CD146及其在纤维化的诊断和治疗中作为生物标志物和治疗靶点的用途

摘要

本发明涉及医学领域，特别是涉及纤维化的诊断和治疗。更具体来说，本发明涉及CD146及其在纤维化的诊断中作为生物标志物和在纤维化的治疗中作为治疗靶点的用途。本发明还涉及在对象中检测对纤维化的易感性，诊断、预后和/或监测纤维化的组合物和方法。本发明还涉及用于在对象中预防或治疗纤维化的CD146抑制剂和包含CD146抑制剂的组合物，以及在诊断或治疗背景中的组合物、试剂盒及其用途。

说明书

技术领域

本发明涉及医学领域，特别是涉及纤维化的诊断和治疗。更具体来说，本发明涉及CD146及其在纤维化的诊断中作为生物标志物和在纤维化的治疗中作为治疗靶点的用途。本发明还涉及在对象中检测对纤维化的易感性，诊断、预后和/或监测纤维化的组合物和方法。本发明还涉及用于在对象中预防或治疗纤维化的CD146抑制剂和包含CD146抑制剂的组合物，以及在诊断或治疗背景中的组合物、试剂盒及其用途。

背景技术

纤维化是在修复性或反应性过程中在器官或组织中形成过多的纤维结缔组织。从生理学上讲，纤维化的作用是沉积结缔组织，这会消除下方器官或组织的体系结构和功能。由细胞外基质(ECM)蛋白的病理性积累所定义，纤维化引起瘢痕形成和受影响组织的增厚。它实质上是夸张的伤口愈合反应，干扰了正常的器官功能。组织变得更加僵硬并丧失功能。

纤维化与瘢痕形成过程相似，因为两者都涉及受刺激的成纤维细胞铺放包括胶原蛋白和糖胺聚糖的结缔组织。当免疫细胞例如巨噬细胞释放刺激成纤维细胞的可溶性因子时，所述过程开始。表征最充分的促纤维化介导物是TGFβ，它由巨噬细胞以及任何受损的被称为间质的表面之间的组织释放。纤维化的其他已知可溶性介导物包括CTGF、血小板衍生生长因子(PDGF)和白介素4(IL-4)。自身免疫疾病也可导致纤维化。

这个组织修复过程是复杂的，其中ECM的合成和降解的严格调控确保维持正常的组织体系结构。所述整个过程尽管是必需的，然而如果组织损伤是严重或重复性的，或者如果伤口愈合反应本身变得失调，则可能导致进行性的不可逆的纤维化反应。

纤维化可发生在体内的器官和许多组织中，通常是炎症或损伤的结果，其实例包括心脏(心房纤维化、心内膜心肌纤维化、梗塞特别是陈旧性心肌梗塞)、肾脏(肾纤维化)、肝脏(肝硬化、胆道闭锁)、肺(进行性大块纤维化)、脑(胶质瘢痕)、动脉(动脉僵硬)、关节例如膝或肩(关节纤维化)、肠(克罗恩病)、手、手指(杜普伊特伦挛缩)、皮肤(瘢痕疙瘩、肾源性系统性纤维化)、纵隔软组织(纵隔纤维化)、腹膜后软组织(腹膜后纤维化)、骨髓(骨髓纤维化)等。

肾小球疾病可以逐步或迅速导致肾纤维化和慢性肾病(CKD)。快速进行性或新月体性肾小球肾炎(GN)是一组罕见的肾脏疾病，作为显著炎症并伴有肾小球损伤和新月体出现的结果，它们可能会迅速发展至晚期肾衰竭(Mathieson,P，2007)。其他的肾区室也受到影响，包括肾小管间质，其表现出导致肾间质纤维化的炎症。这种结构性病变的功能性结果是肾功能的迅速恶化(Moeller,M.J，2013)。尽管几项主要是关于实验性GN的临床前模型的研究提供了关于炎症过程和随之而来的纤维化两方面的病理生理学进展，但对所述疾病的调控和进展的分子认识仍然有限，并且当前的治疗仍仅仅部分有效。

心肌纤维化是对某些形式的心脏病例如心肌梗塞、某些心肌病或高血压做出响应而自发发生的一种创伤愈合过程。它的特征在于细胞外基质蛋白(纤连蛋白、I型和III型胶原蛋白)的沉积增加，并伴有参与基质降解的金属蛋白酶(MMP)的表达降低(Talman和Ruskoaho，2016)。这种组织积累造成受伤心脏的刚性增加和顺应性下降，心脏不仅丧失其收缩和松弛的能力，而且丧失其驱动固有心脏电活动的能力。所有这些变化最终导致患者发生心功能不全，从长远来看会导致心脏骤停(Chaturvedi等，2010)。

心肌纤维化根据其在心肌中的位置分为两类：

-“反应性/间质性”纤维化，其对应于纤维化扩展到心肌细胞之间的间隙空间中。这种类型的纤维化在衰老的背景下得到了更具体的描述(Chen和Frangogiannis，2010；Mays等，1991)。事实上，许多工作已显示，心脏衰老与变得肥大的心肌细胞的总数的减少以及心肌胶原蛋白沉积的显著增加相关。这些变化造成心脏顺应性下降，从而导致舒张功能障碍的建立而收缩功能得以保留(Biernacka和Frangogiannis，2011)，和

-“修复性纤维化”，其是指对心脏病例如心肌梗塞做出响应的瘢痕组织形成(Weber，1989)。

目前，控制心肌纤维化的有害过程的有效疗法很少。因此，寻找抑制或逆转这一过程的新疗法是重要的公共卫生问题。

由于人口老龄化和心血管疾病风险因子(糖尿病、肥胖和高血压)的加重，伴有纤维化的病症的频率显著增加。

到目前为止，尚无可用于检测纤维化的特异性生物标志物。量化纤维化的唯一方式是组织活检。同样，没有可用于治疗纤维化的治疗方法，特别是没有可以逆转纤维化过程的治疗方法。

仍然缺少一种诊断和监测纤维化或确定患者是否具有发生纤维化的风险的简单可靠且特异性的测试，并且所述测试对于快速建立旨在保护或改善患者健康的预防和治疗策略具有很高价值。这是本发明的目的。

发明内容

本发明人在本文中首次将CD146鉴定为在纤维化的诊断中特别令人感兴趣的生物标志物以及在纤维化的治疗中有利的治疗靶点或治疗工具。

因此，本文中描述了CD146蛋白，特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146(sCD146)蛋白或SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白或SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白，它们在对象中通常作为生物标志物，用于对纤维化特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的易感性的检测，用于所述纤维化的诊断和/或预后，或用于所述纤维化的监测。

本文还描述了一种在对象中检测对纤维化特别是心肌、肾、皮肤或肺纤维化的易感性或诊断和/或预后所述纤维化的体外、离体或体内方法。这种方法通常包括确定所述对象的生物样品中CD146蛋白的表达水平，通常是可溶性CD146蛋白的表达水平，特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：7的可溶性CD146蛋白的表达水平、SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的表达水平或SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白的表达水平的步骤。

本文还描述了一种在对象中监测纤维化、优选为心肌或肾纤维化的体外、离体或体内方法。所述方法通常包括在两个或更多个时间点确定所述对象的生物样品中CD146蛋白的表达水平、特别是可溶性CD146蛋白的表达水平，所述可溶性CD146蛋白选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更高的可溶性CD146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更低的可溶性CD146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的可溶性CD146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。

本文还描述了一种在对象中监测纤维化、特别是皮肤或肺纤维化的体外、体内或离体方法，所述方法包括在两个或更多个时间点确定所述对象的生物样品中SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的表达水平，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更高的可溶性CD146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更低的人类可溶性CD146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的人类可溶性CD146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。

本文还描述了一种在对象中监测纤维化、特别是皮肤或肺纤维化的体外、体内或离体方法，所述方法包括在两个或更多个时间点确定所述对象的生物样品中SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白的表达水平，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更低的可溶性CD146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更高的人类可溶性CD146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的人类可溶性CD146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。

本文还描述了一种CD146抑制剂，特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白的抑制剂，其用于在对象中，通常是在已通过本文描述的方法鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌和/或肾纤维化。

本文还描述了一种CD146抑制剂，特别是SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抑制剂，其用于在对象中，通常是在已通过本文描述的方法鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化，特别是皮肤或肺纤维化。

本文还公开了CD146抑制剂、特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白的抑制剂或SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抑制剂的用途，其用于体外或离体制备组合物，以(用于)在需要的对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌和/或肾纤维化。

本发明人还在本文中提供了一种组合物，其包含CD146抑制剂、特别是选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白的抑制剂或SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抑制剂和可药用载体，用于在对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化。

本文还描述了一种组合物，其包含CD146蛋白、特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白或SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白和可药用载体，用于在对象、优选为人类中预防或治疗皮肤纤维化和/或肺纤维化。

本发明人还在本文中描述了一种针对CD146蛋白、特别是选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白、SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白或SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白的抗体及其片段。本文中新描述的优选抗体或其片段包含SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96的重链可变区(VH)CDR多肽序列和SEQ ID NO：97、序列FAS和SEQ ID NO：98的轻链可变区(VL)CDR多肽序列。另一种本文新描述的抗体是包含SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89的重链可变区(VH)CDR多肽序列和SEQ ID NO：90、序列QVS和SEQ ID NO：91的轻链可变区(VL)CDR多肽序列的抗体或其片段。

本发明人在本文中还描述了一种在对象中诊断纤维化、特别是心肌或肾纤维化的方法。这种方法通常包括在所述对象的生物样品中，通常在所述对象的血清中检测并优选地定量CD146、优选为选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的sCD146蛋白的量的步骤。这种方法通常涉及使用本文中描述的结合CD146蛋白、优选为sCD146蛋白的抗体。

本发明人还在本文中描述了一种在需要的对象中，通常是在已通过本文描述的方法鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化增加或具有预后不良的纤维化的对象中治疗纤维化、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的方法。这种方法通常包括向所述对象给药通常为有效量的CD146抑制剂、特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白的抑制剂或SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抑制剂或包含此类CD146抑制剂的组合物的步骤。

还描述了一种体外、离体或体内监测药物、通常是CD146抑制剂、特别是选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7的可溶性CD146蛋白的抑制剂或SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抑制剂或组合物用于治疗纤维化、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的效能的方法。这种方法通常包括将在任何纤维化治疗之前来自于对象的第一生物样品中CD146、通常为可溶性CD146的表达，与已暴露于用于治疗纤维化的药物或组合物的同一对象的第二生物样品中CD146、通常为可溶性CD146的表达进行比较的步骤。

另一方面，本公开提供了试剂盒，其包含本文中描述的产品、通常为蛋白、(可溶性)CD146的抑制剂或组合物中的任一者或多者。通常，所述试剂盒还包含根据所公开的方法使用所述蛋白质、抑制剂或组合物的说明书。

发明详述

CD146是一种属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白。已知它与内皮通透性、炎症和血管生成有关。

膜型CD146是在无论任何血管口径或解剖区域的血管树的所有内皮细胞中检测到的一种粘附蛋白(Bardin,N.2001；Georges F 1991)。它主要位于细胞间连接处，并控制内皮细胞之间的内聚和细胞旁通透性(Anfosso,F.,2001；Solovey,A.N.,2001；Jouve,N.,2015)，但是也控制单核细胞迁移(Bardin,N.,2009)和血管生成(Chan,B.,2005；Harhouri,K.,2010；Yan,X.,2003；Halt J KI,2016)。CD146以不同的同工型存在：带有假定的PDZ结合基序的短同工型(Kebir,A.,S.2001；Taira,E.,1995；Vainio,O.,1996)，所述结合基序可能介导其锚定到细胞骨架；带有假定的内吞作用基序的长同工型(Guezguez,B.,2007)；以及作为膜CD146的金属蛋白酶依赖性脱落的结果的可溶性形式(sCD146)(Bardin,N.,2003；Boneberg,E.M.,2009)。sCD146可以在人类血清中检测到，并且其水平在不同病症例如炎性肠病(Bardin,N.,2006)、异常妊娠(Pasquier,E.,2005)或慢性肾衰(Bardin,N.,2003)中受到调节。

本发明人在本文中首次证实了CD146的短的和长的膜同工型分别通过Tace和ADAM10蛋白酶脱落。此外，RNA测序实验揭示出存在两种可选的sCD146剪接变体，在本文中被鉴定为“I5-13-sCD146”(或I5-13可溶性CD146)和“I10-sCD146”(或I10可溶性CD146)。

此外，本发明人已发现并且现在在本文中首次描述，CD146、通常为sCD146可以有利地在纤维化诊断中用作生物标志物并在纤维化治疗中用作治疗靶点或治疗工具。

对用于在对象中检测对纤维化、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的易感性，用于所述纤维化的诊断和/或预后或用于所述纤维化的监测来说，CD146是特别有利的。

在本发明的情形中，CD146通常是CD146蛋白，例如膜型CD146或可溶性CD146(sCD146)，优选为选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的sCD146蛋白、SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白或SEQID NO：9的I10可溶性CD146蛋白，正如在下文中进一步描述的。

更准确来说，本发明人首次证实了可溶性CD146、特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的sCD146蛋白参与心肌和肾纤维化的建立，并因此是心肌和肾纤维化的生物标志物。事实上，本发明人显示，sCD146刺激造成纤维化的细胞，即成纤维细胞和内皮细胞。本发明人的实验具体来说证实了在严重肾纤维化诱导的两种模型(由肾小球基底膜血清诱导的模型和输尿管单侧梗阻模型)中CD146极大增加，并且循环血中sCD146的浓度升高；在使用CD146的KO小鼠时对纤维化的影响大大降低。他们还证实了在小鼠中，在心肌梗塞模型中CD146和sCD146增加；与对照动物相比，在CD146的KO动物中心肌梗塞后纤维化的量减少，并且与野生型(WT)小鼠相比，在KO CD146小鼠中老年小鼠心肌纤维化的发生减少。

他们还证实了可溶性CD146、特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的sCD146蛋白在心脏和肾脏中具有促纤维化活性，因此是用于治疗心肌纤维化和/或肾纤维化的治疗靶点。因此，在选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：7的可溶性CD146蛋白的抑制剂、特别是针对这种sCD146蛋白的单克隆抗体存在下，纤维化现象可以被阻止或逆转。

另一方面，本发明人证实了可溶性CD146、特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的sCD146蛋白在皮肤和肺中具有抗纤维化活性，因此可用于在对象中预防或治疗皮肤纤维化和/或肺纤维化。

本发明人还证实了新鉴定的同工型SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白和SEQID NO：9的I10可溶性CD146蛋白均为纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的生物标志物。然而，这两种同工型不以相同的方式变化。在纤维化中I5-13可溶性CD146被上调，而I10可溶性CD146被下调。I5-13是用于治疗纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的治疗靶点，而I10可用作在对象中预防或治疗纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的治疗工具。

正如上文中指明的，纤维化可能在缺血事件例如心肌梗塞后、在免疫疾病的情形中以及在衰老期间发生。

术语“对象”是指任何可试验的对象，并且通常是指患者。优选地，所述对象是哺乳动物，甚至更优选为人类。本发明可用于个体和整个群体两者。所述对象不论其年龄或性别如何均可被试验。

“人类长CD146蛋白”或“长CD146”是指主要存在于内皮细胞的膜中并具有对应于本文中描述的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的人类蛋白、肽或氨基酸分子。

“人类短CD146蛋白”或“短CD146”是指主要存在于内皮细胞的膜中并具有对应于本文中描述的SEQ ID NO：11的氨基酸序列的人类蛋白、肽或氨基酸分子。

“人类可溶性CD146蛋白”或“可溶性CD146”或“sCD146”通常是指人类蛋白、肽或氨基酸分子。这种sCD146蛋白通常存在于人类血清中。根据本发明的特定人类可溶性CD146蛋白包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由所述氨基酸序列构成。

在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7中，SEQ ID NO：7是在本发明的其中所述对象是哺乳动物、特别是人类的情形中可用的优选人类可溶性CD146蛋白。

正如前面解释的，根据本发明的典型sCD146蛋白是在诊断情形中可用作生物标志物，并且在治疗性或预防性治疗的情形中可用作治疗靶点或治疗工具的蛋白质。

本说明书还描述了相应地编码本文中描述的本发明的蛋白的核酸分子。

此类核酸分子是RNA或DNA，它们通常编码具有生物活性的人类CD146蛋白、特别是人类可溶性CD146蛋白，或者可用于制备其重组形式。

术语“治疗”或“疗法”是指治疗性和预防性治疗或措施两者，它们能够减轻、减缓或治愈(逆转)纤维化或导致纤维化、由纤维化引起或与纤维化相关的任何病症、疾病、障碍或功能失调状态，通常为任何人类纤维化疾病。此类疾病的实例包括心房纤维化、心内膜心肌纤维化、梗塞特别是陈旧性心肌梗塞、肾纤维化、肝硬化、胆管闭锁、进行性大块纤维化、胶质瘢痕、动脉僵硬、关节纤维化、克罗恩病、杜普伊特伦挛缩、肾源性系统性纤维化、纵隔纤维化、腹膜后纤维化、骨髓纤维化、系统性硬化等。

这种“治疗”通常打算用于上文中所定义的需要的对象，通常为哺乳动物对象，优选为人类对象。被认为是此类对象的是患有导致纤维化、由纤维化引起或与纤维化相关的病症、疾病、障碍或功能失调状态的对象，或被认为“有风险发生”或被怀疑有风险发生此类必须被预防的病症、疾病、障碍或功能失调状态的对象。

例如，所述患者可以是易于(或被怀疑易于)发生纤维化或本文中描述的导致纤维化、由纤维化引起或与纤维化相关的病症、疾病、障碍或功能失调状态之一的对象。例如，所述对象是患有或被认为“有风险发生”心肌纤维化(例如心房纤维化、心内膜心肌纤维化或梗塞特别是陈旧性心肌梗塞)或肾纤维化的对象。

所述对象可以是无症状的，或表现出此类病症、疾病、障碍或功能失调状态的早期或晚期体征。

典型的对象是由于本文中描述的方法已被鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化增加或具有预后不良的纤维化的对象。

本文描述的另一个特定对象是一种选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白，其通常作为生物标志物，用于在对象、通常是哺乳动物、优选为人类中检测对纤维化、特别是心肌和/或肾纤维化的易感性，用于诊断和/或预后所述纤维化，或用于监测所述纤维化。

优选的人类可溶性CD146蛋白包含SEQ ID NO：7或由其构成。

本文描述的另一个特定对象是SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白，其作为生物标记物用于在对象中检测对纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的易感性，用于诊断和/或预后所述纤维化，或用于监测所述纤维化。

本文描述的另一个特定对象是SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白，其作为生物标记物用于在对象中检测对纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的易感性，用于诊断和/或预后所述纤维化，或用于监测所述纤维化。

本文中具体描述了一种体外、离体或体内方法，其用于在对象、通常是哺乳动物、优选为人类中检测对纤维化、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的易感性或诊断和/或预后所述纤维化。在与心肌和/或肾纤维化相关的优选情况下，在这种方法中使用的sCD146选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

在与皮肤和/或肺纤维化相关的另一种优选情况下，在这种方法中使用的sCD146是SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白或SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白。

术语“诊断”是指在对象中检测或鉴定本文中所定义的病症、疾病、障碍或功能失调状态、通常为纤维化，或评估(定量、比较)此类病症、疾病、障碍或功能失调状态的严重性或阶段。

在特定情况下，本发明的诊断方法包括确定对象的生物样品中CD146、通常是sCD146蛋白的存在和/或测量其存在的量，并优选地包括所述量与参比值的比较。

术语“预测”是指评估所述对象发生本文中所定义的病症、疾病、障碍或功能失调状态、通常为纤维化的易感性。

术语“预后”是指在治疗或未治疗的对象中评估或监测本文中所定义的病症、疾病、障碍或功能失调状态的进展(过程)，通常是指预测此类疾病或障碍的恶化和相关有害效应，或与之相反，预测所述对象健康的改善。

本发明的预后方法可以包括在各个不同阶段包括早期、症状前和晚期阶段，在来自于所述对象的一个或多个生物样品中监测、定量CD146、通常为CD146蛋白和比较测量到的量或水平等的一个或几个步骤。

预后通常包括评估(预测)纤维化的进展和表征对象以确定最适合的治疗。

本文描述的方法通常包括在所述对象的生物样品中确认CD146、特别是sCD146的存在或换句话说确定CD146蛋白表达的步骤，并优选地包括确定CD146的表达水平(测量CD146的量)的步骤。

具体来说，本文中描述的人类CD146蛋白、通常为人类可溶性CD146蛋白中的任一者可用作生物标志物，为对象、通常为哺乳动物、优选为人类中纤维化或与纤维化相关的疾病、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的存在提供指示。

在特定情况下，所述在对象中检测对纤维化的易感性或诊断和/或预后纤维化的方法包括下述步骤：i)确定所述对象的生物样品中可溶性CD146蛋白的表达水平，所述可溶性CD146蛋白选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，ii)将所述在步骤i)中确定的表达水平与参比值例如预先确定的参比值进行比较，以及iii)当所述在步骤i)中确定的水平高于所述参比值时，得出所述对象具有易感性、患有纤维化或具有不良预后的结论，或者当所述在步骤i)中确定的水平低于所述参比值时，得出所述患者没有易感性、未患纤维化或具有良好预后的结论。

在另一种特定情况下，所述在对象中检测对纤维化的易感性或诊断和/或预后纤维化的方法包括确定所述对象的生物样品中SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白或SEQID NO：9的I10可溶性CD146蛋白的表达水平的步骤。

更准确来说，在一种情况下，所述方法包括下述步骤：i)确定所述对象的生物样品中I5-13可溶性CD146蛋白的表达水平，ii)将所述在步骤i)中确定的表达水平与参比值进行比较，以及iii)当所述在步骤i)中确定的水平高于所述参比值时，得出所述对象具有易感性、患有纤维化或具有不良预后的结论，或者当所述在步骤i)中确定的水平低于所述参比值时，得出所述患者没有易感性、未患纤维化或具有良好预后的结论。

在另一种情况下，所述方法包括下述步骤：i)确定所述对象的生物样品中I10可溶性CD146蛋白的表达水平，ii)将所述在步骤i)中确定的表达水平与参比值进行比较，以及iii)当所述在步骤i)中确定的水平低于所述参比值时，得出所述对象具有易感性、患有纤维化或具有不良预后的结论，或者当所述在步骤i)中确定的水平高于所述参比值时，得出所述患者没有易感性、未患纤维化或具有良好预后的结论。

术语“参比值”、“对照值”或“截止值”可以是指基础值，其对应于使用参比群体，通常为健康对象、即未患有本文中所定义的病症、疾病、障碍或功能失调状态的对象的群体或组群所获得的值(测量到的水平、量或浓度)的平均值。

所述参比值也可以是统计或判别值，即已通过在健康对照群体和具有本文中所定义的已知病症、疾病、障碍或功能失调状态的群体两者中测量所述参数而确定的值。所述判别值在分析健康对照群体与患病患者群体的参数值和已知临床数据之间的关系的基础上，以预定的特异性和/或预定的灵敏度鉴定所述患病群体。以这种方式确定的判别值对将来的各个试验中相同的实验设置有效。例如，参比值对于I5-13可溶性CD146蛋白来说可以是300ng/ml，对于I10可溶性CD146蛋白来说可以是50ng/ml。

本文描述的一种特定方法是在对象中监测纤维化、特别是心肌或肾纤维化的体外、离体或体内方法。所述方法通常包括在两个或更多个时间点在所述对象的生物样品中确定可溶性CD146蛋白的存在和/或测量可溶性CD146蛋白的表达水平或可溶性CD146蛋白的量，所述可溶性CD146蛋白选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中CD146蛋白的存在(在不存在之后)或更高的CD146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加或纤维化的恶化，而更低的可溶性CD146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的可溶性CD146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化稳定或换句话说没有进展。

本文描述的另一种特定方法是在对象中监测纤维化的体外、体内或离体方法，所述方法包括在两个或更多个时间点在所述对象的生物样品中确定SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的表达水平，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更高的可溶性CD146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更低的人类可溶性CD146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的人类可溶性CD146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。

本文描述的另一种特定方法是在对象中监测纤维化的体外、体内或离体方法，所述方法包括在两个或更多个时间点在所述对象的生物样品中确定SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白的表达水平，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更低的可溶性CD146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更高的人类可溶性CD146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的人类可溶性CD146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。

为了评估纤维化的演变或控制治疗效率，在治疗下或任何治疗之前测试患者，并在几天、几周或几个月后在治疗下(通常在不存在任何治疗中断的情况下)测试同一患者，可能是有帮助的。在这种情形中，将所述第二次测试的结果(测量值)与第一次测试的结果进行比较。

“超过参比值”或“高于参比值”的CD146量/表达水平可以意味着统计学显著的提高，例如提高至少2个标准偏差。

术语“生物样品”包括来自于对象、特别是哺乳动物对象、通常为人类的任何生物样品。所述生物样品可以是组织活检样品例如心脏活检样品或生物流体样品。

可用于本发明的情形的生物样品的典型实例可以选自血浆、血液、血清、尿液、脑脊液和唾液样品。优选地，所述生物样品是血浆、血液或血清样品，甚至更优选为血清样品。

所述生物样品优选为稀释的样品，稀释度通常为1/25、1/50、1/100、1/200或1/400，优选为1/25。

具体来说，在检测对纤维化的易感性、诊断、预后或监测纤维化的方法中，所考虑的CD146蛋白的血清浓度可以指示高的值。事实上，可以将所述测量值与对象的健康状态相关的标准值进行比较。具体来说，所考虑的CD146形式、通常为选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的sCD146或SEQ ID NO：9的I5-13可溶性CD146蛋白的过表达，可以指示纤维化的存在。

