一种通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤的基因

摘要

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤的基因，包括：利用脂多糖注射BALB/c小鼠构建脓毒症小鼠模型；细胞培养与处理；末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记；通过CCK‑8测定分析细胞活力；细胞凋亡分析；定量逆转录‑PCR；蛋白质印迹分析；荧光素酶报告基因分析；RNA下拉；用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。本发明利用脂多糖注射BALB/c小鼠构建脓毒症小鼠模型，观察CASC7对脓毒症肝损伤的影响，对CASC7对脓毒症肝损伤作用机制进行研究。研究结果表明，CASC7通过靶向miR‑217/TLR4轴参与脓毒症肝损伤的发生。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤的基因。

背景技术

目前，脓毒症是由感染引起全身炎症反应综合征引起的一种致命的疾病。脓毒症发生在机体对感染的应答过程中，继而导致器官或组织的损伤，其中脓毒症死亡的发生率高达25％-30％。在脓毒症进展过程中，肝脏是异常炎症过程的潜在靶器官。脓毒症所致肝损伤的高发病率和临床死亡率已被认为是一个重要的公共卫生问题。脓毒症诱导的肝损伤与多种分子和细胞过程相关。在脓毒症所致肝损伤的发展过程中，炎症细胞因子能够损伤各种组织或器官，调节免疫反应失调。IL-1和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF-a)在早期控制免疫反应，由免疫细胞显著表达和分泌，进行转录和翻译后调节。然而，脓毒症所致肝损伤的机制尚不清楚。

长非编码RNA(LncRNAs)是一类含有200多个核苷酸的非编码分子，与RNA、DNA和蛋白质相互作用，调节转录、染色质重塑和转录后修饰。LncRNAs是一种新兴的重要生物调控因子，在细胞周期、分化、凋亡、心血管疾病和肝病等生理病理过程中发挥着多种作用。lncRNAs在脓毒症中的异常调节可能与脓毒症所致脏器损害的发展有关。已有报道LncRNANEAT1通过Let-7A/TLR4信号转导增加脓毒症所致肝损伤的炎症反应。LncRNA MALAT1通过与miR-125b和p38/MAPK/NF-kB相互作用调节脓毒症引起的心功能障碍和炎症。LncRNA H19作为水通道蛋白1的竞争性内源性RNA，在LPS诱导的脓毒症中介导miR-874的表达。LncRNAHOTAIR通过激活LPS产生的脓毒症小鼠模型心肌细胞中的NF-kB通路来提高TNF-a的生成。LncRNACASC7在多种疾病模型，如癌症和脊髓缺血再灌注损伤中作为一种研究良好的LncRNA。然而，lncRNA CASC7在脓毒症肝损伤进展中的调节作用尚不清楚。

MicroRNAs(miRNAs)是一种长度约为20-25个核苷酸的短的非编码RNAs，对许多生物学过程产生重要影响。MiRNAs能够通过在3'非翻译区(3'UTR)与靶mRNAs配对来控制转录后水平的基因表达。大量的研究表明miRNAs参与了脓毒症所致肝损伤的进展。例如，有报道称miR-155通过靶向Nrf-2调节线粒体功能障碍和氧化应激介导的ER应激而加重肝损伤。血清miR-122水平升高可作为炎症性疾病肝损伤的独立生物标志物。同时，miR-217在炎症相关损伤中的作用已有报道。而且，Toll样受体4(TLR4)作为包括肝病在内的多种生理病理过程中必不可少的调节因子，已被鉴定参与脓毒症相关肝损伤的调节。此外，miR-217能够靶向TLR4调节足细胞凋亡。然而，lncRNA CASC7与miR-217和TLR4在脓毒症肝损伤中的相关性尚不清楚。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是由细菌膜释放的内毒素，与内皮细胞表面的受体相互作用，从而作为一种产生急性炎症的有害因子。LPS通过调节氧化应激或炎症因子以及内皮细胞的生长而引起脓毒症。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)脓毒症所致肝损伤的机制尚不清楚。

