依托泊苷在促进骨再生修复中的应用

摘要

本发明提供一种活性物质的用途，其特征在于：所述活性物质为依托泊苷或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、消旋体、水合物、溶剂化物、代谢产物以及药学上可接受的盐或前药：所述用途为制备促进干细胞成骨分化及骨再生修复的药物。

说明书

技术领域

本发明提供了一种活性物质的新用途，具体地，涉及抗肿瘤药物依托泊苷促进干细胞成骨分化及骨再生修复的作用及机制。

背景技术

原发性骨肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤，良性肿瘤常见骨瘤、骨性骨瘤等，而恶性肿瘤中以骨肉瘤尤为常见，多发生于青少年。临床上对于恶性骨肿瘤及巨大的良性肿瘤的治疗方法主要是外科手术联合新辅助化疗。而骨肿瘤外科手术通常力求彻底，以免复发或引起恶变。对于术后巨大骨缺损，临床工作中虽然可以应用不同的技术来进行骨重建，包括异体(种)骨移植、内用假体等。然而，这些方法会常常会导致骨折不连、感染、机械并发症等诸多问题。术后造成的较大的骨缺损或骨重建不良仍然是目前骨科临床面临的一大挑战，寻找能够抑制肿瘤细胞并促进干细胞向成骨分化的药物是解决这一难题的有效策略。

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，提供一种既能够抑制肿瘤，又能够促进干细胞成骨分化及骨再生修复的药物

本发明提供的一种活性物质的用途，其特征在于：

上述活性物质为依托泊苷或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、消旋体、水合物、溶剂化物、代谢产物以及药学上可接受的盐或前药：

上述用途包含如下用途中的至少一种：

用途1.制备促进干细胞成骨分化的药物；

用途2.制备用于骨再生修复的药物。

进一步地，本发明提供的一种活性物质的用途，其特征还在于：

上述用途还包括制备促进结缔组织生长因子的表达的药物。

进一步地，本发明提供的一种活性物质的用途，其特征还在于：

上述用途还包括制备激活结缔组织生长因子的靶基因DNA结合抑制因子1 的药物。

进一步地，本发明提供的一种活性物质的用途，其特征还在于：

上述用途还包括制备促进runt相关转录因子2及成骨特异性转录因子的表达的药物。

进一步地，本发明提供的一种活性物质的用途，其特征还在于：

上述用途还包括制备增加ALP、OCN、COL1A1的mRNA表达的药物。

进一步地，本发明提供的一种活性物质的用途，其特征还在于：

上述药物中上述活性成分的用量为药物总重量的10

进一步地，本发明提供的一种活性物质的用途，其特征还在于：

上述活性成分作为药物使用时的有效浓度为≥0.001μmo l/L。

进一步地，本发明提供的一种活性物质的用途，其特征还在于：

当上述活性成分的浓度≥0.1953μmo l/L时，抑制干细胞的增殖。

进一步地，本发明提供的一种活性物质的用途，其特征还在于：

上述药物的剂型为经胃肠道以外给药途径剂型或经胃肠道给药剂型；

上述药物的给药途径剂型选自注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂；

当用途为制备促进干细胞成骨分化及骨再生修复的，其给药途径优选：为经由外科植入或填充的，外科植入物医疗器械(假体、骨棒、骨板、骨针、骨钉、脊柱内固定器材等)、外科填充材料(生物材料等)。

上述注射给药剂型的输注方式选自静脉内输注、腹膜内注射、皮下输注、肌肉输注。

另外，本发明还提供了一种细胞模型，其特征在于：对离体干细胞进行成骨诱导液诱导的。

依托泊苷(Etoposide，VP-16)是植物成分鬼臼脂素的半合成衍生物，由于其具有广谱抗癌活性和相当高的治疗指数而应用于抗肿瘤治疗，于1983年由美国FDA批准上市。本发明发现依托泊苷对于干细胞成骨分化有明显促进作用，进一步通过RNA-seq技术进行转录组测序和生物信息学分析，发现依托泊苷可显著促进结缔组织生长因子(connectivetissue growth factor，CTGF)的表达，并激活其靶基因DNA结合抑制因子1(inhibitor ofDNA binding 1，ID1)，进而激活ID1下游成骨关键转录因子runt相关转录因子2(runtrelated transcr iption factor 2，Runx2)和成骨特异性转录因子(Osterix，OSX), 从而促进干细胞成骨分化。本发明的研究为肿瘤切除术后骨缺损或骨重建不良提供可行的新策略及理论依据。