优选地，CD146、特别是sCD146的存在的确定以及其量的测量，在免疫测定法中通过其中将对象的生物样品与适合的抗CD146抗体直接接触的一步法或通过隐含生物样品的预处理的方法来确定。

与CD146、特别是sCD146结合并且能够在对象的生物样品中鉴定/定量它的抗体在本领域中是已知的。优选的抗体是单克隆抗体，优选为选择性结合CD146、特别是选择性结合sCD146(相比于膜CD146)的单克隆抗体。

选择性结合sCD146的特定抗体，可以从选择性结合包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9(相比于膜CD146)、优选为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或由它们构成的蛋白质的抗体中选择。

有利情况下，根据本发明的选择性结合sCD146(相比于膜CD146)的抗体包含SEQID NO：87、SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89的重链可变区(VH)CDR多肽序列和SEQ ID NO：90、序列QVS和SEQ ID NO：91的轻链可变区(VL)CDR多肽序列。

SEQ ID NO：87对应于下述氨基酸序列：GYTFTSHF

SEQ ID NO：88对应于下述氨基酸序列：IFPGSGDT

SEQ ID NO：89对应于下述氨基酸序列：ARTWAY

SEQ ID NO：90对应于下述氨基酸序列：QSLLYSDGKTY

SEQ ID NO：91对应于下述氨基酸序列：AQTTHFPLT

在特定情况下，根据本发明的抗体或其片段包含含有SEQ ID NO：93的轻链可变区(VL)和含有SEQ ID NO：92的重链可变区(VH)。

有利情况下，根据本发明的选择性结合sCD146(相比于膜CD146)的抗体包含SEQID NO：94、SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96的重链可变区(VH)CDR多肽序列和SEQ ID NO：97、序列FAS和SEQ ID NO 98的轻链可变区(VL)CDR多肽序列。

SEQ ID NO：94对应于下述氨基酸序列：GFTFSDYG

SEQ ID NO：95对应于下述氨基酸序列：IYYDSSKM

SEQ ID NO：96对应于下述氨基酸序列：AAFQFDY

SEQ ID NO：97对应于下述氨基酸序列：QGISTS

SEQ ID NO：98对应于下述氨基酸序列：QQSYNLPYT

在特定情况下，根据本发明的抗体或其片段包含含有SEQ ID NO：100的轻链可变区(VL)和含有SEQ ID NO：99的重链可变区(VH)。

任何本文中描述的抗体可以以容易由本领域专业技术人员确定的相应的适合剂量并入到组合物、通常为诊断组合物中，所述组合物还包含可药用载体或支持物。

所述结合CD146的抗体通常以有效量使用或存在于所述组合物中。

表述“有效量”是指足以在对象中或对象的生物样品中检测和/或测量CD146、特别是sCD146的抗CD146抗体的量或浓度。

在诊断情形中用于哺乳动物、通常为人类中的抗CD146抗体的典型有效量在约1μg/ml至5μg/ml之间，优选在约1μg/ml至2.5μg/ml之间或约2.5μg/ml至5μg/ml之间。

所述免疫测定法可以通过本领域的公知方法来进行：在固相或均相中，在一个或两个步骤中，通过竞争性方法等。

更优选地，所述免疫测定法选自ELISA、FEIA、western印迹、斑点印迹、基于珠子的测定法、抗原阵列和放射免疫测定法。

在ELISA中，抗原必须被固定到固体表面，然后与连接到酶的抗体复合。检测通过经与底物温育以产生有色产物以评估所述偶联的酶活性来实现。

在FEIA中，所述有色产物是荧光的。

在放射免疫测定法中，所述最终产物是有放射活性的。

使用斑点印迹方案的蛋白质检测与western印迹相似，因为两种方法都允许鉴定和分析感兴趣的蛋白质。斑点印迹方法与传统的western印迹技术的区别在于不使用电泳来分离蛋白质样品。相反，将样品蛋白点在膜上并与抗体探针杂交。基于珠子的测定法或抗原阵列是允许调查人员同时测量生物和环境样品中的多种分析物的新方法。

半定量测量可以利用每种前述方法来获得，使用例如正常对照将所述值归一化然后建立比率，或使用阳性对照作为校准物(以任意单位表示)。

所述检测可以在固体支持物例如微孔板上进行，在所述支持物上以确定且有序的方式布置多种抗体，以便检测和/或定量一种或不同形式的CD146，或者可以在固体粒子、试管等上进行。

在其中所述抗体是结合可溶性CD146蛋白的抗体，例如选择性结合可溶性CD146蛋白(相对于膜型CD146)、特别是包含SEQ ID NO：7或由其构成的可溶性CD146蛋白的抗体的特定情况下，当与参比水平相比时所述测试对象的血清中所述可溶性CD146蛋白水平的提高，指示了纤维化或纤维化的增加，特别是心肌和/或肾纤维化或纤维化的增加。

在其中所述抗体是结合包含SEQ ID NO：8或由其构成的I5-13可溶性CD146蛋白的抗体的另一种特定情况下，当与参比水平相比时所述测试对象的生物样品、通常为血清中所述I5-13可溶性CD146蛋白水平的提高，指示了纤维化或纤维化的增加，特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化或纤维化的增加。

在其中所述抗体是结合包含SEQ ID NO：9或由其构成的I10可溶性CD146蛋白的抗体的另一种特定情况下，当与参比水平相比时所述测试对象的生物样品、通常为血清中所述I10可溶性CD146蛋白水平的提高，指示了纤维化的减少，特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的减少。

本发明人还在本文中描述了一种在对象中诊断纤维化、特别是心肌或肾纤维化的方法。这种方法通常包括在所述对象的血清中检测并优选地测量/定量CD146、优选为sCD146的量的步骤。这种方法通常包括使用本文中所描述的结合CD146蛋白、优选为sCD146蛋白的抗体。

本发明人还在本文中描述了一种CD146抑制剂，特别是选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白的抑制剂或包含这种CD146抑制剂的组合物，其用于在对象、通常是通过本文中描述的方法已被鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化的增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌和/或肾纤维化，或引起纤维化、由纤维化引起或与纤维化有关的任何病症、疾病、障碍或功能失调状态。

本发明人还在本文中描述了一种SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抑制剂或包含这种CD146抑制剂的组合物，其用于在对象、通常是通过本文中描述的方法已被鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化的增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化，特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化，特别是与系统性硬化相关的肺纤维化，或引起纤维化、由纤维化引起或与纤维化有关的任何病症、疾病、障碍或功能失调状态。

本文中描述的以至少一种特定形式的CD146、通常为sCD146或CD146的受体的过量表达为特征的引起纤维化、由纤维化引起或与纤维化有关的病症、疾病、障碍或功能失调状态，在有利情况下通过本文中所描述的CD146抑制剂，优选为针对CD146、优选地针对人类CD146、特别是人类sCD146的抗体或针对这种CD146的任何其他CD146拮抗剂来治疗。

事实上，本发明人已发现，一旦给药到对象中，这种CD146抑制剂能够预防、停止或甚至逆转纤维化。

具体来说，本说明书涉及CD146抑制剂、优选为选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白的抑制剂、SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抑制剂或包含这种CD146抑制剂的组合物的用途，其用于体外或离体制备组合物、通常为药物组合物，所述组合物用于在需要的对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化，或引起纤维化、由纤维化引起或与纤维化有关的任何病症、疾病、障碍或功能失调状态。

在典型情况下，所述CD146抑制剂选自抗体、适体、多肽、有机小分子和核酸。

在优选情况下，所述CD146抑制剂是抗CD146抗体或CD146抗原结合分子，优选为抗sCD146抗体或sCD146抗原结合分子，其功能性片段(即能够与CD146结合的片段)或其衍生物。

术语“抗体”以最宽泛的意义使用，并且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(即抑制纤维化)即可。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子、单域抗体(例如来自于骆驼科动物)、鲨鱼NAR单域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段也可以是指包含CDR或抗原结合结构域的结合组成部分，包括但不限于V H区(V H、V H-V H)、抗运载蛋白(anticalin)、佩普体(PepBody)、抗体-T-细胞表位融合体(Troybody)或肽体(Peptibody)。根据本发明的抗体可以是任何类别，例如IgG、IgA、IgD1、IgE1、IgM1或IgY1，尽管IgG抗体通常是优选的。抗体可以是任何哺乳动物或禽类来源的，包括人类、鼠类(小鼠或大鼠)、驴、绵羊、山羊、兔、骆驼、马或鸡。可以通过将任何类型的分子共价附连到所述抗体来修饰所述抗体。例如但非限制性地，所述抗体衍生物包括已被修饰的抗体，所述修饰例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其他蛋白或本领域中已知的其他修饰。

通常，用于制备抗体(包括多克隆抗体、单克隆抗体和杂交瘤)和用于使用抗体检测抗原的技术在本领域中是公知的，例如Harlow&Lane，《抗体使用实验指南》(UsingAntibodies,A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1998；Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；和Cole等，《单克隆抗体和癌症疗法》(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，第77-96页，1985。此外，根据本发明的抗体可以被融合到标志物序列例如肽标签，以便于纯化；适合的标签是六聚组氨酸标签。抗体也可以通过本领域中已知的方法偶联到诊断或治疗药剂。用于制备此类偶联物的技术在本领域中是公知的。制备这些单克隆抗体以及嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体的其他方法在本领域中是已知的。

在特定情况下，所述抗CD146抗体特异性/选择性地识别/结合到人类可溶性CD146蛋白，优选为包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其构成的蛋白，或它们的参与纤维化过程的表位。

这种抗体优选地还中和所述被靶向的CD146蛋白、特别是被靶向的选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白和/或SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白、优选为被靶向的人类可溶性CD146蛋白的生物活性。优选地，所述单克隆抗体在本文中所定义的对象、通常为哺乳动物、优选为人类中减少或抑制纤维化。

特定的单克隆抗体优选地也能够降低或抑制可溶性CD146受体或CD146蛋白受体亚基的过量表达(与标准表达相比)。

结合人类CD146蛋白、通常为人类可溶性CD146蛋白和CD146或可溶性CD146蛋白受体(或CD146蛋白受体亚基)两者的抗体也可用于本发明的情形。制造此类抗体的方法在本领域中是已知的(参见例如Despoix N,Walzer T,Jouve N,Blot-Chabaud M,Bardin N,Paul P,Lyonnet L,Vivier E,Dignat-George F,Vély F.，“小鼠CD146/MCAM是自然杀伤细胞成熟的标志物”(Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cellmaturation)，Eur J Immunol.2008；38:2855-64)。

由本发明人选出的可用于本发明的情形的能够选择性结合可溶性CD146(相比于膜CD146)的优选抗体，可以是包含SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89的重链可变区(VH)CDR多肽序列和SEQ ID NO：90、序列QVS和SEQ ID NO：91的轻链可变区(VL)CDR多肽序列的抗体，或包含SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96的重链可变区(VH)CDR多肽序列和SEQ ID NO：97、序列FAS和SEQ ID NO：98的轻链可变区(VL)CDR多肽序列的不同的抗体。

在特定情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO：93的轻链可变区(VL)和含有SEQ IDNO：92的重链可变区(VH)。

在另一种特定情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO：100的轻链可变区(VL)和含有SEQ ID NO：99的重链可变区(VH)。

所述CD146抑制剂也可以是适体。适体是在分子识别方面代表了抗体的替代方案的一类分子。适体是具有以高亲和性和特异性识别几乎任何类型的靶分子的能力的寡核苷酸或寡肽序列。正如在Tuerk C和Gold L.，1990中所述，此类配体可以通过随机序列文库的指数富集配体系统进化(SELEX)技术来分离。所述随机序列文库可以通过DNA的组合化学合成来获得。在这种文库中，每个成员是具有独特序列的最终被化学修饰的线性寡聚物。这类分子的可能的修饰、用途和优点已综述在Jayasena S.D.，1999中。通过双杂交方法从组合文库选择的肽适体由平台蛋白例如大肠杆菌硫氧还蛋白A展示的构象受限的抗体可变区构成(Colas等，1996)。

在另一种情况下，所述CD146抑制剂是包含氨基酸残基的肽或多肽分子。

当在本文中使用时，术语“氨基酸残基”是指采取(L)或(D)构型的任何天然/标准和非天然/非标准氨基酸残基，并包括α或α-双取代的氨基酸。它是指异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸。它还包括β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸(Aib)、4-氨基-丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸(例如L-鸟氨酸)、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、环戊基丙氨酸、环丁基丙氨酸、环丙基丙氨酸、环己基甘氨酸、环戊基甘氨酸、环丁基甘氨酸、环丙基甘氨酸、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸、2-萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-甲酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、L-高精氨酸(hArg)、N-乙酰基赖氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2,4,-二氨基丁酸(D-或L-)、对氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、硒代半胱氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸(HoSer)、磺基丙氨酸、ε-氨基己酸、δ-氨基戊酸或2,3-二氨基丁酸(D-或L-)等。这些氨基酸在生物化学/肽化学领域中是公知的。

在本发明的情形中使用的包括肽的化合物可以包含至少一个肽键被电子等排修饰的替换。本发明的包括肽的化合物可以是肽模拟物。肽模拟物的特征通常在于保留它的肽对等物的极性、三维尺寸和功能性(生物活性)，但是其中一个或多个肽键/连接通常已被对蛋白水解更加稳定的连接代替。通常，所述代替酰胺键的键(酰胺键替代物)保留了所述酰胺键的许多或所有性质，例如构象、空间位阻、静电特点、氢键形成潜力等。典型的肽键替换包括脂类、多胺及其衍生物以及取代的烷烃和烯烃，例如氨基甲基和酮基亚甲基。例如，所述肽可以具有一个或多个肽连键被诸如-CH

在另一种情况下，所述CD146抑制剂是有机小分子。

术语“有机小分子”是指与制药中通常使用的有机分子尺寸相当的分子。所述术语排除了生物大分子(例如蛋白质、核酸等)。优选的有机小分子的尺寸范围至多约5000Da，更优选地至多2000Da，最优选地至多约1000Da。

在另一种情况下，所述CD146抑制剂是核酸。

所述CD146抑制剂通常可以是多核苷酸或寡核苷酸，通常为抑制性核苷酸。它们包括短干扰RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)和合成的发夹RNA(shRNA)、反义核酸、互补DNA(cDNA)或指导RNA(可以在CRISPR/Cas系统的情形中使用的gRNA)。在某些优选实施方式中，使用靶向CD146表达的siRNA。在各种不同的生物体中已显示了通过双链RNA例如siRNA干扰内源基因的功能和表达。参见例如A.Fire等，“在秀丽隐杆线虫中通过双链RNA进行的强力特异性遗传干扰”(Potent and Specific Genetic Interference by Double-StrandedRNA in Caenorhabditis elegans)，Nature 391:806-811(1998)；J.R.Kennerdell&R.W.Carthew，“使用dsDNA介导的遗传干扰证实卷曲蛋白和卷曲蛋白2在Wingless途径中发挥作用”(Use of dsDNA-Mediated Genetic Interference to Demonstrate thatfrizzled and frizzled 2Act in the Wingless Pathway)，CeJ 95:1017-1026(1998)；F.Wianni&M.Zernicka-Goetz，“在小鼠早期发育中通过双链RNA特异性干扰基因功能”(Specific Interference with Gene Function by Double-Stranded RNA in EarlyMouse Development)，Nat.Cell Biol.2:70-75(2000)。siRNA可以包括包含自身互补的序列或双链序列的发夹环。siRNA通常具有少于100个碱基对，并且可以是例如约30bps或更短，并且可以通过本领域中已知的方法，包括使用互补DNA链或合成方法来制造。这种双链RNA可以通过从模板的两个方向读出的单链RNA的体外转录和正义和反义RNA链的体外退火来合成。靶向CD146的双链RNA也可以从cDNA载体构建物合成，在所述构建物中CD146基因(例如人类CD146基因)以相反方向被克隆并被反向重复序列隔开。在细胞转染后，所述RNA被转录，并且互补链重新退火。靶向CD146基因的双链RNA可以通过适合的构建物的转染引入到细胞中。

通常，由siRNA、miRNA或shRNA介导的RNA干扰在翻译水平上介导；换句话说，这些干扰RNA分子阻止相应mRNA分子的翻译并导致它们的降解。也有可能RNA干扰也可在转录水平上工作，阻断对应于这些干扰RNA分子的基因组区域的转录。

这些干扰RNA分子的结构和功能在本领域中是公知的，并被描述在例如通过参考并入本文的R.F.Gesteland等主编，《RNA世界》(The RNA World)(第三版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2006),第535-565页中。对于这些方法来说，在克隆至载体和转染的方法在本领域中也是公知的，并被描述在例如通过参考并入本文的J.Sambrook&D.R.Russell，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)(第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,2001)中。

除了双链RNA之外，靶向CD146的其他核酸试剂也可用于本发明的实践，例如反义核酸。反义核酸是与特定靶mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子。在细胞中，所述单链反义分子与该mRNA杂交，形成双链分子。细胞不翻译这种双链形式的mRNA。因此，反义核酸干扰mRNA翻译成蛋白质，并因此干扰被转录成该mRNA的基因的表达。反义方法已被用于在体外抑制许多基因的表达。参见例如C J.Marcus-Sekura，“使用反义寡脱氧核糖核苷酸研究基因表达的技术”(Techniques for Using Antisense Oligodeoxyribonucleotidesto Study Gene Expression)，Anal.Biochem.172:289-295(1988)；J.E.Hambor等，“将Epstein-Ban病毒游离型复制子用于人类细胞毒性T细胞克隆中的反义RNA介导的基因抑制”(Use of an Epstein-Ban Virus Episomal Replicon for Anti-Sense RNA-MediatedGene Inhibition in a Human Cytotoxic T-CeIl Clone)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:4010-4014(1988)；H Arima等，“通过硫代磷酸酯反义寡核苷酸在鼠类巨噬细胞样细胞中特异性抑制白介素-10的生产”(Specific inhibition oflnterleukin-10Production in Murine Macrophage-Like Cells by PhosphorothioateAntisense Oligonucleotides)，Antisense Nucl.Acid Drug Dev.8:319-327(1998)；和W.-F.Hou等，“针对各个钙调蛋白基因转录本的反义寡脱氧核苷酸对PC12细胞的增殖和分化的影响”(Effect of Antisense Oligodeoxynucleotides Directed to IndividualCalmodulin Gene Transcripts on the Proliferation and Differentiation of PC12Cells)，Antisense Nucl.Acid Drug Dev.8:295-308(1998)，所有上述文献通过参考并入本文。反义技术被进一步描述在通过参考并入本文的C.Lichtenstein&W.Nellen主编，《反义技术：实用方法》(Antisense Technology:A Practical Approach)(IRL Press,Oxford,1997)。来自于人类和许多其他动物、特别是哺乳动物的CD146多核苷酸序列在本领域中已知。基于所述已知序列，可以使用本领域中公知的方法容易地合成靶向CD146的抑制性核苷酸(例如siRNA、miRNA或shRNA)。

根据本发明的示例性siRNA可以具有至多29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bp或这些数字之间的任何整数个碱基对。用于设计最佳抑制性siRNA的工具包括可以从DNAengine Inc.(Seattle,Wash.)和Ambion,Inc.(Austin,Tex)获得的工具。

本发明的氨基酸分子可以被设计，以改善它们的性能和/或与在对象、通常为哺乳动物、优选为人类中的诊断、治疗或预防用途的相容性。它们可以被例如糖基化、甲基化、乙酰化、磷酸化或融合到另一个多肽，优选被甲基化、乙酰化、磷酸化或融合到另一个多肽，用于优选地在人类中靶向不同类型的组织，特别是病理组织例如通常为心脏或肾组织。

本发明人还在本文中提供了一种组合物，其包含通常为治疗有效量的CD146抑制剂和可药用赋形剂、支持物、介质或载体。

所述组合物可以包含几种不同的CD146抑制剂，例如针对特定形式的CD146例如选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白和SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抗CD146抗体，和针对相同或不同形式的CD146的不同抗CD146抗体。

任何本文中描述的抗体可以以容易被本领域技术人员确定的相应的适合剂量并入到还包含可药用载体或支持物的组合物中。

所述组合物还可以包含旨在预防或治疗纤维化的不是CD146抑制剂的另外的不同治疗性化合物。

在特定情况下，本文中描述的包含抗体、特别是特异性针对本文描述的人类可溶性CD146的抗体的组合物，还可以包含至少一种其他的抗纤维化因子。在本发明的情形中，抗纤维化因子是抑制或干扰成纤维细胞发育或抑制或干扰细胞外基质沉积的因子。

可以在本发明的情形中使用的抗纤维化因子可以选自骨形态发生蛋白7(BMP7)、松弛素、格列扎(Glitazar)和miRNA(例如mir-29或miR-101)。

CD146抑制剂的“治疗有效量”是允许在需要的对象、通常为哺乳动物、优选为人类中预防或治疗纤维化的量。

在哺乳动物、通常为人类中使用的典型的治疗有效量在约5mg/kg至15mg/kg之间，例如约5mg/kg至10mg/kg之间或约10至15mg/kg之间。

可以在本发明的情形中使用的可药用赋形剂、支持物、介质或载体是例如等渗缓冲盐溶液例如20％甘露糖醇，并任选地与稳定剂例如同基因白蛋白或任何其他稳定性蛋白、甘油等以及佐剂例如聚凝胺或DEAE葡聚糖等组合。

所述组合物通常用于在对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌和/或肾纤维化。

本文中描述的包含SEQ ID NO：8的I5-13可溶性CD146蛋白的抑制剂和可药用载体的特定组合物用于在对象中预防或治疗肺纤维化，特别是与系统性硬化相关的肺纤维化。

本文中描述的特定组合物包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可溶性CD146蛋白或SEQ ID NO：9的I10可溶性CD146蛋白和可药用载体，用于在对象、优选为人类中预防或治疗皮肤纤维化和/或肺纤维化，特别是与系统性硬化相关的肺纤维化。

本发明人还在本文中描述了一种在需要的对象、通常为已通过本文中描述的方法被鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化的增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化、特别是心肌、皮肤、肺和/或肾纤维化的方法。这种方法通常包括向所述对象给药通常为有效量的CD146抑制剂、特别是sCD146抑制剂或特定sCD146或包含这种CD146抑制剂或特定sCD146的组合物的步骤。

在特定情况下，所述方法包括向所述对象给药(有效量的)抗体、通常为本文中所描述的抗CD146抗体或包含这种抗体的组合物(通常为药物组合物)的步骤。

本文描述的诊断或药物组合物的剂量可以由专业技术人员根据被治疗的对象、给药途径、靶组织、生物活性化合物(本文中所公开的)等进行调整。

所述给药可以使用各种不同的方案，例如抗CD146抗体、CD146抑制剂或如上所述的任何其他化合物的同时或顺序给药、单次或重复给药等，这可以由专业技术人员进行调整。

考虑到所述靶病理组织或区域，所述含有根据本发明的产品的诊断或药物组合物可以系统性、皮下、脊柱内、脑内或真皮内给药到患者。优选的注射方式是系统性注射，特别是静脉内或动脉内注射或皮下注射。

本文中还描述了一种体外、离体或体内监测药物、通常为CD146抑制剂或组合物用于治疗纤维化、特别是心肌、皮肤、肺和/或肾纤维化的效能的方法。这种方法通常包括将在任何纤维化治疗之前来自于对象的第一生物样品中CD146的表达，与已暴露于用于治疗纤维化的药物或组合物的同一对象的第二生物样品中CD146的表达进行比较的步骤。

本文中还提供了一种试剂盒，其包含通常为有效或治疗量的本文中描述的产品中的任一者或多者、通常为蛋白质、抗体、(可溶性)CD146的抑制剂或包含此类产品的组合物，任选地包含用于将所述产品给药到需要的对象的手段或装置，并任选地包含为在本文中所描述的方法的情形中使用所述产品提供指导的说明书。

优选存在于所述试剂盒中的抗体通常针对本文中描述的CD146蛋白之一，优选地针对本文中描述的sCD146蛋白之一。它优选为单克隆抗体。

通常，所述试剂盒还包含根据所公开的方法使用所述蛋白质、抗体、抑制剂或组合物的说明书。

本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中描述，所述实验部分应当被视为说明性的，而不是限制本申请的范围。在本申请中引用的所有参考文献通过参考并入本文。

附图说明

图1.在小鼠中CD146在实验性GN中被诱导

在小鼠中，在NTS(去补体的肾毒性血清)给药后第4天至第15天，损伤肾脏中的CD146逐步地被高度上调，并主要位于受损的肾小球中(A)。这种上调通过western印迹得以确认(B、C)。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。显微照片的放大倍数：X200。