(2)lncRNA CASC7在脓毒症肝损伤进展中的调节作用尚不清楚。

(3)lncRNA CASC7与miR-217和TLR4在脓毒症肝损伤中的相关性尚不清楚。

解决以上问题及缺陷的难度为：脓毒症是机体对感染反应失控引起的全身炎症反应综合征，常导致多器官功能障碍，全球每年有近5000万脓毒症病例发生，死亡率约为25％～30％，已成为重大的公共卫生问题。脓毒症患者通常发生多器官功能衰竭，肺、肝、肾和心脏是严重受影响的器官，有研究表明，每增加一个器官的衰竭，患者死亡风险增加15％～20％。脓毒症延时注射会导致器官不可逆转损伤和功能衰竭，当脓毒症累及4到5个器官时，其死亡率增到90％以上。由于脓毒症发病机制复杂，因此对其机制研究，将对疾病的诊断、注射以及降低死亡率有重要意义。

解决以上问题及缺陷的意义为：目前对CASC7影响脓毒症肝损伤发生、发展的精确分子机制尚不完全清楚，因此进一步探索研究新基因的功能与脓毒症肝损伤发生、发展的关系，对揭示疾病发生发展的精确分子机制、设计合理的注射药物及判断预后，进一步提高脓毒症的诊疗水平具有重要意义。lncRNA与疾病的发生、发展存在一定联系，因此阐明一段可作为基因诊断、注射靶点的lncRNA，对脓毒症诊疗和预后具有非常重要的意义。本研究独特之处在于，证明了CASC7可通过CASC7/miR-217/TLR4轴促进脓毒症急性肝损伤的进展，提示CASC7可能作为脓毒症急性肝损伤注射的一个潜在靶点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤的基因。

本发明是这样实现的，一种通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤的基因，所述通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤的基因为CASC7，其序列为SEQ ID NO：1。

进一步，所述CASC7基因敲除可抑制LPS诱导的小鼠肿瘤坏死因子和白细胞介素-1的表达，CASC7作为miR-217在肝细胞中的海绵，CASC7通过海绵化miR-217促进脓毒症所致肝损伤的进展。

本发明的另一目的在于提供利用长链非编码RNA CASC7对脓毒症肝损伤的调控方法，所述利用长链非编码RNA CASC7对脓毒症肝损伤的调控方法包括以下步骤：

步骤一，利用脂多糖注射BALB/c小鼠构建脓毒症小鼠模型；

步骤二，细胞培养与处理；

步骤三，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记；

步骤四，通过CCK-8测定分析细胞活力；

步骤五，细胞凋亡分析；

步骤六，定量逆转录-PCR；

步骤七，蛋白质印迹分析；

步骤八，荧光素酶报告基因分析；

步骤九，RNA下拉；

步骤十，用GraphPadPrism 7软件进行统计分析。

进一步，步骤一中，所述脓毒症小鼠模型的构建，包括：

将雄性、四周龄的BALB/c小鼠保存在湿度和温度调节的地方，在通常的暗/光循环下12h，水和食物；腹腔注射20mg/kg的LPS或等体积生理盐水；小鼠尾静脉注射携带CASC7shRNA的慢病毒或相应对照；获得携带相应对照的CASC7 shRNA的慢病毒；用苏木精-伊红HE染色分析小鼠肝损伤情况；用ELISA法测定小鼠体内肿瘤坏死因子和白细胞介素-1水平。

