一种快速检测新型冠状病毒69-70del突变的引物组合物及试剂盒

摘要

本发明提供了一种快速检测新型冠状病毒69‑70del突变的引物组合物及试剂盒。该引物组合物包括引物组和PNA探针；该PNA探针的序列如SEQ ID NO：8所示；该引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，选自包括序列如SEQ ID NO：3～7的组合物、包括序列如SEQ ID NO：9～13的组合物、包括序列如SEQ ID NO：14～18的组合物和包括序列如SEQ ID NO：15和17～20的组合物的一组或者几组。本发明基于LAMP技术提供了一种快速检测新型冠状病毒69‑70del突变的引物组合物及试剂盒，特异性好、灵敏度高，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30‑60min内即可实现核酸分子标志物的快速检测，检测结果可以通过目视法直接判断，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种快速检测新型冠状病毒 69-70del突变的引物组合物及试剂盒。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus，CoV)，因其包膜表面有一圈形似日冕的棘突而得 名，广泛存在于自然界中，是一种呼吸道病毒，其宿主包括人类、脊椎动物和无 脊椎动物。冠状病毒属套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，为有包膜的正股 单链RNA病毒，直径为80～120nm，约有3万个碱基组成，其遗传物质是已知 RNA病毒中最大的。国际病毒分类命名委员会在2012年根据其遗传学差异和血 清学特性将冠状病毒分为α、β、γ、δ四群，其中β群CoV又进一步分为A、B、 C、D四个组。α、β两群易感染哺乳动物，包含了7种对人类致病的冠状病毒， 分别为HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、 MERS-CoV和SARS-CoV-2；而γ、δ两群则主要感染禽类。冠状病毒是一种常 见的、易引发呼吸道疾病的病原体，在引起成人社区获得性肺炎的病毒中，冠状 病毒检出率与其他呼吸道病毒的检出率相似。SARS-CoV-2感染不仅会对人类的 生命安全构成威胁，还会对全球社会经济造成极大损失，我们需要“未雨绸缪”， 积极应对，对其流行病学和致病机制进行深入研究，积极研发新型特效药和疫苗， 并开发出更有效的检测手段，把冠状病毒扼杀于“摇篮”阶段，为人类的健康保 驾护航。

由于病毒自身的结构特征及宿主众多，导致该病毒极易发生变异，产生新类 型的冠状病毒突变体，例如英国科学家发现了一种被称为B.1.1.7的新冠病毒变 种，变异病毒与人受体亲和力提高了1000倍，变异病毒传播能力要比原始毒株 高70％左右，而伦敦最近新冠感染病例超过60％都来自变异病毒，“超级传播 者”被频繁报道，给疾病的防治带来了极大难度。2020年12月31日世卫组织 正式通报了新冠病毒主要的四种突变体，分别为：在欧洲发现的新冠病毒出现 D614G突变、在丹麦发现的一种与水貂相关的“Cluster 5”新冠病毒突变体、在 英国发现的VOC 202012/01的新冠病毒突变体、在南非发现的501Y.V2突变体。 目前全球已有几十个国家出现了变异的SARS-CoV-2，变异SARS-CoV-2病毒可 能不会增加疾病严重性，但其会导致更高的发病率，产生更多住院及死亡病例， 所以需要采取更严格的公共卫生措施来控制这些变异病毒的传播，确保新冠肺炎 “可防、可控、可治”。

69-70del是出现的新冠病毒刺突蛋白(spike protein，S蛋白)N端结构域 (NTD)中的第69位的组氨酸(H69)和和第70位的缬氨酸(V70)缺失突变， 69-70del突变可能导致刺突蛋白的构象变化，有利于病毒逃逸逃逸宿主的免疫反 应，甚至可能让疫苗和药物对其失去效果。因此快速检测SARS-CoV-2，及时了 解病毒株的主流突变情况，对于疫情的防控、疾病的诊疗和疫苗的研发等均具有 重要的意义。