图2.CD146敲除小鼠受到保护免于NTS诱导的肾小球肾炎。

在疾病诱导后小鼠中的体重增加(A)。肾功能通过被表示为克蛋白/mmol肌酐的蛋白尿(B)和BUN(C)来评估。所有三种参数揭示出在CD146敲除动物中疾病的进展较慢。肾切片的梅森三色染色(D)显示出在CD146敲除动物中肾结构得以保留，因为它们发生更少的肾小球新月体(E)和肾小管扩张(F).新月体被表示为呈现出细胞新月体的肾小球的百分率(％)。*，P<0.05；**，P<0.01。显微照片的放大倍数：X200。

图3.CD146敲除小鼠发生更少的肾炎症和纤维化。

Il-1β(A)、TNF-α(B)和ICAM-1(C)的QPCR显示出在诱导NTS-GN后15天，CD146 KO小鼠的肾脏中受限的炎症反应。F4/80(D、E)和CD3(F、G)的免疫组织化学分别确认了CD146 KO小鼠中有限的单核细胞和淋巴细胞粘附。在相同的时间点，TGFβ(H)、胶原蛋白III(I)的QPCR和天狼猩红染色(J)的定量显示出CD146 KO小鼠中纤维化反应的限制。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。显微照片的放大倍数：X200。

图4.在NTS给药后肾小球内皮细胞中CD146被强烈诱导。

CD146和肾小球组分例如内皮细胞(CD31/PECAM1)(A)、足细胞(巢蛋白)(B)、壁细胞(紧密连接蛋白-1)(C)和系膜细胞(α-SMA)(D)的各种不同标志物的双重免疫荧光素染色的肾皮质切片显示出在NTS-GN后7天，CD146表达主要在肾小球内皮细胞中被诱导。显微照片的放大倍数：X400。

图5.CD146-EC-del小鼠的产生。

首先将CD146-floxed小鼠与表达荧光蛋白ZsGreen1作为CRE-重组酶活性的报告物的B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J小鼠(Jackson laboratories)杂交。然后，通过将CD146 flox-Zs Green动物进一步与Ralf Adams建立的Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠株系杂交，产生了具有CD146基因的内皮细胞特异性缺失的小鼠(A)。所述CD146基因的缺失通过I.P.注射在玉米油中稀释的他莫昔芬(10mg/ml溶液，1mg他莫昔芬/注射)并连续给药3天来诱导。

CD146的免疫荧光确认了它从血管内皮缺失(B)。相应地，在CD146-EC-del小鼠的肾脏中CD146 mRNA表达也降低(C)。*，P<0.05；**，P<0.01；#，P＝0.05(NTS相比于CTL)。显微照片的放大倍数：X200。

图6.在NTS-GN诱导后CD146的内皮特异性缺失保护肾功能和结构

在CD146-EC-del小鼠中，NTS诱导的体重(A)、蛋白尿(B)和BUN(C)的增加均被减弱。此外，肾皮质切片中的梅森三色染色(D)揭示出在NTS注射后15天肾小球新月体(E)和肾小管扩张(F)大大减少。*，P<0.05；**，P<0.01(NTS相比于CD146-EC-del)；#，P<0.05；##，P<0.01(NTS相比于CTL-PBS)。显微照片的放大倍数：X200。

图7.CD146内皮特异性缺失保护小鼠免于炎症和肾间质纤维化两者

F4/80染色显示在NTS注射后15天，CD146-EC-del小鼠中的单核细胞浸润被减弱(A)。相应地，VCAM-1(B)和MCP-1(C)的QPCR显示出这些炎性标志物的上调被减弱。此外，TGF-β1(D)和Col1a1(E)的QPCR显示出相似的结果。*，P<0.05；**，P<0.01。显微照片的放大倍数：X200。

图8.在人类中肾小球疾病中CD146转录本的表达

从患有糖尿病性肾病(DN)、微小病变肾病(MCD)、IgA肾病(IgA)、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、膜性肾小球肾炎(MGN)、狼疮性肾炎(SLE)、快速进行性肾小球肾炎(RPGN)的患者的分离的肾小球和对照(移植前同种异体移植物活检组织)获得的基因表达数据。与对照相比，在肾小球疾病中CD146表达被显著且差异地调控。

图9.由心肌梗塞诱导的心肌纤维化的阶段(A)和产生成肌纤维细胞的细胞群体(B)(V.Rai,Mol.Cell Biochem.,2017)。

图10.心肌梗塞的模型

冠状动脉左降支经历永久性结扎(A和B)。在手术后21天将动物处死，以便进行各种不同检查(C)。

图11.免疫组织学原理和方法

感兴趣的蛋白质的间接免疫检测使用信号放大系统来进行。在这种方法中，使用第一抗体检测组织上存在的感兴趣的蛋白质。这种抗体的杂交通过偶联到生物素分子的第二抗体来检测。添加连接到酶、即辣根过氧化物酶(HRP)的亲和素-生物素复合物，使得在沉积特异性底物(二氨基联苯胺)后可以检测所述靶抗原。所述反应产生稳定的棕色沉淀物，其可以通过光学显微术观察(表I和II)。

图12.western印迹的原理

图13.在“MI”(或“IM”)动物中心肌纤维化带的位置(A和B)和CD146 RNA表达(C)(n＝3)

梗死/纤维化带或区(“IZ”或“IA”或“FZ”或“FA”)位于结扎下方左室心尖处。边缘带或区(“BZ”或“BA”)紧邻所述梗死带，并且远端/远离带或区(“DZ”或“DA”或“RZ”或“RA”)位于结扎带上方。心肌纤维化(B，60X物镜)位于梗死带(红色箭头)处并在边缘带(蓝色箭头)中传播。

图14.心肌梗塞模型中CD146/sCD146的表达(N＝3)

(A)CD146的免疫检测。CD146的免疫检测显示出与假手术组动物相比，在MI动物的心室壁中标记更多。纤维化带未被标记(“IA”)，而外周心肌细胞被标记(“BA”)。某些图像在20X物镜下获取，而其他图像在60X下获取。

(B)CD146 ELISA(n＝2)。在2只假手术组和2只MI小鼠的血清中确定了CD146浓度。结果以ng/ml为单位给出。

图15.衰老相关的纤维化模型中CD146的表达(n＝3)

24月龄动物(e、f)的心肌切片的天狼猩红染色(e)和CD146免疫检测(f)。

图16.在衰老期间CD146在心肌纤维化中的作用

A-24月龄雌性动物的心肌纤维化的天狼猩红染色(a、b：40X物镜)和被胶原蛋白占据的面积分数的定量(c)(n＝3)(p＝0.0001)。胶原蛋白RNA表达的RT-PCR定量(d)(n＝1)。

B-细胞膜的染色和心肌细胞尺寸的定量(n＝3)(p<0.0001)。

图17.CD146在成肌纤维细胞表型获得中的作用

细胞增殖研究显示出在使用CD146刺激期间的增加与使用TGF-β观察到的可比(A)(p<0.05)。在RNA(B)和蛋白质(C)分析中，在用CD146(50ng/mL)刺激48小时后成肌纤维细胞标志物SMA的表达提高，并且肌动蛋白纤维更大(D)，其方式与使用TGF-β的刺激相同(20X物镜)。在用CD146刺激后纤连蛋白和I型胶原蛋白的表达(E)也提高，其方式与使用TGF-β刺激后相同。CD146在RNA水平上诱导TGF-β表达的提高(F)。

图18.在不同时间使用抗sCD146抗体治疗具有肾衰竭和纤维化的UUO(单侧输尿管阻塞)小鼠模型

8至12周龄的雄性C57BL/6小鼠经历右侧输尿管结扎。通过中线腹部切口暴露出右侧输尿管，并在肾盂下方1cm用5.0结扎丝线完全阻塞(结扎的动物)。在手术后，准备4组各7只动物。一组动物被用作对照，并在第1、4、7和10天用介质IV治疗。一组动物在手术后第1、4和10天用每只小鼠10微克的抗sCD146抗体IV治疗。另一组动物用相同的方案但仅在手术后第7和10天治疗。最后一组动物在手术后第1、4、7和10天用每只小鼠10微克的对照IgG IV治疗。

图19.抗sCD146治疗对肾纤维化的效果

在手术后第14天，将动物处死并取出肾脏用于免疫组织化学。在实验肾或对侧肾上的纤维化使用天狼猩红来估算。结果显示与对侧肾相比，在实验肾中纤维化增加。使用IgG的治疗不改变纤维化。相反，从第1至14天或从第7至14天使用抗sCD146抗体的治疗显著减少纤维化。

图20.抗sCD146治疗对α-SMA表达的影响

在手术后第14天，将动物处死并取出肾脏。通过使用特异性抗体的免疫组织化学来确定实验肾或对侧肾上的α-SMA表达。结果显示与对侧肾相比，在实验肾中α-SMA增加。使用IgG的治疗不改变α-SMA表达。相反，从第1至14天或从第7至14天使用抗sCD146抗体的治疗显著降低α-SMA表达。

图21.在内皮细胞中蛋白酶抑制剂对可溶性CD146分泌的影响

A：在ECFC中确定了对使用20ng/ml TNF、20ng/ml VEGF、5ng/ml TGFb、50ng/ml纺锤蛋白、50ng/ml Wnt5a和50ng/ml Wnt3a的24h治疗做出响应的可溶性CD146(CD146s)的分泌。

B：通过ELISA试验了在ECFC细胞中泛抑制剂GM6001对CD146s分泌的影响。

实验在对照条件下和用20ng/ml TNF治疗24h后进行。插图显示出TNF治疗从治疗的24h起显著增加CD146s。在1至50μM之间进行了GM6001效果的剂量依赖性实验。结果是5次实验的平均值+/-SEM。

C：在对照条件下和用20ng/ml TNF治疗24h后，测试了50μM的弗林蛋白酶转化酶抑制剂(IF)对CD146s分泌的影响。结果是3次实验的平均值+/-SEM。

D：在对照条件下和用20ng/ml TNF治疗后，测试了TIMP-1、-2和-3(1μg/ml)对CD146s分泌的影响。结果是3次实验的平均值+/-SEM。

*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，实验相比于对照。

图22：在ECFC中ADAM10参与CD146的长同工型的脱落

A：将ECFC用靶向CD146的短(shCD146)或长(lgCD146)同工型的siRNA和对照siRNA(C)转染。确定可溶性CD146(sCD146)的分泌。结果是4次不同实验的平均值+/-SEM。

B：将ECFC用靶向MT1-MMP、MMP2、ADAM10或Tace的siRNA和对照siRNA(C)转染。确定可溶性CD146(sCD146)的分泌。在一种条件下，将细胞用10μM GM6001处理。结果是5次不同实验的平均值+/-SEM。

C：将在基础条件(EBM2)下培养的ECFC中的ADAM10免疫沉淀。然后使用特异性抗体通过western印迹检测CD146的长(lgCD146)和短(shCD146)同工型。结果代表了3次不同实验。

D：将ECFC用靶向ADAM10或Tace的siRNA和对照siRNA(C)转染。使用葡聚糖-FITC确定在半透性滤膜上生长的ECFC单层的通透性。结果是3次实验的平均值+/-SEM。

E：将ECFC用编码ADAM10(p-ADAM10)或Tace(p-Tace)的质粒载体和对照质粒载体(C)转染。使用葡聚糖-FITC确定在半透性滤膜上生长的ECFC单层的通透性。结果是3次实验的平均值+/-SEM。

*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，实验相比于对照。

图23：在ECFC中Tace参与CD146的短同工型的脱落

A：将ECFC用靶向CD146的短(shCD146)或长(lgCD146)同工型的siRNA和对照siRNA(C)转染，并在基础条件下和用20ng/ml TNF处理24h的细胞中确定可溶性CD146(sCD146)分泌。结果是5次不同实验的平均值+/-SEM。

B：将用20ng/ml TNF处理24h的ECFC用靶向Tace、ADAM10、MT1-MMP的siRNA和对照siRNA(C)转染，并确定可溶性CD146(sCD146)的分泌。结果是3次不同实验的平均值+/-SEM。

图24：I10-sCD146和I5-13-sCD146同工型的表征

A：I10-sCD146和I5-13-sCD146同工型与脱落形式相比较的示意图。氨基酸的差异被注明。

B：在ECFC和HUVEC中分析了I10-sCD146和I5-13-sCD146同工型的mRNA表达，并与CD146的短和长同工型的mRNA表达进行比较。结果是3次实验的平均值+/-SEM。

C：在ECFC中，在用重组的脱落可溶性CD146 50ng/ml、VEGF 20ng/ml、TNF 20ng/ml、TGFβ5ng/ml和纺锤蛋白50ng/ml处理所述细胞24h后，通过qPCR分析I10-sCD146和I5-13-sCD146同工型的mRNA表达。细胞也用WNT5a 200ng/ml处理15min和用WNT3a 50ng/ml处理1h。结果是3次实验的平均值+/-SEM。

*：P<0.05，实验相比于对照。

图25：I5-13-sCD146和I10-sCD146对血管生成的影响

A：靶向I10-sCD146和I5-13-sCD146的siRNA对ECFC增殖的影响。实验在10μMGM6001存在下进行。结果是4次不同实验的平均值，并给出了在一次实验中细胞的代表性图片。

B：通过质粒转染实现的I10-sCD146(p-I10-sCD146)、I5-13-sCD146(p-I5-13-sCD146)和脱落的sCD146(p-shed sCD146)的过表达对ECFC增殖的影响。实验在10μMGM6001存在下进行。

C：50ng/ml重组蛋白I10-sCD146、I5-13-sCD146和脱落的sCD146对ECFC增殖的影响。实验在10μM GM6001存在下进行。结果是4次不同实验的平均值。

D：卵黄囊膜测定法在25ng/ml或50ng/ml I5-13-sCD146和I10-sCD146存在下进行48h，并与对照进行比较。给出了4次不同实验的代表性图片。

E：在使用ECFC实现的球状体实验中50ng/ml重组蛋白I10-sCD146、I5-13-sCD146和脱落的sCD146对芽数量、分枝点和累计芽长的影响。将结果与VEGF 20ng/ml和完全EGM2-MV培养基进行比较。

给出了实验的平均值和代表性图片。结果是4次不同实验的平均值。*：P<0.05，***：P<0,001，实验相比于对照。

图26：在小鼠缺血性后肢模型中重组I5-13-sCD146和I10-sCD146的局部注射的效果

A：将缺血小鼠用PBS或2μg rh-sCD146/rh-I10-sCD146/rh-I5-13-sCD146或VEGF治疗。通过激光多普勒监测血液灌注率。结果是每组6只不同动物的平均值，并表示为对照腿的％。*，**，***：P<0.05，P<0.01，P<0.001，I10-sCD146相比于PBS；$$，$$$：P<0.01，P<0.001，I5-13-sCD146相比于PBS；##，###：P<0.01，P<0.001，脱落的sCD146相比于PBS；￡：P<0.05，VEGF相比于PBS。

B：在手术后28天，来自于对照(PBS)和脱落的rh-sCD146/rh-I10-sCD146/rh-I5-13-sCD146治疗的动物的后肢肌肉切片中的血管检查。血管用同工凝集素B4标记。**，***：P<0.01，P<0.001，实验相比于对照；$：P<0.05，I10-sCD146相比于I5-13-sCD146。

C：在D28时对照(PBS)和脱落的sCD146/I10-sCD146/I5-13-sCD146治疗的动物的血管造影照片。照片是每组中6只动物的代表。血管密度的平均值被表示为在腿的不同部分(小腿、大腿)和整个腿中右腿相比于左腿。*，**：P<0.01，P<0.001，小腿中实验相比于PBS；$：P<0.05，大腿中实验相比于PBS；#，##：P<0.05，P<0.01，整个腿中实验相比于PBS。

图27：在系统性硬化中I5-13-sCD146和I10-sCD146同工型的表达和效果

A：在患有系统性硬化的22位患者中确定脱落的sCD146、I5-13-sCD146和I10-sCD146的浓度，并与匹配的对照进行比较。也比较了患有和未患肺纤维化的SSc患者中的I5-13-sCD146(插图；分别为n＝10和n＝12)。

B：在来自于CD146 KO和WT小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中估算了经典Wnt信号传导的活化(b-连环蛋白/TCF转录活性；萤光素酶测定法)。将MEF在存在或不存在脱落的sCD146、I5-13-sCD146或I10-sCD146的情况下用或不用博来霉素处理。结果是5次独立实验的平均值+/-SEM。

C：在通过博来霉素的皮下注射诱导的系统性硬化的CD146 KO小鼠模型中评估了真皮厚度。估算了脱落的sCD146、I5-13-sCD146和I10-sCD146的影响，并给出了4-5只不同动物的平均值。还示出了代表性照片。

D：示出了在用博来霉素处理并注射或未注射脱落的sCD146、I10-sCD146和I5-13-sCD146的不同CD146 KO小鼠中皮肤的外貌。

E：在用或未用脱落的sCD146/I10-sCD146/I5-13-sCD146处理的动物的皮肤中的血管检查。血管用同工凝集素B4标记。结果是在4-5只动物中的3次不同实验的代表。

*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，实验相比于对照。

图28：正常组织中I5-13-sCD146和I10-sCD146同工型的表达

通过组织阵列检查了各种不同器官中I10-sCD146和I5-13-sCD146的mRNA表达。结果作为淋巴结中的表达的函数进行归一化。

图29：UUO对CD146表达和可溶性CD146分泌的影响

A：CD146的表达在肾脏切片上被观察到，并在具有UUO的肾脏中进行定量。示出了定量。

B：在假手术组和UUO动物中通过ELISA对可溶性CD146进行定量。结果是7只动物的平均值。

*：P<0.05；**：P<0.01，UUO相比于对侧。

图30：抗体治疗对胶原蛋白和纤连蛋白表达的影响

观察了UUO对胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤连蛋白的蛋白表达的影响。也观察了使用抗体的治疗的影响，并与使用对照IgG的治疗进行比较。

结果是每组中7只动物的平均值。

****：P<0.001，介质相比于对侧

§§§§：P<0.001，mAb相比于介质

***：P<0.01，介质或对照IgG相比于对侧

§§§：P<0.01，mAb相比于介质

图31：抗体治疗对a-SMA表达的影响

通过免疫组织化学观察了UUO对a-SMA表达的影响。也观察了使用抗体的治疗的影响，并与使用对照IgG的治疗进行比较。

结果是每组中7只动物的平均值。

***：P<0.01，介质相比于对侧

§§§：P<0.01，mAb相比于介质

图32：在人类肾成纤维细胞的原代培养物中抗sCD146 mAb对a-SMA表达和波形蛋白mRNA表达的影响

检查了sCD146(50ng/ml)对来自于人类成纤维细胞的原代培养物的影响。单独(Ac)或与sCD146一起给药的500ng/ml抗sCD146 mAb的影响。

结果是3次实验的平均值+/-SE，并被表示为与未处理的对照条件相比的变化倍数。

*：P<0.05；sCD146相比于对照

$：P<0.05；sCD146+Ac相比于sCD146

图33：腺嘌呤饮食对肾脏特征的影响

A：将动物用(腺嘌呤)或不用腺嘌呤(对照)处理，并在腺嘌呤饮食结束后2周处死。在用天狼猩红着色后检测肾脏中的纤维化。示出了代表性照片。

B：在对照肾上和在刚完成腺嘌呤饮食后(结束)、腺嘌呤饮食结束后1周(第1周)、腺嘌呤饮食结束后2周(第2周)和腺嘌呤饮食结束后3周(第3周)的肾中分析TGFb、胶原蛋白a1和αSMA的mRNA表达。结果被表示为与对照组相比的变动。

C：在对照肾上和在刚完成腺嘌呤饮食后(结束)、腺嘌呤饮食结束后1周(第1周)、腺嘌呤饮食结束后2周(第2周)和腺嘌呤饮食结束后3周(第3周)的肾中分析αSMA的蛋白质表达。结果被表示为相对于对照组的变动。

D：在对照肾上和在刚完成腺嘌呤饮食后(结束)、腺嘌呤饮食结束后1周(第1周)、腺嘌呤饮食结束后2周(第2周)和腺嘌呤饮食结束后3周(第3周)的肾中分析CD146的mRNA表达。结果被表示为与对照组相比的变动。

图34：在用腺嘌呤处理的小鼠的肾脏中抗sCD146抗体对纤维化的影响

A：将用腺嘌呤处理的动物用PBS、对照IgG或抗sCD146 mAb注射。在所述饮食结束后2周，在天狼猩红着色后检测肾脏中的纤维化。示出了代表性照片。

B：纤维化面积的定量被表示为纤维化面积相对于总表面的％。结果被表示为来自于每个组中4只动物的至少5个切片的平均值+/-SE。

实验部分

下文中描述的实验具体来说显示了：

-在肾纤维化的严重诱导的两种模型(由肾小球基底膜抗血清诱导的模型和输尿管单侧梗阻模型)中，CD146在肾小球毛细血管的水平上明显增加，并且循环血中sCD146的浓度大大提高；在使用CD146KO小鼠时对纤维化的影响极大降低，并且在用抗sCD146抗体注射所述动物时，这种影响被阻止或逆转；

-在小鼠中的心肌梗塞模型中，在纤维化区域附近CD146增加，并且sCD146增加；

-在CD146 KO动物中，与对照动物相比在心肌梗塞后纤维化的量减少；

-在老年小鼠中，与WT小鼠相比，在KO-CD146小鼠中心肌纤维化的发生减少；

-sCD146在体外增加肾和心脏成纤维细胞的增殖，并诱导它们向成肌纤维细胞的转变；

-在肾和心脏内皮细胞中，sCD146在体外诱导内皮-间质转化；和

-sCD146在体外显著诱导常常与纤维化相关的miR21。

这些结果显示，sCD146在各种不同的与纤维化相关的病症、通常为人类纤维化疾病中丰富地分泌，并通过靶向成纤维细胞和内皮细胞两者参与间质纤维化的发生。此外，当用抗sCD146抗体治疗动物时，所述现象被阻止或逆转。

实施例1–在小鼠中CD146的内皮特异性缺失针对实验性肾小球肾炎提供保护

小鼠株系

CD146-floxed和CD146-KO小鼠如以前所述产生并回交超过10代，成为C57BL/6J背景(Bardin,N,2009)。首先将CD146-floxed小鼠与表达荧光蛋白ZsGreen1作为CRE重组酶活性的报告物的B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J小鼠(Jacksonlaboratories)杂交。然后，通过将CD146flox-ZsGreen动物与作为来自于Dr Ralf Adams的馈赠(Wang,Y 2010)的Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠株系进一步杂交，产生具有CD146基因的内皮细胞特异性缺失的小鼠。所述CD146基因的缺失通过腹腔注射在玉米油中稀释的他莫昔芬(10mg/ml溶液，1mg他莫昔芬/注射)并连续给药3天来诱导。用于CD146等位基因的基因分型的引物是SEQ ID NO：22：5’-TCACTTGACAGTGTGATGGT-3'(用于检测CD146 WT、floxed和KO等位基因的正向引物)、SEQ ID NO：23：5’-CCTTAGAAAGCAGGGATTCA-3'(用于检测CD146 WT和floxed等位基因的反向引物)和SEQ ID NO：24：5’-CCCAAATCCTCTGGAAGACA-3'(用于检测CD146 KO等位基因的反向引物)。

多种人类肾小球疾病中的CD146分析

人类肾脏活检组织在多中心研究(欧洲肾脏cDNA库-

肾毒性血清诱导的肾小球肾炎

去补体的肾毒性血清(NTS)如以前所述制备(Mesnard L 2009；Kerroch M,2012)，并在连续两天(第1和2天)内静脉内注射每克体重17,5μl血清。对于时间过程方案来说，将2月龄雌性C57Bl6/J用NTS注射，并在第4、7和15天处死，用于组织收集(每个时间点n＝6只小鼠)。6只小鼠用PBS注射并用作对照。

对于CD146-KO方案来说，使用2月龄CD146-KO雌性小鼠和它们的野生型同窝仔畜(每组n＝16)。将来自于每个组的10只小鼠用NTS注射并且6只用PBS注射。在第0、4、8和15天获取体重和尿液样品。所有小鼠在第15天处死并获得血液和组织样品。

对于CD146-floxed方案来说，将10只2月龄雌性小鼠用他莫昔芬处理。它们中的6只用NTS注射，4只用PBS注射。将不带有CRE重组酶转入基因的CD146-floxed ZsGreen小鼠用他莫昔芬处理并用作对照(对于NTS来说n＝6，对于PBS来说n＝4)。在第0、4、8、12和15天获取体重和尿液样品。在第15天，在获取血液样品后将小鼠处死。

关于动物实验的所有程序遵照欧盟实验室动物的护理和使用准则，并得到法国国家健康与医学研究院(Institut National de la Santéet de la Recherche Médicale)的当地伦理委员会批准。动物被饲养在恒定温度下，并自由取用水和食物。

组织学和功能参数

将来自于每只动物的半个肾脏固定在4％福尔马林溶液中并包埋在石蜡中。将4μm切片用梅森三色染色，用于肾损伤的组织学评估。肾小管扩张使用下述量表半定量评估：0，无肾小管损伤；1，所分析的肾小管中1–25％损伤；2，所分析的肾小管中26–50％损伤；3，所分析的肾小管中51–75％；4，所分析的肾小管中>76％损伤。肾小球新月体被测量，并表示为表现出新月体的肾小球的数目相比于肾小球总数的％。评分由两位不同的调查人员在编号载片上以不知情的方式进行。图像使用OlympusIX83光子显微镜在X200放大倍数下进行。间质纤维化在天狼猩红染色的石蜡切片上以X200放大倍数进行半定量评估。然后使用基于计算机的形态计量分析软件(Analysis,Olympus)对纤维化进行定量，所述软件允许形成二值图像，其中染色区域可以被自动计算为图像区域的百分率。BUN和蛋白尿水平使用酶法(Konelabautomater)测量，并分别以毫摩尔/升和克/毫摩尔肌酐为单位表示。

