382的作用。随着总生长板高度的提高(如通过COL2A1表达所证明)，在经KY19382处理的小鼠中，每个生长板区域的高度和BrdU阳性细胞均升高(图5F至H)。如在老龄小鼠中观察到的，通过KY19382处理，β联蛋白表达软骨细胞也提高(图5F)。

为了排除扩展的HZ(肥大区)是延迟软骨再吸收的结果的任何可能性，进行了在胫骨切片中的TRAP染色。现在参考图5I，组之间生长板/小梁界面中TRAP阳性灶的数目无差异，表明KY19382不影响快速生长的年轻小鼠的软骨再吸收。然而，与经载剂处理的小鼠相比，来自7周龄至9周龄的用KY19382处理的老龄老鼠表现出升高的TRAP阳性灶(图5A和5D)。这些作用表明，尽管青春期后期小鼠的生长板衰老，但通过KY19382处理，生长板成熟的整个过程，包括待由成骨性骨形成替代的空间的制备激活。

现在参考图11，在体外通过KY19382处理之后，BrdU阳性ATDC5细胞数目增强进一步验证了KY19382对软骨细胞增殖的作用(图11A)。另外，在ATDC5和C28/I2细胞中，通过KY19382，软骨形成标志物的mRNA水平上调(图11B和11C)。如图11B中所示，这些作用被siRNA介导的Ctnnb1敲低消除。

现在参考图12，还通过在经KY19382处理的ATDC5细胞中测量多个信号传导途径的靶基因的mRNA水平探索了KY19382的脱靶作用。尽管KY19382显著提高了Wnt/β联蛋白靶基因(例如Fosl1、Wisp1和Axin2)的表达水平，但响应于其他途径的其他19个其他基因却无显著改变。这些结果表明，KY19382通过特异性激活Wnt/β联蛋白途径促进了软骨细胞的增殖和分化。

为了研究从青春期之前和青春期早期至成年期时期的综合性作用，进行了在自3周至13周龄的小鼠中KY19382的长期施用，持续10周。与经载剂处理组相比，0.1mg/kgKY19382的每天处理显著提高了胫骨长度(图5J)。现在参考图13，在经KY19382处理的小鼠的关节软骨和肝组织中未检测到组织学异常(图13A和13B)。在处理10周期间，组之间未观察到重量差异(图13C)。综上所述，这些数据揭示，KY19382通过在快速生长的年轻小鼠中促进生长板成熟以及在老龄小鼠中延迟生长板衰老诱导了纵向骨生长，而无显著的毒性。

本公开内容提供了在青春期后期的生长板软骨细胞中，Wnt/β联蛋白途径的负反馈调节剂CXXC5随着β联蛋白的抑制而逐渐提高。CXXC5的上调部分由雌激素(可随着青春期进展而提高的性激素)介导。此外，在Cxxc5

CXXC5可定位于细胞质或细胞核，这取决于细胞类型和组织(Kim等.，2014；Lee等.，2015)。如本文中所公开的，在生长板衰老期间提高细胞质CXXC5支持了CXXC5可通过与细胞质中的DVL相互作用来发挥其功能。与CXXC5不同，CXXC4(在结构和功能上类似于CXXC5的蛋白质)在青春期进展期间未在生长板中显著表达，这表明CXXC5在生长板衰老中发挥特异性作用。

由于细胞质CXXC5通过与DVL的PDZ结构域相互作用而发挥作用，因此在本文中确定并验证了CXXC5-DVL相互作用作为用于开发使用PTD-DBMP(CXXC5-DVL阻断肽)延迟生长板衰老的药物的靶标。为了进一步开发能够通过延迟生长板衰老来诱导纵向骨生长的小分子，使用监测CXXC5-DVL相互作用的体外筛选系统来筛选小分子文库。可用作GSKβ抑制剂的靛玉红类似物BIO和I3O被确定为潜在的CXXC5-DVL抑制剂。

功能上改善的靛玉红衍生物，尤其是KY19382的开发，确定了这些家族化合物可作为CXXC5-DVL相互作用和/或GSK3β活性的抑制剂而发挥双重作用。本文中公开的结果表明，KY19382通过伴随促进软骨细胞的增殖和分化而延迟生长板衰老而有效地提高了胫骨的纵向生长。尽管不希望受到任何理论的束缚，但KY19382在增强纵向骨生长中的有效性可能是由于在快速生长的年轻时期通过使GSK3β失活而增强生长板成熟以及在青春期期间后期通过干扰CXXC5-DVL相互作用而延迟生长板衰老的双重功能所致。

