一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂

摘要

本发明公开了一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂，属于医学试剂技术领域，包括胰蛋白酶和EDTA。本发明公开了一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂，其组分配比简单，能够降低细胞在细胞刷中的留存率，从而提高检测样本中细胞数量，进而实现增加检测细胞数量的作用。本发明辅助试剂能够促使口腔癌早筛广泛推广，降低我国口腔癌的发生，提高治愈率。

说明书

技术领域

本发明属于医学试剂技术领域，具体涉及一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂。

背景技术

口腔黏膜病变虽然早期容易通过病人自体察觉容易早期发现，但是否发生癌变或只是单纯的粘膜病需要到专科医院进行诊治，口腔癌前病变的演变在发病时间上具有较常的时间跨度，大部分病人需要长期的随访来实现监测病情发展，对于有癌变风险的患者，一般采取局部切除活检的方式进行处理。患者对此种方法的接受度不高。因此具备无创性、检测准确率高的检测手段具有很好的临床应用价值。

脱落细胞学检测是目前国际医学界公认的癌症早期筛查手段，在人体周身多种癌症的早期筛查中均有广泛应用。尤其是在宫颈癌早期筛查中已经得到广泛应用。按照脱落细胞学筛查癌变细胞的基本原理，进行口腔癌前病变的早期筛查存在理论可行性。遗憾的是口腔癌前病变的脱落细胞学早期筛查工作存在现实应用的瓶颈。

现有技术的问题是：脱落细胞学的正常开展在于每次检查可以获取合适的细胞量。在临床实际应用中，口腔黏膜癌前组织病损多数伴有较明显的角化特征，病损面积不稳定。为此临床医生在收集脱落细胞时无法收集足够的细胞或者能真正反应出细胞是否发生癌变的趋势的细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂，以解决背景技术存在的问题。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂，包括胰蛋白酶和EDTA，所述胰蛋白酶和EDTA以一定的比例加入口腔癌早筛脱落细胞学检测过程中，提高参检细胞数量。

进一步的，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25％。

进一步的，所述EDTA的质量浓度为0.01％。

本发明辅助试剂中的胰蛋白酶(Trypsin)是目前应用最广泛的消化试剂，通过作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽腱，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。但对于纤维组织和较硬的癌组织的效果差，常常将胰蛋白酶与其他消化酶联合使用。EDTA可以用来增强胰蛋白酶的水解功能，而血清则会影响胰蛋白酶的活性。

本发明辅助试剂中的EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)化学成分是乙二胺四乙酸,一种金属螯合剂。一般和胰蛋白酶配合使用。原因在于：钙、镁等金属离子会降低胰酶活力，故在使用胰酶消化液时要配合加入EDTA。它可以螯合这些离子，消除对胰酶的抑制。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明公开了一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂，其组分配比简单，现有病人口腔黏膜进行脱落细胞学细胞获得的过程是通过脱落细胞刷完成的，约有50-80％的细胞会留存于细胞刷中，而本发明的辅助试剂能够降低细胞在细胞刷中的留存率，从而提高检测样本中细胞数量，进而实现增加检测细胞数量的作用。本发明辅助试剂能够促使口腔癌早筛广泛推广，降低我国口腔癌的发生，提高治愈率。

具体实施方式

实施例1

一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂，包括胰蛋白酶和EDTA；胰蛋白酶的质量浓度为0.25％；EDTA的质量浓度为0.01％。

为了验证本发明效果，对上述实施例1制得的辅助试剂进行实验测试。

动物实验

1.小鼠舌癌变建立，实验组BALB/c鼠与C57小鼠各40只随机平均分配两组。BALB/c小鼠SPF级，体重为18～20g，鼠龄30～50d，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。用1,2丙二醇配置4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)(Sigma公司，美国)成500mg/L浓度液体称其为“原液”，避光保存于4℃冰箱备用。给药方式：用蒸馏水稀释“原液”成50mg/L浓度，置于避光瓶内作为饮用水供自由饮用至16wk，16wk后换为蒸馏水继续喂养。

