一种快速预测河南石斛掺伪霍山石斛的方法

摘要

本发明公开一种快速预测河南石斛掺伪霍山石斛的方法，包括以下步骤：(1)掺伪霍山石斛粉末样品的制备；(2)红外光谱采集；(3)光谱预处理；(4)光谱特征性波长的筛选；(5)掺伪量预测。本发明通过采用同一样品多次采集和光谱预处理方法，可有效减少人工取样误差，以及扫描次数、分辨率、温度和光程对中红外光谱图的影响；通过移动窗口偏最小二乘法、蒙特卡罗无信息变量消除法和区间随机蛙法三种不同的波长选择方法进行特征波长变量筛选，可有效压缩中红外光谱图中的无用变量及干扰信息；同时获得对该预测模型最合适的光谱预处理方法和波长筛选方法，建立的准确可靠的掺伪预测模型，实现对掺伪霍山石斛样品中的掺伪量进行快速测定。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术领域，更具体地说，关于一种快速预测河南石斛掺伪霍山石斛的方法。

背景技术

霍山石斛(Dendrobium huoshanense Tang et Cheng)属兰科石斛属多年生草本植物，主产于安徽霍山、岳西、潜山等地，含多糖、生物碱及丰富的微量元素。具有生津益胃、抗肿瘤、抗白内障等多种功效，是安徽重要道地药材之一。由于霍山石斛自然状态下萌芽率低、生长缓慢，加上长期过度采挖，其野生资源已濒临灭绝，市价高达30-40万元/kg，且有价无市。目前市场上销售的霍山石斛多是组培霍山石斛经野外驯化栽培品，市场价格仍达10-15万元/kg，市场上霍山石斛的伪品较多。河南石斛为霍山石斛最常见的伪品，常将河南石斛掺在霍山石斛中冒充霍山石斛进行销售。由于霍山石斛和河南石斛从外观上很难辨认，作为霍山石斛的药用部位茎及其粉末状加工品的掺伪鉴别更加困难，仅从外观形态上很难辨别是否掺伪，同时两者药性功效相差甚远，这种掺伪方式直接影响药材的品质，严重威胁霍山石斛临床用药安全，扰乱了霍山石斛药材市场，对霍山石斛产业的长远发展危害极大。因此，亟需建立霍山石斛掺伪河南石斛的检测方法。

目前鉴别中药真伪的常用方法有性状鉴别、显微鉴别、色谱鉴别以及分子生物学技术鉴别等。但是，性状和显微鉴别较多的依赖于从业人员的经验，主观性较强。专利CN105779628A公开了一种用于鉴别霍山石斛的SNP标记及其分子检测方法。专利CN110951912A公开了一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法；专利CN106282372A公开了霍山石斛与美花石斛的对比鉴定方法；专利CN106282373A公开了一种霍山石斛与河南石斛的对比鉴定方法。上述技术均采用的是分子生物学技术对霍山石斛及其近缘种河南石斛进行鉴定，但是，分子和色谱等鉴别方法操作复杂，费时费力，虽然能辨别药材的真假，但是难以检测掺伪样品的掺伪量。

中红外光谱技术具有分析速度快、成本低、样品预处理简单等优点，已在现代医药、食品、农产品等多种样品分析获得运用。但在掺伪定量研究方面，中红外光谱主要对液体样品，如油脂，蜂蜜，牛奶等样品的研究较多，固体样品主要是集中在化学添加剂的定量分析研究，而两种植物固体样品的掺伪定量检测更为复杂，相关研究较少。虽然中红外光谱存在波长范围短，检测存在光谱重叠严重、背景噪音大、无关波段干扰信息多等问题，但有效的波长筛选可以提高中红外光谱构建预测模型的性能。常见的波长筛选方法主要应用在近红外光谱的定量分析中，而中红外光谱对固体植物样品结合波长筛选方法，进行掺伪定量分析的研究鲜有报道，在中药霍山石斛的掺伪研究中，还未见有研究对于掺伪霍山石斛进行定量分析。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种中红外光谱技术结合化学计量学方法，建立快速、便捷、准确可靠的掺伪石斛样品掺伪量测定方法。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种快速预测河南石斛掺伪霍山石斛的方法，包括以下步骤：