免疫染色

免疫组织化学在4μm厚的石蜡包埋组织切片上进行。将组织脱石蜡，并使用pH6的10mM柠檬酸在95℃下进行抗原修复。将切片用0.1％triton/PBS通透化。使用针对F4/80(AbDSerotec)和CD3(Dako)的抗体。F4/80和CD3阳性区域在每只动物至少10张200X放大倍数的照片中使用可公开获得的图像处理软件(ImageJ；Fiji)进行定量，并表示成总组织面积的百分率。免疫荧光在在甲醇中固定的4μm厚冷冻切片上进行。使用CD146(自制大鼠抗小鼠)、CD31(Abcam)、紧密连接蛋白-1(Thermo Scientific)、巢蛋白(BD Pharmingen)、肾素(Abcam)抗兔和α-SMA(Sigma Aldrich)抗小鼠抗体。Alexa fluor(Invitrogen)第二抗体被用于检测。图像使用OlympusIX83光子显微镜在X400放大倍数下获得。

定量实时PCR

使用TRI试剂(MRC)从半个肾脏提取总RNA。通过测量OD 260:280比率来验证RNA质量，并通过在37℃下进行30分钟的DNase I处理(Thermo Fisher Scientific)来除去残留的基因组DNA。使用来自于Thermo Fisher Scientific的Maxima第一链cDNA合成试剂盒，按照制造商的说明书将总共1mg RNA转录成cDNA。实时PCR利用Roche Light Cycler 480检测系统，使用SYBR Green PCR主混合物(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)在下述程序下进行：95℃5分钟，95℃15秒和60℃15秒共45个循环，和72℃15秒。对于定量分析来说，使用DDCT方法将实验基因归一化到HPRT表达。分析解离曲线以确定扩增的是单一产物。引物序列在表1中列出。

Western印迹

使用RIPA裂解缓冲液(Santa Cruz Biotechnology)从肾脏组织提取蛋白质。针对CD146(Epitomics)的Western印迹使用以前描述的标准技术来进行(Bardin等，2009)。GAPDH(Sigma-Aldrich)被用作载样对照。

统计分析

值被表示为平均值±SEM。数据使用单向方差分析，然后使用Statview软件包的受保护的最小显著差异Fisher检验来分析。误差条对于体内数据来说表示平均值±SEM，对于体外数据来说表示平均值±SD。具有P<0.05的结果被认为是统计显著的。

表1：

CD146在受损的肾小球中被诱导

为了评估肾小球疾病进展期间CD146的表达，本发明人在野生型小鼠中诱导了被动的肾毒性血清肾小球肾炎(NTS-GN)。在NTS给药后4、7和15天将动物处死。免疫荧光显示在健康动物的肾小球中CD146的表达弱(图1A)。在肾小管周毛细血管和受损的肾小球中，从第4天至第15天，CD146表达逐步提高。这种上调通过肾组织的western印迹得以确认(图1B和1C)。CD146敲除小鼠受到保护免于肾毒性血清诱导的肾小球肾炎。

为了评估CD146在GN中的作用，我们在CD146 WT和KO小鼠两者中注射NTS。在NTS给药后15天将小鼠处死。正如预期的，NTS-GN在WT动物中诱导疾病后导致体重增加(图2A)。相应地，肾功能改变，因为蛋白尿和血尿素氮(BUN)两者均大大增加(图2B和2C)。相反，在CD146 KO小鼠中，体重和BUN增加被减弱。此外，在这些小鼠中蛋白尿的升高明显更低。通过梅森三色染色进行的组织学病损的定量显示，在CD146 KO小鼠中NTS注射诱导更少的损伤(图2D)。事实上，通过与WT动物相比新月体形成和肾小管扩张两者的显著减少，证实了CD146 KO动物中的显著结构保护(图2E和2F)。因此，CD146 KO动物受到保护免于由NTS-GN诱导的肾小球和肾小管病损，其保留肾功能并且蛋白尿减少。

CD146 KO小鼠在NTS注射后显示出炎症和肾纤维化的减少

通过qPCR进行的肾脏中的炎性标志物的评估显示，在CD146 KO小鼠中，在NTS注射后15天IL-1β、TNF-α和ICAM-1mRNA的诱导被减弱(图3A、3B和3C)。因此，F4/80免疫染色显示出在CD146KO小鼠的肾皮质中更少的巨噬细胞浸润(图3D和3E)。此外，这些动物在第15天表现出减少的CD3细胞浸润(图3F和3G)。因此，在缺少CD146的小鼠中肾纤维化受限。事实上，在CD146 KO小鼠中纤维化标志物例如TGF-β和胶原蛋白III的mRNA表达被减弱(图3H和3I)。天狼猩红着色的定量确认了这些动物中肾间质纤维化的减少(图3J)。合在一起，这些数据证实在NTS-GN中CD146的缺少显著限制了肾脏炎症和肾间质纤维化。

在NTS-GN进展期间肾小球内皮中的CD146增加

为了鉴定在攻击后受损的肾小球中过表达CD146的细胞类型，本发明人在NTS给药后第7天使用适合的肾小球组分的标记物进行了着色实验。CD146在基础条件下在血管簇中略微表达(图1A)。在诱导NTS-GN后，CD146过表达主要与内皮标志物CD31/PECAM共定位(图4A)。相反，在足细胞中没有检测到CD146，因为没有与巢蛋白共定位(图4B)。它既没有在壁细胞中检测到，因为他们没有检测到CD146与紧密连接蛋白-1的任何共定位(图4C)，也没有在系膜细胞中检测到(图4D)。因此，本发明人的数据确认了在疾病诱导后CD146主要在受损的肾小球内皮细胞中高度过表达。

CD146的内皮特异性缺失保护小鼠抵抗NTS-GN

为了估计内皮CD146过表达在NTS-GN进展中的影响，本发明人产生了CD146-EC-del小鼠株系。通过将带有他莫昔芬可诱导的VE-钙粘蛋白Cre重组酶的小鼠(Wang,Y,2010)与CD146flox-ZsGreen小鼠杂交育种，特异性缺失了血管内皮中的CD146(图5A)。内皮细胞中CD146缺失的特异性在他莫昔芬注射后和NTS给药后15天通过免疫荧光得以验证(图5B)，并通过qPCR进一步确认(图5C)。CD146-EC-del小鼠显示出体重、蛋白尿和BUN的有限增加(图6A-C)。这种功能保护通过肾脏结构的全面保留得以实现(图6D)，因为在诱导NTS-GN后15天，与相应的对照相比新月体数量(图6E)和肾小管损伤(图6F)两者均急剧减少。此外，F4/80免疫染色显示出在CD146-EC-del小鼠的肾皮质中单核细胞浸润减少(图7A)。相应地，qPCR实验显示出VCAM-1和MCP1两者的上调被完全消除(图7B和7C)。随后，与对照肾脏相比，在CD146-EC-del小鼠中TGF-β1和胶原蛋白I mRNA的增加的表达被减弱(图7D和7E)。这些数据证实了在小鼠中CD146的内皮过表达促进实验性GN的进展。

在人类肾小球疾病中CD146转录本数目增加

在来自于患有糖尿病性肾病(DN，n＝7)、微小病变肾病(MCD，n＝5)、IgA肾病(IgA，n＝27)、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS，n＝10)、膜性肾小球肾炎(MGN，n＝21)、狼疮性肾炎(SLE，n＝32)和快速进行性肾小球肾炎(RPGN，n＝23)的患者的肾活检组织的显微切割的肾小球中分析了CD146 mRNA表达。与对照活检组织(n＝6)相比，损伤的肾小球显示出CD146转录本的显著转录上调(图8)。

各种不同的慢性炎性疾病与内皮细胞间功能和连接完整性的破坏相关(WuthrichRP,1990)。在慢性肾病的进展过程中内皮细胞连接的组织化也发生缺陷。事实上，在来自于几种病因的肾病患者的活检组织中，本发明人以前报道了内皮细胞膜型CD146的高表达与毛细血管内增殖、蛋白尿和炎症相关(Daniel L,2005)。此外，CD146水平的提高与慢性肾衰竭进展期间肾形态计量的变化相一致，表明在这些病理背景中由CD146支持的连接功能可能改变。然而，这种过表达的病理意义仍不清楚。有趣的是，在本文描述的实验中，CD146的增加的表达似乎促进肾病，因为它的缺失保护肾脏免于免疫攻击并防止严重的肾功能障碍。本发明人证实，CD146代表了对抗肾小球肾炎的起始和进展的新的治疗靶点。

在本实验中，从所述疾病的早期阶段开始CD146在肾脏微循环中过表达，但主要在受损的肾小球中过表达。在较晚的时间点，也发现CD146在近端小管中过表达(图1A)。在本发明人的实验模型中，所述疾病的起点是肾小球区室，CD146过表达促进肾小球和肾小管-间质炎症的发生并伴有肾衰竭、蛋白尿和体重增加。CD146 KO小鼠受到保护免于这些改变。据报道在小鼠中，CD146在髓系细胞中表达(Despoix,N.,2008)。由于共定位实验显示出CD146主要在受损的内皮中过表达，因此本发明人产生了CD146的特异性内皮细胞KO，以辨别内皮细胞CD146在NTS-GN中的特定作用。这清楚地证实了内皮细胞在控制肾小球损伤以及间质炎症中的重要作用。这些结果与本发明人的以前研究相一致，所述研究证实内皮细胞CD146在体外参与单核细胞跨内皮迁移的调控(Bardin,N.,2009)。事实上，在肿瘤坏死因子-α刺激后，在HUVEC的细胞连接和顶端膜两者处CD146表达增加，并进一步有助于单核细胞通过内皮细胞单层的迁移。更近些时候，在多发性硬化的小鼠模型中报道了类似的结果，其中靶向内皮细胞CD146通过限制血脑屏障上的淋巴细胞外渗减少神经炎症(Duan,H.；2013)。

另一个有趣的发现是在CD146 KO和CD146-EC-del小鼠两者中肾纤维化被减弱。尽管这个发现是在作为人类中的罕见疾病的新月体性GN的模型中报道，但它是特别令人感兴趣的，因为肾纤维化是所有肾脏疾病的共同演化结果，并且高度预测了慢性肾病(CKD)的进展(Rockey,D.C 2015)。本发明人相信内皮CD146在对内皮细胞的活化做出响应的纤维化过程的控制中发挥关键作用。已提出在小鼠中，在实验性肾病的不同模型中，内皮细胞向间充质细胞的转化(Endo-MT)有助于纤维化肾脏中活化的成纤维细胞和成肌纤维细胞的积累(Zeisberg,E.M.,2008)。在这一方面，当CD146表达被下调时纤维化的减轻可以部分用Endo-MT的减少来解释。然而，更近的研究证实了Endo-MT程序对肾纤维化出现的贡献是中等的(LeBleu,V.S.,2013)。另一种假说可以是CD146诱导细胞活化的作用，因为它已被描述在其他组织中的内皮细胞向间充质细胞的转化现象中，所述转化现象是转移性传播中的重要事件(Zeng,Q.,2012,Liang,Y.K 2017)。本发明人相信由活化的内皮细胞释放的可溶性CD146(sCD146)刺激成纤维细胞增殖和向成肌纤维细胞表型的转变，引起肾细胞外基质沉积和纤维化。已认识到在全世界GN是末期肾病(ESRD)的第二常见的病因(Chadban,S.J.,2005)。尽管存在攻击性的免疫抑制疗法，但快速进行性GN可以引起不可逆的肾损伤并伴有CKD和通常是ESRD。考虑到需要治疗靶点来阻止GN中的肾小球损伤以及肾小管间质炎症和纤维化，本发明人使用了一种强有力的实验工具，利用人类肾小球疾病的某些特点来研究CD146在肾炎性损伤中的作用。事实上，注射富含针对肾小球抗原的免疫球蛋白的绵羊血清会诱导即时炎症反应，其特征是免疫系统细胞的肾浸润，随后是严重的肾小球损伤和肾功能的快速丧失(LuqueY.,2017；El Machhour F.,2015；Mesnard L.,2014；Toubas J.,2011；Mesnard L.,2009)。这是快速进行性肾病的一种鲁棒模型，因为小鼠在诱导所述疾病后的最近4周内死亡(Kerroch M.,2012；Kavvadas 2017)。因此，这种GN模型的优点在于它可用于在快速的时间框架内描述引起免疫性肾炎的致病过程，并允许鉴定可能决定疾病严重性的几种因素。从遗传易感性以及临床治疗学两种观点来看，这具有重要的临床意义(Fu Y,2007)。实际上，已显示几种介导物例如细胞因子、趋化因子、粘附分子、表面受体和细胞外基质蛋白在介导CKD中的炎症反应中发挥至关重要的作用(Tang WW,1994；Le Hir M.,1998；Schwarting A.,1998；Kitching AR,1999；Karkar AM,2001；Kishimoto T.2005；HeniqueC.,2016；Prakoura N.,2017)。因此，本发明人的研究的主要发现是CD146缺失在这种GN模型中有益，因为在CD146 KO和CD146-EC-del两种小鼠中所述疾病的进展被减弱。与健康对照相比，在患有不同类型的GN的患者的活检组织中肾小球内的这种连接分子的夸张表达，强化了针对CD146的特异性抑制工具的治疗重要性(图8)。

发明人的结果支持内皮在肾脏中控制对所有区室、肾小球以及肾小管的攻击的主要作用。它们证实了内皮CD146在GN的进展中发挥主要作用，并且靶向这种连接分子代表了阻止急性GN向慢性肾病发展的良好治疗策略。

本发明人还通过免疫组织化学体内定量了与假手术组动物相比UUO(单侧输尿管阻塞)动物的肾脏切片中CD146的表达，并通过Elisa体内定量了所述动物的血浆中sCD146的分泌(图29)。结果显示，与对侧肾脏相比在具有UUO的肾脏中CD146显著增加，并且与假手术组动物相比在UUO动物中sCD146显著增加。

观察了UUO对胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤连蛋白表达的影响。结果(图30)显示UUO提高了这些蛋白质的表达。有趣的是，与对照IgG相比，在UUO之前或UUO后一周使用抗sCD146抗体的治疗降低胶原蛋白和纤连蛋白表达，显示出抗体治疗阻止胶原蛋白和纤连蛋白沉积。

观察了UUO对a-SMA表达的影响。结果(图31)显示UUO提高a-SMA的表达。有趣的是，与对照IgG相比，在UUO之前或UUO后一周使用抗sCD146抗体的治疗降低a-SMA表达，显示出抗体治疗阻止成纤维细胞活化。

在(体外)培养物中的人类肾成纤维细胞中，观察了抗sCD146治疗对a-SMA和波形蛋白的mRNA表达的影响。结果(图32)显示使用抗sCD146抗体(500ng/ml)的治疗抑制了使用sCD146时观察到的sCD146诱导的a-SMA和波形蛋白mRNA表达的提高。

实施例2–在心肌梗塞模型中心肌纤维化的建立与CD146/CD146s的表达提高相关

本发明人显示，在心肌梗塞模型中，在动物体内，心肌纤维化的建立与CD146/CD146s的表达提高相关。他们还显示，在体外，CD146s以与TGF-β可比的效果诱导心脏成纤维细胞分化成成肌纤维细胞。因此，CD146/CD146s构成了旨在限制和/或逆转心肌纤维化过程的新的治疗靶点。

使用心肌纤维化的两种鼠类模型研究CD146/CD146s的作用：

-第一种心肌纤维化模型由心肌梗塞诱导。

-第二种模型是老年动物中的组成性心肌纤维化。

a)由心肌梗塞诱导的心肌纤维化模型

这第一种模型与Francesca Rochais博士的团队(CR,INSERM,UMR S 910)合作建立。通过腹膜内注射氯胺酮、甲苯噻嗪和阿托品的混合物将小鼠麻醉。然后对动物插管并置于人工呼吸下。切开动物的胸腔，打开心包并进行冠状动脉左降支的永久性结扎。心肌缺血通过结扎点下方左室心尖的变白来观察。然后将动物的胸腔封闭，并将动物置于恢复笼中。经历过心肌梗塞的动物的存活率平均为50％。

所有手术在分为2组的12周龄雄性C57BL6上进行：

·C57BL6-假手术组小鼠(n＝3)：将动物麻醉并插管，然后经历开胸手术但不结扎冠状动脉。

·C57BL6+MI小鼠(n＝3)：动物经历用于诱导心肌梗塞的完整的手术程序。

在21天后将所有小鼠(假手术组和MI)处死。将动物用异氟烷麻醉，称重并抽取心内血样，然后通过颈椎脱位处死。取出动物的心脏和胫骨。

b)衰老期间的组成性心肌纤维化模型

实验在不表达CD146的24月龄雌性转基因C57Bl/6小鼠(CD146-KO；n＝5)上进行，并与表达CD146的C57BL/6小鼠(n＝5)进行比较。在处死后，取出每只动物的心脏。对心脏进行制备以用于组织学(n＝3)和免疫组织化学分析，或立即在-80℃下冷冻以便进行RNA或蛋白质提取(n＝1)。

c)心功能的检查

动物的心功能使用在CERIMED进行的多普勒超声心动图(VisualSonicsVevo2100,550D探头)来评估。从在纵向(长轴)然后在横向(短轴)方向上依次以M模式捕获的图像获取测量值。测量了以下参数：舒张期容积，收缩期容积，用于计算收缩期射血分数。

d)组织学和免疫组织化学

组织制备：将收获的心脏用冷PBS溶液清洗，在首先在液氮中冷却的异戊烷中冷冻固定，并在-80℃下储存。使用低温恒温器通过心脏的水平面切出7μm厚的连续切片，以便在组织切片上观察到四个心脏仓室。

天狼猩红染色：将所述切片用甲醛(在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中稀释至4％)固定3分钟，然后用天狼猩红染色。将切片在天狼猩红中浸泡1小时，然后在乙酸溶液(0.5％，在双蒸馏水中)中使染色分化，在不断提高的乙醇浴中脱水，在二甲苯中清理，并固定在树脂固定介质(Entellan)中。将载片在Olympus BX-40显微镜下观察，并用Olympus DP-21相机拍摄照片。

定量使用ImageJ软件进行。在排除血管结构后，通过将红色染色的胶原蛋白占据的面积与总组织面积相关联来表示胶原蛋白占据的面积分数(以％为单位)。

总共对每只动物(每组4只动物)的3个切片进行染色，并对在每只动物的左心室中专门拍摄的4个视野(X20)进行定量。

使用麦胚凝集素(WGA)确定心肌细胞的尺寸：在重新水合后，将组织切片在含有WGA和DAPI(1/5000)的溶液中温育45分钟，然后冲洗，然后将其固定在水性介质中。在荧光显微镜(Nikon)上读取载片。使用ImageJ软件分析获取的图像。对每只动物(每组3只动物)的3个切片进行染色，并对在每只动物的左心室中专门拍摄的4个视野(X20)进行定量。细胞的面积通过测量细胞核居中的细胞的尺寸来确定。

免疫组织学

将所述切片解冻，然后在冷却的丙酮中固定10分钟。对于第一抗体是在小鼠以外的物种中产生的抗体的切片来说，使用常规的免疫组织化学程序。它包括几个步骤：

-阻断内源过氧化物酶活性的步骤。将切片在用甲醇稀释的0.6％H

-阻断非特异性染色的步骤，其包括将切片与来自于产生第二抗体的物种的正常血清(5％，在PBS中)在室温温育20分钟。

然后将所述切片在含有第一抗体的溶液中温育，其稀释度和温浴时间在表2中说明。

表2：在免疫组织化学中使用的第一抗体和条件

接下来，将所述切片在第二抗体溶液中温育。所有操作使用生物素化的抗体(表3)。

表3：在免疫组织化学中使用的生物素化的抗体和条件

将所述切片放置成与含有预先形成的亲和素-生物素复合物(Vector)的溶液接触30分钟。过氧化物酶的检测使用DAB(Sigma)来进行。将所述切片用苏木精明矾(Mayer)复染，然后脱水并装片(Entellan)。

对于第一抗体是在小鼠中产生的抗体的切片来说，使用商业化试剂盒(VectorM.O.M.)来中和小鼠IgG，以便降低与在小鼠组织上使用在小鼠中产生的抗体相关的背景噪音。

e)分子生物学分析

将心脏放置在冰上，然后打开以清除在心室腔中形成的血凝块。

组织RNA提取

将得到的研磨过的组织(100mg)置于1mL QIAzol中，然后使用Polytron在冰上匀浆30秒。向匀浆液添加体积为200-μL的氯仿；在剧烈振摇后，将样品以12000g离心15分钟。收集上清液，并通过添加500μL异丙醇将RNA沉淀。通过在4℃以12000g离心10分钟将RNA沉积。将得到的RNA沉积物用75％乙醇清洗，然后转移到200μL无RNase水中。使用分光光度计(NanoDrop)在260nm处测量RNA的量。

反转录

反转录使用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)，从放置到10μL H

将所述混合物在Mastercycler梯度装置中在25℃温育10分钟，然后在37℃温育120分钟。最后，将所述反应在85℃下失活5分钟。将得到的cDNA立即冷冻在-80℃下。

实时聚合酶链反应(qPCR)

PCR使用Power SYBR Green PCR主混合物试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行。为此目的，将10ng cDNA添加到含有250nM靶向感兴趣的基因的右侧和左侧引物(表4)和含有Taq聚合酶、dNTP和SYBR Green的12.5μL缓冲液的混合物中。

表4：使用的PCR引物

扩增在StepOnePlus热循环仪(Thermo Fisher)上进行。样品经历40个循环，每个循环由下述步骤组成：95℃5分钟(变性)，95℃10秒(引物杂交)和60℃30秒(聚合)。在每个循环结束时读取荧光。在确定Ct值后，计算每个所研究的基因的相对表达。

心脏成纤维细胞的维持和刺激

人类心脏成纤维细胞(HCF)(PromoCell)在37℃和受控气氛下的环境中，在成纤维细胞生长培养基3补充包(PromoCell)中生长。所述HCF被生长到第3至第7次传代之间。

为了进行刺激，将所述成纤维细胞以30 000个细胞/cm

然后将这种培养基更换为增补有25、50、75或100ng/mL CD146s或2.5、5或10ng/mLTGF-β的最低培养基，用于增殖研究。

细胞增殖

细胞增殖使用增殖试剂盒(BrdU测定，Roche)来确定。将在稀释溶液中1/100稀释的抗BrdU抗体在37℃温育90分钟。在除去并洗掉过量抗体后，将特异性针对抗BrdU抗体并偶联到过氧化物酶的第二抗体在室温温育30分钟，然后除去。检测通过添100μL酶底物来进行。通过添加50μL 0.1M H

RNA表达

使用纯化试剂盒(RNeasy Mini,Qiagen)提取总mRNA，然后洗脱到30μL无RNase水中。使用分光光度计(NanoDrop)在260nm处测量RNA的量。然后使用200ng RNA并按照与组织RNA相同的方案将所述RNA转变成cDNA。基因表达研究从10ng cDNA通过实时PCR来进行(表4)。

蛋白质表达

将细胞在由10mM Tris-HCl(pH 8)、1mM EDTA、150mMNaCl、10％NP40组成并含有蛋白酶抑制剂混合物(Pierce,Thermo Scientific)的缓冲液中在4℃下裂解。将得到的细胞裂解液在4℃以15000g离心10分钟。收集含有溶解的蛋白质的上清液，并使用牛血清白蛋白(BSA)的校准曲线确定蛋白质的量，所述校准曲线从在样品制备期间使用的裂解缓冲液中稀释的1mg/mL BSA溶液制备。

将所述待测定的样品和标准品(25μL)沉积在96孔板上，并添加200μL BCA试剂(BCA测定试剂盒，Pierce)。在550nm处读取吸光值，并使用校准标准品确定感兴趣的样品的蛋白质浓度。

然后将所述样品用于western印迹实验中。为此目的，将含有30μg蛋白质的等分试样转移到含有还原剂的4X Laemmli缓冲液(Invitrogen)中，在75℃加热10分钟，然后沉积在电泳凝胶(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶，Invitrogen)上。在样品迁移后，将蛋白质干法转移到硝酸纤维素膜(iBlot 2,Invitrogen)。将所述膜用含有0.1％Tween20(TBS-T)和4％BSA的Tris缓冲液阻断45分钟。用在TBS-T中稀释的第一抗体(表5)在4℃下杂交12小时，然后用TBS-T清洗3×10分钟。用HRP偶联的第二抗体(TBS-T)杂交1小时。在清洗后，使用化学发光底物(ECL,Pierce)检测HRP活性。针对其表达不被实验条件所改变的归一化蛋白质(β-微管蛋白)的抗体可以将所述定量归一化，然后半定量地表述结果(对照的％)。使用相机(G:BOX)捕获发出的光。感兴趣的蛋白质以白色背景上的黑色条带被观察到。由此获得的信号通过密度测量法来定量(Image Lab软件4.1版)(表5)。