2.实验方法：

获取标本

在建立动物模型,分别在第16，20，24，28周随机处死实验组每组小鼠7只和对照组小鼠，每组7只。

第一部分：辅助试剂加入TCT与LPT保存液中增加载玻片检测细胞数量。

研究意义

口腔癌早筛工作开展方兴未艾，分析脱落学检测在宫颈癌早筛中的广泛应用优势不难发现，脱落细胞细胞学在口腔癌早筛中无法获得充足的检测细胞量是限制口腔癌早筛工作的主要原因。

细胞学检查方法是多年逐渐发展、成熟起来的一种检测诊断技术，其主要用于肿瘤的诊断和鉴别诊断，为临床医学事业的发展做出了重大贡献。常见方法包括了传统的巴氏涂片(Pap test)和液基薄层细胞技术(Liquid based thin-layer cell technology，TCT)两种方式，其用于筛查的目的是发现可能癌变的非典型细胞，在临床实际情况下也可看到感染、炎症等非癌性病变或者已经癌变的细胞。巴氏涂片法使用采集器刮取子口腔黏膜脱落细胞，涂片和染色后对其进行观察，制片质量和诊断准确率较低；TCT相比于巴氏涂片法的主要区别是在对脱落细胞进行涂片前，加入试剂以剔除干扰物质，从而提高了制片的质量和诊断的准确率。随后美国三路影像公司(TriPathImaging)又推出了LCT-超栢(AutoCyte/PrepStain)即自动细胞学检测，被誉为第三代细胞学制片技术，在美国市场占有更高份额。这些公司在脱落细胞提取到制片过程能够实现标准化，因此在样本制作的规范性上就有很大优势，此外它们产品都有各自的优势与特点，具有大量专利保护手段，其主打产品集中在宫颈脱落细胞的检测方面，形成一定程度的垄断。

研究目的：本研究分别在TCT制片方法与LPT制片方法过程中加入试剂观察获取样本合格率。

方法：我们将两种技术分别应用于小鼠口腔黏膜病损的脱落细胞采集过程，判断此次研发的辅助试剂是否增加检验细胞数量。两种检测技术的采样器及取材方法基本一致。首先用无菌干棉球轻擦目标黏膜处黏液，再将采样刷再病损处轻转动，保持适当的压力，转5-10圈，再将采样刷的刷头放入装有分别放入DMEM细胞培养液(实验组)与细胞保存液(对照组)中标本瓶中。

TCT制片法

在振荡仪上混匀保存瓶内标本，阳性对照组加入50ul辅助试剂，2min后，10％FBS的DMEM/F12终止消化，高速离心去上清留取细胞层，再加入新柏氏TCT保存液进入ThinPrep2000系统程序化处理，阴性对照组标本经细胞保存液处理直接进入Thin Prep2000系统程序化处理，制成直径为2cm的薄层细胞涂片，95％乙醇固定，巴氏染色封固后，进行镜下观察；阴性对照组加入同等体积的PBS。

LPT制片方法

在振荡仪上混匀保存瓶中的标本，阳性对照组加入50ul辅助试剂，2min后，10％FBS的DMEM/F12终止消化，高速离心去上清留取细胞层。阴性对照组无此步骤，将保存液分别注入，丢弃采样刷，将混匀的标本缓慢倾入装又3ml清洗液的离心管中，使其自然分层，离心半径18cm,2400r/min,离心10min，使标本中黏液、血液和坏死碎片等于有效上皮细胞分离，上皮细胞团留存于试管底层。快速丢弃上清液，加入上皮细胞团体积3-4倍的细胞基液，充分震荡混匀成细胞悬液，用微量加样器吸取50ul的混悬液体，加到多聚赖氨酸镀膜的载玻片上画圆图片，制成直径15mm的薄层图片，自然干燥，95％乙醇固定，巴氏染色封片后，进行观察。

制片成功与否以细胞数量大于5000为基准。

结果：辅助试剂分别在小鼠致癌模型16wk-4NQO,20wk-

4NQO，24wk-4NQO，28wk-4NQO.

