一种具有高阶重复性及重现性的电化学快扫伏安方法及其分析应用

摘要

本发明公开了一种具有高阶重复性及重现性的电化学快扫伏安方法及其分析应用，该方法呈现的数据形式具有明显的高阶重现性及重复性特点，在几百个周期的数据结果高度一致。通过改变TdT(0.1～190U/mL)或PP(0～9mM)在混合反应液中的终浓度，采用FSCV对传感器进行测试，设置初始电位为0V，终止电位为1V，扫速设置为400V/s，基于此将该快扫方法应用于TdT及其小分子抑制剂的分析检测，具有灵敏度高、特异性强、分析时间短响应速度快、制备简单并且能够输出高阶重复性及重现性的电化学信号，可以很好地实现较低浓度的TdT活性分析，检测限分别为①0.067U/mL、②0.1U/mL，③0.067U/mL和④0.1U/mL，抑制剂检测IC50值分别为1.7mM、1.6mM、1.5mM和1.7mM，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及两个领域：电化学分析技术及生物传感，尤其是涉及一种具有高阶重复性的电化学快扫伏安方法，并应用于末端脱氧核苷酸转移酶及其小分子抑制剂的生物传感分析。

背景技术

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)不同于其他DNA聚合酶，具有以独立于模板的方式将核苷酸掺入单链DNA的3`-OH端的特殊能力。TdT基因的表达通常在大多数人体细胞中被抑制，但在急性淋巴细胞性白血病细胞和一些其他白血病相关的细胞中则异常高。值得注意的是，急性淋巴细胞白血病在儿童期最常见的癌症中占比约25％，这样来看，TdT的检测对于癌症相关药物的开发和基础生化研究至关重要。尽管TdT生物功能强大，但传统的TdT活性检测方法是将凝胶电泳与放射性标记结合、生化测定和免疫分析，这些方法非常经典，但同时经常会遭到固有缺点的限制，包括有害辐射、灵敏度低或者是操作复杂，非常浪费时间。近年来，对于TdT的及其小分子抑制剂的分析开发了几种新方法，包括荧光法、比色法和电化学发光法。然而，这些方法仍然存在一些局限性，例如化学反应复杂、灵敏度不够高、材料合成繁琐等，导致重复性和重现性较差。因此，对于开发用于TdT分析的简单快速、灵敏且具有高重复性和重现性的新方法仍是科研工作者追求的目标。

快速扫描伏安技术(FSV)是一种具有高于10V/s扫描速率的电化学技术，保留了普通电化学方法的操作简便、响应快、灵敏度高等优点的同时，有更大程度的空间和亚秒级时间测量分辨率并能显著提高对分析物检测的灵敏度。利用扣除背景的快速扫描循环伏安法(FSCV)结合碳纤维微电极已经广泛用于探测体内神经化学动力学，目前主要应用在包括多巴胺、褪黑素、血清素、组胺、章鱼胺、腺苷、鸟苷等。本发明使用的FSCV设备包括一台Tektronix AFG1022函数发生器、一台Tektronix TBS1102示波器，一组基于正反馈技术和微控制器技术可以在线补偿溶液欧姆降的自研发电路。该装置能够在不同扫速下主动补偿整个反应体系的欧姆降，保证输出的伏安信号真实有效，获得准确的电化学信息。在FSCV图中，我们可以清晰地看到每个电化学峰的特征性状及保留时间，并且由于高的扫描速度，我们可以得到在普通电化学工作站上无法得到的亚秒级可逆电化学信息：在本设备提供的高扫速下，输出的电化学信号呈现出高阶重复性和重现性，相比于商品化的电化学工作站(扫速一般在0.01～0.5V/s)，具有高阶重复性和重现性的分析方法不仅能避免实验结果的偶然性、提高测量数据的准确性、减小每次测量数据之间的误差，最重要的是能够明显降低同种方法在间隔一段时间后测定结果的分散程度。从实验开始进行到实验停止，FSCV信号能够一直稳定存在，即使随机截取的数据周期亦显示高度一致性。在每个氧化还原周期下，FSCV激发输出的伏安信号清晰且稳定，将该电化学技术应用在分析传感领域，有望帮助解决其它生物学的问题。

