包含用于治疗因骨密度降低或软骨损失导致的疾病的治疗剂的缓释药物组合物及其用途

摘要

本发明关于一种具有高药物脂质比及高包埋效率的药物组合物，所述药物组合物包含至少一脂质体及用于治疗因骨密度降低或软骨损失导致的疾病的治疗剂。所述药物组合物改善药物动力学图谱及维持治疗剂的释放。本发明亦提供使用本文所揭露的药物组合物用于治疗因骨密度降低或软骨损失导致的疾病的方法。

说明书

本申请案主张2018年11月14日提交的美国专利申请号62/767,254的效益，其全部内容藉由引用并入本文。

技术领域

本发明是针对一种用于治疗因骨密度降低或软骨损失导致的疾病的缓释药物组合物，其使用至少一捕获剂并具有高药物脂质比(drug to lipid ratio)及高包埋效率(encapsulation efficiency)。此药物组合物的高药物脂质比、高包埋效率及药物组合物持续的释放图谱(release profile)减少施予的频率、增加患者顺从性(patientcompliance)并改善治疗效果(therapeutic outcome)。

背景技术

骨重塑是一个生理程序，由涉及蚀骨细胞和成骨细胞，以及骨细胞、炎性细胞以及介质的依序和协调交互作用所决定。成骨细胞与蚀骨细胞活性之间的平衡维持了骨恒定。蚀骨细胞的功能缺损增加骨再吸收，并造成各种骨头与关节疾病，举例来说，骨质疏松症(osteoporosis)、骨石化症(osteopetrosis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、骨关节炎(osteoarthritis)、骨癌及Paget氏病(Paget’s bone disease)。

组织蛋白酶(Cathepsin)K是一种在蚀骨细胞中高度表现的半胱氨酸蛋白酶，并且在羟磷灰石及蛋白质(特别是第I型胶原蛋白)构成的骨基质衰退作用中扮演关键角色。组织蛋白酶K也涉及人类关节软骨中第II型胶原蛋白裂解。最近的研究显示，每日口服一次或两次组织蛋白酶K抑制剂，可以预防骨质流失及软骨退化。因此维持组织蛋白酶K抑制剂的治疗浓度，并将治疗因骨密度降低及软骨损失导致的疾病之给药频率最小化是非常值得向往的。

脂质体已被广泛地用于各种药物之缓释配方的开发。药物装载至脂质体中可经被动地(passively)(在脂质体形成的期间包埋药物)或远端地(remotely)/主动地(actively)(在脂质体形成的期间制造跨膜(transmembrane)pH-或离子梯度，而后药物在脂质体形成后藉由因梯度产生的驱动力装载)达成(美国专利号5,192,549及5,939,096)。尽管文献中详细记载药物装载至脂质体的一般方法，仅有极少数的治疗剂得以高包埋效率的装载至脂质体中。各种因子能够影响脂质体药物的药物脂质比及包埋效率，其包含但不限于治疗剂的物理及化学特性，例如亲水性/疏水性特征、解离常数、溶解度及分配系数，脂质组成、捕获剂、反应溶剂及粒径(Proc Natl Acad Sci U S A.2014；111(6):2283-2288以及Drug Metab Dispos.2015；43(8):1236-45)。

对于具有高药物脂质比及高药物包埋效率以降低组织蛋白酶K抑制剂的给药频率并改善治疗效果的缓释配方仍存在未被满足的需求。本发明解决此需求以及其他需求。

发明内容

在一实施例中，提供的是一种缓释药物组合物包含(a)至少一脂质体，其包含双层膜，所述双层膜包含至少一脂质；(b)捕获剂；以及(c)治疗剂，用以治疗因骨密度降低或软骨损失引起的疾病，其中治疗剂对脂质的摩尔比值等于或大于大约0.1。