进一步，步骤二中，所述细胞培养与处理，包括：

将人肝LO2细胞在含有10％胎牛血清，0.1mg/ml链霉素和100单位/ml青霉素的DMEM培养基中，于37℃，5％CO

进一步，步骤三中，所述末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记，包括：

利用TUNEL检测试剂盒检测小鼠肝组织中的细胞凋亡；TUNEL染色后，取心室标本用DAPI染色，进行核染色，并使用共聚焦显微镜观察荧光。

进一步，步骤四中，所述CCK-8测定，包括：

通过CCK-8测定分析细胞活力；将5×10

进一步，步骤五中，所述细胞凋亡分析，包括：

将2×10

进一步，步骤六中，所述定量逆转录-PCR，包括：

利用TRIZOL从小鼠组织和细胞中提取总RNA；使用Stand cDNA合成试剂盒作为制造商的说明书合成第一链cDNA；利用SYBR Real-time PCR I试剂盒进行qRT-PCR；mRNA/lncRNA和miRNA的标准对照分别为GAPDH和U6；RNA水平的定量测定用SYBR GreenPremix ExTaqTM II试剂盒进行。

进一步，所述引物序列如下：

CASC7前锋：5'-ATCAACGTCAAGCTGGGAGG-3'

CASC7反向：5'-CTTGTCCCCCGCTCGTTC-3'

TLR4前锋：5'-TGGATACGTTTCCTTATAAAG-3'

TLR4反向：5'-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3'

miR-217前进：

5'-CATGCTCGAGCTTATCAAGGATAAAAATACCATG-3'

miR-217反向：

5'-GTTACGGCCGCTTGAGATCTACCTCTAATTCTTTTTAAC-3'

GAPDH前锋：5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3'

GAPDH反向：5'-tccaccacccagttgctgta-3'

U6前锋：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'

U6反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

进一步，步骤七中，所述蛋白质印迹分析，包括：

用RIPA缓冲液从小鼠的细胞或肿瘤组织中提取总蛋白；用BCA蛋白定量试剂盒分析蛋白质浓度；用SDS-PAGE分离相同浓度的蛋白质，随后转移到PVDF膜；用5％的乳汁阻碍膜，用1：1000的PARPTLR4、裂解1：1000的PARP、caspase3、裂解1：1000的caspase3和1：1000的GAPDH，在4℃下孵出过夜，其中GAPDH作为对照；使用相应的1：1000的第二抗体在室温下孵化膜1h，通过使用Odyssey CLx红外成像系统进行可视化；Westernblot分析结果用ImageJ软件进行定量。

进一步，所述相同浓度的蛋白质是12％聚丙烯酰胺凝胶。

进一步，步骤八中，所述荧光素酶报告基因分析，包括：

利用双荧光素酶报告基因测定系统进行荧光素酶报告基因测定；利用miR-21模拟物或对照模拟物处理细胞，通过使用Lipofectamine 3000将含有CASC7、CASC7突变体、TLR4和TLR4突变体片段的载体转染到细胞中，随后分析荧光素酶活性，其中Renilla作为标准化对照。

进一步，步骤九中，所述RNA下拉，包括：

用MEGAscript T7试剂盒的biotin-UTP体外转录生物素标记的RNA，根据制造商的指导用MEGAclear试剂盒纯化，然后与整个细胞裂解物孵育；利用链霉亲和素珠分离生物素标记的转录物和相互作用的RNA后，进行qPCR分析。

进一步，步骤十中，所述统计分析，包括：

用GraphPad Prism 7软件进行统计分析；两组比较采用非配对t检验，多组比较采用单因素方差分析；其中，P<0.05有统计学意义。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的利用长链非编码RNACASC7对脓毒症肝损伤的调控方法，采用脂多糖(LPS)注射BALB/c小鼠，建立脓毒症小鼠模型。采用苏木精伊红(HE)染色、ELISA检测、TUNEL检测试剂盒、CCK-8检测、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒等方法，观察CASC7对脓毒症肝损伤的影响。通过RNA下拉法、荧光素酶报告基因分析、qPCR分析和Westernblot分析等方法对其作用机制进行了研究。

