高效液相色谱法测定氨基己酸及其注射液中有关物质的方法

摘要

本发明公开了一种高效液相色谱法测定氨基己酸及其注射液中有关物质的方法，采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为磷酸二氢钾缓冲液‑甲醇；所述流动相B为甲醇；所述流动相A的配制方法如下：将0.05mol/L～0.2mol/L磷酸二氢钾溶液先用酸碱调节剂调节pH=2.0～3.0，得到磷酸二氢钾缓冲液，再与甲醇按照80∶20～95∶5的体积比混合得到。本发明的方法通过选择合适的流动相以及洗脱条件，能够将氨基己酸与各杂质在同一色谱条件下进行快速有效的分离，氨基己酸主峰与相邻杂质峰、各杂质峰之间均能达到基线分离。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定氨基己酸及其注射液中有关物质的方法。

背景技术

氨基己酸（也即6-氨基己酸）是抗纤维蛋白溶解药。纤维蛋白原通过其分子结构中的赖氨酸结合部位特异性地与纤维蛋白结合，然后在激活物作用下变为纤溶酶，该酶能裂解纤维蛋白中精氨酸和赖氨酸肽链，形成纤维蛋白降解产物，使血凝块溶解。本品能阻抑纤溶酶原与纤维蛋白结合，防止其激活，从而抑制纤维蛋白溶解，高浓度则直接抑制纤溶酶活力，达到止血效果。氨基己酸注射液适用于防治纤维蛋白溶解亢进引起的各种出血。

文献1公开了一种HPLC法测定氨基己酸注射液的含量及有关物质，它是采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱；流动相A为0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH=2.0），流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH=2.0）-乙腈（体积比为70∶30）。该文献测定的有关物质只有己内酰胺。

文献2公开了一种氨基己酸注射液中有关物质检查方法的研究，其中LC-MS法采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱；流动相A为0.02mol/L甲酸铵缓冲液（含0.1%的甲酸），流动相B为乙腈。LC法采用的流动相为体积比25∶75的甲醇-0.55%己烷磺酸钠溶液（含1%磷酸二氢钾，pH=2.2）。该文献测定的有关物质包括己内酰胺和氨基己酸二聚体。

然而，通过实验发现，氨基己酸及其注射液中的杂质不仅包括己内酰胺和氨基己酸二聚体（记为3002），还包括氨基己酸三聚体（记为3003）、6-氨基己酰胺（记为3004）以及其它未知杂质。

氨基己酸三聚体的结构如下：

6-氨基己酰胺的结构如下：

目前，尚未发现能够同时测定氨基己酸及其注射液中上述所有杂质的文献报道。

文献1：张静等，“HPLC法测定氨基己酸注射液的含量及有关物质”，《今日药学》2019年第29卷第2期，第101-104页。

文献2：江文明等，“氨基己酸注射液中有关物质检查方法的研究”，《药物分析杂志》2016年第36卷第7期，第1258-1262页。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种高效液相色谱法测定氨基己酸及其注射液中有关物质的方法，该方法不仅能测定出己内酰胺和氨基己酸二聚体，还能测定出氨基己酸三聚体、6-氨基己酰胺以及其它未知杂质。

实现本发明目的的技术方案是：一种高效液相色谱法测定氨基己酸及其注射液中有关物质的方法，采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为磷酸二氢钾缓冲液-甲醇；所述流动相B为甲醇。

所述流动相A中，磷酸二氢钾缓冲液与甲醇的体积比为80∶20～95∶5；优选为85∶15。

所述流动相A的配制方法如下：将磷酸二氢钾溶液先用酸碱调节剂调节pH=2.0～3.0，得到磷酸二氢钾缓冲液，再与甲醇按照上述体积比混合得到。

所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L，优选为0.1mol/L。

所述梯度洗脱条件如下：0～25min，流动相B从10%升至40%；25.1～40min，流动相B=10%。

所述高效液相色谱其它色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

柱温：35～45℃，优选为40℃。

紫外检测波长：205～230nm，优选为210nm。

进样量：10～100μL，优选10μL。

流动相流速：0.8～1.2mL/min，优选为1.0mL/min。

稀释剂：水。

本发明具有的积极效果：

（1）本发明的方法通过选择合适的流动相以及洗脱条件，能够将氨基己酸与各杂质（己内酰胺、3002、3003、3004以及其它未知杂质）在同一色谱条件下进行快速有效的分离，氨基己酸主峰与相邻杂质峰、各杂质峰之间均能达到基线分离。