本发明设计了一种具有高阶重复性和重现性的FSCV，并将此技术应用于TdT活性分析。该方法通过Au和巯基相互作用将巯基DNA引入金电极表面，利用TdT聚合延长作用将dTTP不断延伸到巯基DNA的3`-OH端，形成poly-T DNA长链，该长链通过T-Hg

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、检测速度快、灵敏度高、结果准确可靠、成本低具有高阶重复性和重现性的检测TdT及其小分子抑制剂新型分析手段。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种具有高阶重复性及重现性的电化学快扫伏安方法及其分析应用，具体步骤如下：

(1)电极的前处理

将直径为2mm的金电极依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al

(2)电化学生物传感器的制备

电极1：将2～10μL浓度为3～10μM的巯基DNA滴加到处理过的金电极表面，置于4℃冰箱里过夜。在孵育完成后，轻轻淋洗电极表面以除去未结合的巯基DNA，之后，将该电极浸入浓度为0.5～2mM的2-巯基乙醇(MCH)中0.5～3h，以封闭未结合上巯基DNA的活性位点。

电极2：制备TdT反应混合液：0.05～0.3μL浓度为0.01U/mL～20U/μL的TdT酶溶液，0.5～2μL浓度为10mM的dTTP溶液，2～10μL的5×TdT buffer(1M potassium cacodylate，0.125M Tris，0.05％(v/v)Triton X-100，5mM氯化钴(pH 7.2at 25℃))和1～5μL的双蒸水，混合均匀后滴加到电极1上，将该电极置于37℃反应0.5～3h，形成poly-T DNA长链，用水冲洗掉残余的TdT反应试剂。

电极3：将上述制备好的电极2置于100～200μL浓度为10

(3)TdT活性及抑制剂分析

基于滴加到电极2的反应液，通过改变TdT的浓度(0.01U/mL～20U/μL)，其他步骤和实验条件与电极制备步骤相同，实现对TdT活性的检测。

基于滴加到电极2的反应液，在固定TdT浓度的同时，将不同浓度的焦磷酸钠(PP)与反应液混合，其余步骤和实验条件与电极制作步骤相同，实现对TdT抑制剂的分析检测。

(4)FSCV检测

利用上述流程中得到的电极将电极3作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，置入pH＝7的PBS电解质溶液中，采用快速扫描循环伏安法(FSCV)，设置初始电位为-0.5～0V，终止电位为0.9～1.2V，电位扫描速度为50～400V/s；测定不同TdT浓度、不同抑制剂浓度(固定TdT浓度)对应的电压峰值，建立电压响应与TdT/PP之间的定量关系，根据两者之间的定量关系可以确定未知实际样品中的TdT/PP含量。

发明原理：本发明是一种具有高阶重复性及重现性的电化学快扫伏安方法及其分析应用，将该技术成功应用于TdT及其小分子抑制剂的分析检测。首先将利用Au-S键将巯基DNA牢牢固定于金电极上，其3`-OH端作为TdT作用位点，在加入TdT反应混合液后，该酶将dTTP添加到巯基DNA尾部，使其形成poly-T DNA长链，利用T与Hg

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)高灵敏度。TdT延伸的poly-T DNA长链能够捕获更多的Hg

(2)高特异性。对TdT的检测：将对照物质如碱性磷酸酶(ALP)、胆固醇氧化酶(ChOx)、蛋白激酶A(PKA)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和木瓜蛋白酶(papain)对该体系均无干扰。

(3)分析时间短，响应速度快。FSCV有更大程度的空间和亚秒级时间测量分辨率，所以能极大缩短分析时间，节省了时间成本。

(4)制备方法简单，试剂用量少，成本低。本发明只需要消耗少量试剂耗材就能搭建起该传感器，实现对TdT及其抑制剂的分析检测。

(5)高重复性及高重现性。得益于自组装的在线补偿欧姆降快扫伏安设备，利用高扫速的优势，保证数据真实有效的同时能够输出重复性和重现性高的电化学伏安信号。随机取到的两个周期数据经分析显示线性方程相似，在误差允许范围内：TdT活性的检测线性范围为：0.5～150U/mL，每个周期检测限分别为①0.067U/mL、②0.1U/mL，③0.067U/mL和④0.1U/mL；TdT抑制剂每个周期数据经计算为IC