表5：在western印迹中使用的抗体

免疫荧光

将细胞在70°乙醇中在4℃固定5分钟，然后用PBS清洗。在含有5％BSA的PBS溶液中阻断1小时后，用1/50稀释的第一抗体(抗α-SMA抗体，Dako-0851)，然后用偶联到荧光分子(Alexa Fluor 488)的第二抗体(抗小鼠抗体)温育1.5小时。在每个步骤之间使用PBS进行清洗。将细胞在含有核染色剂的水性介质(含有DAPI的ProLongMountant，Invitrogen)中装片，然后在荧光显微镜下观察。

I.在两种心肌纤维化模型中CD146/CD146s表达的研究

本工作的第一部分的目的是研究心肌纤维化期间CD146/CD146s的表达。为此目的，本发明人依靠由心肌梗塞诱导的心肌纤维化模型和在老年动物中观察到的组成性心肌纤维化模型。

a)由心肌梗塞诱导的心肌纤维化

心肌纤维化的表现

天狼猩红染色(图13B)揭示出纤维化带位于动物左心室的周边。这种胶原蛋白沉积最致密的带(纤维或纤维化带)位于梗死带处，不再含有心肌细胞。在这个纤维化带周围，这种沉积是间质性的，并逐步扩展到MI动物左心室中心肌细胞之间的边缘带或区(“BZ”或“BA”)中。

编码CD146的mRNA的表达

CD146 RNA表达的分析(图13C)从梗死/纤维化带(“IZ”或“FZ”)、紧邻该带的带(“BZ”)、然后是远离/远隔该带的带(“DZ”或“RZ”)中的显微解剖的组织，通过RT-PCR来进行。将得到的结果与使用从假手术组动物的左心室提取的RNA获得的结果进行比较。结果显示，与假手术组个体相比，在MI动物的左心室中CD146表达提高。心脏的每个带的分析显示，在紧邻梗死带的组织带(BZ)中CD146表达具体来说显著提高3倍。

CD146的免疫检测

在假手术组小鼠中，CD146染色是均匀的，并且只位于心肌细胞的周边(图14A和14B)。在MI小鼠中，在纤维化带中CD146表达低，并且仍然与这个带中存在的血管结构相关(图14，“IA”)。相反，在纤维化区(“FA”或“BA”)周围CD146表达非常高(图14，“BA”)。这种在组织尺度上观察到的纤维化周边的染色揭示出存在CD146表达的梯度，其中在边缘带中染色增强，并且在远隔区(“DZ”或“RA”)中显著降低(图14，“IM”)。在高放大倍数下的观察显示，在纤维化带的周边，CD146表达位于心肌细胞的细胞质中(图14，“BA”或“BZ”)，并且它在位于这些心肌细胞周边的细胞中实质性提高。

CD146的血清测定

在假手术组和MI动物(n＝2)中，从通过心脏内穿刺获取的血样进行了CD146的首次血清测定(图14B)。得到的初步结果显示在具有MI诱导的心肌纤维化的动物中可溶性CD146增加。这些初次结果仍有待在新的动物组群上确认。

b)衰老期间的心肌纤维化模型

纤维化的表现

天狼猩红染色(图15，e)显示，与较年轻小鼠(3月龄)相比，源自于较老小鼠(24月龄)的心脏的切片的染色显著增加。动物的衰老伴有血管周和间质胶原蛋白沉积物的增加。

CD146的免疫检测

在衰老相关的心肌纤维化模型(24周龄)中，CD146表达(图15,f)是均匀的，并且相对于12周龄假手术组动物提高。这种CD146提高位于心肌细胞以及位于它们周边处的细胞中。

II.CD146在心肌纤维化发生中的作用

使用在实验室中产生的不表达CD146的动物(CD146-KO)来显示CD146在衰老期间心肌纤维化发生中的作用。

这项研究在一组WT动物(n＝4)上进行，并与2岁雌性CD146-KO动物(n＝4)进行比较。

心肌纤维化

在WT动物中，天狼猩红染色揭示出在心肌细胞之间存在将它们彼此隔离开的胶原蛋白积累(图16A，a)。来自于CD146-KO动物的组织学切片的观察揭示出胶原蛋白沉积低得多，并导致不存在心肌细胞的个体化(图16A，b)。天狼猩红的定量(图16A，c)证实了与WT动物相比，在CD146-KO动物中胶原蛋白沉积减少大约50％。这个结果通过来自于每个实验组的动物心脏的I型胶原蛋白RNA表达的RT-PCR分析得以确认。

心肌细胞尺寸

WGA染色(图16B)能够特异性染色细胞膜，并因此能够确定组织中细胞的尺寸。本发明人的结果显示，位于WT动物的左心室中的心肌细胞大于CD146-KO动物的相应细胞(图16B，a)。这一观察也通过被染色细胞面积的定量得以确认(图16B，b)。因此，在WT小鼠中，心肌细胞面积约为在CD146-KO小鼠中定量的面积的2倍，反映出在这些动物中心肌细胞肥大的显著减少。

III.CD146在获得成肌纤维细胞表型中的作用

MI动物中CD146s的增加和与不存在CD146相关的心肌纤维化的减少的观察，导致本发明人假设CD146s在驻留在成肌纤维细胞(myoFB)的心脏细胞的召集/分化中发挥作用。因此，本发明人测试了CD146s在心脏成纤维细胞分化成myoFB中的作用。

为此目的，他们研究了CD146对与myoFB表型(增殖、α-SMA和纤维化基质蛋白的表达)相关的标志物的表达的影响。所有这些实验均使用TGF-β这种成纤维细胞活化成myoFB的已知诱导物作为对照来进行。

a)CD146s对心脏成纤维细胞(HCF)的细胞增殖的影响

测试了逐渐增加的量的CD146s对心脏成纤维细胞的增殖的影响(图17A)。得到的结果显示出细胞增殖的显著、剂量依赖性的增加。使用50ng/mL CD146s获得了CD146s的最大促增殖效果。这个量被用于后续实验。这种CD146s诱导的增殖提高与在用5ng/mL TGF-β刺激细胞时观察到的提高相当。

b)CD146s对α-SMA表达的影响

检查了对用50ng/mL CD146刺激HCF 48小时做出响应的α-SMA表达的调节。

RNA表达水平的半定量分析显示，CD146s诱导α-SMA的显著的(n＝4)、2.5倍的过表达，这与在用5ng/mL TGF-β刺激这些细胞时观察到的诱导相当(图17B)。这些结果与通过western印迹进行的α-SMA蛋白质表达的分析相关。因此，50ng/mL CD146也诱导α-SMA蛋白质表达水平的2.5倍的提高(图17C)。

使用针对α-SMA的抗体进行的间接免疫荧光显示，这种由50ng/mL CD146诱导的α-SMA表达的提高与平滑肌肌动蛋白网络的建立相关，所述肌动蛋白网络侵入HCF的细胞质，其组织结构与对TGF-β刺激做出响应所观察到的α-SMA网络相当(图17D)。

c)CD146s对基质蛋白表达的影响

编码由myoFB表达的两种基质蛋白的RNA的表达的半定量RT-PCR分析显示，CD146s诱导纤连蛋白和I型胶原蛋白合成的提高(图17E)，与对TGF-β刺激做出响应时观察到的相当。

d)CD146s对TGF-β表达的影响

与成肌纤维细胞表型相关的标志物对HCF被CD146s刺激做出响应的表达提高(图17F)，表明这种效应可能是诱导TGF-β表达的结果。因此，本发明人通过研究TGF-β对CD146表达的影响，开始了一项与参与这种效应的机制相关的研究。第一批结果(n＝2)显示出50ng/mL CD146s诱导CD146表达的2倍提高。

心肌纤维化是对某些形式的心脏病例如心肌梗塞做出响应或在衰老期间自发发生的一种伤口愈合过程。目前，缺乏心肌纤维化的有效治疗方法，使得这一目标成为主要的公共卫生问题。

本发明人研究了CD146/CD146s在心肌纤维化发生中的作用，以便考虑将它用作治疗靶点。他们能够在两种鼠类模型(心肌梗塞和衰老)上体内显示并在人类心脏成纤维细胞(HCF)上体外显示CD146/CD146s确实对心肌纤维化的发生具有影响。

本发明人的结果显示，在MI和老年动物中，心肌纤维化与CD146的过表达相关。在MI动物中，位于心尖处并蔓延到左心室的心肌纤维化伴有不是在梗死带中而是在近端带中的CD146过表达，并具有随着距这个带的距离而降低的表达梯度。这种组织CD146的过表达伴有CD146s分泌的增加。已知CD146s基本上通过膜型CD146的切割机制产生(Bardin等，2003)，这可以解释这两种形式的同时增加。

此外，他们能够在衰老模型中观察到心肌纤维化的发生也与CD146的过表达相关。事实上，所述结果显示在24月龄小鼠中间质胶原蛋白沉积增加，这与整个左心室中CD146表达的均匀增加相关。在在这种模型中使用CD146-KO动物，通过显示出间质胶原蛋白沉积的减少确认了这些结果。此外，在CD146-KO动物中，在假手术组小鼠中可见的心肌细胞肥大显著减少。在所述衰老模型中，他们确认了CD146/CD146s在组成性心肌纤维化出现中的作用。

心肌纤维化是需要时间才能建立的过程。事实上，修复性纤维化以三个相互依存的阶段相继发生：炎性阶段，然后是增殖阶段，最后是成熟阶段。本发明人的结果显示，当用sCD146刺激细胞时，CD146s诱导成肌纤维细胞分化和细胞增殖的增加。此外，这种刺激与在用TGF-β这种成纤维细胞分化为成肌纤维细胞中的已知因子刺激期间获得的刺激相同。此外，CD146s诱导myoFB的特征性标志物α-SMA、纤连蛋白和I型胶原蛋白的表达提高。这些过表达也与用TGF-β刺激后发现的过表达相当。所有这些结果显示，CD146s参与成纤维细胞向myoFB的分化。

发明人的初步结果还显示CD146s能够提高TGF-β表达，这表明了这两种分子之间的关系。对CD146s刺激后TGF-β表达的研究将有可能了解所述分子的潜在机制之一，并确定TGF-β和CD146s是否具有累加或协同效应。

还存在产生成肌纤维细胞的其他过程，尤其是内皮细胞通过EndoMT过程分化成间充质细胞。因此，未来的体外工作将通过分析内皮标记物(PECAM-1、VE-钙粘蛋白等)并与间充质标记物(α-SMA、波形蛋白、纤连蛋白、I型胶原蛋白等)进行比较，来研究CD146s对这个细胞过程的影响。

目前，缺乏控制心肌纤维化的有效疗法。发明人在本文中显示，CD146/CD146s的作用构成了其治疗的靶。本发明人产生了特异性针对CD146的可溶形式的抗体。这些抗体具有阻断作用，即它们能够抑制CD146s的作用。

实施例3–可溶性CD146的不同促血管生成变体通过脱落和可选剪接由内皮细胞分泌：性质和与纤维化的牵连

可溶性CD146构成了参与生理和病理，特别是控制血管生成的主要分子。因此，本发明人调查了：1/在内皮细胞中产生sCD146的长和短CD146同工型的脱落机制；2/sCD146的剪接变体的潜在存在；3/它们的相应功能，特别是在血管生成和纤维化的调控中的功能；和4/它们与系统性硬化的牵连。

方法

内皮集落形成细胞(ECFC)如以前所述在内皮EGM-2MV培养基中培养(Delorme B等，2005)。

HUVEC如以前所述获得并在EGM2培养基中培养(Kaspi等，2017)。

MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)从第13天分离。从CD146 KO或WT小鼠分离胚胎并如以前所述培养(Xu J.,2005)。

实验如以前所述进行(Stalin等，2013)。

球状体形成实验如以前所述进行(Korff T.等，2001)。

实验如以前所述进行(Stalin等，2016)。

萤光素酶测定法如以前所述进行(Kaspi等，2017)。

鸡胚的绒毛-尿囊膜测定法(CAM)使用以前描述的方案来进行(Beckers等，1997)。

如以前所述，通过用非离子型去污剂处理的细胞的蔗糖密度梯度离心来分离脂筏(Tellier等，2006)。

如以前所述，将雄性CD146 KO小鼠(11-16周)用皮下博来霉素处理，并与WT小鼠同窝仔畜进行比较(Kaspi等，2017)。

将小鼠皮肤切片在4％福尔马林中固定并包埋在石蜡中。如以前所述，使用用Merz网格的体视学方法对真皮厚度进行定量(Kaspi等，2017)。

产生被设计用于沉默sCD146的不同同工型的SiRNA。在每个实验中也使用对照siRNA。按照制造商的描述使用Silence magmagnetofection试剂盒(OZ Biosciences)将siRNA引入到内皮细胞中。随着实验而变，沉默导致约80-95％的蛋白质表达。不同siRNA的序列提供在表6中。

表6：

RNA分离、反转录和实时PCR

从细胞分离总细胞RNA，反转录成cDNA，并对得到的cDNA进行qPCR。正向和反向特异性引物序列提供在表7中。

表7：

将膜用特异性第一抗体(7A4 1/3000，肌动蛋白1/5000，Tace和ADAM10 1/1000，I10-sCD146和I5-13-sCD146 1/250)探测、然后用偶联到过氧化物酶的第二抗体探测。印迹使用ECL底物(Pierce)揭示。

CD146的不同同工型的膜表达水平，通过用偶联到荧光染料的抗体或同型匹配的对照抗体(10μg/ml)在4℃下标记细胞1h来确定。在清洗后，通过流式细胞术分析样品(GalliosTM流式细胞仪，Beckman Coulter,Villepinte)。然后使用Kaluza软件(

按照制造商的描述使用Fugen试剂盒(Promega)将编码不同蛋白的质粒引入到CHO细胞中。然后使用遗传霉素和FACS选择稳定的克隆，并进行western印迹或RT-PCR分析以鉴定具有最高表达的克隆。

按照制造商的说明书使用TissueScan人类正常组织qPCR阵列(OriGeneTechnologies,Rockville MD)在48种不同组织中筛选I5-13-sCD146和I10-sCD146表达。

脱落的sCD146使用可商购的ELISA测定法(CY-QUANT sCD146,Biocytex,Marseille)来测定。将板用特异性小鼠单克隆抗人类CD146F(ab’)2片段抗体包被。向每个孔添加10μL血清，并在室温温育30分钟。在温育后，将板清洗5次，然后与在特定稀释剂中1:1000稀释的特异性HRP偶联的单克隆抗体(7A4-HRP，1mg/ml，Biocytex,Marseille,France)在室温温育30分钟，然后清洗5次。与200μL四甲基联苯胺(TMB)底物在室温温育大约20分钟。然后通过添加100μL酸溶液终止比色反应。信号强度与一开始存在于样品中的sCD146的浓度直接相关。为了检测sCD146的两种剪接同工型(I5-13-sCD146和I10-sCD146)，使用了相同的免疫测定法(Biocytex)。方案的修改仅在于第二抗体(检测抗体)，将其用偶联到HRP的抗I5-13-sCD146或抗I10-sCD146抗体代替。

将ECFC在用或不用siRNA转染后以每孔60,000个细胞的密度接种在24孔双腔室系统(Multiwell Insert System,BD Biosciences,Le Pont de Claix,France)上的膜插件(孔隙度为1μm)上。然后将合生的内皮细胞单层在存在或不存在不同形式的sCD146的情况下在EGM-2培养基中温育24h。在细胞的顶表面处添加FITC-葡聚糖(sigma)，并允许其在37℃下迁移1.5h。然后使用Cytofluor Series 4000荧光测定仪(PerSeptiveBiosystems,Framingham,MA)测量基底侧的FITC-葡聚糖。

在接种在盖玻片上的细胞中检查CD146的不同同工型和ADAM10/Tace的定位。将细胞用多聚甲醛在室温固定10分钟，然后用皂苷(0.2％)通透化，然后与抗CD146抗体(1/100)和抗Tace(1/200)或抗ADAM10(1/100)抗体在室温温育30分钟。然后将细胞与结合到荧光探针的第二抗体温育。在某些实验中，将细胞核用DAPI染色。然后通过共聚焦显微术(Zeiss510)检查细胞。

在来自于缺血小鼠的肌肉切片中，使用同工凝集素B4(Lifetechnologies)(1/100)可视化血管分布。通过荧光显微术(Leica sp5,Leica,Nanterre,France)检查组织切片。

通过手术取出鸡胚的绒毛-尿囊膜(CAM)，并在10％缓冲甲醛中固定10小时，在逐级乙醇中脱水，在二甲苯中清理，并包埋在石蜡中。在与CAM的表面平行的平面上切出5μm厚的切片，并用苏木精-曙红染色，将其在光学显微镜下观察。

通过完全切除整个左股动脉使雌性小鼠发生单侧后肢缺血。手术后，将动物分为四个治疗组：一个对照组，每周两次在缺血的内收肌中注射PBS共28天；三个实验组，用2μg三种不同的重组人类可溶性CD146(rh-sCD146、rh-I5-13-sCD146、rh-I10-sCD146)如对照组那样治疗。

使用激光多普勒血流分析仪测量缺血后肢相对于正常后肢血流的比率。在手术后不同时间点(第1、3、7、14、21和28天)，在感兴趣的区域(腿和足)上对动物进行3次连续的激光扫描。血流被表示为缺血后肢相对于正常后肢的比率。

将动物用氯胺酮-甲苯噻嗪木糖胺(分别为100mg/kg和10mg/kg)的混合物深度麻醉，并心脏内灌注2ml碘油。使用具有下述特点的microPET/microCT啮齿动物模型扫描仪(

对来自于在Marseille(France)内科部住院的24名SSc患者的血清进行分析。所有患者均符合2013年ACR/EULAR硬化症分类标准，然后根据LeRoy等人的标准进行亚分类。作为对照，本发明人研究了24名年龄和性别相匹配的献血者的血清。所有样品均来自于符合道德准则的公开声明的Biobank(DC 2012-1704)，并在使用前储存在-80℃下。

动物实验符合欧洲议会的指令2010/63/EU，并由学术动物护理和使用委员会(Aix-Marseille大学)批准。上文描述的程序在机构批准的动物使用方案(Marseille伦理委员会)和授权研究人员的监督(B.Guillet；n°13328)下进行。

对人类样品的实验是对来自于系统性硬化患者的血浆的回顾性研究。它们根据1983年修订的1975年赫尔辛基宣言(Helsinki declaration)进行，经相关机构审查委员会批准，并获得了患者的知情同意。B.Granel和N.Bardin对数据进行了分析，并且所有作者均可访问原始临床数据。

对应于脱落的sCD146的重组人类可溶形式的CD146(rh-sCD146)从Biocytex获得。rh-I5-13-sCD146和rh-I10-sCD146得自于带有HA肽标签的蛋白质在柱上的纯化(试验试剂盒3320A，MBL)。

编码Tace的质粒来自于Dr F.Peiretti,UMR-S1062,Marseille,France。

编码ADAM10的质粒是来自于Dr B.Charreau,UMR-S1064,Nantes,France的善意馈赠。

针对I5-13-sCD146和I10-sCD146的多克隆抗体由Covalab公司通过注射对应于所述两种蛋白质的特定部分的肽[分别为NH2-C-YLDGPLPTPVDNPR-CONH2(SEQ ID NO：101)和NH2-C-RDQVTPSGVVFKLFDKKP-CONH2(SEQ ID NO：102)]来产生。针对ADAM-17(ab2051)、ADAM-10(EPR5622)、CD146(克隆7A4)和肌动蛋白的抗体分别从Abcam、Millipore、Biocytex和Cell signaling购买。

GM6001来自于Selleck chemicals。

数据表示为所示实验次数的平均值±SEM。统计分析使用Prism软件(GraphPadSoftware Inc.,San Diego,CA)来进行。显著差异使用非参数Mann Whitney检验来确定。P值<0.05被认为是显著的。

结果

在内皮细胞中，可溶性CD146(sCD146)的分泌对不同刺激物如TNF、VEGF、纺锤蛋白、TGFb、Wnt5a做出响应而增加(图21A)。由于TNF产生更高的影响，因此本发明人在对照条件下和用TNF处理后分析了sCD146分泌。实验在不存在或存在泛基质金属蛋白酶抑制剂GM6001的情况下进行，以便估算脱落和剪接的形式的相对贡献。结果显示sCD146的GM6001依赖性部分对应于总分泌的75％左右。因此总分泌的25％对应于GM6001抗性分泌(图21B)。

本发明人在弗林蛋白酶转化酶抑制剂(IF)存在下进行了相同类型的实验。他们观察到在对照和TNF两种条件下IF均抑制sCD146分泌。有趣的是，在两种条件下，对IF有抗性的分泌的分数相近(图21C)。

最后，他们使用不同的TIMP来抑制sCD146分泌(图21D)。结果显示TIMP-1(1μg/ml)能够在两种条件下减少sCD146分泌，而TIMP-3(1μg/ml)只能在细胞用TNF处理时较少sCD146分泌，TIMP-2(1μg/ml)没有观察到效果。

合在一起，这些实验显示：1/从短和长CD146产生sCD146涉及两种不同的脱落机制；并且2/残留的对GM6001有抗性的sCD146分泌的分数(约25％)可能依赖于另一种机制，例如通过原始转录本的可选剪接产生sCD146变体。

本发明人在对照条件下分析了在内皮细胞中长(lgCD146 siRNA)和短(shCD146siRNA)CD146 siRNA对sCD146分泌的影响。他们观察到(图22A)尽管lgCD146 siRNA将sCD146分泌降低75％左右，但shCD146 siRNA没有作用。这表明在对照条件下，只有长CD146同工型通过脱落过程参与sCD146分泌。有鉴于在对照条件下TIMP对sCD146分泌的抑制效应(TIMP-1的效应)，他们测试了靶向ADAM10、MT1-MMP和MMP-2的siRNA的效应。作为对照，还测试了靶向Tace的siRNA的效应。结果(图22B)显示，只有ADAM10 siRNA能够抑制sCD146分泌，并且所述效应与GM6001的效应相似。

为了确认这个结果，本发明人进行了免疫共沉淀实验，并且显示在对照条件下lgCD146与ADAM10免疫共沉淀，而shCD146和ADAM10不会(图22C)。通过免疫荧光，本发明人显示lgCD146与ADAM10共定位，在合生的ECFC中两者均在内皮细胞连接处和核周区域中。在未合生细胞中，它们也在细胞内区室中共定位。在合生细胞中lgCD146和ADAM10在细胞连接处的共定位，在另一种内皮细胞类型HUVEC中得以确认。相反，在合生细胞中，shCD146不与ADAM10共定位。

为了评估长和短形式的CD146是否可以相互补充，本发明人用siRNA沉默了lgCD146并观察对另一种形式的影响。沉默lgCD146不改变shCD146 mRNA表达。这与两种同工型在内皮细胞中的不同定位相一致。本发明人还分析了ADAM10沉默或过表达对两种CD146同工型的mRNA表达的影响。ADAM10沉默或过表达既不改变长的也不改变短的CD146mRNA表达。

由于lgCD146基本上在连接处表达，因此本发明人测试了ADAM10沉默和过表达对细胞通透性的影响，正如通过葡聚糖通透性所确定的(图22E和F)。结果显示，用ADAM10siRNA处理ECFC或用ADAM10质粒转染所述细胞分别降低和提高了它们对葡聚糖的通透性，而用Tace siRNA处理或用Tace质粒转染不改变它。为了估算不依赖于CD146切割的ADAM10的潜在贡献，本发明人进行了通透性实验，在其中他们比较了在存在或不存在长CD146siRNA的情况下内皮细胞中ADAM10过表达的影响。结果显示ADAM10过表达和长CD146 siRNA转染显著提高内皮通透性。当将细胞用长CD146 siRNA转染并且ADAM10过表达时，对通透性的影响与在单独的长CD146 siRNA存在下观察到的影响没有显著不同。这表明在这些细胞中ADAM10基本上作用于长CD146以控制通透性。

为了确认这些结果，本发明人通过转染含有lgCD146同工型的质粒，在CHO细胞(其不表达CD146)中表达了这种同工型。选择出表达大量的lgCD146A的稳定克隆。将这个克隆用编码ADAM10的质粒瞬时转染，并观察对sCD146分泌的影响。结果显示，在ADAM10存在下sCD146分泌显著增加。最后，观察了ADAM10转染对用或未用lgCD146稳定转染的CHO(分别为CHO-lgCD146和CHO-C)的通透性的影响。结果显示，在ADAM10存在下CHO-lgCD146的通透性显著提高，而ADAM10对CHO-C没有影响。