研究结果表明，CASC7在脓毒症小鼠肝组织和LPS处理的LO2细胞中的表达均呈时间依赖性升高。CASC7的耗竭可减轻LPS诱导的脓毒症小鼠肝损伤。LPS可促进脓毒症小鼠的细胞凋亡，而CASC7的耗竭可阻断这种促进作用。CASC7基因敲除可抑制LPS诱导的小鼠肿瘤坏死因子和白细胞介素-1的表达，而LPS诱导的CASC7基因敲除可抑制LPS诱导的小鼠肿瘤坏死因子和白细胞介素-1的表达。CASC7作为miR-217在肝细胞中的海绵。CASC7通过海绵化miR-217促进脓毒症所致肝损伤的进展。MiR-217通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤。因此，CASC7通过靶向miR-217/TLR4轴参与脓毒症肝损伤的发生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的利用长链非编码RNA CASC7对脓毒症肝损伤的调控方法流程图。

图2A-图2C是本发明实施例提供的lncRNA CASC7的表达与脓毒症肝损伤呈正相关的结果示意图。

图3A-图3D是本发明实施例提供的lncRNA CASC7缺失对脓毒症肝损伤的缓解作用的结果示意图。

图4A-图4G是本发明实施例提供的LncRNA CASC7在肝细胞中充当miR-217的海绵的结果示意图。

图5A-图5D是本发明实施例提供的LncRNA CASC7通过靶向miR-217促进脓毒症肝损伤的进展示意图。

图6A-图6H是本发明实施例提供的MiR-217靶向TLR4减轻脓毒症肝损伤的结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤的基因，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的利用长链非编码RNA CASC7对脓毒症肝损伤的调控方法包括以下步骤：

S101，脓毒症小鼠模型构建；

S102，细胞培养与处理；

S103，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记；

S104，通过CCK-8测定分析细胞活力；

S105，细胞凋亡分析；

S106，定量逆转录-PCR；

S107，蛋白质印迹分析；

S108，荧光素酶报告基因分析；

S109，RNA下拉；

S110，用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

1、脓毒症是一种可导致肝损伤的系统炎症性疾病。长非编码RNA作为重要的调节因子参与脓毒症肝损伤的调节。然而，lncRNA CASC7(CASC7)在脓毒症肝损伤中的调节作用尚不清楚。本发明旨在探讨CASC7对脓毒症所致肝损伤的影响，探讨lncRNA CASC7在脓毒症肝损伤中的作用。用脂多糖(LPS)注射BALB/c小鼠，建立脓毒症小鼠模型。以脓毒症小鼠模型和LPS处理的肝细胞为实验动物，研究CASC7对脓毒症肝损伤的影响及其机制。本发明鉴定了CASC7通过靶向miR-217/TLR4轴参与脓毒症诱导的肝损伤的进展。

方法：采用脂多糖(LPS)注射BALB/c小鼠，建立脓毒症小鼠模型。采用苏木精伊红(HE)染色、ELISA检测、TUNEL检测试剂盒、CCK-8检测、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒等方法，观察CASC7对脓毒症肝损伤的影响。通过RNA下拉法、荧光素酶报告基因分析、qPCR分析和Westernblot分析等方法对其作用机制进行了研究。

结果：CASC7在脓毒症小鼠肝组织和LPS处理的LO2细胞中的表达均呈时间依赖性升高。CASC7的耗竭可减轻LPS诱导的脓毒症小鼠肝损伤。LPS可促进脓毒症小鼠的细胞凋亡，而CASC7的耗竭可阻断这种促进作用。CASC7基因敲除可抑制LPS诱导的小鼠肿瘤坏死因子和白细胞介素-1的表达，而LPS诱导的CASC7基因敲除可抑制LPS诱导的小鼠肿瘤坏死因子和白细胞介素-1的表达。CASC7作为miR-217在肝细胞中的海绵。CASC7通过海绵化miR-217促进脓毒症所致肝损伤的进展。MiR-217通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤。