根据本发明的另一实施例，提供用以治疗因骨密度降低或软骨损失导致的疾病的方法，所述方法包含对所需的个体施予本文所描述的药物组合物的步骤。

亦提供本文所描述的药物组合物在制造用于治疗和/或预防性治疗因骨密度降低导致疾病的药物的用途。

进一步提供包含治疗有效剂量的本文所描述的药物组合物用于治疗因骨密度降低或软骨损失导致的疾病的药物。

在本专利中所使用的用语“发明(invention)”、“该发明(the invention)”、“此发明(this invention)”以及“本发明(the present invention)”意于广泛指的是本专利及下列的权利要求的所有申请标的。包含这些用语的叙述应理解为不限制本文所描述的申请标的、或不限制下列权利要求的含义或范畴。藉由本专利涵盖的本发明之实施例系藉由下列权利要求定义，而非此发明内容。此发明内容为本发明各种态样的高层次概述(high-level overview)，并引导进一步描述于下列实施方式的段落中的部分概念。此发明内容不意于定义所请申请标的的关键或必要特征，亦非意于用在单独使用而定义所请申请标的的范畴。申请标的应藉由参考说明书全文、任何或所有图式及各权利要求合适的部分而理解。

可藉由参照说明书的其余部分及图式进一步理解本发明的本质及优点。

附图简述

图1显示大鼠经关节内注射游离L-006235及L-006235脂质体后血浆L-006235浓度的折线图。

实施方式

除非本文中另行明确地表示，否则如上及本揭露全文所采用的下列用语，“一(a)”、“一(an)”以及“该(the)”等单数型式包含复数型式。

本文的所有数字可被理解成藉由“大约(about)”修饰。如本文所用，用语“大约(about)”指的是特定值±10％的范围。

如本文所用，用语“有效剂量(effective amount)”指的是降低因骨再吸收和骨密度降低而引起的疾病之症状或病征，例如骨质量减少/增加、软骨下硬骨或软骨损失、关节炎的关节疼痛或关节肿胀。用语“有效剂量(effective amount)”及“治疗有效剂量(therapeutically effective amount)”可互换使用。

如本文所用，用语“治疗(treating)”、“治疗(treated)”或“治疗(treatment)”包含预防(preventative)(例如，预防(prophylactic))、舒缓(palliative)及治疗方法(curative methods)、用途或结果。用语“治疗(treatment)”或“治疗(treatments)”亦可指的是组合物或药物。本发明中，治疗是指增加骨密度或减少软骨损失的方法，因而减少或延缓因骨密度降低或软骨损失引起的一或多个疾病的症状或病征、或是完全缓解因骨密度降低或软骨损失引起的疾病。前述骨密度降低或软骨损失均可以通过本领域已知的技术来测得。现有先前技术公认的方法可用于检测因骨密度降低或软骨损失导致的疾病及其症状。这包含，但不限于，临床检查、造影检查(例如：骨矿物质密度计、X射线造影、双能X射线吸光测定法、磁振成像、电脑断层扫描、超音波及核子造影)、测量体液(例如：血清、尿液或滑液)中的生物标记(例如：检测C反应蛋白、抗环瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinatedpeptide)、血清碱性磷酸酶、肌酸激酶BB同功酶、耐酒石酸磷酸酶、基质金属蛋白酶-3、第I型胶原蛋白的C-端肽链(telopeptide)、第II型胶原蛋白的C-端肽链、第I型胶原蛋白的N-端肽链、第IIA型胶原蛋白的N端前肽以及血清玻尿酸)、或是生物检体/组织病理学评估(举例来说，软骨及软骨下硬骨染色)，等等。举例来说，与治疗之前或是与控制组个体相比，如果一个体藉由骨矿物质密度计测得的骨密度至少增加1％，或该个体由骨密度降低或软骨缺少导致疾病的一或多种症状减少大约1％，则本揭示方法被认为是一种治疗方法。因此，此减少可为大约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％，或是任何在其之间减少的数值。