附图说明

图1.CCK-8法检测依托泊苷对MSCs细胞增殖活性的影响；

其中，图A为不同浓度依托泊苷(0～25μM)与MSCs孵育12hMSC的活性；

图B为不同浓度依托泊苷(0～25μM)与MSCs孵育24hMSC的活性；

图C为不同浓度依托泊苷(0～25μM)与MSCs孵育36hMSC的活性；

图D为不同浓度依托泊苷(0～25μM)与MSCs孵育48hMSC的活性；

图E为不同浓度依托泊苷(0～25μM)与MSCs孵育60hMSC的活性。

图2.碱性磷酸酶染色检测依托泊苷对干细胞ALP活性的影响；

其中,图A为不同浓度的依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与人MSCs 孵育7天后ALP的活性；

图B为图A中ALP活性的定量统计；

图C为不同浓度的依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与小鼠MSCs 孵育7天后ALP的活性；

图D为图C中ALP活性的定量统计；

图E为不同浓度的依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与UMR-106 孵育3天后ALP的活性；

图F为图E中ALP活性的定量统计。

图3.碱性磷酸酶染色检测依托泊苷对干细胞ALP活性的影响；

其中，图A为不同浓度的依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与人 MSCs孵育14天后钙结节含量；

图B为图A中钙结节含量的定量统计；

图C为不同浓度的依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与小鼠MSCs 孵育14天后钙结节含量；

图D为图C中钙结节含量的定量统计。

图4实时荧光定量PCR检测依托泊苷对MSCs成骨相关基因表达的影响；

其中，图A为不同浓度依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与MSC 孵育并成骨诱导5天后对成骨相关基因ALP的mRNA表达的影响；

图B为不同浓度依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与MSC孵育并成骨诱导5天后对成骨相关基因OCN的mRNA表达的影响；

图C为不同浓度依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与MSC孵育并成骨诱导5天后对成骨相关基因COL1的mRNA表达的影响；

“*”表示与0μM组相比p＜0.05，“**”表示与0μM组相比p＜0.01。

图5RNA-seq检测发现依托泊苷靶向CTGF调节UMR-106细胞；

其中，图A为Venn图表示依托泊苷对UMR-106细胞差异基因的表达变化；

图B为Scatter图显示依托泊苷对UMR-106细胞差异基因的表达变化；

图C为Heatmap图显示依托泊苷对UMR-106细胞差异基因的表达变化；

图D为不同浓度依托泊苷(0,0.001,0.01和0.1μM)与UMR-106细胞孵育3天后CTGF的mRNA表达变化。

图6依托泊苷通过调节ID1来促进成骨相关下游基因的表达；

其中，图A为不同浓度依托泊苷(0,0.001,0.01，0.1和1μM)与MSC 孵育并成骨诱导7天后Runx2、OSX、ID1蛋白表达。

图B为Runx2蛋白的定量统计；

图C为OSX蛋白定量统计；

图D为ID1蛋白定量统计；

“**”表示与0μM组相比p＜0.01。

具体实施方式

在本实施例中，将依托泊苷与MSCs共培养以确定其工作浓度；用依托泊苷对原代间充质干细胞(MSCs)及成骨细胞系UMR-106进行处理，通过碱性磷酸酶(ALP)、茜素红染色及实时荧光定量PCR观察依托泊苷对干细胞成骨分化的影响；将依托泊苷与UMR-106细胞共孵育后对样品进行转录组测序和生物信息学分析，寻找依托泊苷促进干细胞成骨分化的靶基因，并通过Western blot进行验证。

结果发现依托泊苷浓度≥0.1953μM时显著抑制MSCs的增殖；ALP染色、茜素红染色及荧光定量PCR结果显示依托泊苷对干细胞成骨分化具有明显促进作用，RNA测序分析及蛋白检测结果表明，依托泊苷可刺激干细胞分泌结缔组织生长因子(CTGF)、并激活其靶基因DNA结合抑制因子1(ID1)，进而促进runt 相关转录因子2(RUNX2)及成骨特异性转录因子(OSX)的表达。

具体过程如下：

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

雌性C57BL/6J小鼠,6～8周龄，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，饲养于上海交通大学附属新华医院动物房，饲养环境为SPF级。生产许可证号为SCXK (沪)2013-0018,使用许可证号为SYXK(沪)2013-0062。