(1)掺伪霍山石斛粉末样品的制备

将收集的新鲜霍山石斛茎和河南石斛茎进行挑拣、清洗除杂、切段冻干、粉碎过筛后，收集颗粒大小为60-100目的霍山石斛茎粉末和河南石斛茎粉末，按照质量比为将河南石斛茎粉末和霍山石斛茎粉末按不同比例混合，得到21组掺伪样品，每组掺伪样品设置10个平行样品，密封保存备用，其中河南石斛茎粉末和霍山石斛茎粉末的质量比例范围在0-100％之间；

(2)红外光谱采集

将步骤(1)中制得的210份掺伪样品，使用傅里叶变换衰减全反射中红外光谱仪(Nicolet iS50 ATR-FTIR红外光谱仪)采集每份掺伪样品的中红外光谱图，每份样品多次采集，获得原始光谱，用于平均谱图计算；

(3)光谱预处理

对掺伪样品的中红外光谱图进行基线校正和平均谱图计算，消除因人工取样误差，导致的谱图差异，再将平均谱移动15个数据点，采用光谱平滑法，消除因检测环境引起的光谱噪声，通过比较最小二乘法(PLS)交叉验证模型的R

(4)光谱特征性波长的筛选

比较移动窗口偏最小二乘法、蒙特卡罗无信息变量消除法和区间随机蛙法三种不同的波长选择方法，得到了建立预测模型的有效波长，以提高模型计算工作量和准确性；

(5)掺伪量预测

使用掺伪定量模型，预测掺伪样品的掺伪量；通过偏最小二乘方法建立105份掺伪石斛样品作为校正集，其光谱图特征波长变量与掺伪量之间建立掺伪定量模型，并使用该掺伪定量模型对105份预测集掺伪样品的掺伪量进行验证。

本发明提供的结合中红外光谱技术建立掺伪霍山石斛样品掺伪量测定方法,通过采用同一样品多次采集和光谱预处理方法，可有效减少人工取样误差，以及扫描次数、分辨率、温度和光程对中红外光谱图的影响；通过移动窗口偏最小二乘法、蒙特卡罗无信息变量消除法和区间随机蛙法三种不同的波长选择方法进行特征波长变量筛选，可有效压缩中红外光谱图中的无用变量及干扰信息；同时获得对该预测模型最合适的光谱预处理方法和波长筛选方法，建立的准确可靠的掺伪预测模型，实现对掺伪霍山石斛样品中的掺伪量进行快速测定。

优选地，所述步骤(1)的21组掺伪样品中，河南石斛茎粉末和霍山石斛茎粉末的质量之比分别为：0％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％。

优选地，所述步骤(1)中每份掺伪样品的总质量控制在500mg。

优选地，所述步骤(1)中样品于-20℃下密封保存备用，这样以保证其石斛药材稳定性。

优选地，所述步骤(2)中红外光谱仪配备AIR附件。

优选地，所述步骤(2)中红外光谱仪光谱采集的相关参数设置为：测定范围4000-400cm

优选地，所述步骤(2)中对同一样品采集的6次中红外光谱原始谱图进行基线校正和平均谱图计算，获得其平均谱，以消除因人工取样误差，导致的谱图差异。

优选地，所述步骤(3)中将平均谱移动15个数据点，采用光谱平滑法减少检测环境导致的光谱噪声。

优选地，所述步骤(3)中8种光谱预处理方法为多元散射校正法、标准正态变化法、一阶导数法、二阶导数法、多元散射校正加一阶导数法、多元散射校正加二阶导数法、标准正态变化加一阶导数法和标准正态变化加二阶导数法。

优选地，所述步骤(5)中用掺伪定量模型预测所述掺伪石斛样品的掺伪量，具体为通过偏最小二乘法建立1/2总样品数校正集掺伪石斛样品的光谱图特征变量与掺伪量之间的掺伪定量模型，并利用该掺伪定量模型对1/2总样品数份预测集掺伪霍山石斛样品的掺伪量进行验证。

本发明具有如下的有益效果：本发明提供的结合中红外光谱技术建立掺伪霍山石斛样品掺伪量测定方法,通过采用同一样品多次采集和光谱预处理方法，可有效减少人工取样误差，以及扫描次数、分辨率、温度和光程对中红外光谱图的影响；通过移动窗口偏最小二乘法、蒙特卡罗无信息变量消除法和区间随机蛙法三种不同的波长选择方法进行特征波长变量筛选，可有效压缩中红外光谱图中的无用变量及干扰信息；同时获得对该预测模型最合适的光谱预处理方法和波长筛选方法，建立的准确可靠的掺伪预测模型，实现对掺伪霍山石斛样品中的掺伪量进行快速测定。

