检测红细胞表面有无不完全抗体的方法、系统及其应用

摘要

本发明涉及检测红细胞表面有无不完全抗体的方法、系统及其应用，属于生物检测技术领域。本发明提供了一种基于固相吸附的检测红细胞表面有无不完全抗体的方法，所述方法为将待检测红细胞和抗人球蛋白添加至包被有丙种球蛋白的容器中进行离心，离心结束后，观察待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部是否被吸附，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部被吸附，则待检测红细胞表面有不完全抗体，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部不被吸附，则待检测红细胞表面无不完全抗体；所述方法在保持较高的灵敏度和特异性的前提下，具有更低的检测成本，且所述方法具有易于自动化操作的优势，能避免操作过程中的人为误差，提高工作效率。

说明书

技术领域

本发明涉及检测红细胞表面有无不完全抗体的方法、系统及其应用，属于生物检测领域。

背景技术

抗人球蛋白试验(antiglobulin test)是1945年由Coombs创立的用于检测受血者或者孕妇、新生儿血清(血浆)或红细胞上有无IgM抗体之外的不完全血型抗体的技术，又称Coombs试验，其中，用于检测红细胞上除IgM抗体之外的其他不完全血型抗体的方法称为直接抗人球试验(Direct antiglubin test,DAT)。直接抗人球试验用于评估受血者、孕妇、胎儿发生IgM之外的其他不完全血型抗体引起溶血的风险。

目前，通用的直接抗人球试验是利用不完全抗体和红细胞在抗人球蛋白介导下体外发生凝集反应的原理，常用的方法有试管法、微板法、微柱凝胶法等方法(试管法、微板法、微柱凝胶法均记载于《全国临床检验操作规程》中)。其中，试管法和微板法是以不完全抗体与红细胞在抗人球蛋白介导下形成的凝集块的大小判断凝集强度，从而达到检测受检者红细胞是否被IgM之外的其他不完全血型抗体致敏的目的；微柱凝胶法是在凝胶中添加抗人球抗体，通过离心，红细胞上吸附有IgG类血型抗体的会被阻滞在凝胶上层，形成一个红细胞凝集条带，没有吸附IgG类血型抗体的红细胞通过离心到达微柱底部，从而判断红细胞是否被IgG类血型抗体致敏。但是，这些方法均存在缺陷，例如：

试管法需要人工进行混匀的步骤，费时费力，并且，试管法在对凝集程度进行判定时需要晃动试管，力度对检测结果易造成影响，同一份样本不同的人可能会产生不同的判定结果，尤其是对于一些弱阳性样本，容易产生人工误差；

微板法抗体和红细胞的加样量和抗体批间差异会影响结果的稳定性；

微柱凝胶法在运输过程中试剂凝胶容易变形和产生气泡，气温对凝胶分子筛的大小也会产生影响，从而对最终检测结果的稳定性和可靠性产生影响。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法，所述方法包含检测步骤；所述检测步骤为：将待检测红细胞和抗人球蛋白添加至包被有丙种球蛋白的容器中进行离心，离心结束后，观察待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部是否被吸附，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部被吸附，则待检测红细胞表面有不完全抗体，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部不被吸附，则待检测红细胞表面无不完全抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述丙种球蛋白为人血丙种球蛋白。人血丙种球蛋白是从人血液中纯化的IgG类抗体，该抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的混合物。

在本发明的一种实施方式中，所述不完全抗体包含IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。

在本发明的一种实施方式中，所述离心的转速为90～360g、时间为1～30min。

在本发明的一种实施方式中，所述离心的转速为190～360g、时间为1～3min。

在本发明的一种实施方式中，所述检测步骤前，还包含稀释步骤；所述稀释步骤为：将待检测红细胞稀释至浓度为0.3～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述稀释步骤为：用Liss(低离子强度溶液)或生理盐水将待检测红细胞稀释至浓度为0.3～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述稀释步骤为：用生理盐水将待检测红细胞洗涤3～5次后，用Liss或生理盐水将待检测红细胞稀释至浓度为0.3～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器中的添加量为10～100μL。