（2）本发明的方法专属性强、灵敏度高、精密度好、准确度高，可对氨基己酸各杂质进行准确检测，从而能够有效控制氨基己酸及其注射液的质量，最终保证了氨基己酸及其注射液的有效性和安全性。

附图说明

图1为实施例1中的系统适用性溶液的高效液相色谱图。

图2为实施例2中的供试品溶液的高效液相色谱图。

图3a～图3e为试验例1中各专属性试验的高效液相色谱图；其中，图3a为酸破坏溶液及未降解空白及降解的叠加图，图3b为碱破坏溶液及未降解空白及降解的叠加图，图3c为高温破坏溶液及未降解空白及降解的叠加图，图3d为光照破坏溶液及未降解空白及降解的叠加图，图3e为氧化破坏溶液及未降解空白及降解的叠加图。

具体实施方式

一、仪器。

高效液相色谱仪：Thermo-U3000。

色谱柱：CNW Athena C18（4.6mm×250mm，5μm）。

二、色谱条件。

柱温：40℃。

紫外检测波长：210nm。

进样量：10μL。

流动相流速：1.0mL/min。

流动相A：磷酸二氢钾缓冲液（pH=2.5）-甲醇（体积比为85∶15）。

配制方法如下：取13.6g的磷酸二氢钾，加水溶解并稀释至1L，得到0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液，然后用磷酸调节pH=2.5，得到磷酸二氢钾缓冲液，再与甲醇按照85∶15的体积比混合得到。

流动相B：甲醇。

稀释剂：水。

具体梯度洗脱条件如下：0～25min，流动相B从10%升至40%；25.1～40min，流动相B=10%。

（实施例1）

空白溶液：水。

杂质定位溶液：精密称取己内酰胺、3002、3003、3004标准品各10mg，分别置于25mL容量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为各杂质定位溶液。

系统适用性溶液：精密称取氨基己酸标准品（质量分数为100%）0.4g，置于10mL容量瓶中，分别精密移取上述各杂质定位溶液1mL，加稀释剂至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

其中，氨基己酸含量为40mg/mL，己内酰胺、3002、3003、3004含量均为40μg/mL。

精密量取10μL系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，具体结果见表1。

表1

由图1以及表1可以看出：氨基己酸与各杂质均能达到有效的分离。

（实施例2）

供试品溶液：精密量取氨基己酸注射液样品（规格为5mL，含1.0g氨基己酸）2.0mL，置10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，，作为供试品溶液。

精密量取10μL供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2。

由图2可以看出：样品中不但能够检测出己内酰胺和3002，还能够检测出3003、3004以及其它未知杂质。

（试验例1）

本试验例为本发明的检测方法的专属性试验。

供试品储备液：氨基己酸注射液样品（规格为5mL，含1.0g氨基己酸）。

1mol/L酸破坏溶液：取供试品储备液2mL，置于10mL量瓶中，先加3mol/L盐酸溶液1mL，静置24h后，再加3mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

1mol/L碱破坏溶液：取供试品储备液2mL，置于10mL量瓶中，先加3mol/L氢氧化钠溶液1mL，静置24h后，再加3mol/L盐酸溶液1mL中和，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

高温破坏溶液：取供试品储备液2mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，于105℃加热24h，冷却，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

光照破坏溶液：取供试品储备液2mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，置于光照箱中2天，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

氧化破坏溶液：取供试品储备液2mL，置于10mL量瓶中，加30%双氧水溶液1mL，静置24h后，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

同法制备酸破坏空白、碱破坏空白及氧化破坏空白溶液。

精密量取上述溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

每个条件未降解空白及降解的叠加图分别见图3a～3e。

由图3a～图3e可以看出：本品经强制降解试验，各条件下杂质与主峰良好分离，说明本方法的专属性良好，可以作为本品有关物质的检测方法。

（试验例2）

本试验例为本发明的检测方法的线性试验。

空白溶液：水。

线性储备液（400μg/mL）：精密称取氨基己酸、己内酰胺、3002、3003、3004各40mg，置同一100mL量瓶中，溶解，稀释至刻度，混匀，作为线性储备液。