如本文所用，用语“因骨密度降低或软骨损失引起的疾病(disease due toreduced bone density or cartilage loss)”，其包含各种类型与子类型的骨疾病与关节疾病，由骨再吸收或软骨退化导致的各种已知或未知的病因学及成因，包含但不限于：骨质疏松症、骨石化症、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨癌、骨折及Paget氏病。

如本文所用，用语“个体(subject)”可指患有或有发展因骨密度降低或软骨损失引起的疾病风险之脊椎动物，或视为需要治疗以增加骨密度和/或修复软骨之脊椎动物。个体包含所有恒温动物，如哺乳动物、如灵长类动物且更佳为人类。非人类灵长类动物亦为个体。用语个体包含如猫、狗等的驯养动物、家畜(例如，牛、马、猪、羊、山羊等)及实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、沙鼠(gerbil)、豚鼠(guinea pig)等)。因此，本文涵盖兽医用途及医药剂型。

脂质体

如本文所用，用语“脂质体(liposome)”、“脂质体(liposomal)”及相关用语的特征为藉由一或多层双层膜形成的囊泡，将内部水性空间(interior aqueous space)与外部介质(outer medium)隔离。在某些实施例中，脂质体的内部水性空间实质上不含中性脂质，如甘油三酯(triglyceride)、非水(non-aqueous)相(油相)、水-油乳液或其它含有非水相的混合物。脂质体的非限制性实例包含小单层囊泡(small unilamellar vesicles，SUV)、大单层囊泡(large unilamellar vesicles，LUV)及多层囊泡(multilamellar vesicle，MLV)，其具有平均直径范围从50-500nm、50-450nm、50-400nm、50-350nm、50-300nm、50-250nm、50-200nm、100-500nm、100-450nm、100-400nm、100-350nm、100-300nm、100-250nm或100-200nm。

脂质体的双层膜通常藉由至少一脂质形成，即，包含空间上分离的疏水域及亲水域的合成或天然的两性分子(amphiphilic molecules)。脂质的实例包含但不限于，如磷脂(phospholipids)、甘油二酯(diglycerides)、二脂肪基糖脂(dialiphatic glycolipids)的双脂链脂质(dialiphatic chain lipids)，如鞘磷脂(sphingomyelin)及鞘糖脂(glycosphingolipid)的单脂质及其组合物。根据本发明的磷脂的实例包含但不限于1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DMPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，PSPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine，POPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dioleoy1-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hydrogenated soyphosphatidylcholine，HSPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)(sodium salt)，DMPG)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)(sodium salt)，DPPG)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)(sodium salt)，PSPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)(sodium salt)，DSPG)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)，DOPG)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine(sodium salt)，DMPS)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine(sodium salt)，DPPS)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine(sodium salt)，DSPS)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine，DOPS)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)，DMPA)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodium salt)，DPPA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodium salt)，DSPA)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodium salt)，DOPA)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DPPE)、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(N-(carbonyl-methoxypolyethyleneglycol)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，PEG-DPPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，POPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DSPE)、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(N-(carbonyl-methoxypolyethyleneglycol)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，PEG-DSPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-肌醇)(铵盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-myo-inositol)(ammonium salt)，DPPI)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸肌醇(铵盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol)(ammonium salt)，DSPI)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-肌醇)(铵盐)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-myo-inositol)(ammonium salt)，DOPI)、心磷脂(cardiolipin)、L-α-磷脂酰胆碱(L-α-phosphatidylcholine，EPC)及L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-phosphatidylethanolamine，EPE)。在一些实施例中，脂质为一种或多种前述脂质的脂质混合物，或一种或多种前述脂质与一种或多种未列出的脂质、薄膜稳定剂(membrane stabilizer)或抗氧化剂的混合物。

在一些实施例中，在脂质体双层膜中的脂质之摩尔百分比系等于或少于大约80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45或在其之间的任何值或范围(例如，大约45-80％、大约45-75％、大约45-70％、大约45-65％、大约50-80％、大约50-75％、大约50-70％或大约50-65％)。