目前逆转录实时PCR技术被认为是SARS-CoV-2检测“金标准”，然而该 技术操作复杂，扩增速度较慢(2-3个小时)，需要在要求较高的实验室内才能 进行，所需的检测设备价格昂贵，而且需要训练有素的专业技术人员才能进行检 测，导致该技术难以推广，尤其是基础设施薄弱、偏远落后的地区难以推广。而 环介导等温扩增技术(LAMP)是利用设计的四对特殊引物和具有连置换活性的 Bst DNA聚合酶(具有链置换特性)，在60-65℃恒温条件下进行特异、高效、 快速的扩增靶核酸。但目前未有采用LAMP技术检测新型冠状病毒69-70del突 变的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种快速检测新型冠状病毒69-70del 突变的引物组合物及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种快速检测新型冠状病毒69-70del突变的引物组 合物，包括引物组和PNA探针；该PNA探针的序列如SEQ ID NO：8所示；

上述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，选自 包括序列如SEQ ID NO：3～7的组合物、包括序列如SEQ ID NO：9～13的组合 物、包括序列如SEQ IDNO：14～18的组合物和包括序列如SEQ ID NO：15和 17～20的组合物的一组或者几组。

进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：3～7的引物和序列如 SEQ IDNO：8所示的PNA探针。

进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：9～13的引物和序列如 SEQ IDNO：8所示的PNA探针。

进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：14～18的引物和序列如 SEQID NO：8所示的PNA探针。

进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：15和17～20的引物和 序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。

第二方面，本发明提供了包括上述引物组合物的快速检测新型冠状病毒 69-70del突变的扩增体系，其还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和 /或荧光染料以及去离子水。

进一步地，在上述扩增体系中，F3引物和B3引物的终浓度为0.2μmol/L； FIP引物和BIP引物的终浓度为1.6μmol/L；LB引物的终浓度为0.8μmol/L；PNA 探针的终浓度为0.8μmol/L。

进一步地，总体积为25μL的扩增体系包括如下组分：2×反应缓冲液12.5μL， F3引物1μL，B3引物1μL，FIP引物1μL，BIP引物1μL，LB引物1μL，PNA 探针1μL，8U酶溶液1μL，中性红染料1μL，去离子水2.5μL，模板2μL。

进一步地，上述扩增体系的反应条件为58℃-68℃，30-60min；所用的设备 为普通PCR仪或恒温金属浴。

第二方面，本发明提供了包括上述引物组合物的快速检测新型冠状病毒 69-70del突变的试剂盒，其还包括反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染 料以及去离子水。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明基于LAMP技术提供了一种快速检测新型冠状病毒69-70del突变的 引物组合物及试剂盒，特异性好、灵敏度高，无需复杂、昂贵的辅助设备，在 30-60min内即可实现核酸分子标志物的快速检测，检测结果可以通过目视法直 接判断，具有良好的应用前景。

附图说明

图1显示了本发明一实施例中检测LAMP检测体系的灵敏度的结果图；从右 到左依次空白对照、阴性对照、5×10

图2显示了本发明一实施例中LAMP检测体系的灵敏度的荧光检测结果图；

图3显示了本发明一实施例中检测LAMP检测体系的特异性的结果图；从 右向左分别为：甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、鼻病毒RNA、呼吸道 合胞病毒RNA、弱阳性对照和阳性对照；

图4显示了本发明一实施例中LAMP检测体系的特异性的荧光检测结果图。

具体实施方式

本发明针对如SEQ ID NO：1(野生型)和SEQ ID NO：2(突变型)的靶 基因片段，提供了一种采用LAMP技术的快速检测的引物组合物；其中，靶片 段的序列如下：

TTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCT TACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGG TGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCA GGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACAT GTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTT AATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGC TGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTT AATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCA(SEQ ID NO： 1)；

TTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCT TACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGG TGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCA GGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATATCT GGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGA TGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGAT TTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAA CGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCA(SEQ ID NO：2)。