合在一起，这些实验显示在内皮细胞中，在连接处表达的长CD146通过ADAM10脱落以产生sCD146。

本发明人通过与对照条件进行比较，分析了在TNF 20ng/ml处理24h后长(lgCD146siRNA)和短(shCD146 siRNA)CD146 siRNA对sCD146分泌的影响。他们确认了(图23A)在对照条件下只有lgCD146 siRNA减少sCD146分泌，并且观察到在TNF下，lgCD146和shCD146siRNA将sCD146分泌分别减少约60％和25％。因此，他们使用不同的siRNA来鉴定参与shCD146脱落的蛋白酶。有鉴于在TNF下TIMP对sCD146分泌的影响(被TIMP-1和TIMP-3抑制)，他们测试了靶向ADAM10、MT1-MMP和Tace的siRNA的影响。结果(图23B)显示，ADAM10siRNA和Tace siRNA两者能够抑制sCD146分泌，并且在同时添加时具有累加效应。有趣的是，ADAM10和Tace siRNA将sCD146分泌分别减少60％和25％，与使用lgCD146和shCD146siRNA所观察到的相同。这个结果表明尽管lgCD146通过ADAM10脱落，而shCD146可能通过Tace脱落。

为了证实这种假设，本发明人进行了免疫共沉淀实验，并显示在TNF下，shCD146与Tace共沉淀，而lgCD146与ADAM10共沉淀。通过免疫荧光，他们显示在TNF下，在ECFC细胞中shCD146与Tace共定位。在合生细胞中，shCD146在膜处和核中与Tace共定位，而在非合生细胞中，它们基本上在迁移的细胞的核周围和膜皱褶处共定位。相反，在合生细胞中lgCD146不与Tace共定位。正如对长CD146同工型所显示的，沉默shCD146不改变lgCD146 mRNA，表明两种同工型不相互补充。本发明人还分析了Tace沉默对两种CD146同工型的mRNA表达的影响。Tace沉默既不改变长的也不改变短的CD146的mRNA表达。

由于shCD146最近被描述为存在于内皮细胞的脂筏中，并且由于Tace也被描述为在这种细胞级分中，因此本发明人分析了在对照条件和TNF下ECFC的脂筏级分。在这些实验中，向细胞添加10μM的GM6001以便避免所述分子的脱落。结果显示，在对照条件下在脂筏中没有观察到shCD146。相反，在TNF下，shCD146和Tace两者均存在于这种细胞级分中。

为了确认这些结果，本发明人通过转染含有shCD146同工型的质粒，在CHO细胞中表达了这种形式。选择出表达大量shCD146的稳定克隆。将这个克隆用编码Tace的质粒瞬时转染，并观察对sCD146分泌的影响。结果显示，在Tace存在下sCD146分泌显著增加。

合在一起，这些实验显示在内皮细胞中，短CD146在炎性条件(TNF)下通过Tace脱落，以产生sCD146。

由于本发明人观察到一部分sCD146分泌是GM6001不敏感的并因此不依赖于膜型CD146的脱落(参见图21)，因此他们假设这个部分可能是由于通过原始转录本的可选剪接产生的另外形式的sCD146的生成而造成的。为了试验这种假设，他们对ECFC细胞进行了RNA测序。结果显示存在至少两种另外的sCD146同工型。这些同工型中的一种含有所述分子的内含子10(I10-sCD146同工型)。另一种含有所述分子的内含子5和13两者(I5-13-sCD146同工型)。图24A给出了这两种同工型与脱落形式比较的示意图，并且SEQ ID NO：8/19和SEQID NO：9/20提供了这些同工型的序列(分别为I5-13和I10)。

本发明人在ECFC和其他内皮细胞HUVEC中验证了I10-sCD146和I5-13-sCD146转录本的表达。结果显示，两种转录本均存在于ECFC和HUVEC中(图24B)，并且它们被表达成蛋白质，正如在ECFC上通过免疫荧光和在ECFC上清液中通过western印迹所证实的。本发明人试验了影响膜型CD146脱落的不同刺激物(参见图21A)对所述两种剪接变体的mRNA表达的影响。有趣的是，它们被差异调节。事实上，I5-13-sCD146在mRNA水平上被TNF和Wnt5a上调，并且不被CD146的脱落形式、VEGF、TGFb、纺锤蛋白和Wnt3a改变。相反，I10-sCD146在mRNA水平上不被这些不同因子上调。I10-sCD146变体的mRNA水平甚至被VEGF、纺锤蛋白和Wnt3a下调(图24C)。

为了评估这些新的剪接变体与其他CD146同工型的表达之间的相互作用，本发明人进行了siRNA实验。结果显示，长CD146 siRNA和短CD146 siRNA均不在mRNA水平上影响I10-sCD146或I5-13-sCD146的表达。同样地，针对I10-sCD146或I5-13-sCD146的siRNA不改变短或长CD146 mRNA表达。最后，用重组I10-sCD146或I5-13-sCD146蛋白处理内皮细胞不在mRNA水平上改变短CD146、长CD146、I5-13-sCD146和I10-sCD146的表达。这些数据支持所述不同同工型不相互补充这一事实。

合在一起，这些实验显示，除了膜CD146同工型的脱落之外，sCD146也作为原始转录本的两种新的剪接变体产生。

由于ECFC构成了用于离体血管生成研究的有用模型，因此本发明人评估了两种剪接sCD146同工型(I10-sCD146和I5-13-sCD146)对ECFC增殖的影响。实验在GM6001存在下进行，以便防止膜CD146脱落并因此只观察这些新的同工型的效应。结果显示，靶向I10-sCD146和I5-13-sCD146两者的siRNA均抑制ECFC的增殖(图25A)。两种siRNA的效率得到验证。也将编码两种同工型的质粒转染到ECFC中，以检查它们对增殖的影响。结果(图25B)显示两种质粒均显著提高增殖。在产生重组蛋白后，也估算了这两种sCD146同工型的血管生成潜力。重组I10-sCD146和I5-13-sCD146蛋白(分别为rh-I10-sCD146和rh-I5-13-sCD146)被产生并表征。测试了它们对ECFC增殖的影响并与重组的脱落sCD146形式(rh-sCD146)的影响进行比较(图25C)。

结果显示，rh-I10-sCD146、rh-I5-13-sCD146和rh-sCD146提高内皮细胞增殖，尽管rh-I5-13-sCD146的效应显得幅度更低。它们还在绒毛-尿囊膜测定法中提高血管化(图25D)。本发明人使用所述三种重组蛋白进行了3D毛细血管样形成实验(球状体实验)。结果显示所述三种重组蛋白提高产生假毛细血管的能力，正如通过芽数量和累计芽长所测量的(图25E)。在这里，同样地，与脱落的sCD146或I10-sCD146相比I5-13-sCD146的效应显得幅度更低。不同形式的sCD146的促血管生成性质促使本发明人调查它们在后肢缺血小鼠模型中的血管生成效应。将缺血小鼠每周两次用2μg的rhsCD146、rh-I10-sCD146、rh-I5-13-sCD146和VEGF局部治疗28天，并通过激光多普勒估算血流。结果显示，与用PBS治疗的动物相比所述三种形式能够提高血流，并且使用不同形式的sCD146观察到的效应甚至高于使用VEGF所观察到的(图26A)。有趣的是，I10-sCD146的效应似乎比其他分子更快，因为快至第一次注射后3天即观察到显著效应。用同工凝集素B4对肌肉的标记显示，与用PBS处理的对照动物相比，在用rh-I10-sCD146、rh-I5-13-sCD146、rh-sCD146和VEGF处理的动物中血管化增加(图26B)。最后，血管造影术照片也显示与用PBS处理的腿相比，在用rh-I10-sCD146、rh-I5-13-sCD146和rhsCD146处理的腿中血管数目增加(图26C)。定量结果显示，当用rh-sCD146、rh-I10-sCD146、rh-I5-13-sCD146和VEGF处理时，小腿、大腿和整个腿中血管密度显著提高。在所有实验中，与I5-13-sCD146相比，I10-sCD146和脱落的sCD146呈现出更高的效应。最后，由于他们已显示长CD146同工型通过ADAM10的脱落与跨内皮通透性提高相关(参见图22)，因此本发明人分析了新的剪接变体I10-sCD146和I5-13-sCD146是否可以改变这种通透性。结果显示，对应于这些变体的siRNA转染和重组蛋白处理均不改变跨内皮通透性。

合在一起，这些结果显示所述脱落形式的sCD146和剪接变体两者均表现出与VEGF相似的促血管生成效应。与I5-13-sCD146相比，I10-sCD146和脱落的sCD146似乎表现出更高的促血管生成效应。

本发明人使用组织阵列分析了新鉴定的sCD146变体的mRNA水平。结果提供在图28中。尽管许多器官不表达I5-13-sCD146或I10sCD146，然而肺、淋巴结或直肠高表达所述sCD146的两种同工型。有趣的是，外周血单核细胞表达高水平的I5-13-sCD146，但不表达I10-sCD146。由于I5-13-sCD146和I10-sCD146在肺中高表达并且被TNF和Wnt5a/3a差异调节，因此本发明人决定聚焦于这些同工型在系统性硬化(SSc)中的表达。因此，本发明人确定了SSc患者的血清中脱落的sCD146、I5-13-sCD146和I10-sCD146的浓度，并与对照患者进行比较(图27A)。结果显示，在SSc患者中脱落的sCD146和I5-13-sCD146显著增加，而I10-sCD146则减少。有趣的是，本发明人观察到与没有肺疾病的患者相比，在肺纤维化患者的血清中I5-13-sCD146浓度明显更高(插图)。

由于本发明人最近报道了参与SSc纤维发生的经典Wnt途径受sCD146调节(Kaspi等，2017)，因此本发明人分析了不同的可溶性形式对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中b-连环蛋白/TCF转录活性模型的影响。本发明人首先显示(图27B，左侧部分)来自于CD146 KO小鼠的MEF比来自于WT小鼠的MEF对博来霉素更加敏感。因此，他们使用来自于CD146 KO小鼠的MEF来分析脱落的sCD146、I10-sCD146和I5-13-sCD146的效应。结果(图27B，右侧部分)显示sCD146和I10-sCD146降低b-连环蛋白/TCF转录活性，而I5-13-sCD146提高它。

为了进一步研究所述机制，本发明人使用了由博来霉素诱导的系统性硬化的动物模型(Kaspi等，2017)。向用博来霉素处理的动物皮下注射脱落的sCD146、I5-13-sCD146或I10-sCD146。然后分析真皮厚度、皮肤外观和血管密度。结果显示，博来霉素处理导致真皮厚度增加。用sCD146或I10-sCD146处理将这种真皮厚度减少到在对照动物中观察到的值。相反，I5-13-sCD146没有显著影响(图27C)。有趣的是，在用博来霉素处理的动物中，在宏观水平上观察到皮肤的血管化降低(图27D)。也在宏观水平上观察到，使用脱落的sCD146和I10-sCD146的处理导致血管化提高，而使用I5-13-sCD146的处理则没有。在用同工凝集素b4标记后，这些结果得以确认。在博来霉素处理的动物中血管密度降低，并且这种效应被sCD146和I10-sCD146显著逆转。相反，I5-13-sCD146没有影响(图27E)。

合在一起，这些结果显示，I5-13-sCD146是促纤维化的，并且在患有肺纤维化的SSc患者的血清中大大增加。相反，I10-sCD146和脱落的sCD146是抗纤维化的，并且能够在SSc的动物模型中减少纤维化。

讨论

在本研究中，本发明人证实了内皮细胞分泌sCD146的多种同工型，并确定了它们的产生机制。他们首次鉴定了参与两种膜CD146同工型的脱落的蛋白酶，并报道了通过原始转录本的可选剪接产生并编码另外的sCD146蛋白的两种补充同工型的存在。这些同工型表现出与血管生成和纤维化的调控相关的不同性质。一种分子可以作为不同形式存在这一事实突出了它在生理和/或病理中的重要性。有趣的是，已为许多蛋白质、特别是另一种高度促血管生成的分子VEGF鉴定到不同的剪接变体。因此，可溶性CD146可能也组成了具有大量剪接变体的蛋白质的一个大家族。

关于脱落形式的CD146，本发明人证实了它根据膜CD146同工型由两种不同的ADAM产生。事实上，长形式由ADAM10脱落，而短形式由Tace脱落。有趣的是，本发明人最近显示，CD146的短同工型表现出完全的蛋白水解加工以脱落细胞外部分，然后通过早老蛋白-1脱落细胞内部分，产生细胞内结构域(shCD146-ICD)。相反，长同工型仅表现出细胞外脱落(Stalin等，2016)。本发明人显示，短CD146同工型因此可以通过shCD146-ICD易位到核中而表现出直接的转录效应。在本研究中，他们显示参与shCD146脱落的ADAM是Tace。有趣的是，Tace和早老蛋白-1通常结合以产生蛋白质的顺序脱落。因此，notch也通过这两种分子进行加工，导致具有转录效应的NICD的产生(Gudey等，2014)。

除了脱落形式的CD146之外，本发明人的研究显示，内皮细胞能够分泌至少两种其他形式的sCD146。这两种同工型由可选剪接产生。他们对于这两种新的同工型证实的第一种性质是它们的促血管生成能力，正如已经对于脱落形式所描述的(Harhouri K.等，2010)。有趣的是，I10-sCD146和脱落的sCD146表现出比I5-13-sCD146更高的血管生成能力，并且I10-sCD146表现出更快的效应，因为它的血管生成效应在所述分子注射到缺血动物中之后快至3天即可被观察到。已显示不同的血管生成因子作为具有各种不同血管生成能力的不同同工型存在。因此，主要血管生成分子VEGF表现出许多不同的同工型(Guyot M.等，2015)。这些同工型表现出可以在不同细胞中表达并影响血管生成/淋巴血管生成的不同受体(Jussila L.等，2002)。有趣的是，不同同工型也可结合相同受体，并诱导不同的信号转导和运输，引发多种多样的细胞结果(Fearnley GW等，2016)。对于VEGF来说，已鉴定到至少四种不同受体，即VEGFR1/2/3和神经纤毛蛋白-1。这些受体参与血管生成，但是也参与淋巴血管生成。为了确定不同sCD146变体是否结合不同受体以及它们是否也参与淋巴血管生成，进一步的研究将是必需的。最近，VEGF的促血管生成和抗血管生成同工型两者已被描述。这是非常有趣的，因为在肿瘤中两种类型的分子均被表达。然而，它们两者均被抗VEGF分子如贝伐单抗抑制，降低了所述疗法的效果(Biselli-Chicote PM等，2012)。本发明人最近显示，在透明细胞肾细胞癌中，可溶性CD146构成了舒尼替尼效能的预测性标志物，并且对舒尼替尼的抗性的机制之一可能依赖于所述分子的大量增加(Dufies M.等，2018)。由于在本研究中描述的另外的剪接变体也是促血管生成的，因此分析它们在这种现象中的牵连将是有趣的。有趣的是，本发明人已显示，sCD146的所述两种另外的同工型也参与纤维化的控制，特别是在系统性硬化(SSc)中。SSc的特征在于巨大的纤维化和失调的血管生成。已报道了许多因子的异常(Hummers LK等，2009)。在本研究中，本发明人显示I5-13-sCD146剪接变体被Wnt5a和TNF增加，并且在SSc患者的血清中所述蛋白质显著增加，而I10-sCD146被Wnt3A和VEGF减少，并且在SSc中减少。在患者血清中观察到的所述两种同工型的调控与在SSc患者中描述的TNF、Wnt3a和VEGF的提高相一致。这个结果是重要的，因为它确认了CD146/sCD146参与SSc，并且显示出在这种病症中sCD146的不同的促血管生成形式受到调节。使用在小鼠中通过博来霉素诱导的SSc的体内模型，本发明人显示脱落的sCD146和I10-sCD146能够降低SSc，正如通过真皮厚度所确定的，而I5-13-sCD146则不能。有趣的是，脱落的sCD146和I10-sCD146能够提高这些动物的真皮中的血管密度，而I5-13-sCD146则不能。因此，尽管所有形式都是促血管生成的，但只有sCD146和I10-sCD146能够在这种模型中刺激新血管的产生。这表明不同形式的sCD146可能参与不同途径，并且它们的效应可能根据病理状况而被平衡。通过这种方式，脱落的sCD146和I10-sCD146也能在MEF的体外模型中降低b-连环蛋白/TCF转录活性，表明通过Wnt经典途径的下调潜在地减少皮肤纤维化。相反，I5-13-sCD146提高它。这些结果明显支持下述事实，即与sCD146和I10-sCD146相比，I5-13-sCD146可能通过不同的受体起作用并触发不同的信号传导途径。

合在一起，这些数据显示I10-sCD146和I5-13-sCD146在SSc中构成了新的生物标志物。具体来说，与没有肺纤维化的患者相比在具有肺纤维化的SSc患者中I5-13-sCD146显著增加这一事实，表明它可能构成了所述疾病的严重程度的标志物。此外，与I5-13-sCD146相反，脱落的sCD146和I10-sCD146通过提高血管化和减少纤维化在SSc中表现出治疗效果。

总而言之，本研究鉴定到参与CD146的两种膜同工型的脱落的两种蛋白酶，并鉴定到通过可选剪接产生的sCD146的另外两种同工型。所有这些变体均表现出促血管生成性质，并且似乎组成了促血管生成分子的一个新的家族，正如对于VEGF所述。相反，它们在系统性硬化患者的血清中被差异调控，并表现出差异的纤维化性质。

实施例4–在小鼠中由腺嘌呤饮食诱导的肾间质纤维化模型中用特异性抗体阻断sCD146对纤维化发生的影响

本发明人使用腺嘌呤饮食诱导了与间质纤维化相关的慢性肾病。这诱导了结晶性肾病，其发展成肾小管间质纤维化。C57BL/6小鼠为8周龄，并用掺有0.25％腺嘌呤的饮食喂养12天(A04 Ade 0.25％，安全)。对照小鼠喂食正常饮食(A04，安全)。在12天后停止所述饮食，并立即或在所述饮食结束后1、2或3周使用所述动物。

结果显示，在腺嘌呤饮食结束后2周，动物表现出间质性肾纤维化，而在对照动物中没有纤维化(图33A)。这种纤维化伴有TGFb、胶原蛋白1a和aSMA的增加，正如在mRNA水平上观察到的(图33B)。aSMA蛋白也显著增加(图33C)。最后，他们观察到CD146的mRNA表达的渐进性提高，其在腺嘌呤饮食结束后2和3周显著(图33D)。

为了预防纤维化的发生，本发明人从腺嘌呤饮食开始时直至所述饮食结束后2周进行的处死为止，每周两次用10μg抗sCD146抗体IV治疗所述动物。结果显示，在处死时，对照动物和用对照IgG治疗的动物两者均发生高度纤维化。有趣的是，用抗sCD146抗体治疗的动物显示出显著减少的间质纤维化(图34A和34B)。

参考文献

-Alais,S.,Allioli,N.,Pujades,C.,Duband,J.L.,Vainio,O.,Imhof,B.A.,Dunon,D.，HEMCAM/CD146下调β1整合蛋白的细胞表面表达(HEMCAM/CD146 downregulatescell surface expression of beta1integrins)，Journal of cell science114:1847-1859(2001)

-Anfosso,F.,Bardin,N.,Vivier,E.,Sabatier,F.,Sampol,J.,Dignat-George,F.，人类内皮细胞中与CD146接合相关的由外而内的信号传导途径(Outside-in signalingpathway linked to CD146 engagement in human endothelial cells)，J BiolChem276:1564-1569(2001)

Solovey,A.N.,Gui,L.,Chang,L.,Enenstein,J.,Browne,P.V,Hebbel,R.P.，内皮P1H12的鉴定和功能评估(Identification and functional assessment of endothelialP1H12)，J Lab Clin Med.138:322-31(2001)

-Arima等，在鼠类巨噬细胞样细胞中通过硫代磷酸酯反义寡核苷酸特异性抑制白介素-10的产生(Specific inhibition of lnterleukin-10Production in MurineMacrophage-Like Cells by Phosphorothioate Antisense Oligonucleotides)，Antisense Nucl.Acid Drug Dev.8:319-327(1998)

-Bardin,N.,Anfosso,F.,Masse,J.M.,Cramer,E.,Sabatier,F.,Le Bivic,A.,Sampol,J.,Dignat-George,F.，作为参与细胞-细胞内聚控制的内皮连接组分的CD146的鉴定(Identification of CD146 as a component of the endothelial junctioninvolved in the control of cell-cell cohesion)，Blood 98:3677-3684(2001)

-Bardin,N.,Blot-Chabaud,M.,Despoix,N.,Kebir,A.,Harhouri,K.,Arsanto,J.P.,Espinosa,L.,Perrin,P.,Robert,S.,Vely,F.,Sabatier,F.,Le Bivic,A.,Kaplanski,G.,Sampol,J.,Dignat-George,F.，CD146及其可溶性形式调控单核细胞跨内皮迁移(CD146 and its soluble form regulate monocyte transendothelialmigration)，Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology 29:746-753(2009)

-Bardin,N.,Moal,V.,Anfosso,F.,Daniel,L.,Brunet,P.,Sampol,J.,Dignat-George,F.，一种新的内皮标志物可溶性CD146在与内皮连接改变相关的生理病理背景中增加(Soluble CD146,a novel endothelial marker,is increased inphysiopathological settings linked to endothelial junctional alteration)，Thromb Haemost.90:915-920(2003)

-Bardin,N.,Reumaux,D.,Geboes,K.,Colombel,J.F.,Blot-Chabaud,M.,Sampol,J.,Duthilleul,P.,Dignat-George,F.，在活跃的炎性肠病中一种内皮连接的新的标志物CD146的表达提高(Increased expression of CD146,a new marker of the endothelialjunction in active inflammatory bowel disease)，Inflammatory bowel diseases12:16-21(2006)

-Beckers M,Gladis-Villanueva M,Hamann W,Schmutzler W,Zwadlo-Klarwasser G.，鸡胚绒毛-尿囊膜在抗炎活性测试中的使用(The use of the chorio-allantoic membrane of the chick embryo as test for anti-inflammatoryactivity)，Inflamm Res Off J Eur Histamine Res Soc Al.1997；46:29–30.

-Biernacka,A.,and Frangogiannis,N.G.(2011)，衰老和心肌纤维化(Aging andCardiac Fibrosis)，Aging Dis.2,158–173.

-Boneberg,E.M.,Illges,H.,Legler,D.F.,Furstenberger,G.，可溶性CD146在钙诱导的基质金属蛋白酶依赖性过程中通过膜CD146的胞外域脱落产生(Soluble CD146 isgenerated by ectodomain shedding of membrane CD146 in a calcium-induced,matrix metalloprotease-dependent process)，Microvascular research78:325-331(2009)

-Chadban,S.J.,Atkins,R.C.，肾小球肾炎(Glomerulonephritis)，Lancet.365:1797-1806(2005)

-Chan,B.,Sinha,S.,Cho,D.,Ramchandran,R.,Sukhatme,V.P.，CD146在斑马鱼血管发育中的关键作用(Critical roles of CD146 in zebrafish vasculardevelopment)，Dev Dyn232:232-244(2005)

-Chaturvedi,R.R.,Herron,T.,Simmons,R.,Shore,D.,Kumar,P.,Sethia,B.,Chua,F.,Vassiliadis,E.和Kentish,J.C.(2010)，由于先天性心脏病的心肌被动僵硬及其对舒张的影响(Passive Stiffness of Myocardium From Congenital Heart Diseaseand Implications for Diastole)，Circulation 121,979–988.

-Chen,W.和Frangogiannis,N.G.(2010)，炎性和纤维生成途径在衰老相关的心力衰竭中的作用(The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heartfailure associated with aging)，Heart Fail.Rev.15,415–422.

-Cohen,C.D.,Lindenmeyer,M.T.,Eichinger,F.等，通过基于单探针的微阵列数据分析改进对与糖尿病性肾病相关的生物学过程的阐明(Improved elucidation ofbiological processes linked to diabetic nephropathy by single probe-basedmicroarray data analysis)，PLoS One3:e2937(2008)

-Daniel,L.,Bardin,N.,Moal,V.,Dignat-George,F.,Berland,Y.,Figarella-Branger,D.，肾病中肾小管的CD146表达与慢性肾衰竭相关(Tubular CD146 expressionin nephropathies is related to chronic renal failure)，Nephron Exp Nephrol99:e105-111(2005)

-Delorme B,Basire A,Gentile C,Sabatier F,Monsonis F,Desouches C,Blot-Chabaud M,Uzan G,Sampol J,Dignat-George F，在人类CD146+血细胞中存在不同于成熟内皮细胞的内皮祖细胞(Presence of endothelial progenitor cells,distinct frommature endothelial cells,within human CD146+blood cells)，ThrombHaemost.2005；94:1270–1279.

-Despoix N,Walzer T,Jouve N,Blot-Chabaud M,Bardin N,Paul P,Lyonnet L,Vivier E,Dignat-George F,Vély F，小鼠CD146/MCAM是自然杀伤细胞成熟的标志物(Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation)，Eur JImmunol.2008；38:2855-64

-Djudjaj,S.,Chatziantoniou,C.,Raffetseder,U.,Guerrot,D.,Dussaule,J.C.,Boor,P.,Kerroch,M.,Hanssen,L.,Brandt,S.,Dittrich,A.,Ostendorf,T.,Floege,J.,Zhu,C.,Lindenmeyer,M.,Cohen,C.D.,Mertens,P.R，Notch-3受体活化驱动肾小管间质性肾损伤后的炎症和纤维化(Notch-3receptor activation drives inflammation andfibrosis following tubulointerstitial kidney injury)，J Pathol.228:286-299(2012)

-Duan,H.,Xing,S.,Luo,Y.,Feng,L.,Gramaglia,I.,Zhang,Y.,Lu,D.,Zeng,Q.,Fan,K.,Feng,J.,Yang,D.,Qin,Z.,Couraud,P.O.,Romero,I.A.,Weksler,B.,Yan,X，靶向内皮CD146通过限制淋巴细胞向CNS的外渗减弱神经炎症(Targeting endothelial CD146attenuates neuroinflammation by limiting lymphocyte extravasation to theCNS)，Sci Rep.3:1687(2013)

-El Machhour F,Keuylian Z,Kavvadas P,Dussaule JC,Chatziantoniou C.，肾小球中Notch3的活化促进快速进行性肾病的发生(Activation of Notch3 in GlomeruliPromotes the Development of Rapidly Progressive Renal Disease)，J AmSocNephrol.2015Jul；26(7):1561-75.doi:10.1681/ASN.2013090968.Epub 2014Nov 24.