在一些实施例中，双层膜中的脂质是第一脂质及第二脂质的混合物。在一些实施例中，第一脂质选自基本上由磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、HSPC、DOPC、POPC、DSPC、DPPC、DMPC、PSPC及其组合所组成的群组，而第二脂质选自基本上由磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)、PEG-DSPE、DPPG、DOPG及其组合所组成的群组。在另一实施例中，在双层膜中第一脂质的摩尔百分比为等于或少于大约79.9、79.5、79.1、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30或在其之间的任何值或范围(例如，大约30-79.9％、大30-79.5％、大约30-79.1％、大约30-70％、大约35-65％或大约40-60％)，而双层膜中第二脂质的摩尔百分比为等于或高于0.1或0.5至少于大约25、24、23或在其之间的任何值或范围(例如，大约0.1-25％、大约0.1-24％、大约0.1-23％、大约0.5-25％、大约0.5-24％、大约0.5-23％、大约0.7-25％、大约0.7-24％或大约0.7-23％)。

脂质体的双层膜进一步包含小于大约55摩尔百分比的类固醇，较佳为胆固醇。在某些实施例中，双层膜中胆固醇之摩尔％为大约20-55％、大约20-50％、大约20-45％、大约25-55％、大约25-50％、大约25-45％、大约30-55％、大约30-50％或大约30-45％。

在一例示性实施例中，双层膜中脂质及胆固醇的摩尔百分比为大约45-80％：20-55％或是50-75％：25-50％。在另一例示性实施例中，双层膜中第一脂质、第二脂质与胆固醇的摩尔百分比是大约30-79.9％：0.1％-25％：20-55％、30-75％：0.1-25％：20-50％或是35-70％：0.5-25％:20-45％，且第一脂质是HSPC，而第二脂质是DSPE-PEG2000。

远端装载

如本文所用，用语“远端装载(remote loading)”为涉及藉由多原子离子梯度(polyatomic ion-gradient)将治疗剂从外部介质跨越脂质体的双层膜传输至内部水性空间的程序的药物装载法。这些梯度藉由在脂质体的内部水性空间中包埋至少一多原子离子作为捕获剂，并以例如，纯水、蔗糖溶液(sucrose solution)或生理食盐水等具有较低多原子离子浓度的额外介质藉由如管柱分离(column separation)、透析(dialysis)或离心(centrifugation)等已知技术置换脂质体的外部介质而产生。在脂质体的内部水性空间及外部介质之间制造多原子离子梯度以将治疗剂捕获于脂质体的内部水性空间。作为捕获剂的例示性多原子离子包含但不限于硫酸盐(sulfate)、亚硫酸盐(sulfite)、磷酸盐(phosphate)、磷酸氢盐(hydrogen phosphate)、钼酸盐(molybdate)、碳酸盐(carbonate)及硝酸盐(nitrate)。例示性的捕获剂包含但不限于硫酸铵(ammonium sulfate)、磷酸铵(ammonium phosphate)、钼酸铵(ammonium molybdate)、蔗糖八硫酸酯铵(ammoniumsucrose octasulfate)、蔗糖八硫酸酯三乙铵(triethylammonium sucrose octasulfate)及硫酸葡聚糖(dextran sulfate)其组合。

在一实施例中，蔗糖八硫酸酯三乙铵的浓度为大约10至大约200mM、大约50至大约150mM或大约60至大约100mM。在另一实施例中，硫酸铵的浓度为大约100至大约600mM、大约150至大约500mM或大约200至大约400mM。

根据本发明，包埋捕获剂的脂质体可藉由任何已知或后来开发的技术制备。例如，可藉由将经选择的脂质组成物与捕获剂藉由水合脂膜(hydrated lipid film)、喷雾干燥粉末或冻干饼(lyophilized cake)直接形成MLV脂质体；藉由音振处理(sonication)、均质化(homogenization)、微射流作用(microfluidization)或挤压(extrusion)将MLV脂质体依尺寸制作为SUV脂质体及LUV脂质体。