在本发明的一种实施方式中，所述抗人球蛋白的效价为64～512。

在本发明的一种实施方式中，所述抗人球蛋白在包被有丙种球蛋白的容器中的添加量为1～30μL。

在本发明的一种实施方式中，所述包被有丙种球蛋白的容器的制备方法为：将丙种球蛋白添加至容器后，于2～8℃包被8～16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有BSA(牛血清蛋白)和Tween20(吐温-20)的缓冲液后，于37℃封闭1～6h，得到包被有丙种球蛋白的容器。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液；所述BSA在缓冲液中的体积浓度为0.1～5％；所述Tween20在缓冲液中的体积浓度为0.02～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述包被有丙种球蛋白的容器的制备方法包含如下步骤：

包被步骤：用pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液将丙种球蛋白倍比稀释2～2048倍，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2～8℃包被8～16h，得到经包被的容器；

第一次洗板步骤：在经包被的容器中加入pH 6.5～7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到经洗涤的容器；

封闭步骤：在经洗涤的容器中加入含有体积浓度为0.1～5％的BSA和体积浓度为0.02～1％的Tween20的pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭1～6h，得到经封闭的容器；

第二次洗板步骤：在经封闭的容器中加入pH 6.5～7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到包被有丙种球蛋白的容器。

在本发明的一种实施方式中，所述容器为微孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述微孔板为U型微孔板。

本发明还提供了利用上述方法进行检测的系统，所述系统包括包被有丙种球蛋白的容器以及抗人球蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述容器为微孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述微孔板为U型微孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述包被有丙种球蛋白的容器的制备方法为：将丙种球蛋白添加至容器后，于2～8℃包被8～16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有BSA和Tween20的缓冲液后，于37℃封闭1～6h，得到包被有丙种球蛋白的容器。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液；所述BSA在缓冲液中的体积浓度为0.1～5％；所述Tween20在缓冲液中的体积浓度为0.02～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述包被有丙种球蛋白的容器的制备方法包含如下步骤：

包被步骤：用pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液将丙种球蛋白倍比稀释2～2048倍，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2～8℃包被8～16h，得到经包被的容器；

第一次洗板步骤：在经包被的容器中加入pH 6.5～7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到经洗涤的容器；

封闭步骤：在经洗涤的容器中加入含有体积浓度为0.1～5％的BSA和体积浓度为0.02～1％的Tween20的pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭1～6h，得到经封闭的容器；

第二次洗板步骤：在经封闭的容器中加入pH 6.5～7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到包被有丙种球蛋白的容器。

本发明还提供了上述方法或上述系统在检测红细胞表面不完全抗体中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了一种基于固相吸附的检测红细胞表面不完全抗体的方法，所述方法为将待检测红细胞和抗人球蛋白添加至包被有丙种球蛋白的容器中进行离心，离心结束后，观察待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部是否被吸附，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部被吸附，则待检测红细胞表面有不完全抗体，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部不被吸附，则待检测红细胞表面无不完全抗体；所述方法与试管法相比，避免了人工操作，具有易于自动化操作和稳定性高的优势，所述方法包被抗体用量少、样本红细胞经稀释后也是微量，反应结果清晰宜读，具有灵敏度高和特异性强的优势，并且，所述方法与微柱凝胶法相比，摆脱了对价格较高的凝胶的依赖，一个微孔和微量抗体与样本红细胞就可以鉴定一个样本红细胞是否被不完全抗体致敏，具有成本低的优势。

附图说明

图1：一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法的检测原理图。图1中，从左至右依次为：包被有丙种球蛋白的容器，添加了待测红细胞和抗人球蛋白的包被有丙种球蛋白的容器，红细胞被吸附的包被有丙种球蛋白的容器，红细胞没有被吸附的包被有丙种球蛋白的容器。