具体地，该引物组合物包括PNA探针、F3引物、B3引物、FIP引物、BIP 引物和LB引物，采用PNA探针对扩增体系中的非特异性模板(野生型核酸) 进行封闭，以提高LAMP检测体系的特异性；具体的序列信息如下表1所示：

表1快速检测新型冠状病毒69-70del突变的引物组合物的序列信息

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理 解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使 用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供含有上述引物组合物的快速检测新型冠状病毒69-70del突变 的试剂盒，其还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和去离子水。

该试剂盒在使用时配制的LAMP扩增体系的总体积25μL，其包括如下体积 的组分：2×反应缓冲液(RM)12.5μL，F3引物(终浓度0.2μmol/L)1μL， B3引物(终浓度0.2μmol/L)1μL，FIP引物(终浓度1.6μmol/L)1μL，BIP引 物(终浓度1.6μmol/L)1μL，LB引物(终浓度0.8μmol/L)1μL，PNA探针 (终浓度0.8μmol/L)1μL，酶溶液(EM，8U)1μL，中性红染料1μL，去离子水2.5μL，模板2μL。

上述LAMP扩增体系的LAMP反应条件为：58℃-68℃，30-60min；所用的 设备为普通PCR仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备。

使用该试剂盒检测新型冠状病毒69-70del突变的结果判断：反应结束后，反 应液的颜色由原来的淡黄色变为红色，即判定为反应阳性。

验证实施例

本实施例对实施例1提供的扩增体系(其中，引物组合物采用表1中的第1 组引物体系)和试剂盒的灵敏度和特异性进行了检测，具体的步骤和实验结果如 下：

1.灵敏度：构建含靶片段的TA克隆质粒，将重组质粒与健康人的咽拭子样 本混合，制作梯度浓度的模拟样本，用上述LAMP扩增体系进行检测，得到的 结果如图1所示。

此外，在上述不同浓度的模拟样本的扩增体系中同时加入SYBR，在AB 7300PCR仪器上进行实时荧光检测，结果如图2所示。

如图1～2可知，检测灵敏度可达5×10

2.特异性：采用所建立的上述LAMP扩增体系对临床常见的呼吸道病原： 甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、鼻病毒RNA和呼吸道合胞病毒RNA 进行扩增，结果如图3所示。

在上述针对各个病毒RNA和阳性对照的扩增体系中同时加入SYBR，在AB 7300PCR仪器上进行实时荧光检测，结果如图4所示。

由图3～4可知，上述病毒RNA均未发生非特异扩增，表明所建立的LAMP 检测体系具有良好的特异性。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并 不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行 的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范 围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属华山医院北院

<120> 一种快速检测新型冠状病毒69-70del突变的引物组合物及试剂盒

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 397

<212> DNA

<213> 靶基因序列（野生型）

<400> 1

ttgtttttct tgttttattg ccactagtct ctagtcagtg tgttaatctt acaaccagaa 60

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<210> 2

<211> 391

<212> DNA

<213> 靶基因序列（突变型）

<400> 2

ttgtttttct tgttttattg ccactagtct ctagtcagtg tgttaatctt acaaccagaa 60

ctcaattacc ccctgcatac actaattctt tcacacgtgg tgtttattac cctgacaaag 120

ttttcagatc ctcagtttta cattcaactc aggacttgtt cttacctttc ttttccaatg 180

ttacttggtt ccatgctata tctgggacca atggtactaa gaggtttgat aaccctgtcc 240

taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata ataagaggct 300

ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt aataacgcta 360

ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc a 391

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaactcagg acttgttctt 20

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggactgggtc ttcgaatc 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atcaaacctc ttagtaccat tggtcctttc ttttccaatg ttacttgg 48

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttttgcttcc actgagaagt ctaac 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttctttcaca cgtggtgt 18

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<213> 人工序列

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agtggaagca aaataaacac c 21

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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