药物组合物

本发明针对缓释药物组合物，其包含：(a)至少一包含双层膜的脂质体；(b)捕获剂；及(c)治疗剂，用以治疗因骨密度降低或软骨损失引起的疾病，其中双层膜由至少一脂质组成且治疗剂对该脂质的摩尔比值系大于或等于大约0.1。

在一个实施例中，缓释药物组合物进一步包含至少一药学上可接受的赋形剂、稀释剂、用于活性成分的介质、防腐剂、冷冻保护剂或其组合。在一个例示性实施例中，双层膜的重量百分比为大约0.1-15％；捕获剂的重量百分比为大约0.1-12％；及药学上可接受的赋形剂(如蔗糖、组氨酸(histidine)、氯化钠及超纯水)、稀释剂、用于活性成分的介质、防腐剂、冷冻保护剂或其组合的重量百分比为大约75.0-99.9％。

在特定实施例中，用于治疗因骨密度降低软骨缺损引起的疾病的治疗剂是组织蛋白酶K抑制剂。组织蛋白酶K抑制剂的非限制性示例包含巴利卡替(balicatib，C

在一方面，药物组合物的缓释曲线是由于高的药物包埋效率。这些药物组合物的包埋效率为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

在另一方面，药物组合物的缓释曲线是由于较高的治疗剂对脂质摩尔比值。在一例示性实施例中，用于治疗因骨密度降低或软骨损失引起的疾病的治疗剂对一种或多种脂质的摩尔比值为大于或等于大约0.1，选择性地从大于或等于0.1至小于大约20、小于大约15、小于大约10、小于大约5、小于大约4、小于大约3、小于大约2或小于大约1.5。

在又一方面，相较于用于治疗因骨密度降低或软骨缺损引起的疾病的游离治疗剂，在本文用于治疗因骨密度降低或软骨缺损引起的疾病的治疗剂的半衰期延长至少2倍、至少5倍、至少7.5倍、至少10倍或至少20倍。

本发明亦提供治疗因骨密度降低或软骨缺损引起的疾病的方法，所述方法包含对所需的个体施予本文所描述的药物组合物之有效剂量，因而减轻在所需个体中因骨密度降低或软骨缺损引起的疾病的症状及/或病征。

药物组合物配制成适于注射，例如关节内(intraarticular)、皮下(subcutaneous)、表皮下(subdermal)、皮内(intradermal)、经皮(transdermal)或肌内(intramuscular)途径。药物组合物亦配制成以经皮贴片施予。

本发明的药物组合物剂量可由所属技术领域具有专业知识者根据实施例决定。涵盖各在某些临床环境中提供优势的单剂量或多剂量形式。根据本发明，被施予的药物组合物的实际量可根据被治疗的个体之年龄、体重、条件、任何存在的医疗条件，并取决于医学专家之判断。

在一实施例中，本揭示内容的药物组合物展现出用于治疗因骨密度降低或软骨缺损引起的疾病的治疗剂具有显著的延长释放曲线。举例来说，本发明的药物组合物将L-006235在大鼠的半衰期延长至56.6小时，这是L-006235于大鼠中经由口服给药半衰期(3.4小时)的16.6倍(J Med Chem 20051:48(24):7520-34)。这些药物组合物是被开发用以降低给药频率，从每日一至两次降至每两日一次、每三日一次、每四日一次、每五日一次、每六日一次、每周一次、每两周一次、每一个月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次或每六个月一次。

实例

本发明之实施例藉由下列实例说明，其不应以任何方式解释为对其范围强加限制。相反地，应被清楚理解的是在不脱离本发明的精神下，所属技术领域具有专业知识者在阅读本文说明书之后，可采取各种其它实施例、修改及其等效物。除非另有指出，在下列实例中描述的研究中，将遵循习知程序。

