粪肠球菌突变菌、粪肠球菌感染的治疗药物以及应用

摘要

本发明公开了一种粪肠球菌突变菌、粪肠球菌感染的治疗药物以及应用，属于分子生物学及微生物领域。本发明公开的粪肠球菌突变菌，其胞外多糖合成能力以及生物膜成膜能力较低，其活性较差，毒力因子表达量水平低；本发明公开的粪肠球菌突变菌可以通过内源性生态治疗的策略用于治疗因粪肠球菌感染引起的相关疾病，本发明为粪肠球菌感染疾病的预防和治疗提供了新的思路和策略。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及微生物领域，具体而言，涉及一种粪肠球菌突变菌、粪肠球菌感染的治疗药物以及应用。

背景技术

根尖周炎是一类以根管尖部炎性病变为表现的口腔常见病之一。在世界范围内，该疾病的患病率高达总人口的50％。随着年龄的增长，其患病率将进一步增加。研究证实，该疾病引起的长期炎症反应，将进一步引起机体其他系统疾病，如糖尿病、冠心病以及加重肝硬化患者出现并发症等。

根内微生物是引起根尖周炎主要病因，其中粪肠球菌是最为常见的致病菌，其分离比例约占22％-77％。因此，治疗根尖周炎的主要方式为清除根管内的微生物或最大程度降低根管内的致病菌负荷，并通过根管填充的方式来避免感染复发。

氢氧化钙是最为常用的根管内封药(intracanal medication，ICM)。该药物主要通过调节根管内的pH值，起到消毒灭菌的作用。但致病细菌对于大部分ICM的敏感性较低，甚至可在pH值高达11.5的环境下生存。因此，粪肠球菌对ICM的耐药性往往是难治性根尖周炎的罪魁祸首。

发明内容

本发明的目的在于提供一种粪肠球菌突变菌及其应用。本发明提供的粪肠球菌突变菌具有较低的胞外多糖合成能力以及较低的生物膜代谢能力，该突变菌可以通过内源性生态治疗的策略用于治疗因粪肠球菌感染引起的相关疾病，本发明为此类疾病的治疗提供了一种新的治疗思路。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种粪肠球菌突变菌，其walR基因的表达受到抑制。

本发明的发明人创造性地发现，抑制粪肠球菌的walR基因的表达，可以使粪肠球菌的胞外多糖合成能力以及生物膜成膜能力降低，并进一步发现，粪肠球菌的walR基因受到抑制时，其活性和毒力因子表达量水平也明显下降，其耐药性也大大地降低；基于此，本发明提供一种粪肠球菌突变菌，其walR基因的表达受到抑制，该突变菌具有上述的特点，利用该突变菌的上述特点，通过内源性生态治疗的策略，可以将本发明的突变菌用于预防或治疗因粪肠球菌感染的相关疾病中，本发明为防或治疗因粪肠球菌感染的疾病提供了一种新的预防或治疗思路。

上述突变菌株的walR基因表达受到抑制，其具有较低的胞外多糖合成能力以及生物膜成膜能力，该突变菌的活性和毒力因子表达量水平也比较低，具有较低的耐药性。

采用本发明的粪肠球菌突变菌治疗通过内源性生态治疗的策略用于治疗因粪肠球菌感染引起的相关疾病的方法是：将上述粪肠球菌突变菌施加于因粪肠球菌感染或可能被粪肠球菌感染的组织部位，并使上述粪肠球菌突变菌成为优势菌群。

另一方面，本发明提供如上任一项所述的粪肠球菌突变菌在制备用于预防或治疗粪肠球菌感染引起的疾病的制剂或药物中的应用。

进一步地，在一些实施方式中，所述疾病为根尖周炎。

本发明提供的粪肠球菌突变菌其应用治疗的疾病包括但不限于根尖周炎，其他由粪肠球菌突变菌引起的疾病，也可以采用本发明的粪肠球菌突变菌进行治疗。

另一方面，本发明提供一种预防或治疗粪肠球菌感染疾病的药物或制剂，其含有如上任一项所述的粪肠球菌突变菌。

另一方面，本发明提供一种制备如上任一项所述的粪肠球菌突变菌的方法，其包括：抑制野生型粪肠球菌的walR基因的表达。

本领域技术人员应当容易地理解到，在本发明公开的基础上，本领域技术容易想到采用本领域常规的基因编辑方式例如包括但不限于RNA干扰技术以使walR基因的表达受到抑制，得到本发明的粪肠球菌突变菌。