1.1.2实验试剂

α-MEM培养基(Hyclone，美国),低糖DMEM培养基(Hyclone，美国)，胎牛血清(Gibco，美国),青-链霉素溶液(Gibco，美国)，CCK8试剂(日本同仁化学，日本)。BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天，中国)。茜素红S染色试剂(Sigma Aldrich，美国)。抗坏血酸、地塞米松及β-磷酸甘油(Sigma Aldrich，美国)。实时荧光定量聚合酶链反应相关试剂(TaKaRa公司,日本)。小鼠GAPDH抗体(sc-166574,美国，Santa Cruz),RUNX2抗体(ab76956，Abcam，美国)，OSX抗体(ab209484，Abcam，美国)，ID1抗体(ab134163，Abcam，美国)，鼠抗兔二抗抗体(sc-2357，Santa Cruz，美国)，山羊抗鼠二抗抗体(ab6788， Abcam，美国)。

1.1.3实验仪器

1.2实验方法

1.2.1小鼠的MSCs分离、培养

将6～10周龄的小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精消毒10分钟后，取出股骨和胫骨，将骨附着的肌肉剥离干净，切断干骺端，将骨髓从骨髓腔中冲出，用70μ m滤网过滤至50ml离心管，1000转离心5分钟。去上清，加入α-MEM完全培养基(10％胎牛血清，1％双抗)重悬，种于10cm培养皿中，置于37℃、5％CO

1.2.2人的MSCs分离、培养

人的骨髓液标本收集经新华医院伦理委员会同意并征得患者的知情同意后，选取新华医院骨科手术室股骨颈骨折术后病人的骨髓液。将约15毫升的骨髓液1000转离心5分钟后，吸除上层脂肪液层及中层的絮状细胞层，余下约5 毫升的骨髓沉淀液加10毫升低糖DMEM完全培养基(10％胎牛血清，1％双抗)重悬后种至10cm培养皿中，置于37℃、5％CO

1.2.3 MSCs体外成骨诱导

将P5代的小鼠MSCs或P2代的人MSCs种至6孔板中，待细胞融合至40％后加入成骨诱导液(50μM的抗坏血酸,10mM的β-磷酸甘油和100nM的地塞米松)，此后每3天更换诱导液。

1.2.4细胞增殖实验

将P5代的小鼠MSCs细胞以每孔4*10

1.2.5细胞碱性磷酸酶活性实验

小鼠P5代或人P2代MSCs细胞：接种于6孔板中，待细胞融合至40％～50％后更换成骨诱导培养基，按药物浓度的不同分为0、0.001、0.01、0.1、1μmol/L 组，每组设3个复孔。在37℃、5％CO

UMR-106细胞：接种于6孔板中，待细胞融合至30％～40％后更换培养基，按组别的不同分为未加药组、加药组(分别含依托泊苷0.001、0.01、0.1、1μmol/L) 共5组，每组设3个复孔。在37℃、5％CO

1.2.6细胞基质矿化测定

小鼠P5代或人P2代MSCs细胞接种于6孔板中，待细胞融合至40％～50％后更换成骨诱导培养基，按药物浓度的不同分为0、0.001、0.01、0.1、1μmol/L 组，每组设3个复孔。在诱导14天后，去除培养基，PBS清洗3遍，加5％多聚甲醛固定15分钟后，PBS清洗3遍，向每孔细胞加入1mL的茜素红染色液进行染色。

1.2.7成骨相关基因mRNA表达的测定

小鼠P5代MSCs细胞接种于6孔板中，待细胞融合至40％～50％后更换成骨诱导培养基，按药物浓度的不同分为0、0.001、0.01、0.1、1μmol/L组，每组设3个复孔。在诱导第5天后收集细胞，每孔细胞加入1mL的RNA裂解试剂，提取细胞总RNA后检测浓度，按反转录试剂盒说明方法取每孔RNA(1μg)进行逆转录，反转录得到的20μL cDNA稀释10倍后加入相关引物和酶进行qPCR检测。得到Ct值后，以GAPDH作为内参，用2

表1引物序列

1.2.8成骨相关基因蛋白表达的测定

小鼠P5代MSCs细胞接种于6孔板中，待细胞融合至40％-50％后更换成骨诱导培养基，按药物浓度的不同分为0、0.001、0.01、0.1、1μmol/L组，每组设3个复孔。在诱导第7天后收集细胞，每孔加入RIPA裂解液100μL和100 mmol/L蛋白酶抑制剂1μL，刮下细胞碎片，冰上放置30min，4°12000转离心10min，取上清并加入4*上样缓冲液，98°煮10分钟。将等量各组上样至SDS-PAGE凝胶，进行电泳分离，再将凝胶通过电转移至NC膜。将膜置于封闭液中在摇床上孵育1h后，将膜分别与RUNX2抗体、OSX抗体及ID1抗体在4°摇床孵育过夜。次日加入二抗，室温孵育1h，将配置好的显影液滴加到膜表面, 放入显影仪器中显影拍照。