-Fire,A.等，在秀丽隐杆线虫中通过双链RNA进行的强力且特异性的遗传干扰(Potent and Specific Genetic Interference by Double-Stranded RNA inCaenorhabditis elegans)，Nature 391:806-811(1998)

-Fu Y,Du Y,Mohan C，作为研究自发性狼疮性肾炎的工具的实验性抗GBM病(Experimental anti-GBM disease as a tool for studying spontaneous lupusnephritis)，Clin Immunol.2007；124:109-118.

-George,F.,Poncelet,P.,Laurent,J.C.,Massot,O.,Arnoux,D.,Lequeux,N.,Ambrosi,P.,Chicheportiche,C.,Sampol,J，使用S-Endo 1单克隆抗体通过细胞荧光法检测全血中的人类内皮细胞(Cytofluorometric detection of human endothelial cellsin whole blood using S-Endo 1monoclonal antibody)，J.Immunol Methods.139:65-75.(1991)

-Gesteland等主编，《RNA世界》(The RNA World)(第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2006),第535-565页

-Gudey SK,Sundar R,Mu Y,Wallenius A,Zang G,Bergh A,Heldin C-H,

-Guezguez,B.,Vigneron,P.,Lamerant,N.,Kieda,C.,Jaffredo,T.,Dunon,D，黑素瘤细胞粘附分子(MCAM)/CD146在淋巴细胞内皮相互作用中的双重作用：MCAM/CD146在淋巴细胞中通过微绒毛诱导促进滚动并且是内皮粘附受体(Dual role of melanoma celladhesion molecule(MCAM)/CD146 in lymphocyte endothelium interaction:MCAM/CD146 promotes rolling via microvilli induction in lymphocyte and is anendothelial adhesion receptor)，J Immunol179:6673-6685(2007)

-Guyot M,Pagès G，VEGF剪接和VEGF剪接变体的作用：从生理-病理状况到特异性mRNA前体剪接(VEGF Splicing and the Role of VEGF Splice Variants:FromPhysiological-Pathological Conditions to Specific Pre-mRNA Splicing)，MethodsMol Biol Clifton NJ.2015；1332:3–23.

-Halt KJ,

-J.E.Hambor等，在人类细胞毒性T细胞克隆中将Epstein-Ban病毒游离型复制子用于反义RNA介导的基因抑制(Use of an Epstein-Ban Virus Episomal Replicon forAnti-Sense RNA-Mediated GeneInhibition in a Human Cytotoxic T-CeIl Clone)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:4010-4014(1988)

-Harhouri,K.,Kebir,A.,Guillet,B.,Foucault-Bertaud,A.,Voytenko,S.,Piercecchi-Marti,M.D.,Berenguer,C.,Lamy,E.,Vely,F.,Pisano,P.,Ouafik,L.,Sabatier,F.,Sampol,J.,Bardin,N.,Dignat-George,F.,Blot-Chabaud,M，在实验性后肢缺血中可溶性CD146表现出血管生成性质并促进新生血管化(Soluble CD146 displaysangiogenic properties and promotes neovascularization in experimental hind-limb ischemia)，Blood.115:3843-3851(2010)

-Harlow&Lane，《使用抗体实验指南》(Using Antibodies,ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998；Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)

-Henique C,Bollee G,Lenoir O,Dhaun N,Camus M,Chipont A,Flosseau K,Mandet C,Yamamoto M,Karras A,Thervet E,Bruneval P,Nochy D,Mesnard L,TharauxPL，红系核因子2相关因子2驱动对新月体性GN的抗性所必需的过氧化物酶体增殖物活化受体γ的足细胞特异性表达(Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2DrivesPodocyte-Specific Expression of Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorγEssential for Resistance to Crescentic GN)，J Am SocNephrol.2016Jan；27(1):172-88.doi:10.1681/ASN.2014111080.Epub 2015May21.

-Hou等，针对各个钙调蛋白基因转录本的反义寡核苷酸对PC12细胞的增殖和分化的影响(Effect of Antisense Oligodeoxynucleotides Directed to IndividualCalmodulin Gene Transcripts on the Proliferation and Differentiation of PC12Cells)，Antisense Nucl.Acid Drug Dev.8:295-308(1998)

-Jouve,N.,Bachelier,R.,Despoix,N.,Blin,M.G.,Matinzadeh,M.K.,Poitevin,S.,Aurrand-Lions,M.,Fallague,K.,Bardin,N.,Blot-Chabaud,M.,Vely,F.,Dignat-George,F.,Leroyer,A.S.，CD146通过FAK活化介导VEGF诱导的黑素瘤细胞外渗(CD146mediates VEGF-induced melanoma cell extravasation through FAK activation)，IntJ Cancer.137:50-60(2015)

-Jussila L,Alitalo K，血管生长因子和淋巴血管生成(Vascular growthfactors and lymphangiogenesis)，Physiol Rev.2002；82:673–700.

-Kebir,A.,Harhouri,K.,Guillet,B.,Liu,J.W.,Foucault-Bertaud,A.,Lamy,E.,Kaspi,E.,Elganfoud,N.,Vely,F.,Sabatier,F.,Sampol,J.,Pisano,P.,Kruithof,E.K.,Bardin,N.,Dignat-George,F.,Blot-Chabaud,M，CD146短同工型在体外和体内提高内皮祖细胞的促血管生成潜力(CD146 short isoform increases the proangiogenicpotential of endothelial progenitor cells in vitro and in vivo)，Circ Res.107:66-75(2010)

-Karkar AM,Smith J,Pusey CD，通过阻断肿瘤坏死因子-α预防和治疗实验性新月体性肾小球肾炎(Prevention and treatment of experimental crescenticglomerulonephritis by blocking tumour necrosis factor-alpha)，Nephrol DialTransplant.2001；16:518-524.

-Kaspi E,Heim X,Granel B,Guillet B,Stalin J,Nollet M,Bertaud-FoucaultA,Robaglia-Schlupp A,Roll P,Cau P,Leroyer A,Bachelier R,Benyamine A,Dignat-George F,Blot-Chabaud M,Bardin N，CD146被鉴定为参与系统性硬化的新的分子作用物(Identification of CD146 as a novel molecular actor involved in systemicsclerosis)，J Allergy Clin Immunol.2017

-Kavvadas P,Abed A,Poulain C,Authier F,Labéjof LP,Calmont A,Afieri C,Prakoura N,Dussaule JC,Chatziantoniou C,Chadjichristos CE，连接蛋白43的表达减弱了实验性GN的发展(Expression of Connexin 43Blunts the Progression ofExperimental GN)，J Am SocNephrol.2017Jun 30.pii:ASN.2016111211.doi:10.1681/ASN.2016111211.[付印前的电子版]

-Kerroch M,Guerrot D,Vandermeersch S,Placier S,Mesnard L,Jouanneau C,Rondeau E,Ronco P,Boffa JJ,Chatziantoniou C,DussauleJC，盘状结构域受体1的遗传抑制保护小鼠免于新月体性肾小球肾炎(Genetic inhibition of discoidin domainreceptor 1protects mice against crescentic glomerulonephritis)，FASEBJ.2012Oct；26(10):4079-91.doi:10.1096/fj.11-194902.Epub 2012Jul 2.

-Kennerdell&R.W.Carthew，使用dsDNA介导的遗传干扰来证明frizzled和frizzled 2在Wingless途径中起作用(Use of dsDNA-Mediated Genetic Interferenceto Demonstrate that frizzled and frizzled 2Act in the Wingless Pathway)，CeJ95:1017-1026(1998)

-Kitching AR,Holdsworth SR,Tipping PG，在鼠类肾小球肾炎中干扰素-γ介导新月体形成和细胞介导的免疫损伤(IFN-gamma mediates crescent formation andcell-mediated immune injury in murine glomerulonephritis)，J AmSocNephrol.1999；10:752-759

-Kishimoto T，白介素-6：从基础科学到医学——免疫学40年(Interleukin-6:from basic science to medicine--40years in immunology)，Annu Rev Immunol.2005；23:1-21

-Korff T,Kimmina S,Martiny-Baron G,Augustin HG，3维球状体共培养模型中的血管成熟：与平滑肌细胞的直接接触调控内皮细胞休眠并消除VEGF反应性(Bloodvessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model:directcontact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence andabrogates VEGF responsiveness)，FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol.2001；15:447–457.

-Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；和Cole等，《单克隆抗体和癌症疗法》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，第77-96页，1985

-LeBleu,V.S.,Taduri,G.,O'Connell,J.,Teng,Y.,Cooke,V.G.,Woda,C.,Sugimoto,H.,Kalluri,R，肾纤维化中成肌纤维细胞的起源和功能(Origin and functionof myofibroblasts in kidney fibrosis)，Nat Med.19:1047-1053(2013)

-Le Hir M,Haas C,Marino M,Ryffel B，在肿瘤坏死因子缺陷型小鼠中由抗肾小球膜抗体诱导的新月体性肾小球肾炎的预防(Prevention of crescenticglomerulonephritis induced by anti-glomerular membrane antibody in tumornecrosis factor-deficient mice)，Lab Invest.1998；78:1625-1631

-Liang,Y.K.,Zeng,Xiao,Y.S.,Wu Y.,Ouyang,Y.X.,Chen,M.,Li,Y.C.,Lin,H.Y.,Wei,X.L.,Zhang,Y.Q.,Kruyt,F.A.,Zhang,G.J.，在乳腺癌细胞中MCAM/CD146通过诱导上皮-间质转化、降低的ERα表达和AKT活化促进他莫昔芬抗性(MCAM/CD146 promotestamoxifen resistance in breast cancer cells through induction of epithelial-mesenchymal transition,decreased ERαexpression and AKT activation)，CancerLett.386:65-76(2017)

-Lichtenstein&W.Nellen主编，《反义技术：一种实用方法》(AntisenseTechnology:A Practical Approach)(IRL Press,Oxford,1997)

-Luque Y,Cathelin D,Vandermeersch S,Xu X,Sohier J,Placier S,Xu-DuboisYC,Louis K,Hertig A,Bories JC,Vasseur F,Campagne F,Di Santo JP,Vosshenrich C,Rondeau E,Mesnard L，肾小球共同γ链提供针对肾小球肾炎的B细胞和T细胞不依赖性保护(Glomerular common gamma chain confers B-and T-cell-independent protectionagainst glomerulonephritis)，Kidney Int.2017May；91(5):1146-1158.doi:10.1016/j.kint.2016.10.037.Epub 2017Jan 19.

-Marcus-Sekura，使用反义寡脱氧核糖核苷酸研究基因表达的技术(Techniquesfor Using Antisense Oligodeoxy ribonucleotides to Study Gene Expression)，Anal.Biochem.172:289-295(1988)；

-Mathieson,P.W.，肾小球肾炎(Glomerulonephritis)，SeminImmunopathol.29:315-316(2007)

-Mays,P.K.,McAnulty,R.J.,Campa,J.S.和Laurent,G.J.(1991)，大鼠组织中胶原蛋白合成和降解的年龄相关的变化。新合成的胶原蛋白的降解在调控胶原蛋白生产中的重要性(Age-related changes in collagen synthesis and degradation in rattissues.Importance of degradation of newly synthesized collagen in regulatingcollagen production)，Biochem.J.276,307–313.

-Mesnard L,Cathelin D,Vandermeersch S,Rafat C,Luque Y,Sohier J,NochyD,Garcon L,Callard P,Jouanneau C,Verpont MC,Tharaux PL,Hertig A,Rondeau E，在小鼠中遗传背景依赖性血栓性微血管病与抗肾小球基底膜肾小球肾炎期间的血管内皮生长因子受体2信号传导相关(Genetic background-dependent thromboticmicroangiopathy is related to vascular endothelial growth factor receptor2signaling during anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis inmice)，Am J Pathol.2014Sep；184(9):2438-49.doi:10.1016/j.ajpath.2014.05.020.Epub 2014Jul 6.

-Mesnard L,Keller AC,Michel ML,Vandermeersch S,Rafat C,Letavernier E,Tillet Y,Rondeau E,Leite-de-Moraes MC，恒定自然杀伤性T细胞和TGF-β减弱抗GBM肾小球肾炎(Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBMglomerulonephritis)，J Am SocNephrol.2009Jun；20(6):1282-92.doi:10.1681/ASN.2008040433.Epub 2009May 21.

-Moeller,M.J.,Smeets,B，RPGN治疗中的新靶点：活化的壁细胞(Novel targetin the treatment of RPGN:the activated parietal cell)，Nephrol DialTransplant.28:489-492(2013)

-Pasquier,E.,Bardin,N.,De Saint Martin,L.,Le Martelot,M.T.,Bohec,C.,Roche,S.,Mottier,D.,Dignat-George,F.，在原因不明的妊娠丢失妇女中可溶性CD146的首次评估。新的见解？(The first assessment of soluble CD146 in women withunexplained pregnancy loss.A new insight？)，Thromb Haemost94:1280-1284(2005)

-Prakoura N,Kavvadas P,Kormann R,Dussaule JC,Chadjichristos CE,Chatziantoniou，在GN中CNFκB诱导的骨膜蛋白激活整合蛋白-β3信号传导以促进GN中的肾损伤(CNFκB-Induced Periostin Activates Integrin-β3Signaling to Promote RenalInjury in GN)，J Am SocNephrol.2017May；28(5):1475-1490.doi:10.1681/ASN.2016070709.Epub 2016Dec 5.

-Rockey,D.C.,Bell,P.D.,Hill,J.A，纤维化——器官损伤和衰竭的常见途径(Fibrosis--a common pathway to organ injury and failure)，NEngl J Med.372:1138-1149(2015)

-Schwarting A,Wada T,Kinoshita K,Tesch G,Kelley VR，IFN-γ在MRL-Fas(lpr)小鼠中IFN-γ受体信号传导对于自身免疫性肾脏疾病的起始、加速和破坏来说至关重要(IFN-gamma receptor signaling is essential for the initiation,acceleration,and destruction of autoimmune kidney disease in MRL-Fas(lpr)mice)，J.Immunol.1998；161:494-503.

-Stalin J,Harhouri K,Hubert L,Subrini C,Lafitte D,Lissitzky J-C,Elganfoud N,Robert S,Foucault-Bertaud A,Kaspi E,Sabatier F,Aurrand-Lions M,Bardin N,Holmgren L,Dignat-George F,Blot-Chabaud M，可溶性黑素瘤细胞粘附分子(sMCAM/sCD146)通过血管动蛋白促进对内皮祖细胞的血管生成效应(Soluble melanomacell adhesion molecule(sMCAM/sCD146)promotes angiogenic effects onendothelial progenitor cells through angiomotin)，J Biol Chem.2013；288:8991–9000.

-Stalin J,Nollet M,Garigue P,Fernandez S,Vivancos L,Essaadi A,MullerA,Bachelier R,Foucault-Bertaud A,Fugazza L,Leroyer AS,Bardin N,Guillet B,Dignat-George F,Blot-Chabaud M，用中和抗体靶向可溶性CD146抑制了CD146阳性肿瘤的血管化、生长和存活(Targeting soluble CD146 with a neutralizing antibodyinhibits vascularization,growth and survival of CD146-positive tumors)，Oncogene.2016；35:5489–5500.

-Taira,E.,Nagino,T.,Taniura,H.,Takaha,N.,Kim,C.H.,Kuo,C.H.,Li,B.S.,Higuchi,H.,Miki,N.，免疫球蛋白超家族细胞粘附分子gicerin的新的同工型的表达和功能分析(Expression and functional analysis of a novel isoform of gicerin,animmunoglobulin superfamily cell adhesion molecule)，The Journal of biologicalchemistry270:28681-28687(1995)

-Tang WW,Feng L,Vannice JL,Wilson CB，白介素-1受体拮抗剂改善与实验性抗肾小球基底膜抗体相关的肾小球肾炎(Interleukin-1receptor antagonist amelioratesexperimental anti-glomerular basement membrane antibody-associatedglomerulonephritis)，J Clin Invest.1994；93:273-279.

-Toubas J,Beck S,Pageaud AL,Huby AC,Mael-Ainin M,Dussaule JC,Chatziantoniou C,ChadjichristosCE，连接蛋白表达的改变是慢性肾病的早期信号(Alteration of connexin expression is an early signal for chronic kidneydisease)，Am J Physiol Renal Physiol.2011Jul；301(1):F24-32.doi:10.1152/ajprenal.00255.2010.Epub 2011Mar 23

-J.Sambrook&D.R.Russell，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)(第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,2001)

-Talman,V.和Ruskoaho,H.(2016)，心肌梗死中的心脏纤维化——从修复和重塑到再生(Cardiac fibrosis in myocardial infarction—from repair and remodelingto regeneration)，Cell Tissue Res.365,563–581.

-Tellier E,Canault M,Poggi M,Bonardo B,Nicolay A,Alessi M-C,NalboneG,Peiretti F，HDL激活ADAM17依赖性的脱落(HDLs activate ADAM17-dependentshedding)，J Cell Physiol.2008；214:687–693.

-Vainio,O.,Dunon,D.,Aissi,F.,Dangy,J.P.,McNagny,K.M.,Imhof,B.A.，HEMCAM，一种由c-kit+造血祖细胞表达的粘附分子(HEMCAM,an adhesion moleculeexpressed by c-kit+hemopoietic progenitors)，The Journal of cell biology135:1655-1668(1996)

-Wang N,Fan Y,Ni P,Wang F,Gao X,Xue Q,Tang L，在体外高葡萄糖对CD146在人类近端肾小管上皮细胞中的作用的影响(High glucose effect on the role of CD146in human proximal tubular epithelial cells in vitro)，J Nephrol.2008Nov-Dec；21(6):931-40.

-Wang,Y.,Nakayama,M.,Pitulescu,M.E.,Schmidt,T.S.,Bochenek,M.L.,Sakakibara,A.,Adams,S.,Davy,A.,Deutsch,U.,Lüthi,U.,Barberis,A.,Benjamin,L.E.,

-Wianni&M.Zernicka-Goetz，在小鼠早期发育中通过双链RNA特异性干扰基因功能(Specific Interference with Gene Function by Double-Stranded RNA in EarlyMouse Development)，Nat.Cell Biol.2:70-75(2000)

-Weber,K.T.(1989)，健康和疾病中的心肌间质：纤维状胶原蛋白网络(Cardiacinterstitium in health and disease:The fibrillar collagen network)，J.Am.Coll.Cardiol.13,1637–1652.

-Wuthrich RP,Jevnikar AM,Takei F,Glimcher LH,Kelley VE，在自身免疫性鼠类狼疮性肾炎中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达被上调(Intercellular adhesionmolecule-1(ICAM-1)expression is upregulated in autoimmune murine lupusnephritis)，Am J Pathol.1990；136:441-450.

-Xu J.，小鼠胚胎成纤维细胞的制备、培养和永生化(Preparation,culture,andimmortalization of mouse embryonic fibroblasts)，Curr Protoc Mol Biol.2005；Chapter 28:Unit 28.1.

-Yan,X.,Lin,Y.,Yang,D.,Shen,Y.,Yuan,M.,Zhang,Z.,Li,P.,Xia,H.,Li,L.,Luo,D.,Liu,Q.,Mann,K.,Bader,B.L.，新型抗CD146单克隆抗体AA98抑制血管生成和肿瘤生长(A novel anti-CD146monoclonal antibody,AA98,inhibits angiogenesis andtumor growth)，Blood 102:184-191(2003)

-Zeisberg,E.M.,Potenta,S.E.,Sugimoto,H.,Zeisberg,M.,Kalluri,R.，在肾纤维化中成纤维细胞通过内皮向间质转化而出现(Fibroblasts in kidney fibrosisemerge via endothelial-to-mesenchymal transition)，J Am SocNephrol.19:2282-2287(2008)

-Zeng,Q.,Li,W.,Lu,D.,Wu,Z.,Duan,H.,Luo,Y.,Feng,J.,Yang,D.,Fu,L.,Yan,X.，上皮-间质转化诱导物CD146与三阴性乳腺癌相关(CD146,an epithelial-mesenchymaltransition inducer,is associated with triple-negative breast cancer)，ProcNatl Acad Sci U S A.109:1127-1132(2012)

序列表

<110> 公共事业救济局-马赛医院等

<120> CD146及其在纤维化的诊断和治疗中作为生物标志物和治疗靶点的用途

<130> B2850PC00

<160> 102

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 552

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Gly Leu Pro Arg Leu Val Cys Ala Phe Leu Leu Ala Ala Cys Cys

1 5 10 15

Cys Cys Pro Arg Val Ala Gly Val Pro Gly Glu Ala Glu Gln Pro Ala

20 25 30

Pro Glu Leu Val Glu Val Glu Val Gly Ser Thr Ala Leu Leu Lys Cys

35 40 45

Gly Leu Ser Gln Ser Gln Gly Asn Leu Ser His Val Asp Trp Phe Ser

50 55 60

Val His Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ile Phe Arg Val Arg Gln Gly Gln

65 70 75 80

Gly Gln Ser Glu Pro Gly Glu Tyr Glu Gln Arg Leu Ser Leu Gln Asp

85 90 95

Arg Gly Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Val Thr Pro Gln Asp Glu Arg

100 105 110

Ile Phe Leu Cys Gln Gly Lys Arg Pro Arg Ser Gln Glu Tyr Arg Ile

115 120 125

Gln Leu Arg Val Tyr Lys Ala Pro Glu Glu Pro Asn Ile Gln Val Asn

130 135 140

Pro Leu Gly Ile Pro Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Glu Val Ala Thr

145 150 155 160

Cys Val Gly Arg Asn Gly Tyr Pro Ile Pro Gln Val Ile Trp Tyr Lys

165 170 175

Asn Gly Arg Pro Leu Lys Glu Glu Lys Asn Arg Val His Ile Gln Ser

180 185 190

Ser Gln Thr Val Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Gln Ser Ile Leu

195 200 205

Lys Ala Gln Leu Val Lys Glu Asp Lys Asp Ala Gln Phe Tyr Cys Glu

210 215 220

Leu Asn Tyr Arg Leu Pro Ser Gly Asn His Met Lys Glu Ser Arg Glu

225 230 235 240

Val Thr Val Pro Val Phe Tyr Pro Thr Glu Lys Val Trp Leu Glu Val

245 250 255

Glu Pro Val Gly Met Leu Lys Glu Gly Asp Arg Val Glu Ile Arg Cys

260 265 270

Leu Ala Asp Gly Asn Pro Pro Pro His Phe Ser Ile Ser Lys Gln Asn

275 280 285

Pro Ser Thr Arg Glu Ala Glu Glu Glu Thr Thr Asn Asp Asn Gly Val

290 295 300

Leu Val Leu Glu Pro Ala Arg Lys Glu His Ser Gly Arg Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Gln Ala Trp Asn Leu Asp Thr Met Ile Ser Leu Leu Ser Glu Pro Gln

325 330 335

Glu Leu Leu Val Asn Tyr Val Ser Asp Val Arg Val Ser Pro Ala Ala

340 345 350

Pro Glu Arg Gln Glu Gly Ser Ser Leu Thr Leu Thr Cys Glu Ala Glu

355 360 365

Ser Ser Gln Asp Leu Glu Phe Gln Trp Leu Arg Glu Glu Thr Asp Gln

370 375 380

Val Leu Glu Arg Gly Pro Val Leu Gln Leu His Asp Leu Lys Arg Glu

385 390 395 400

Ala Gly Gly Gly Tyr Arg Cys Val Ala Ser Val Pro Ser Ile Pro Gly

405 410 415

Leu Asn Arg Thr Gln Leu Val Lys Leu Ala Ile Phe Gly Pro Pro Trp

420 425 430

Met Ala Phe Lys Glu Arg Lys Val Trp Val Lys Glu Asn Met Val Leu

435 440 445

Asn Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly His Pro Arg Pro Thr Ile Ser Trp

450 455 460

Asn Val Asn Gly Thr Ala Ser Glu Gln Asp Gln Asp Pro Gln Arg Val

465 470 475 480

Leu Ser Thr Leu Asn Val Leu Val Thr Pro Glu Leu Leu Glu Thr Gly

485 490 495

Val Glu Cys Thr Ala Ser Asn Asp Leu Gly Lys Asn Thr Ser Ile Leu

500 505 510

Phe Leu Glu Leu Val Asn Leu Thr Thr Leu Thr Pro Asp Ser Asn Thr

515 520 525

Thr Thr Gly Leu Ser Thr Ser Thr Ala Ser Pro His Thr Arg Ala Asn

530 535 540

Ser Thr Ser Thr Glu Arg Lys Leu

545 550

<210> 2

<211> 553

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Gly Leu Pro Arg Leu Val Cys Ala Phe Leu Leu Ala Ala Cys Cys