进一步地，在一些实施方式中，采用RNA干扰技术抑制walR基因的表达。

进一步地，在一些实施方式中，采用RNA干扰技术抑制walR基因的表达包括：将能够表达出反义RNA的反义RNA表达载体导入所述野生型粪肠球菌内。

所述反义RNA能够特异性结合walR基因的正义链mRNA并形成双链RNA结构。

进一步地，在一些实施方式中，所述反义RNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明研究显示SEQ ID NO.1所示的反义RNA可特异性的结合于walR基因的正义链mRNA，形成双链结构，加速mRNA的降解，抑制mRNA的转录翻译过程，从而下调walR基因的表达量，使得粪肠球菌表现有如下：较低的胞外多糖合成能力，较低的生物膜成膜能力，较低的活性和较低的毒力因子表达量水平，以及较低的耐药性等。此特点，为利用该突变菌采用内源性生态治疗的手段治疗粪肠球菌感染疾病提供了基础和保证。

进一步地，在一些实施方式中，所述反义RNA表达载体的骨架为pDL278，其含有表达所述反义RNA的表达序列。

进一步地，在一些实施方式中，所述表达序列位于所述pDL278质粒载体的BamHI和EcoRI酶切位点之间。

另一方面，本发明提供制备如上任一项所述的粪肠球菌突变菌的试剂，其能够被导入野生型粪肠球菌并抑制walR基因的表达。

进一步地，在一些实施方式中，所述试剂为反义RNA。

进一步地，在一些实施方式中，所述反义RNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1中的菌株的扫描电镜形态鉴定结果图；

图2为本发明实验例1中的菌株的胞外多糖含量实验结果图；

图3为本发明实验例1中的菌株在牙本质的活性实验比较结果图；

图4为本发明实验例1中的菌株在牙本质中合成胞外多糖的实验结果图；

图5为本发明实验例1中的菌株的碱液耐受性比较结果图；

图6为本发明实验例1中的菌株结晶紫染色结果图；

图7为本发明实验例2中的菌株WalR蛋白表达量结果图；

图8为本发明实验例2中的菌株walR基因及毒力相关基因表达量结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种粪肠球菌突变菌株的制备方法，包括以下步骤：

1.1将分离得到的野生型粪肠球菌(即：Enterococcus faecalis V583，简称“E.faecalis V583”或粪肠球菌V583，该菌由四川大学华西医院口腔疾病研究国家重点实验室提供，现有菌株，接种于牛脑心浸液BHI培养基(Sigma-Aldrich Corp Saint Louis,MO,USA)，细菌常规传代过夜培养于DY-2型厌氧培养箱(37℃，5％CO

需要说明的是，在其他的实施例中，采用其他野生型粪肠球菌作为出发菌株也可以取得相同或类似的技术效果。

1.2根据walR基因序列，设计反义RNA序列，walR基因的反义RNA的碱基序列如SEQID No.1所示，并设计特异引物序列(含酶切位点BamHI和EcoRI)，以反义RNA的DNA序列为模板扩增获得表达反义RNA的反义RNA表达序列，如下：

下划线为酶切位点。

1.3将pDL278质粒载体分别用BamHI和EcoRI进行双酶切，并回收获得pDL278线性片段，并与反义RNA表达序列通过连接酶连接得到反义RNA表达载体：pDL278-ASwalR重组质粒；

1.4将粪肠球菌V583接种于牛脑心浸液BHI培养基中，传代过夜厌氧培养，待用；

1.5取2μL的pDL278-ASwalR重组质粒，加入到含有50μL的粪肠球菌V583菌液的500μL的BHI液体培养基中进行转化，同时BHI液体培养基中含有终浓度为1μg/mL的感受肽；

1.6步骤1.5中转化后的菌液于37℃的条件下厌氧培养120min，得到转化菌液；

1.7将厌氧培养的转化菌液接种于带有壮观霉素的BHI平板(壮观霉素的终浓度为1000μg/mL的)，37℃厌氧培养48h，并传代得到粪肠球菌突变菌株(WL20180710)，其walR基因被抑制表达。

该突变菌株的胞外多糖合成能力以及生物膜成膜能力较低，活性较差，毒力因子表达量水平低；该粪肠球菌突变菌可以通过内源性生态治疗的策略用于预防或治疗因粪肠球菌感染引起的疾病例如根尖周炎。

实验例1

本实验例中，检测实施例1提供的粪肠球菌突变菌株的菌落形态、胞外多糖含量、细菌活性以及pH耐受能力。

(1)通过扫描电镜观察实施例1提供的粪肠球菌突变菌(ASwalR)与粪肠球菌V583(E.faecalis)的菌落形态，结果见图1。粪肠球菌突变菌(ASwalR)的生物膜成膜能力较低。

(2)通过激光共聚焦的方法，测定粪肠球菌突变菌株与粪肠球菌V583的胞外多糖含量，以及粪肠球菌突变菌株与粪肠球菌V583菌株在牙本质的细菌活性的差异、粪肠球菌突变菌株与粪肠球菌V583菌株在牙本质中合成胞外多糖的能力。