实例1：制备L-006235脂质体配方

空的脂质体藉由脂质膜水合挤压法(lipid film hydration-extrusion method)制备。将双层膜成分，HSPC、胆固醇及DSPE-PEG2000(摩尔百分比为59.5/39.6/0.9)，溶解于有机溶剂中，举例来说：氯仿及二氯甲烷。藉由旋转蒸发器于真空下去除有机溶剂以形成一薄脂质膜。此干燥脂质膜以含有300mM硫酸铵水溶液于60℃水合30分钟，而形成水性中心(aqueous core)包埋硫酸铵的空的脂质体。也可以使用其他捕获剂，像是蔗糖八硫酸酯三乙铵。在液态氮与60℃水之间进行五次冷冻-解冻循环之后，随后将空的脂质体穿过孔径为0.2μm的聚碳酸酯过滤器挤压10次。未包埋的捕获剂则藉由透析方法(dialysis method)或渗滤方法(diafiltration method)以9.4％蔗糖溶液或0.9％氯化钠(NaCl)溶液置换移除，以在空的脂质体内部水相及外部水相之间制造一个多原子离子梯度。

将含有3.0mg/mL的L-006235(由DC Chemicals购得，中国)、空的脂质体(含有6.0mM的脂质)以及50mM的组氨酸缓冲液(pH 6.5)的混合物于60℃下反应15分钟。反应混合物中未包埋的L-006235藉由Sephadex

包埋效率由L-006235脂质体配方的药物对脂质摩尔比值(D/L)与反应混合物的标称(nominal)D/L比较计算而得，标称D/L系将L-006235的浓度除以空脂质体的脂质浓度而得。粒径分布藉由动态光散射仪(Zetasizer Nano-ZS90,Malvern，美国)测量。

使用300mM硫酸铵作为捕获剂，L-006235脂质体配方的最终D/L为1.00，包埋效率为93.4％，且脂质体的平均粒径为193.7nm。

实例2：各种组织蛋白酶K抑制剂脂质体配方的制备

本文使用的组织蛋白酶K抑制剂包含L-006235及巴利卡替(MedChem Express，美国)。空的脂质体根据实例1并包含以下捕获剂制备：(1)300mM的硫酸铵以及(2)75mM的蔗糖八硫酸酯三乙铵。L-006235脂质体配方的装载步骤是基于实例1。巴利卡替脂质体配方制备如下：将含有2mg/mL的巴利卡替、空的脂质体以及50mM的组氨酸缓冲液(pH 6.5)的反应混合物在60℃下反应15分钟。经由Sephadex

表1、不同组织蛋白酶K抑制剂的装载曲线

EE，包埋效率；n.d.，未测得。

实例3：L-006235脂质体配方的药物动力学(PK)研究

使用七至八周雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠执行L-006235脂质体配方的体内PK评估。大鼠圈养于12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环操作且不限制饮水及摄食的系留室(holding room)中。

将大鼠分成两组(每组n＝4)。第一组的大鼠接受2.5mg/kg游离L-006235的关节内注射，该游离L-006235以L-00623溶于含有0.06N盐酸(HCl)的9.4％蔗糖溶液制备而得，最终浓度为10.0mg/mL，而第二组的每只大鼠则接受5.0mg/kg L-006235脂质体配方关节内注射，所述L-006235脂质体配方根据实例1制备，其最终浓度为18.1mg/mL。于注射后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时以及168小时收集血液样品。藉由离心取得血浆样品，并使用液相色层-串联质谱仪分析。血浆浓度对应时间曲线使用在PKSolver(Comput Methods Programs Biomed.2010；99(3):306-314)中的非区室模型分析模组分析。两种L-006235配方的PK参数则总结于表2。

表2显示L-006235脂质体配方的剂量标准化C

表2、于大鼠单次关节内注射游离L-006235配方或L-006235脂质体配方后衍生的PK参数

C

此外，图1显示注射游离L-006235后24小时，已无法于血浆中侦测到L-006235，然而施予本发明的L-006235脂质体配方后168小时，仍可于血浆中测得L-006235。所述结果显示本发明药物组合物可缓慢释放组织蛋白酶K抑制剂。