1.2.9 RNA-seq

设对照组：UMR-106细胞(不加药)和实验组：UMR-106细胞+0.001μmol/L 依托泊苷，每组3个复孔，孵育3天后，利用TRIzol试剂提取各组总RNA，之后由生工生物工程(上海)有限公司的Illumina Xten平台，对原始数据经过质控后，mapping至参考基因组序列，对mapping到基因上的reads进行计数，计算基因的表达量后，进行基因表达差异分析。

1.3统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,所有数据以均数±标准差表示，两组样本间的均数比较采用独立样本的t检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。“*”表示“P<0.05”，“**”表示“P<0.005”。

2结果

2.1依托泊苷对MSCs细胞增殖的影响

采用等倍稀释法用培养液配制浓度为0.02441～25μmol/L的依托泊苷，作用于小鼠原代MSCs 12h、24h、36h、48h、60h后通过检测到的OD值来表示MSCs 的增殖能力。研究结果显示，依托泊苷对MSCs细胞增殖的影响呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性，当依托泊苷浓度≥0.1953μmol/L(0.1953μΜ)时，在作用于MSCs 12h、24h、36、48、60h均显著抑制MSCs增殖(图1)。

2.2依托泊苷作用于干细胞后的ALP活性检测

根据依托泊苷对MSCs细胞活力的影响，选取0.001、0.01、0.1、1μΜ四个浓度，对人MSCs、小鼠MSCs进行处理并成骨诱导7天后，检测ALP活性(图 2A、B)。对UMR-106细胞分别加0.001、0.01、0.1、1μΜ的依托泊苷，并设不加药组为对照组，药物处理3天后检测ALP活性(图2C)。结果显示，人MSCs 0.01、 0.1μΜ依托泊苷组ALP染色较未加药组明显加深；小鼠MSCs 0.001、0.01、0.1 μΜ依托泊苷组的ALP染色较未加药组明显加深。UMR-106细胞依托泊苷组ALP 染色明显均高于对照组，说明依托泊苷能促进人MSCs、小鼠MSCs、成骨细胞系UMR-106细胞的成骨分化。

2.3依托泊苷作用于MSCs后的矿化结节染色

对人MSCs、小鼠MSCs进行依托泊苷处理并成骨诱导14天后，利用茜素红染色检测矿化结节(图3)，结果显示与未加药组相比，人MSCs、小鼠MSCs 0.001、 0.01、0.1μΜ依托泊苷组钙结节染色明显加深，而1μΜ依托泊苷组染色呈阴性，可能和依托泊苷导致的细胞凋亡相关。

2.4依托泊苷作用于MSCs后ALP、OCN、COL1A1的mRNA表达变化

对人MSCs、小鼠MSCs进行依托泊苷处理并成骨诱导5天后，与未加药组相比，0.01、0.1、1μΜ依托泊苷组成骨相关标志物ALP表达明显升高；0.001、 0.01、0.1μΜ依托泊苷组OCN表达明显升高、依托泊苷组COL1A1 mRNA表达均明显升高，差异有统计学意义(图4)。

2.5依托泊苷作用于UMR-106细胞后RNA测序分析

选择浓度为0.001μmol/L的依托泊苷和UMR-106细胞孵育3天后进行mRNA 测序检测基因的表达变化。Venn图结果显示与对照组相比，依托泊苷可以促进 965个基因表达，同时抑制1215个基因表达(图5A)。进一步我们将表达变化大于2倍并且p值小于0.05的基因筛选出来并利用scatter图和heatmap图展示，结果显示和对照组相比，依托泊苷组有31个基因表达上调，49个基因表达下调(图5B和5C)。在表2中我们列出了依托泊苷组表达上调倍数最高的前 20个基因名称、上调倍数和p值。其中CTGF因对成骨调控基因ID1具有调节功能而对其进行了验证，证实依托泊苷可促进CTGF表达(图5D)。

表2 mRNA测序显示依托泊苷促进URM-106表达上调倍数最高的前20个基因

2.6依托泊苷作用于MSCs后RUNX2、OSX、ID1的蛋白表达变化

Western blotting结果显示与未加药组相比，依托泊苷组CTGF靶基因ID1 显著升高，差异有统计学意义；0.001、0.01、0.1μΜ依托泊苷组ID1下游成骨关键转录因子RUNX2显著升高(P<0.01)、成骨特异性转录因子OSX表达在依托泊苷作用下均显著升高(P<0.01)(图6)。