结论：CASC7通过靶向miR-217/TLR4轴参与脓毒症肝损伤的发生。

2、材料和方法

2.1脓毒症小鼠模型用脂多糖(LPS，sigma，USA)注射BALB/c小鼠建立脓毒症小鼠模型。简单地说，BALB/c小鼠(雄性，四周龄)(n＝5)被保存在一个湿度和温度调节的地方，在通常的暗/光循环下12小时，水和食物。腹腔注射LPS(20mg/kg)或等体积生理盐水。小鼠尾静脉注射携带CASC7 shRNA的慢病毒或相应对照。获得了携带相应对照的CASC7 shRNA的慢病毒(GenePharma，China)。用苏木精-伊红(HE)染色分析小鼠肝损伤情况。用ELISA法测定小鼠体内肿瘤坏死因子和白细胞介素-1水平。动物护理及方法程序经桂阳市第一人民医院动物伦理委员会授权。

2.2细胞培养与处理

人肝LO2细胞购自美国Type Tissue Culture Collection。细胞在含有10％胎牛血清(Gibco，USA)，0.1mg/ml链霉素(Solarbio，CHIA)和100单位/ml青霉素(Solarbio，CHIA)的DMEM培养基中37℃，5％CO

2.3末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法

用德国罗氏公司的TUNEL检测试剂盒检测小鼠肝组织中的细胞凋亡。TUNEL染色后，取心室标本用DAPI(美国Sigma)染色，进行核染色。使用共聚焦显微镜(OlympusFluoview1000，Tokyo，Japan)观察荧光。

2.4 CCK-8测定

通过CCK-8测定分析细胞活力。将约5×10

2.5细胞凋亡分析

将约2×10

2.6定量逆转录-PCR(qRT-PCR)

用TRIZOL(Invitrogen，USA)从小鼠组织和细胞中提取总RNA。使用Stand cDNA合成试剂盒(Thermo，USA)作为制造商的说明书合成第一链cDNA。应用日本Takara公司的SYBRReal-time PCR I试剂盒进行qRT-PCR。mRNA/lncRNA和miRNA的标准对照分别为GAPDH和U6。RNA水平的定量测定用SYBR GreenPremix Ex TaqTM II试剂盒(TaKaRa，Japan)进行。引物序列如下：

SEQ ID NO：1：

CASC7前锋：5'-ATCAACGTCAAGCTGGGAGG-3'

CASC7反向：5'-CTTGTCCCCCGCTCGTTC-3'

SEQ ID NO：2：

TLR4前锋：5'-TGGATACGTTTCCTTATAAAG-3'

TLR4反向：5'-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3'

SEQ ID NO：3：

miR-217前进：

5'-CATGCTCGAGCTTATCAAGGATAAAAATACCATG-3'

miR-217反向：

5'-GTTACGGCCGCTTGAGATCTACCTCTAATTCTTTTTAAC-3'

SEQ ID NO：4：

GAPDH前锋：5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3'。

GAPDH反向：5'-tccaccacccagttgctgta-3'

SEQ ID NO：5：

U6前锋：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'

U6反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

2.7蛋白质印迹分析

用RIPA缓冲液(CST，USA)从小鼠的细胞或肿瘤组织中提取总蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒(Abbkine，USA)分析蛋白质浓度。用SDS-PAGE分离相同浓度的蛋白质(12％聚丙烯酰胺凝胶)，在随后的步骤中转移到PVDF膜(Millipore，USA)。用5％的乳汁阻碍膜，用PARPTLR4(1:1000)(Abcam，USA)、裂解PARP(1:1000)(Abcam，USA)、caspase3(1:1000)(Abcam，USA)、裂解caspase3(1:1000)(Abcam，USA)和GAPDH(1:1000)(Abcam，USA)，在4℃下孵出过夜，其中GAPDH作为对照。然后，使用相应的第二抗体(1:1000)(Abcam，USA)在室温下孵化膜1小时，随后通过使用Odyssey CLx红外成像系统进行可视化。Westernblot分析结果用ImageJ软件进行定量。