胞外多糖含量的结果如图2所示，从图2可以看出，粪肠球菌突变菌株(ASwalR)的颜色变浅，说明粪肠球菌突变菌株的胞外多糖含量降低。

细菌活性的差异结果如图3所示，通过观察发现，粪肠球菌突变菌株(ASwalR)的颜色明显弱于粪肠球菌V583菌株，说明粪肠球菌突变菌株(ASwalR)的细菌活性下降。

粪肠球菌突变菌株(ASwalR)与粪肠球菌V583菌株在牙本质中合成胞外多糖的能力对比结果如图4所示，从图4可看出，粪肠球菌突变菌株(ASwalR)在牙本质中胞外多糖合成能力下降。

(3)分别测定粪肠球菌突变菌株与粪肠球菌V583碱性环境的耐受能力，即粪肠球菌突变菌株(ASwalR)与粪肠球菌V583经碱性溶液处理后死活菌比例差异。

实验结果如图5所示，从图5可以看出粪肠球菌突变菌株(ASwalR)的碱性环境耐受能力显著降低。

(4)通过结晶紫染色方法分析粪肠球菌突变菌株(ASwalR)与粪肠球菌V583菌株的成膜能力。

染色结果和吸光度测定结果如图6所示；从图6可以看出，粪肠球菌突变菌株(ASwalR)染色程度明显低于粪肠球菌V583菌株，说明粪肠球菌突变菌株(ASwalR)的生物膜形成能力下降；从图6的吸光度值可以看出粪肠球菌突变菌株的吸光度值显著低于粪肠球菌V583菌株；进一步说明粪肠球菌突变菌株(ASwalR)的生物膜形成能力下降。

实验例2

本实验例中，检测实施例1提供的粪肠球菌突变菌株的walR基因以及毒力相关基因的表达量和WalR蛋白的含量。

提取粪肠球菌突变菌株(ASwalR)和粪肠球菌V583菌株的WalR蛋白，并进行SDS-PAGE试验和Western blot实验。

结果如图7所示，从图7可以看出，粪肠球菌突变菌株(ASwalR)的WalR蛋白表达量下降。

对粪肠球菌突变菌株(ASwalR)和粪肠球菌V583菌株中walR基因以及毒力相关基因ace、gel、esp、walK、epaOX、epaA、carA、carB的表达量进行检测，表达量的检测用SYBRGreen I嵌合荧光法进行Real-time PCR扩增。采用ABI PRISM 7300按照两步法进行PCR扩增程序进行。引物序列如表1所示。

表1荧光定量PCR引物表

从图8可以看出(图中每个基因对应的柱状图中，从左往右依次是E.faecalis、ASwalR、pDL278)，粪肠球菌突变菌株(ASwalR)的walR基因及毒力相关基因的表达量都明显下降。

综上可以看出，本发明实施例提供的粪肠球菌突变菌(ASwalR)，walR基因被抑制后，其胞外多糖合成能力以及生物膜成膜能力较低，其活性降低，毒力因子表达量水平低；采用上述粪肠球菌突变菌通过内源性生态治疗的策略对治疗因粪肠球菌感染引起的相关疾病如根尖周炎具有治疗效果，本发明为粪肠球菌感染疾病的预防和治疗提供了新的思路和策略。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 粪肠球菌突变菌、粪肠球菌感染的治疗药物以及应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 706

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

uuacuccugu ucaggauuuc uuagauaaua accaacccca cgacgaguaa cuaaauacgu 60

uggaugacuu ggacuaucuu caauuuuuuc ucuuaaacga cguacgguua cguccacugu 120

ccgcacaucc ccaaaauaau cauaacccca aacgguuugu aauaaauguu cacgagucau 180

cacuuguccg auauguuuug cuaaguaaua aaguaacuca aauucacggu ggguuaauuc 240

aauuuuuuca ccccguuuug agaccaugua ugcaucagga ugaaugguua aaucaccaau 300

cguuaauuca gauuguguug ucaccucggc uucuuucgca uugguugcac cucgccguaa 360

auuggcuuuu acacgagcaa cuaauucacg auuugaaaau gguuucguua cauagucauc 420

ggcuccuaau uccaauccua aaaccuuauc aauuucagaa ucuuuggcag ucaccauaau 480

gauuggcaua ucauguguuu ugcgcacuuc ucgcgcgacu ucuaagccau ccauuuuagg 540

gagcauuaag ucuaaaauaa uuaagucugg uuccacuucu uccacuuuuu caagugcuuc 600

uucuccauca uaagcaguaa auacuucaua uccuucuuua accaaauuau auuuaacgau 660

cucugaaauu ggcuucucgu caucaacuac uaaaauuuuc uucacg 706

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcaacgcga agaaccttac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 18

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<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 18

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<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

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