20%线性溶液：取线性储备液1.0mL，置50mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

40%线性溶液：取线性储备液1.0mL，置25mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

80%线性溶液：取线性储备液2.0mL，置25mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

100%线性溶液：取线性储备液1.0mL，置10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

150%线性溶液：取线性储备液3.0mL，置20mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

200%线性溶液：取线性储备液2.0mL，置10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

精密量取上述各线性溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度C（μg/mL）为横坐标，对应主峰峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线并拟定线性回归方程，结果见表2。

表2

由表2可以看出：氨基己酸以及各杂质在浓度8μg/mL～80μg/mL的浓度范围内，线性关系良好。

（试验例3）

本试验例为本发明的检测方法的进样精密度试验。

取试验例2中100%线性溶液10μL 注入液相色谱仪，连续进6针，作为进样精密度，记录色谱图，结果见表3。

表3

由表3可以看出：100%线性溶液连续进样6次，氨基己酸及各杂质峰面积的RSD值分别为2.96%、0.14%、0.88%、0.25%、0.62%，均小于5%；结果表明进样精密度良好。

（试验例4）

本试验例为本发明的检测方法的检测限和定量限试验。

取试验例2中20%线性溶液，稀释2倍作为3002、3003、3004的定量限溶液；移取3mL至10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为3002、3003、3004的检测限溶液。

取试验例2中20%线性溶液，稀释5倍作为己内酰胺的定量限溶液；移取3mL至10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为己内酰胺的检测限溶液。

取试验例2中20%线性溶液，作为氨基己酸的定量限溶液；移取3mL至10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为氨基己酸的检测限溶液。

精密量取上述各溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表4。

表4

由表4可以看出：定量限信噪比均大于10，检测限信噪比均大于3，符合要求。

（试验例5）

本试验例为本发明的检测方法的准确度试验。

空白溶液：水。

杂质储备液：精密称取己内酰胺、3002、3003杂质对照品各20mg，置同一100mL量瓶中，加稀释剂适量，振摇使溶解，加稀释剂至刻度，摇匀。

杂质对照品溶液：精密量取杂质储备液2.0mL，置10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀。

供试品储备溶液：氨基己酸注射液样品（规格为5mL，含1.0g氨基己酸）。

供试品溶液：精密量取供试品储备溶液2.0mL，置10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

加0.05%杂质供试液：分别精密量取供试品溶液2.0mL和杂质对照品溶液1.0mL，置同一10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀。平行制备3份。

加0.1%杂质供试液：分别精密量取供试品溶液2.0mL和杂质对照品溶液2.0mL，置同一10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀。平行制备3份。

加0.15%杂质供试液：分别精密量取供试品溶液2.0mL和杂质对照品溶液3.0mL，置同一10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀。平行制备3份。

精密量取上述各杂质供试液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，扣除供试品溶液本底所含的已知杂质的量，计算回收率，结果见表5。

表5

由表5可以看出：各杂质回收率均在90%～110%范围内，RSD均小于1%，说明本发明的检测方法准确度良好。

（试验例6）

本试验例为本发明的检测方法的稳定性试验。

空白溶液：水。

供试品溶液：精密量取氨基己酸注射液样品（规格为5mL，含1.0g氨基己酸）2.0mL，置10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀。

0.1%对照品溶液：精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，再精密量取该溶液5.0mL，置50mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀。

杂质对照品溶液：精密称取己内酰胺、3002、3003、3004杂质对照品各20mg，置同一100mL量瓶中，加稀释剂适量，振摇使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。再精密量取该溶液2.0mL，置10mL量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀。

取空白溶液、0.1%对照品溶液、杂质对照品溶液、供试品溶液在室温下放置约0、1h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h，分别精密量取各溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，与0小时比较峰面积考察溶液的稳定性，结果分别见表6～表8。

其中，表6为0.1%对照品溶液稳定性结果，表7为杂质对照品溶液稳定性结果，表8为供试品溶液稳定性结果。

表6

表7

表8

由表6～表8可以看出：室温放置24小时内，0.1%对照溶液峰面积RSD=1.73%；杂质对照品溶液己内酰胺、3002、3003、3004峰面积RSD分别为0.23%、0.59%、0.87%、0.48%；供试品溶液中杂质个数没有增加，各杂质测定结果的绝对误差单杂变化均小于0.05%，总杂变化小于0.1%，说明本溶液在24h内稳定。