2.8荧光素酶报告基因分析

利用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，USA)进行荧光素酶报告基因测定。简而言之，用miR-21模拟物或对照模拟物处理细胞，通过使用Lipofectamine3000(Invitrogen，USA)将含有CASC7、CASC7突变体、TLR4和TLR4突变体片段的载体转染到细胞中，随后分析荧光素酶活性，其中Renilla作为标准化对照。

2.9 RNA下拉

用MEGAscript T7试剂盒(Thermo，USA)的biotin-UTP体外转录生物素标记的RNA，并根据制造商的指导用MEGAclear试剂盒(Thermo，USA)纯化，然后与整个细胞裂解物孵育。用链霉亲和素珠分离生物素标记的转录物和相互作用的RNA，然后进行qPCR分析。

2.10统计分析

用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。两组比较采用非配对t检验，多组比较采用单因素方差分析。P<0.05有统计学意义。

3、结果

3.1 lncRNACASC7的表达与脓毒症肝损伤呈正相关

为探讨lncRNA CASC7与脓毒症肝损伤的关系，采用脂多糖(LPS)注射BALB/c小鼠，建立脓毒症小鼠模型。苏木精-伊红(HE)染色以时间依赖性方式揭示肝损伤症状，如肝脏结构紊乱、中性粒细胞浸润汇管区和肝窦、胞浆稀疏、结节性坏死、核固缩(见图2A)。同时，炎性细胞浸润过程中TNF-a和IL-1水平呈时间依赖性升高(P<0.01)(见图2B)。此外，LPS在小鼠肝组织中以时间依赖的方式提高了lncRNA CASC7的表达(P<0.01)(见图2C)。同样，LPS的处理时间依赖性地上调了LO2细胞中CASC7的表达(P<0.01)(见图2C)。这些数据提示lncRNACASC7的表达与脓毒症所致肝损伤呈正相关。

3.2 lncRNACASC7缺失对脓毒症肝损伤的缓解作用

然后，本发明在体内研究lncRNA CASC7对脓毒症诱导的肝损伤进展的影响。为此，用携带CASC7 shRNA或相应对照shRNA的慢病毒注射败血症小鼠。在小鼠肝组织中验证了CASC7 shRNA的有效性(P<0.05)(见图3A)。CASC7的耗尽显著降低了脓毒症小鼠LPS注射诱导的肝损伤(见图3B)。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析显示，LPS的处理增强了TUNEL阳性细胞，而CASC7的耗竭可阻断这种增强，表明CASC7的耗竭减弱了LPS诱导的细胞凋亡(P<0.05)(见图3C)。此外，CASC7基因敲除抑制了LPS增强的小鼠TNF-a和IL-1的表达(P<0.05)(见图3D)。这些提示lncRNA CASC7的耗尽减轻了脓毒症诱导的体内肝损伤。

3.3 LncRNACASC7在肝细胞中充当miR-217的海绵

接下来，本发明试图探讨lncRNA CASC7在LPS诱导的脓毒症肝损伤中的作用机制。通过LPS的处理，小鼠肝组织中miR-217的表达以时间依赖的方式减少(P<0.05)(见图4A)。同样，LPS的处理时间依赖性地下调了LO2细胞中miR-217的表达(P<0.05)(见图4B)。同时，lncRNA CASC7的缺失显著增强了LO2细胞中miR-217的表达(P<0.05)(见图4C)。生物信息学分析通过使用Starbase 3.0V软件确定了lncRNA CASC7和miR-217之间的潜在相互作用(见图4D)。miR-217模拟物的效率在LO2细胞中得到验证(P<0.05)(见图4E)。miR-217模拟物减弱了CASC7的荧光素酶活性，但在LO2细胞中对具有miR-217结合位点突变的CASC7没有影响(P<0.05)(见图4F)。RNA下拉试验显示野生型Bio-miR-217与CASC7相互作用，而突变型Bio-miR-217与CASC7相互作用(P<0.01)(见图4G)。这些结果提示lncRNACASC7在肝细胞中充当miR-217的海绵。