附图说明

图1为本发明一种快速预测河南石斛掺伪霍山石斛含量的方法的流程图；

图2为本发明实施例3的若干份掺伪霍山石斛样品的原始中红外光谱图；

图3为本发明实施例3的若干份掺伪霍山石斛样品的中红外光谱预处理图及三种波长挑选方法挑选波长的位置；

图4为本发明实施例3的掺伪霍山石斛样品的掺伪量检测模型的效果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例和说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

一种快速预测河南石斛掺伪霍山石斛的方法，包括以下步骤：

(1)掺伪霍山石斛样品制备

掺伪霍山石斛样品制备：将收集的新鲜霍山石斛茎和河南石斛茎进行挑拣，使用纯净水清洗以除去表面杂质，然后将霍山石斛茎和河南石斛茎分别切成小段，再置于低温冻干机中冻干，使用粉碎机进行粉碎后过60目筛，获得颗粒大小为60目的霍山石斛茎粉末和河南石斛茎粉末，将河南石斛茎粉末和霍山石斛茎粉末按照质量比分别为0％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％的比例混合，得到21组掺伪样品，每组掺伪样品设置10个平行样品，共210份掺伪样品，且每份掺伪样品质量控制在500mg，最后将210份掺伪样品置于-20℃下密封保存备用；

(2)掺伪霍山石斛样品原始光谱的采集

将补助(1)中得到的若干份掺伪石斛样品，使用中红外光谱仪(Nicolet iS50ATR-FTIR红外光谱仪)采集掺伪霍山石斛样品的中红外光谱图。

光谱采集的过程如下：将掺伪霍山石斛粉末样品置于FTIR光谱仪配备的金刚石单反射AIR附件的样品池中，设置中红外光谱仪的测定范围4000-400cm

(3)光谱预处理

对同一掺伪霍山石斛样品采集的6次中红外光谱原始谱图进行基线校正和平均谱图计算，获得其平均谱消除因人工取样误差导致的谱图，再将平均谱移动平均15点，采用平滑法消除检测环境导致的光谱噪声；

运用8种光谱预处理方法：多元散射校正法、标准正态变化法、一阶导数法、二阶导数法、多元散射校正加一阶导数法、多元散射校正加二阶导数法、标准正态变化加一阶导数法、标准正态变化加二阶导数法，结合偏最小二乘算法(PLS)进行预处理方法的筛选；通过比较PLS交叉验证模型的R

(4)光谱特征性变量的筛

比较了移动窗口偏最小二乘法、蒙特卡罗无信息变量消除法和区间随机蛙法三种不同的波长选择方法；运用上述三种波长变量筛选方法结合建立PLS模型的有效波长以提高模型计算工作量和准确性。

(5)掺伪量预测

根据掺伪石斛样品的光谱图特征波长变量，采用掺伪定量模型预测掺伪霍山石斛样品的掺伪量；通过偏最小二乘方法建立105份校正集掺伪霍山石斛样品的光谱图特征波长变量与掺伪量之间的掺伪定量模型，并利用该掺伪定量模型对105份预测集掺伪霍山石斛样品的掺伪量进行验证。

实施例2

掺伪霍山石斛样品制备：将收集的新鲜霍山石斛茎和河南石斛茎进行挑拣，使用纯净水清洗以除去表面杂质，然后将霍山石斛茎和河南石斛茎分别切成小段，再置于低温冻干机中冻干，使用粉碎机进行粉碎后过80目筛，获得颗粒大小为80目的霍山石斛茎粉末和河南石斛茎粉末，将河南石斛茎粉末和霍山石斛茎粉末按照质量比分别为0％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％的比例混合，得到21组掺伪样品，每组掺伪样品设置10个平行样品，共210份掺伪样品，且每份掺伪样品质量控制在500mg，最后将210份掺伪样品置于-20℃下密封保存备用；

(2)掺伪霍山石斛样品原始光谱的采集

将补助(1)中得到的若干份掺伪石斛样品，使用中红外光谱仪(Nicolet iS50ATR-FTIR红外光谱仪)采集掺伪霍山石斛样品的中红外光谱图。

光谱采集的过程如下：将掺伪霍山石斛粉末样品置于FTIR光谱仪配备的金刚石单反射AIR附件的样品池中，设置中红外光谱仪的测定范围4000-400cm

(3)光谱预处理

对同一掺伪霍山石斛样品采集的6次中红外光谱原始谱图进行基线校正和平均谱图计算，获得其平均谱消除因人工取样误差导致的谱图，再将平均谱移动平均15点，采用平滑法消除检测环境导致的光谱噪声；