1 5 10 15

Cys Cys Pro Arg Val Ala Gly Val Pro Gly Glu Ala Glu Gln Pro Ala

20 25 30

Pro Glu Leu Val Glu Val Glu Val Gly Ser Thr Ala Leu Leu Lys Cys

35 40 45

Gly Leu Ser Gln Ser Gln Gly Asn Leu Ser His Val Asp Trp Phe Ser

50 55 60

Val His Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ile Phe Arg Val Arg Gln Gly Gln

65 70 75 80

Gly Gln Ser Glu Pro Gly Glu Tyr Glu Gln Arg Leu Ser Leu Gln Asp

85 90 95

Arg Gly Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Val Thr Pro Gln Asp Glu Arg

100 105 110

Ile Phe Leu Cys Gln Gly Lys Arg Pro Arg Ser Gln Glu Tyr Arg Ile

115 120 125

Gln Leu Arg Val Tyr Lys Ala Pro Glu Glu Pro Asn Ile Gln Val Asn

130 135 140

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Cys Val Gly Arg Asn Gly Tyr Pro Ile Pro Gln Val Ile Trp Tyr Lys

165 170 175

Asn Gly Arg Pro Leu Lys Glu Glu Lys Asn Arg Val His Ile Gln Ser

180 185 190

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Leu Asn Tyr Arg Leu Pro Ser Gly Asn His Met Lys Glu Ser Arg Glu

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465

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<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

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180 185 190

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<210> 11

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

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Cys Cys Pro Arg Val Ala Gly Val Pro Gly Glu Ala Glu Gln Pro Ala

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180 185 190

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195 200 205

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485 490 495

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ggccagagcg aacctgggga gtacgagcag cggctcagcc tccaggacag aggggctact 300

ctggccctga ctcaagtcac cccccaagac gagcgcatct tcttgtgcca gggcaagcgc 360

cctcggtccc aggagtaccg catccagctc cgcgtctaca aagctccgga ggagccaaac 420

atccaggtca accccctggg catccctgtg aacagtaagg agcctgagga ggtcgctacc 480

tgtgtaggga ggaacgggta ccccattcct caagtcatct ggtacaagaa tggccggcct 540

ctgaaggagg agaagaaccg ggtccacatt cagtcgtccc agactgtgga gtcgagtggt 600

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ttttactgtg agctcaacta ccggctgccc agtgggaacc acatgaagga gtccagggaa 720

gtcaccgtcc ctgttttcta cccgacagaa aaagtgtggc tggaagtgga gcccgtggga 780

atgctgaagg aaggggaccg cgtggaaatc aggtgtttgg ctgatggcaa ccctccacca 840

cacttcagca tcagcaagca gaaccccagc accagggagg cagaggaaga gacaaccaac 900

gacaacgggg tcctggtgct ggagcctgcc cggaaggaac acagtgggcg ctatgaatgt 960

cagggcctgg acttggacac catgatatcg ctgctgagtg aaccacagga actactggtg 1020

aactatgtgt ctgacgtccg agtgagtccc gcagcccctg agagacagga aggcagcagc 1080

ctcaccctga cctgtgaggc agagagtagc caggacctcg agttccagtg gctgagagaa 1140

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

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<212> DNA

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<210> 15

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<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

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ttttactgtg agctcaacta ccggctgccc agtgggaacc acatgaagga gtccagggaa 720

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<210> 16

<211> 1668

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 16

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ctcaccctga cctgtgaggc agagagtagc caggacctcg agttccagtg gctgagagaa 1140

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accatctcct ggaacgtcaa cggcacggca agtgaacaag accaagatcc acagcgagtc 1440

ctgagcaccc tgaatgtcct cgtgaccccg gagctgttgg agacaggtgt tgaatgcacg 1500

gcctccaacg acctgggcaa aaacaccagc atcctcttcc tggagctggt caatttaacc 1560

accctcacac cagactccaa cacaaccact ggcctcagca cttccactgc cagtcctcat 1620

accagagcca acagcacctc cacagagaga aagctgccgg agccggag 1668

<210> 17

<211> 1671

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 17

atggggcttc ccaggctggt ctgcgccttc ttgctcgccg cctgctgctg ctgtcctcgc 60

gtcgcgggtg tgcccggaga ggctgagcag cctgcgcctg agctggtgga ggtggaagtg 120

ggcagcacag cccttctgaa gtgcggcctc tcccagtccc aaggcaacct cagccatgtc 180

gactggtttt ctgtccacaa ggagaagcgg acgctcatct tccgtgtgcg ccagggccag 240

ggccagagcg aacctgggga gtacgagcag cggctcagcc tccaggacag aggggctact 300

ctggccctga ctcaagtcac cccccaagac gagcgcatct tcttgtgcca gggcaagcgc 360

cctcggtccc aggagtaccg catccagctc cgcgtctaca aagctccgga ggagccaaac 420

atccaggtca accccctggg catccctgtg aacagtaagg agcctgagga ggtcgctacc 480

tgtgtaggga ggaacgggta ccccattcct caagtcatct ggtacaagaa tggccggcct 540

ctgaaggagg agaagaaccg ggtccacatt cagtcgtccc agactgtgga gtcgagtggt 600

ttgtacacct tgcagagtat tctgaaggca cagctggtta aagaagacaa agatgcccag 660

ttttactgtg agctcaacta ccggctgccc agtgggaacc acatgaagga gtccagggaa 720

gtcaccgtcc ctgttttcta cccgacagaa aaagtgtggc tggaagtgga gcccgtggga 780

atgctgaagg aaggggaccg cgtggaaatc aggtgtttgg ctgatggcaa ccctccacca 840

cacttcagca tcagcaagca gaaccccagc accagggagg cagaggaaga gacaaccaac 900

gacaacgggg tcctggtgct ggagcctgcc cggaaggaac acagtgggcg ctatgaatgt 960

cagggcctgg acttggacac catgatatcg ctgctgagtg aaccacagga actactggtg 1020

aactatgtgt ctgacgtccg agtgagtccc gcagcccctg agagacagga aggcagcagc 1080

ctcaccctga cctgtgaggc agagagtagc caggacctcg agttccagtg gctgagagaa 1140

gagacaggcc aggtgctgga aagggggcct gtgcttcagt tgcatgacct gaaacgggag 1200

gcaggaggcg gctatcgctg cgtggcgtct gtgcccagca tacccggcct gaaccgcaca 1260

cagctggtca acgtggccat ttttggcccc ccttggatgg cattcaagga gaggaaggtg 1320

tgggtgaaag agaatatggt gttgaatctg tcttgtgaag cgtcagggca cccccggccc 1380

accatctcct ggaacgtcaa cggcacggca agtgaacaag accaagatcc acagcgagtc 1440

ctgagcaccc tgaatgtcct cgtgaccccg gagctgttgg agacaggtgt tgaatgcacg 1500

gcctccaacg acctgggcaa aaacaccagc atcctcttcc tggagctggt caatttaacc 1560

accctcacac cagactccaa cacaaccact ggcctcagca cttccactgc cagtcctcat 1620

accagagcca acagcacctc cacagagaga aagctgccgg agccggagag c 1671

<210> 18

<211> 1674

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 18

atggggcttc ccaggctggt ctgcgccttc ttgctcgccg cctgctgctg ctgtcctcgc 60

gtcgcgggtg tgcccggaga ggctgagcag cctgcgcctg agctggtgga ggtggaagtg 120

ggcagcacag cccttctgaa gtgcggcctc tcccagtccc aaggcaacct cagccatgtc 180

gactggtttt ctgtccacaa ggagaagcgg acgctcatct tccgtgtgcg ccagggccag 240

ggccagagcg aacctgggga gtacgagcag cggctcagcc tccaggacag aggggctact 300

ctggccctga ctcaagtcac cccccaagac gagcgcatct tcttgtgcca gggcaagcgc 360

cctcggtccc aggagtaccg catccagctc cgcgtctaca aagctccgga ggagccaaac 420

atccaggtca accccctggg catccctgtg aacagtaagg agcctgagga ggtcgctacc 480

tgtgtaggga ggaacgggta ccccattcct caagtcatct ggtacaagaa tggccggcct 540

ctgaaggagg agaagaaccg ggtccacatt cagtcgtccc agactgtgga gtcgagtggt 600

ttgtacacct tgcagagtat tctgaaggca cagctggtta aagaagacaa agatgcccag 660

ttttactgtg agctcaacta ccggctgccc agtgggaacc acatgaagga gtccagggaa 720

gtcaccgtcc ctgttttcta cccgacagaa aaagtgtggc tggaagtgga gcccgtggga 780

atgctgaagg aaggggaccg cgtggaaatc aggtgtttgg ctgatggcaa ccctccacca 840

cacttcagca tcagcaagca gaaccccagc accagggagg cagaggaaga gacaaccaac 900

gacaacgggg tcctggtgct ggagcctgcc cggaaggaac acagtgggcg ctatgaatgt 960

cagggcctgg acttggacac catgatatcg ctgctgagtg aaccacagga actactggtg 1020

aactatgtgt ctgacgtccg agtgagtccc gcagcccctg agagacagga aggcagcagc 1080

ctcaccctga cctgtgaggc agagagtagc caggacctcg agttccagtg gctgagagaa 1140

gagacaggcc aggtgctgga aagggggcct gtgcttcagt tgcatgacct gaaacgggag 1200

gcaggaggcg gctatcgctg cgtggcgtct gtgcccagca tacccggcct gaaccgcaca 1260

cagctggtca acgtggccat ttttggcccc ccttggatgg cattcaagga gaggaaggtg 1320

tgggtgaaag agaatatggt gttgaatctg tcttgtgaag cgtcagggca cccccggccc 1380

accatctcct ggaacgtcaa cggcacggca agtgaacaag accaagatcc acagcgagtc 1440

ctgagcaccc tgaatgtcct cgtgaccccg gagctgttgg agacaggtgt tgaatgcacg 1500

gcctccaacg acctgggcaa aaacaccagc atcctcttcc tggagctggt caatttaacc 1560

accctcacac cagactccaa cacaaccact ggcctcagca cttccactgc cagtcctcat 1620

accagagcca acagcacctc cacagagaga aagctgccgg agccggagag ccgg 1674

<210> 19

<211> 1584

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 19

atggtataca ttgttagaca atttctttta tacaatgttt ctgggtcagt ctatttagat 60

caactgatcg ttttgcttac tgccaagttt tccatactac gcatagcagg tagtcgagtt 120

caccattccc catttagtgg acatctagac ggctgctcgt ttttatcatt gcagcattct 180

ttgcacacat ccttggatat gagcagacat gaaaatgttt ttctagggtt gacactgagc 240

agtaaaagtg ctgggttgaa gggtttccag cttgcatttg tacctggcct tctacagggg 300

acagggggct atttagatgg tcccctgcca accccagtgg acaaccctag ggtggggctg 360

gaggtggggc tgaggctgag tcttcctccc cttcctccct gcccaggggt ccacattcag 420

tcgtcccaga ctgtggagtc gagtggtttg tacaccttgc agagtattct gaaggcacag 480

ctggttaaag aagacaaaga tgcccagttt tactgtgagc tcaactaccg gctgcccagt 540

gggaaccaca tgaaggagtc cagggaagtc accgtccctg ttttctaccc gacagaaaaa 600

gtgtggctgg aagtggagcc cgtgggaatg ctgaaggaag gggaccgcgt ggaaatcagg 660

tgtttggctg atggcaaccc tccaccacac ttcagcatca gcaagcagaa ccccagcacc 720

agggaggcag aggaagagac aaccaacgac aacggggtcc tggtgctgga gcctgcccgg 780

aaggaacaca gtgggcgcta tgaatgtcag ggcctggact tggacaccat gatatcgctg 840

ctgagtgaac cacaggaact actggtgaac tatgtgtctg acgtccgagt gagtcccgca 900

gcccctgaga gacaggaagg cagcagcctc accctgacct gtgaggcaga gagtagccag 960

gacctcgagt tccagtggct gagagaagag acaggccagg tgctggaaag ggggcctgtg 1020

cttcagttgc atgacctgaa acgggaggca ggaggcggct atcgctgcgt ggcgtctgtg 1080

cccagcatac ccggcctgaa ccgcacacag ctggtcaacg tggccatttt tggcccccct 1140

tggatggcat tcaaggagag gaaggtgtgg gtgaaagaga atatggtgtt gaatctgtct 1200

tgtgaagcgt cagggcaccc ccggcccacc atctcctgga acgtcaacgg cacggcaagt 1260

gaacaagacc aagatccaca gcgagtcctg agcaccctga atgtcctcgt gaccccggag 1320

ctgttggaga caggtgttga atgcacggcc tccaacgacc tgggcaaaaa caccagcatc 1380

ctcttcctgg agctggtcaa tttaaccacc ctcacaccag actccaacac aaccactggc 1440

ctcagcactt ccactgccag tcctcatacc agagccaaca gcacctccac aggtaagcca 1500

ggcctggcaa gagaacaggg ctgtgccagg gcatcctttc tgccctgtcc ctccccagag 1560

agccctgtcc agaaaggtga gtag 1584

<210> 20

<211> 1403

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 20

atggggcttc ccaggctggt ctgcgccttc ttgctcgccg cctgctgctg ctgtcctcgc 60

gtcgcgggtg tgcccggaga ggctgagcag cctgcgcctg agctggtgga ggtggaagtg 120

ggcagcacag cccttctgaa gtgcggcctc tcccagtccc aaggcaacct cagccatgtc 180

gactggtttt ctgtccacaa ggagaagcgg acgctcatct tccgtgtgcg ccagggccag 240

ggccagagcg aacctgggga gtacgagcag cggctcagcc tccaggacag aggggctact 300

ctggccctga ctcaagtcac cccccaagac gagcgcatct tcttgtgcca gggcaagcgc 360

cctcggtccc aggagtaccg catccagctc cgcgtctaca aagctccgga ggagccaaac 420

atccaggtca accccctggg catccctgtg aacagtaagg agcctgagga ggtcgctacc 480

tgtgtaggga ggaacgggta ccccattcct caagtcatct ggtacaagaa tggccggcct 540

ctgaaggagg agaagaaccg ggtccacatt cagtcgtccc agactgtgga gtcgagtggt 600

ttgtacacct tgcagagtat tctgaaggca cagctggtta aagaagacaa agatgcccag 660

ttttactgtg agctcaacta ccggctgccc agtgggaacc acatgaagga gtccagggaa 720

gtcaccgtcc ctgttttcta cccgacagaa aaagtgtggc tggaagtgga gcccgtggga 780

atgctgaagg aaggggaccg cgtggaaatc aggtgtttgg ctgatggcaa ccctccacca 840

cacttcagca tcagcaagca gaaccccagc accagggagg cagaggaaga gacaaccaac 900

gacaacgggg tcctggtgct ggagcctgcc cggaaggaac acagtgggcg ctatgaatgt 960

cagggcctgg acttggacac catgatatcg ctgctgagtg aaccacagga actactggtg 1020

aactatgtgt ctgacgtccg agtgagtccc gcagcccctg agagacagga aggcagcagc 1080

ctcaccctga cctgtgaggc agagagtagc caggacctcg agttccagtg gctgagagaa 1140

gagacaggcc aggtgctgga aagggggcct gtgcttcagt tgcatgacct gaaacgggag 1200

gcaggaggcg gctatcgctg cgtggcgtct gtgcccagca tacccggcct gaaccgcaca 1260

cagctggtca acgtggccat ttttggtgag gccctccctc tgggtagaga ccaggtcacc 1320

ccaagtgggt ggtttttaag ctctttgaca aaaagccacc tgctgccctg gggagctctg 1380

gtgcggaggg ggaggcaggc tag 1403

<210> 21

<211> 1815

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 21

atggggcttc ccaggctggt ctgcgccttc ttgctcgccg cctgctgctg ctgtcctcgc 60

gtcgcgggtg tgcccggaga ggctgagcag cctgcgcctg agctggtgga ggtggaagtg 120

ggcagcacag cccttctgaa gtgcggcctc tcccagtccc aaggcaacct cagccatgtc 180

gactggtttt ctgtccacaa ggagaagcgg acgctcatct tccgtgtgcg ccagggccag 240

ggccagagcg aacctgggga gtacgagcag cggctcagcc tccaggacag aggggctact 300

ctggccctga ctcaagtcac cccccaagac gagcgcatct tcttgtgcca gggcaagcgc 360

cctcggtccc aggagtaccg catccagctc cgcgtctaca aagctccgga ggagccaaac 420

atccaggtca accccctggg catccctgtg aacagtaagg agcctgagga ggtcgctacc 480

tgtgtaggga ggaacgggta ccccattcct caagtcatct ggtacaagaa tggccggcct 540

ctgaaggagg agaagaaccg ggtccacatt cagtcgtccc agactgtgga gtcgagtggt 600

ttgtacacct tgcagagtat tctgaaggca cagctggtta aagaagacaa agatgcccag 660

ttttactgtg agctcaacta ccggctgccc agtgggaacc acatgaagga gtccagggaa 720

gtcaccgtcc ctgttttcta cccgacagaa aaagtgtggc tggaagtgga gcccgtggga 780

atgctgaagg aaggggaccg cgtggaaatc aggtgtttgg ctgatggcaa ccctccacca 840

cacttcagca tcagcaagca gaaccccagc accagggagg cagaggaaga gacaaccaac 900

gacaacgggg tcctggtgct ggagcctgcc cggaaggaac acagtgggcg ctatgaatgt 960

cagggcctgg acttggacac catgatatcg ctgctgagtg aaccacagga actactggtg 1020

aactatgtgt ctgacgtccg agtgagtccc gcagcccctg agagacagga aggcagcagc 1080

ctcaccctga cctgtgaggc agagagtagc caggacctcg agttccagtg gctgagagaa 1140

gagacaggcc aggtgctgga aagggggcct gtgcttcagt tgcatgacct gaaacgggag 1200

gcaggaggcg gctatcgctg cgtggcgtct gtgcccagca tacccggcct gaaccgcaca 1260

cagctggtca acgtggccat ttttggcccc ccttggatgg cattcaagga gaggaaggtg 1320

tgggtgaaag agaatatggt gttgaatctg tcttgtgaag cgtcagggca cccccggccc 1380

accatctcct ggaacgtcaa cggcacggca agtgaacaag accaagatcc acagcgagtc 1440

ctgagcaccc tgaatgtcct cgtgaccccg gagctgttgg agacaggtgt tgaatgcacg 1500

gcctccaacg acctgggcaa aaacaccagc atcctcttcc tggagctggt caatttaacc 1560

accctcacac cagactccaa cacaaccact ggcctcagca cttccactgc cagtcctcat 1620

accagagcca acagcacctc cacagagaga aagctgccgg agccggagag ccggggcgtg 1680

gtcatcgtgg ctgtgattgt gtgcatcctg gtcctggcgg tgctgggcgc tgtcctctat 1740

ttcctctata agaagggcaa gctgccgtgc aggagctcag ggaagcagga gatggagaga 1800

aatacatcga tctga 1815

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

tcacttgaca gtgtgatggt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

ccttagaaag cagggattca 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

cccaaatcct ctggaagaca 20

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

tgtaatgaaa gacggcacac c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

tcttctttgg gtattgcttg g 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

tcttctcatt cctgcttgtg g 21

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

atgagaggga ggccatttg 19

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

cccacgctac ctctgctc 18

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gatggatacc tgagcatcac c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

tggagcaaca tgtggaactc 20

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gtcagcagcc ggttacca 18

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

tggtttcttc tcacccttct tc 22

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

tgcatcccaa ttcatctacg t 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

tccagtcatc acagattgtc g 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

aaacagggac agtgacctcc t 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

tggtgaaatg gaatctgaac c 21

<210> 38

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

cccagatggt ttcctt 16

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

catccacgtg ttggctca 18

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gatcatcttg ctggtgaatg agt 23

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

gcaggttcac ctactctgtc ct 22

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

cttgccccat tcatttgtct 20

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

ggagcggtag cacctcct 18

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ctggttcatc atcgctaatc ac 22

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

caatcacctg cgtacagaa 19

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ttctgtacgc aggtgattg 19

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

ggcatagagg gagagcac 18

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

ttcggggaga ggtgatgttc 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

gtgctaaagg tggcaarggt 20

<210> 50

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

accaggttca ccgctac 17

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

attgcccaat tgagtgcttc 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

tgatgcttgg agaagctgtg 20

<210> 53

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

gagctattgt aatgaccagt caacaggg 28

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

ggattatact gcctgaccaa ggaaagc 27

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH正向引物

<400> 55

ggtggtctcc tgacttcaac a 21

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH反向引物

<400> 56

gttgctgtag ccaattcgtt gt 22

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD146sh正向引物

<400> 57

ccactggcct cagcacttcc 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD146sh反向引物

<400> 58

ctactcacct ttctggacag 20

<210> 59

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD146lg正向引物

<400> 59

tggtttgtac accttgcaga gtattc 26

<210> 60

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD146lg反向引物

<400> 60

tgggcagccg gtagttg 17

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MT1MMP正向序列

<400> 61

tagcgcttcc ttcgaacatt 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MT1MMP反向引物

<400> 62

gcagaagttt tacggcttgc 20

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP2正向序列

<400> 63

tgatcttgac cagaatacca tcga 24

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP2反向序列

<400> 64

ggcttgcgag gaagaagtt 19

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tace正向序列

<400> 65

gcattctcaa gtctccacaa g 21

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tace反向序列

<400> 66

ctgggagagc caactaagc 19

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADAM10正向序列

<400> 67

cagagtgcac accaggagaa 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADAM10反向序列

<400> 68

cccaggtttc agtttgcatt 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> I10-sCD146正向引物

<400> 69

ggcagaggaa gagacaacca 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> I10-sCD146反向引物

<400> 70

ttggggtgac ctggtctcta 20

<210> 71

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> I5-13-sCD146正向引物

<400> 71

ggacatctag acggtgctc 19

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> I5-13-sCD146反向引物

<400> 72

acaaatgcaa gctggaaacc 20

<210> 73

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siTACE正义siRNA

<400> 73

caggauuuaa agguuaugga a 21

<210> 74

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siTACE反义siRNA

<400> 74

uuccauaaac cuuuaaaucc ug 22

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siADAM10正义siRNA

<400> 75

gaaugguaga acaaggugat t 21

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siADAM10反义siRNA

<400> 76

ucaccuuguu cuaccauucc a 21

<210> 77

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siMT1MMP正义siRNA

<400> 77

gcgaugaagu cuucacuuad tdt 23

<210> 78

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siMT1MMP反义siRNA

<400> 78

uaagugaaga cuucaucgc 19

<210> 79

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sishCD146正义siRNA

<400> 79

caggagaugg agagaaauac aucga 25

<210> 80

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sishCD146反义siRNA

<400> 80

ucgauguauu ucucuccauc uccug 25

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> silgCD146正义siRNA

<400> 81

cccgucucgu aagaccgaac uugua 25

<210> 82

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> silgCD146反义siRNA

<400> 82

uacaaguucg gucuuacgag acggg 25

<210> 83

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siI10-sCD146正义siRNA

<400> 83

cccucccucu ggguagagac caggu 25

<210> 84

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siI10-sCD146反义siRNA

<400> 84

accuggucuc uacccagagg gaggg 25

<210> 85

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siI5-13-sCD146正义siRNA

<400> 85

uggacaucua gacggcugcu cguuu 25

<210> 86

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siI5-13-sCD146反义siRNA

<400> 86

aaacgagcag ccgucuagau gucca 25

<210> 87

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 26D12-7 CDR1

<400> 87

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His Phe

1 5

<210> 88

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 26D12-7 CDR2

<400> 88

Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr

1 5

<210> 89

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 26D12-7 CDR3

<400> 89

Ala Arg Thr Trp Ala Tyr

1 5

<210> 90

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 26D12-7 CDR4

<400> 90

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 26D12-7 CDR6

<400> 91

Ala Gln Thr Thr His Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 92

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 26D12-7可变重链

<400> 92

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30

Phe Val His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 93

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 26D12-7可变轻链

<400> 93

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Val Ala Ile Gly

1 5 10 15

Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Leu Leu Gln Ser Ser Gly Arg Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gln Lys Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Thr

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 94

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2B9-4 CDR1

<400> 94

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly

1 5

<210> 95

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2B9-4 CDR2

<400> 95

Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Met

1 5

<210> 96

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2B9-4 CDR3

<400> 96

Ala Ala Phe Gln Phe Asp Tyr

1 5

<210> 97

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2B9-4 CDR4

<400> 97

Gln Gly Ile Ser Thr Ser

1 5

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2B9-4 CDR6

<400> 98

Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 99

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2B9-4可变重链

<400> 99

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Met Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Phe Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 100

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2B9-4可变轻链

<400> 100

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Ser

20 25 30

Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asn Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Arg Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 101

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<400> 101

Tyr Leu Asp Gly Pro Leu Pro Thr Pro Val Asp Asn Pro Arg

1 5 10

<210> 102

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<400> 102

Arg Asp Gln Val Thr Pro Ser Gly Val Val Phe Lys Leu Phe Asp Lys

1 5 10 15

Lys Pro