3.4 LncRNACASC7通过靶向miR-217促进脓毒症肝损伤的进展

然后本发明通过靶向肝细胞中的miR-217来评估CASC7是否促进了脓毒症诱导的肝损伤的进展。在LPS处理的LO2细胞中，CASC7的过表达抑制了细胞活力，而miR-217模拟物可以挽救细胞活力(P<0.05)(见图5A)。miR-217模拟物的处理能够逆转LPS处理的LO2细胞中CASC7过度表达增强的TNF-a和IL-1水平(P<0.05)(见图5B)。在LPS处理的LO2细胞中，CASC7过度表达诱导的凋亡被miR-217模拟物减弱(P<0.05)(见图5C)。在LPS处理的LO2细胞中，通过miR-217模拟物的处理降低了由CASC7过度表达升高的切割PARP(c-PARP)和切割caspase3(c-Caspase3)的表达(P<0.05)(见图5D)。这些数据表明lncRNA CASC7在体外通过海绵化miR-217促进脓毒症诱导的肝损伤的进展。

3.5 MiR-217靶向TLR4减轻脓毒症肝损伤

接下来，本发明探讨了miR-217在肝细胞中的下游作用靶点。生物信息学分析通过使用miRDB和miRmap软件在TLR43'UTR中鉴定了miR-217靶向位点(见图6A)。miR-217模拟物减弱了LO2细胞中TLR4的荧光素酶活性，但没有影响具有miR-217结合位点突变体的TLR4(P<0.01)(见图6B)。通过miR-217模拟物的处理，细胞中TLR4的蛋白表达减少(P<0.01)(见图6C)。CASC7的缺失使细胞内TLR4蛋白水平下调，而CASC7的过度表达使细胞内TLR4蛋白水平上调(P<0.01)(见图6D)。CASC7的耗尽降低了细胞中LPS升高的TLR4表达(P<0.01)(见图6E)。在细胞中验证了TLR4过表达的效率(P<0.01)(见图6F)。TLR4的过表达能够阻断miR-217的模拟-提高LO2细胞的细胞活力(P<0.05)(见图6G)。TLR4在细胞中的过度表达增强了miR-217模拟减弱的细胞凋亡(P<0.05)(见图6H)。这些数据表明miR-217在体外通过靶向TLR4来减轻脓毒症诱导的肝损伤。

4、讨论

脓毒症是由严重创伤、烧伤和术后感染引起的全身炎症性疾病，导致多脏器功能衰竭，包括肝损伤。脓毒症所致肝损伤的发生和死亡发生率较高。尽管如此，脓毒症所致肝损伤的机制仍然难以捉摸。在本研究中，本发明发现lncRNA CASC7通过调节miR-217/TLR4轴参与脓毒症肝损伤的进程。

脓毒症的发病机制是复杂的，lncRNAs参与了脓毒症的发生发展。多个lncRNAs参与了脓毒症肝损伤的发生发展。例如，差异显示的lncRNA结直肠肿瘤通过靶向miR-126-5p缓解败血症引起的肝损伤。循环lncRNANEAT1与败血症患者预后不良、严重程度高和风险增加相关。LncRNA SNHG16改变了miR-15a/16对LPS产生的炎症通路的影响。LPS通过刺激HUVECs的lncRNA hulc/miR-204-5p/trpm7轴增加脓毒症的发生。LncRNATapSAKI增加炎症损伤和尿源性脓毒症损伤。lncRNAHOTAIR通过介导miR-34a/bcl-2轴对脓毒症大鼠严重器官损伤的影响已有报道。LncRNANEAT1通过介导miR-204和改变NF-kB信号转导在脓毒症所致的严重损伤中发挥重要作用。lncRNAHULC和UCA1的增强表达对于LPS诱导的脓毒症在内皮细胞中的促炎反应是必需的。在本研究中，本发明发现在脓毒症小鼠中lncRNA CASC7的表达升高。LncRNACasc7在脓毒症肝损伤中的调控作用，为lncRNAs在脓毒症肝损伤中的基础作用提供了有价值的证据。