数据相近且都符合已有报道。

综上所述，本发明构建的具有高阶重复性及重现性的电化学快扫伏安方法应用于TdT及其小分子抑制剂的分析检测，具有灵敏度高、特异性强、分析时间短响应速度快、制备简单并且能够输出高阶重复性及重现性的电化学信号等优点，可以很好地实现较低浓度的TdT活性分析，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明FSCV技术呈现的高阶重现性及重复性的实验图；

图2为本发明传感器对TdT及抑制剂分析检测的可行性实验图；

图3为本发明传感器对不同浓度TdT、PP的电压响应与浓度的关系图；

图4为本发明传感器对TdT的特异性实验图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1电化学生物传感器的制备，包括以下步骤：

裸电极：将直径为2mm的金电极依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al

电极1：将5μL浓度为10μM的巯基DNA滴加到处理过的金电极表面，置于4℃冰箱里过夜。在孵育完成后，轻轻淋洗电极表面以除去未结合的巯基DNA，之后，将该电极浸入浓度为2mM的2-巯基乙醇(MCH)中1h，以封闭未结合上巯基DNA的活性位点。

电极2：制备TdT反应混合液：0.2μL浓度为20U/μL的TdT酶溶液，1μL浓度为10mM的dTTP溶液，2μL的5×TdT buffer和2μL的双蒸水，混合均匀后滴加到电极1上，将该电极置于37℃反应3h，形成poly-T DNA长链，用水冲洗掉残余的TdT反应试剂。

电极3：将上述制备好的电极2置于200μL浓度为10

实施例2可行性分析，包括以下步骤：

按上述实施例1电化学生物传感器的制备步骤，将滴加到电极2的TdT混合反应液，包括0.2μL浓度分别为0、100U/mL的TdT溶液，1μL浓度为10mM的dTTP溶液，2μL的5×TdTbuffer和2μL的双蒸水。其他步骤和实验条件与电极制备步骤相同，用于该发明的可行性检测。

采用FSCV检测，将制备的电极3为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，置入pH＝7的PBS电解质溶液中，设置初始电位为0V，终止电位为1V，扫描速度设置为400V/s。结果如图1(C

接下来的所有数据我们进行随机截取两个周期，如图2A，当TdT浓度为0时，传感器没有电化学响应；而对于100U/mL浓度的TdT，FSCV测量显示良好的电化学响应信号，表明该传感器可应用于对TdT活性的检测。

接着，按上述实施例1电化学生物传感器的制备步骤，将滴加到电极2的TdT混合反应液，包括0.2μL浓度为140U/mL的TdT溶液，不同终浓度的PP(0、1、5mM)，1μL浓度为10mM的dTTP溶液，2μL的5×TdT buffer氯化钴和2μL的双蒸水混合滴加到电极2的反应液，其余步骤和实验条件与电极制作步骤相同。

采用FSCV检测，将制备的电极3为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，置入pH＝7的PBS电解质溶液中，设置初始电位为0V，终止电位为1V，扫描速度设置为400V/s。结果如图2B，可以看出随着PP终浓度升高，电化学响应信号减小，该传感器可应用于对TdT抑制剂的分析检测。

实施例3TdT酶活及抑制剂的检测

按上述实施例1的制备步骤以及实施例2对不同TdT/PP的电化学响应，通过改变TdT(0.1～190U/mL)或PP(0～9mM)在混合反应液中的终浓度，采用FSCV对传感器进行测试，设置初始电位为0V，终止电位为1V，扫速设置为400V/s。如图3A，传感器对TdT的电压响应与浓度呈良好的线性关系，传感器的电压响应对TdT浓度线性相关方程为①y＝0.0009x+0.050，R

实施例4特异性检测

为了验证本发明制备的传感器是否具备特异性和抗干扰能力，按上述实例1、2、3的制备步骤和检测方法，在TdT反应混合液中加入其它与TdT浓度相同的活性酶：如碱性磷酸酶(ALP)、胆固醇氧化酶(ChOx)、蛋白激酶A(PKA)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和木瓜蛋白酶(papain)，FSCV参数设置与实施例相同，检测传感器对TdT的选择性。结果如图4所示，表明该传感器发明对于TdT的检测有很好的特异性。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。