运用8种光谱预处理方法：多元散射校正法、标准正态变化法、一阶导数法、二阶导数法、多元散射校正加一阶导数法、多元散射校正加二阶导数法、标准正态变化加一阶导数法、标准正态变化加二阶导数法，结合偏最小二乘算法(PLS)进行预处理方法的筛选；通过比较PLS交叉验证模型的R

(4)光谱特征性变量的筛

比较了移动窗口偏最小二乘法、蒙特卡罗无信息变量消除法和区间随机蛙法三种不同的波长选择方法；运用上述三种波长变量筛选方法结合建立PLS模型的有效波长以提高模型计算工作量和准确性。

(5)掺伪量预测

根据掺伪石斛样品的光谱图特征波长变量，采用掺伪定量模型预测掺伪霍山石斛样品的掺伪量；通过偏最小二乘方法建立105份校正集掺伪霍山石斛样品的光谱图特征波长变量与掺伪量之间的掺伪定量模型，并利用该掺伪定量模型对105份预测集掺伪霍山石斛样品的掺伪量进行验证。

实施例3

一种快速预测河南石斛掺伪霍山石斛的方法，包括以下步骤：

(1)掺伪霍山石斛样品制备

将收集的新鲜霍山石斛茎和河南石斛茎进行挑拣，使用纯净水清洗以除去表面杂质，然后将霍山石斛茎和河南石斛茎分别切成小段，再置于低温冻干机中冻干，使用粉碎机进行粉碎后过100目筛，获得颗粒大小为100目的霍山石斛茎粉末和河南石斛茎粉末，将河南石斛茎粉末和霍山石斛茎粉末按照质量比分别为0％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％的比例混合，得到21组掺伪样品，每组掺伪样品设置10个平行样品，共210份掺伪样品，且每份掺伪样品质量控制在500mg，最后将210份掺伪样品置于-20℃下密封保存备用；

(2)掺伪霍山石斛样品原始光谱的采集

将上一步得到若干份掺伪石斛样品，使用中红外光谱仪(Nicolet iS50ATR-FTIR红外光谱仪)采集掺伪霍山石斛样品的中红外光谱图。

光谱采集的过程如下：将掺伪霍山石斛粉末样品置于FTIR光谱仪配备的金刚石单反射AIR附件的样品池中，设置中红外光谱仪的测定范围4000-400cm

(3)光谱预处理

对同一掺伪霍山石斛样品采集的6次中红外光谱原始谱图进行基线校正和平均谱图计算，获得其平均谱消除因人工取样误差导致的谱图，再将平均谱移动平均15点，采用平滑法消除检测环境导致的光谱噪声；

运用8种光谱预处理方法：多元散射校正法、标准正态变化法、一阶导数法、二阶导数法、多元散射校正加一阶导数法、多元散射校正加二阶导数法、标准正态变化加一阶导数法、标准正态变化加二阶导数法，结合偏最小二乘算法(PLS)进行预处理方法的筛选；

通过比较PLS交叉验证模型的R

表1为8种光谱预处理方法处理结果

(4)特征变量提取

光谱特征性变量的筛选：比较了移动窗口偏最小二乘法、蒙特卡罗无信息变量消除法和区间随机蛙法三种不同的波长选择方法；

运用上述三种波长变量筛选方法结合建立PLS模型的有效波长以提高模型计算工作量和准确性，结果如表2所示，经比较使用区间随机蛙法进行特征波长筛选时仅使用238个数据点，获得较高的R

表2为3种波长变量筛选方法处理结果

(5)掺伪量预测

根据掺伪石斛样品的光谱图特征波长变量，采用掺伪定量模型预测掺伪霍山石斛样品的掺伪量；通过偏最小二乘方法建立105份校正集掺伪霍山石斛样品的光谱图特征波长变量与掺伪量之间的掺伪定量模型，并利用该掺伪定量模型对105份预测集掺伪霍山石斛样品的掺伪量进行验证，结果如图4所示；

根据图4的结果可知，本发明获得校正集的相关系数为0.9951，均方根误差2.98％，预测集的相关系数为0.9556，均方根误差为6.44％，构建的方法可为霍山石斛中掺伪河南石斛的掺伪量测定提供可靠方法。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。