miRNAs作为非编码RNA的主要组成部分，在生理和病理过程中与lncRNAs相互作用，也参与了脓毒症肝损伤的调控。据报道，抑制miRNA155通过灭活JAK/STAT信号而抑制败血症引起的肝损伤。紫杉醇通过microRNA-27A/Tab3/NF-kB轴减轻炎症反应，减轻脓毒症小鼠的肝脏损伤。MCPIP1通过调节miR-9来控制SIRT1的表达，从而减轻脂多糖引起的肝损伤。MiR-103a-3p能够通过介导HMGB1抑制脓毒症引起的肝损伤。MiR-21在远端和局部缺血预处理中保护各器官免受脓毒症的影响。miRNA195抑制脓毒症小鼠模型的多器官损伤和细胞凋亡。MicroRNA-30e通过与FOSL2相互作用，调节JAK/STAT信号通路，抑制穿孔和盲肠结扎所致脓毒症中的细胞凋亡，促进肝细胞增殖。穿刺术和盲肠结扎所致脓毒症与腺苷酸环化酶9的表达抑制和miR142-3p的表达增强有关。本发明的数据表明lncRNA CASC7在肝细胞中起到了miR-217的海绵作用，并且lncRNA CASC7通过海绵化miR-217来促进脓毒症所致肝损伤的进展。本研究提供了miR-217参与CaSC7介导的脓毒症肝损伤进展的有价值的信息，为miR-217参与脓毒症肝损伤发展的调控提供了又一证据。

TLR4参与了脓毒症肝损伤的发生发展。TLR4拮抗剂厄立特里亚四钠通过抑制高迁移率族盒蛋白B1(HMGB1)信号传导抑制肝缺血再灌注损伤。右美托咪定对脓毒症肝损害的调节作用。

依赖于TLR4和MyD88/NF-kB信号的下调，部分通过抗炎胆碱能机制。曲古他汀通过抑制TLR4信号通路保护肝脏免受脓毒症损伤。绿茶提取物对非酒精性脂肪性肝炎肥胖小鼠的注射可恢复肝脏代谢组，其作用与抑制内毒素血症/TLR4/NF调节的炎症有关。实验性败血症产生的线粒体生物发生依赖于TLR9、TLR4和肝脏中的信号转导。TLR4的抑制降低了小鼠腹腔脓毒症和纠正环境中的细菌清除率。白细胞粘附素-1调节的CD11b刺激抑制了LPS产生的巨噬细胞促炎症反应，并通过抑制LPS-TLR4的相互作用保护了小鼠内毒素休克。细胞外组蛋白作为TLR4和TLR2在致命性肝损伤小鼠模型中破坏的介导剂。apilarnil通过TLR4/HMGB-1/NF-kB信号通路对脂多糖相关的大鼠肝损伤的保护作用已有报道。TLR4控制血小板容量，在失血复苏和休克中导致器官损伤和凝血异常。在本研究中，本发明揭示了miR-217通过靶向TLR4来减轻脓毒症诱导的肝损伤。提示TLR4在脓毒症诱导的肝损伤中起着重要的调节作用。

总之，本发明发现lncRNA CASC7通过靶向miR-217/TLR4轴参与脓毒症肝损伤的进展。本发明的发现为CASC7调节脓毒症诱导的肝损伤发展的机制提供了新的见解。LncRNACASC7、miR-217和TLR4可能是注射脓毒症肝损伤的潜在靶点。

缩写：lncRNAs，长非编码RNA；miRNAs，microRNAs；肿瘤坏死因子；脂多糖；TLR4，Toll样受体4。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 周晓倩

<120> 一种通过靶向TLR4减轻脓毒症诱导的肝损伤的基因

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcaacgtca agctgggagg cttgtccccc gctcgttc 38

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagaaggtgg tgaagcaggc tccaccaccc agttgctgta 40

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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