图2：一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法的检测结果图。图2中，阳性结果为红细胞在抗人球蛋白的介导下被容器底部的丙种球蛋白吸附，根据吸附程度的高低，阳性结果分为4+、3+、2+和1+；阴性结果为红细胞不能在抗人球蛋白的介导下被容器底部的丙种球蛋白吸附，从而在容器底部形成圆形细胞扣。

图3：红细胞表面不完全抗体检测实验结果图。

图4：使用实施例1的方法与使用微柱凝胶法检测红细胞表面不完全抗体的检测结果对比图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1：一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法

本实施例提供了一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法包括如下步骤：

(1)包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将质量体积比10％的丙种球蛋白倍比稀释2048倍，得到稀释液；将稀释液以每孔100μL的添加量添加至U型微孔板后，于4℃包被12h，得到经包被的微孔板；

(2)第一次洗板步骤：以每孔250μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

(3)封闭：以每孔250μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为1％的BSA和体积浓度为0.02％的Tween20的pH 9.6的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；

(4)以每孔250μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

(5)稀释：用生理盐水将待测红细胞洗涤3次后，用Liss分别将待测红细胞稀释至浓度为0.5％，得到待测红细胞悬液；

(6)检测：以每孔95μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入待测红细胞悬液，同时，以每孔5μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入抗人球试剂，于190g的转速下离心1min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部被吸附，则待检测红细胞表面有不完全抗体，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部不被吸附，则待检测红细胞表面无不完全抗体。

实施例2：一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法

本实施例提供了一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法包括如下步骤：

(1)包被：用pH 8.9的碳酸盐缓冲液将质量体积比10％的丙种球蛋白倍比稀释1024倍，得到稀释液；将稀释液以每孔10μL的添加量添加至U型微孔板后，于2℃包被8h，得到经包被的微孔板；

(2)第一次洗板步骤：以每孔200μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 6.5的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

(3)封闭：以每孔200μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为0.1％的BSA和体积浓度为0.02％的Tween20的pH 8.9的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭1h，得到经封闭的微孔板；

(4)以每孔200μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 6.5的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

(5)稀释：用生理盐水将待测红细胞洗涤3次后，用Liss分别将待测红细胞稀释至浓度为0.3％，得到待测红细胞悬液；

(6)检测：以每孔90μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入待测红细胞悬液，同时，以每孔10μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入抗人球试剂，于190g的转速下离心1min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部被吸附，则待检测红细胞表面有不完全抗体，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部不被吸附，则待检测红细胞表面无不完全抗体。

实施例3：一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法

本实施例提供了一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法包括如下步骤：

(1)包被：用pH 9.8的碳酸盐缓冲液将质量体积比10％的丙种球蛋白倍比稀释512倍，得到稀释液；将稀释液以每孔100μL的添加量添加至U型微孔板后，于8℃包被16h，得到经包被的微孔板；

(2)第一次洗板步骤：以每孔300μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

(3)封闭：以每孔300μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为5％的BSA和体积浓度为1％的Tween20的pH 9.8的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；

(4)以每孔300μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

(5)稀释：用生理盐水将待测红细胞洗涤5次后，用Liss分别将待测红细胞稀释至浓度为1％，得到待测红细胞悬液；

(6)检测：以每孔80μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入待测红细胞悬液，同时，以每孔20μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入抗人球试剂，于360g的转速下离心3min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部被吸附，则待检测红细胞表面有不完全抗体，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部不被吸附，则待检测红细胞表面无不完全抗体。

实施例4：一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法

本实施例提供了一种检测红细胞表面有无不完全抗体的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法包括如下步骤：

(1)包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将质量体积比10％的丙种球蛋白倍比稀释2048倍，得到稀释液；将稀释液以每孔100μL的添加量添加至U型微孔板后，于4℃包被12h，得到经包被的微孔板；

(2)第一次洗板步骤：以每孔250μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

(3)封闭：以每孔250μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为1％的BSA和体积浓度为0.02％的Tween20的pH 9.6的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；