本实施例的作用和效果：

骨肿瘤术后造成的骨缺损或骨重建不良是目前骨科临床面临的一大挑战，干细胞由于其优越的再生潜能成为器官和组织再生领域的研究热点。有别于一般骨缺损的骨再生，骨肿瘤术后骨再生的理想状态为：在抑制肿瘤细胞的同时促进干细胞骨修复，本研究在目前临床抗肿瘤药物中筛选到了具有此双刃剑作用的依托泊苷，发现依托泊苷具有促进干细胞向成骨细胞分化的功能。碱性磷酸酶(ALP)是MSCs向成骨细胞分化的早期标志性酶，我们检测了人原代MSCs、鼠原代MSCs、成骨细胞系UMR-106经不同浓度的依托泊苷处理后的ALP活性，结果显示依托泊苷能显著增加干细胞早期成骨分化。成骨细胞形成的钙结节是MSCs晚期成骨分化的标记物。研究结果显示在依托泊苷的作用下，MSCs成骨分化晚期钙结节数显著增加。为了进一步说明依托泊苷对MSCs成骨分化的影响，我们又通过mRNA检测了成骨分化的标志物，证实了依托泊苷能显著增加MSCs 成骨分化过程中关键标志物如ALP、OCN、COL1A1的mRNA表达。

转录组测序(Transcriptome sequencing，RNA-Seq)可在RNA水平上研究基因表达差异，目前已应用于多种疾病诊疗的分子机制研究。为研究依托泊苷促进干细胞成骨分化的机制，本研究利用Illumina Xten高通量RNA-seq技术对依托泊苷处理3d(实验组)及未处理(对照组)成骨细胞系UMR-106样品进行转录组测序，结果发现依托泊苷可以促进965个基因的表达，同时降低1215个基因的表达。随后我们将实验组中表达变化大于2倍并且p值小于0.05的基因筛选出来分析，并通过PCR验证发现：依托泊苷可显著促进结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)的表达。结缔组织生长因子(CTGF) 属于CCN蛋白家族，是一种38kDa、富含半胱氨酸的细胞外基质蛋白，由四个结构域或模块组成。CTGF/CCN2已被证明可调节多种细胞功能，并参与更复杂的生物学过程，如软骨生成和成。研究还表明，在骨骼组织的修复或再生过程中， CTGF的表达显著增加。而重组形式的CTGF处理可以刺激成骨细胞或细胞系的增殖和分化。

已有研究表明研究数据证明DNA结合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1，ID1)是CCN2(即CTGF)的下游信号通路，且沉默ID1的表达能下调成骨标志物OPN的表达。ID1在机体生命过程中发挥重要作用，包括细胞发育、衰老、分化、血管生成和迁移。此外，ID1还能在驱动神经干细胞、造血干细胞的自我更新的能力。有研究表明，ID1是成骨信号的重要激活分子，也是BMP信号通路信号的靶基因。为了进一步验证转录组测序结果，我们在蛋白水平检测了依托泊苷作用下MSCs成骨分化过程中ID1及ID1下游成骨关键转录因子Runx2和OSX 的表达，研究筛选出依托泊苷的最佳工作浓度为0.001μΜ，在此工作浓度下依托泊苷对干细胞增殖无明显影响，而能够显著增加MSCs成骨分化过程中ID1、 Runx2和OSX的表达，从而促进干细胞成骨分化。

依托泊苷在抗肿瘤方面起着重要的作用。它通常联合其他化疗药物用于小细胞肺癌，骨肉瘤、乳腺癌等肿瘤的治疗，并能显著提高生存率。本研究发现了依托泊苷的另一个重要功能：促进干细胞分化成骨分化。此外，我们通过RNA 测序及mRNA和蛋白水平的验证发现，依托泊苷促进干细胞成骨分化的重要机制为：依托泊苷促进干细胞中CTGF的表达，激活其靶基因ID1，进而激活ID1下游成骨关键转录因子Runx2和OSX，这对未来研究依托泊苷的药物靶点、药物新功能研究等提供了重要发现。研究为临床肿瘤切除术后的骨缺损、保肢重建治疗的临床难题提供了一个新的可行策略及理论依据。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属新华医院

<120> 依托泊苷在促进骨再生修复中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

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