表1.不同致癌时间点黏膜癌变TCT细胞提取成功个数

表2.不同致癌时间点黏膜癌变LPT细胞提取成功个数

表3.辅助试剂在TCT与LPT细胞提取成功百分率

讨论与结论

TCT技术与LPT技术相比较传统的巴氏涂片法具有较大优势。传统的巴氏涂片法假阴性主要的原因是病变细胞无法全部转移到载玻片中，而在口腔癌前病变的脱落细胞学检测中，这种弊端更加突出，研究显示50％-80％以上的刷取细胞可能存留在细胞取样器中。国外引进的TCT技术与LPT技术能够较好的克服这一问题，但大范围开展更多的是存在于宫颈脱落细胞学检查中。口腔癌前病变筛查中最大的瓶颈为细胞数量不足无法进行充分判断，在一些关于口腔癌前病变筛查的研究报道中已经发现：采用TCT技术与LPT技术可以应用于口腔癌前病变脱落细胞学筛查，但是无法广泛推广的原因很大程度还取决于在样本采集过程中细胞数量不足。本次研究直接将辅助试剂应用于TCT技术与LPT技术过程中检测细胞提取过程中。发现辅助试剂加入TCT技术后提取大于5000的细胞成功率从57.14％提高到71.42％；发现辅助试剂加入LPT技术后提取大于5000的细胞成功率从75.00％提高到82.14％；这说明辅助试剂的应用能够增加口腔黏膜癌前病变组织的细胞提取量。LPT提取标本细胞的总体效率是高于TCT技术的，这种区别可能与更加先进的技术升级手段有关，具体机制我们不做探讨。针对一般TCT技术与LPT技术在细胞不足时也会采用一些补救手段。例如；TCT技术在面对所制涂片若细胞量不够,则加入细胞溶解液(cytolyt液)处理后重复制片；如果细胞量还是不满意,可离心沉淀做常规细胞涂片或建议临床重取材。②若标本血细胞太多(肉眼观呈红色)或黏液过多(呈黏稠状),因为血细胞及黏液会堵塞滤孔阻碍过滤膜对上皮细胞的吸附,则需加入细胞清洗液进行处理后再制片,但处理过程中振荡时间不宜太长,否则细胞肿胀褪变严重,建议3～5min即可。而LPT技术则会通过重新混匀细胞悬液或者补加细胞基液再制片。这些在常规制片中的经验往往是第一次制片质量不佳时才使用。辅助试剂的常规加入将会很大程度会避免二次制片，提高第一次制片的成功率。

TCT技术与LPT技术诊断阳性检出率明显优于传统细胞学涂片，这在国内、外文献均已得到证实,但其自身也有不足之处,如耗材成本相对偏高,患者负担增加；辅助试剂不仅可以显著增加传统涂片过程中的细胞提取量(本研究数据未提及)，通过实验也证实对于TCT与LPT在口腔脱落细胞提取过程中也有提高。随着国产脱落细胞学检测产品逐渐提升，TCT技术与LPT技术中的一些原理性手段已经开始应用于国内产品，但核心技术依然无法突破，辅助试剂的研制主要针对口腔黏膜潜前病变进行研发。本品在辅助采集细胞数量上有较好的作用，利于口腔潜在癌变病损脱落细胞的获取。

不足与优化：细胞分布不均,边缘部细胞较多；经清洗液处理后的细胞肿大,核结构欠佳。还需临床标本的实验证明。第二部分：不同浓度EDTA对胰蛋白酶消化脱落细胞能力的影响

24只小鼠口腔黏膜组织经D-KSFM配制的1.2U/ml的DispaseⅡ4℃冰箱过夜(16h-18h)消化，黏膜组织被随机分为2组，以上操作流程模拟脱落细胞学获取细胞的过程。一组黏膜组织加入0.25％胰酶+0.02％EDTA后37℃消化10min，另一组加入0.25％胰酶+0.01％EDTA后37℃消化10min，吸管吹打，吸出的悬液用含10％FBS的DMEM/F12终止消化，剩余组织再次加入0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，重复1次。上述实验的结果如下：

表4.本次研究采用酶的种类与浓度

注：上表1中所述的D-KSFM:改良角化无血清培养基；

DispaseII酶：中性蛋白酶；0.25％Trypsin/1mM EDTA:胰蛋白酶溶液。

表5.参与本次研究的酶的种类与浓度

应用spss20.0软件进行单因素方差分析，p<0.05为检测标准。

表6.不同浓度EDTA结合混合胰蛋白酶对获取细胞数量的影响

结论：0.01％与0.02％EDTA在相同作用时间对于脱落细胞胰蛋白酶的消化作用没有显著影响。