(4)以每孔250μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

(5)稀释：用生理盐水将待测红细胞洗涤3次后，用Liss分别将待测红细胞稀释至浓度为0.5％，得到待测红细胞悬液；

(6)检测：以每孔95μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入待测红细胞悬液，同时，以每孔5μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入抗人球试剂，于90g的转速下离心30min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部被吸附，则待检测红细胞表面有不完全抗体，若待检测红细胞在包被有丙种球蛋白的容器底部不被吸附，则待检测红细胞表面无不完全抗体。

实验例1：红细胞表面不完全抗体检测实验

1.1实验材料

1.1.1试剂

试剂：人血丙种球蛋白(质量体积比10％，购自北京市血液中心)，pH 9.6的碳酸盐缓冲液(购自Sigma公司)，pH 7.2的PBS缓冲液(购自Sigma公司)，Tween20(购自Sigma公司)、BSA(购自Thermofisher公司)，Liss(购自江苏力博医药生物技术股份有限公司)，抗人球试剂(购自Millipore公司)，表面无不完全抗体的红细胞(购自江苏力博医药生物技术股份有限公司)，表面有不完全抗体的红细胞(购自江苏力博医药生物技术股份有限公司)。

1.1.2耗材

试管离心机，微板离心机，全自动微板操作系统，10～1000μL加样枪，U型可拆卸96微孔板(购自NUNC Maxisorp公司)。

1.2红细胞表面不完全抗体检测实验方法

红细胞表面不完全抗体检测实验使用实施例1中的检测红细胞表面有无不完全抗体的方法，包含如下步骤：

1.2.1包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将丙种球蛋白倍比稀释2048倍，得到稀释液；将稀释液以每孔100μL的添加量添加至U型可拆卸96微孔板后，于4℃包被12h，得到经包被的微孔板；

1.2.2第一次洗板步骤：以每孔250μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

1.2.3封闭：以每孔250μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为1％的BSA和体积浓度为0.02％的Tween20的pH 9.6的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；

1.2.4以每孔250μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

1.2.5稀释：用生理盐水分别将表面无不完全抗体的红细胞和表面有不完全抗体的红细胞洗涤3次后，用Liss分别将表面无不完全抗体的红细胞和表面有不完全抗体的红细胞稀释至浓度为0.5％，得到表面无不完全抗体的红细胞悬液和表面有不完全抗体的红细胞悬液；

1.2.6检测：以每孔95μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入表面无不完全抗体的红细胞悬液和表面有不完全抗体的红细胞悬液，同时，以每孔5μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入抗人球试剂，于190g的转速下离心1min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，观察结果见图3。

1.3红细胞表面不完全抗体检测实验结果

如图3所示，第1行是红细胞表面没有吸附不完全抗体的阴性检测结果，第2～4行是红细胞表面被不完全抗体致敏的阳性红细胞的检测结果。可见，红细胞表面不完全抗体量不同，阳性结果会呈现不同的吸附强度，图2中的4+、3+、2+、1+结果在图3第2～4行中均可见到。

实验例2：红细胞表面不完全抗体检测方法的准确度实验

2.1实验材料

参见实验例1。

2.2红细胞表面不完全抗体检测方法的准确度实验方法

红细胞表面不完全抗体检测方法的准确度实验方法以微柱凝胶法(微柱凝胶法记载于《全国临床检验操作规程》中)为对照，采用实验例1相同的检测试剂和方法，区别在于，将表面无不完全抗体的红细胞和表面有不完全抗体的红细胞替换为6份未知表面是否有不完全抗体的红细胞样本；观察检测结果，结果见图4。

2.3红细胞表面不完全抗体检测方法的准确度实验结果

如图4所示，使用实施例1中的检测试剂和方法对6份未知表面是否有不完全抗体的红细胞样本进行不完全抗体检测的结果与微柱凝胶法相符(6份未知表面是否有不完全抗体的红细胞样本中，有2例显示阳性，有4例显示阴性)。可见，使用实施例1中的检测试剂和方法对红细胞进行不完全抗体检测的结果准确。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。