KY19382未表现出任何显著的脱靶作用，如通过19个其他途径特异性基因的缺乏显著激活(而Wnt/β联蛋白途径靶基因除外)所观察到的。此外，在施用诱导纵向骨生长的0.1mg/kg KY19382之后，未观察到对关节软骨的任何不良作用。靶向通过与DVL相互作用而发挥作用的细胞质CXXC5可提供另外的益处，因为该方法可能会降低可能由靶向核CXXC5而引起的任何不期望的副作用。

表9：KY19382的药动学评价

本文中公开的结果提供了在青春期进展期间雌激素诱导的CXXC5在通过使Wnt/β联蛋白信号传导失活而在促进生长板衰老和抑制纵向骨生长中发挥关键作用(图6A)。使用可通过抑制GSK3β和破坏CXXC5-DVL相互作用的双重机制而激活Wnt/β联蛋白信号传导的小分子进行的有效方法可以是针对患有涉及早期生长板衰老的生长迟缓的儿童的新治疗策略(图6B)。

尽管已经在附图和前述中详细举例说明和描述了该新技术，但是该新技术应被认为在特征方面是举例说明性的而不是限制性的，应理解，仅示出和描述了一些优选实施方案，并且期望保护在该新技术的精神之内的所有改变方案和修改方案。同样，尽管使用具体的实施例、理论论点、说明和举例说明来举例说明了该新技术，但是这些举例说明和伴随的讨论绝不应意在被解释为对该技术的限制。在本申请中所引用的所有专利、专利申请以及对文本、科学论文、出版物等的引用均在其不与本说明书的明确教导相抵触的范围内通过引用其整体并入本文。

序列表

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<151> 2019-03-28

<150> US 62/903,068

<151> 2019-09-20

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ctnnb1 siRNA-1，有义

<400> 1

auuacaaucc gguugugaac guccc 25

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ctnnb1 siRNA-1，反义

<400> 2

gggacguuca caaccggauu guaau 25

<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ctnnb1 siRNA-2，有义

<400> 3

uaaugaaggc gaacggcauu cuggg 25

<210> 4

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ctnnb1 siRNA-2，反义

<400> 4

cccagaaugc cguucgccuu cauua 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACTB正向引物

<400> 5

agagctacga gctgcctgac 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACTB反向引物

<400> 6

agcactgtgt tggcgtaca 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL2A1正向引物

<400> 7

tggaaagcct ggtgatgatg gtg 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL2A1反向引物

<400> 8

tgacctttga caccaggaag gc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP13正向引物

<400> 9

gaagacctcc agtttgcaga gc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP13反向引物

<400> 10

ttcaggattc ccgcgagatt tg 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RUNX2正向引物

<400> 11

caccttgacc ataaccgtct tcac 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RUNX2反向引物

<400> 12

catcaagctt ctgtctgtgc cttc 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEGFA正向引物

<400> 13

agggcagaat catcacgaag tgg 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEGFA反向引物

<400> 14

gtctcgattg gatggcagta gc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Actb正向引物

<400> 15

ggatgcagaa ggagattact 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Actb反向引物

<400> 16

ccgatcccac acagagtact t 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Alp正向引物

<400> 17

gggactggta ctcggataac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Alp反向引物

<400> 18

ctgatatgcg atgtccttgc 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Col2a1正向引物

<400> 19

gcctgtctgc ttcttgtaa 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Col2a1反向引物

<400> 20

tgcggttgga aagtgttt 18

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Col10a1正向引物

<400> 21

tccactcgtc cttctcag 18

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Col10a1反向引物

<400> 22

tttagcctac ctccaaatgc 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ctnnb1正向引物

<400> 23

acaagccaca agattacaag aa 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ctnnb1反向引物

<400> 24

gcaccaatat caagtccaag a 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gapdh正向引物

<400> 25

acccagaaga ctgtggatgg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gapdh反向引物

<400> 26

ggatgcaggg atgatgttct 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mmp9正向引物

<400> 27

tgaagtctca gaaggtggat 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mmp9反向引物

<400> 28

atggcagaaa taggctttgt 20

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mmp13正向引物

<400> 29

taagacacag caagccaga 19

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mmp13反向引物

<400> 30

cacatcagta agcaccaagt 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Runx2正向引物

<400> 31

aaggacagag tcagattaca ga 22

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Runx2反向引物

<400> 32

gtggtggagt ggatggat 18

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sox9正向引物

<400> 33

aactggaaac ctgtctctct 20

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sox9反向引物

<400> 34

acaacacacg cacacatc 18

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vegfa正向引物

<400> 35

ttatttattg gtgctactgt ttatcc 26

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Vegfa反向引物

<400> 36

tctgtatttc tttgttgctg ttt 23

<210> 37

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 磷酸-GS2肽

<400> 37

Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ser Arg His Ser

1 5 10 15

Ser Pro His Gln Ser Glu Asp Glu Glu Glu

20 25