一种利用全内反射荧光显微成像系统实时动态监测内皮细胞释放一氧化氮的方法

摘要

本发明公开了一种利用全内反射荧光显微成像系统实时动态监测内皮细胞释放一氧化氮的方法，包括以下步骤：（1）分离血管内皮细胞并进行鉴定；（2）待内皮细胞加入细胞培养皿中贴壁培养；（3）将DAF‑FM避光孵育内皮细胞；（4）进行荧光检测实验；（5）打开TIRFM‑EMCCD机器系统上的NIS‑Elements AR软件，设置好主要参数；（6）记录细胞荧光值变化，等荧光值趋于稳定后开始加入Ach，通过荧光值变化观察细胞对Ach的动态反应；（7）实验结束后将实验数据进行分析作图。本发明首次将DAF‑FM和TIRFM相结合，发现一种可以实时动态检测活细胞NO合成能力、并且能够对其进行相对定量的实验方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用全内反射荧光显微成像系统实时动态监测内皮细胞释放一氧化氮的方法。

背景技术

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种机体内重要的信使分子和效应分子，在1992年被科学杂志（Science）选为明星分子。目前的研究表明，NO及NO合酶 (nitric oxidesynthetase, NOS) 不仅在心血管、免疫、神经系统中有着广泛的生理功能，而且参与多种疾病的发生和发展。自1987年研究证实血管内皮细胞能够合成并释放NO以来，NO在心血管系统中的作用即倍受重视。美国科学家罗伯·佛契哥特等人因发现“NO在心血管系统中起信号分子作用”而获得了1998年的诺贝尔生理学或医学奖。可见对血管内皮细胞NO的捕集及动态监测对研究NO在生物体中的应用具有重要意义。

血管内皮细胞是覆盖在血管内腔表面的连续单层扁平细胞，能够分泌多种血管功能调节因子，参与机体血管系统的正常调节。NO是机体最主要的血管舒张物质，NO合成通常反应血管内皮功能状况。NO改善心脑血管的作用机理：在血管内皮细胞里产生的NO气体，由于它是脂溶性的，所以很快渗透出细胞膜向下扩散进入平滑肌细胞，从而作用于平滑肌细胞，使其松弛，扩张血管，最终导致血压的下降。同时也会很快渗透出细胞膜向上扩散进入血液，进入血小板细胞，使血小板活性降低，抑制其凝集和向血管内皮的粘附，从而防止血栓的形成，防止动脉粥样硬化的发生。

NO测定包括直接法和间接法，其中直接法主要包括：重氮化法、化学发光法、气相色谱法和质谱法等。间接测定NO的方法中最常用的亚硝酸盐比色法、 NOS的定量测定等。DAF-FM即3-Amino,4-aminomethyl-2',7'-difluorescein, diacetate，是最新一代用于NO定量检测的荧光探针。DAF-FM 可以穿过细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM在和NO反应后可以产生强烈荧光，激发波长为495nm，发射波长为515nm。任何可以检测fluorescein的仪器，包括荧光显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于该荧光探针的检测。这些方法均不能实时动态监测内皮细胞合成NO的动态反应。

NO最初是在1935年汉弗莱·戴维（Humphrey Davy）在研究笑气（N

发明内容

为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用全内反射荧光显微成像系统实时动态监测内皮细胞释放一氧化氮的方法，其中，全内反射荧光显微成像系统为全内反射荧光显微镜电子倍增电荷耦合器件成像系统（total internalreflection fluorescence microscopy electron-multiplying charge-coupled device(TIRFM-EMCCD) imaging system）。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种利用全内反射荧光显微成像系统实时动态监测内皮细胞释放一氧化氮的方法，包括以下步骤：

（1）2型胶原酶法体外原代分离血管内皮细胞，并用内皮细胞特异性标志物CD31对所分离得到的血管内皮细胞进行鉴定；

（2）待内皮细胞培养2代后，使用胰酶消化重悬，按每平方毫米1000个细胞的密度，将细胞加入细胞培养皿中，贴壁培养2小时；

（3）将DAF-FM用磷酸盐缓冲液PBS稀释1000倍，使得终浓度为5µM；细胞静置好后去除细胞培养液，加入稀释好的DAF-FM，加入的体积以能完全覆盖细胞皿底为宜；置于37℃细胞培养箱中避光孵育30分钟；用PH7.4的磷酸盐缓冲液PBS洗涤3次，以充分去除未进入细胞的DAF-FM，整个过程需要避光；

（4）在培养皿中加入190µL PSS液进行荧光检测实验；

（5）打开TIRFM-EMCCD机器系统上的NIS-Elements AR软件，设置好主要参数；

（6）在显微镜下选取合适的细胞视野后开始记录细胞荧光值变化，通过荧光值实时动态曲线图观察细胞的荧光值，等荧光值趋于稳定后开始加入Ach，通过荧光值变化观察细胞对Ach的动态反应；

（7）实验结束后将实验数据进行分析作图。

进一步的，所述PSS液体配方如下：Nacl 137mM，Kcl 6mM，Mgcl

进一步的，所述步骤（5）中，主要参数设置如下：Zyla Settings参数设置：Format：No Binning，Auto Exposure：100ms，Readout Mode：Rolling shutter，Readout Rate：540MHz，Dynamic Range：12-bit & Gain 4，Sensor Mode：Overlap；Ti Pad主要参数设置：Intensilight：1，Filters：绿色。

进一步的，所述步骤（7）中，实验结束后将实验数据用NIS-Elements AR Analysis软件打开后分析，用Graph Pad Prism 5.0软件对数据进行整理作图。

有益效果：本发明提供了一种利用全内反射荧光显微成像系统实时动态监测内皮细胞释放一氧化氮的方法，本发明首次将DAF-FM和TIRFM相结合，发现一种可以实时动态检测活细胞NO合成能力、并且能够对其进行相对定量的实验方法。全内反射荧光显微镜被用于研究发生在物体表面的生物现象，在这些区域会发生细胞和分子生物学中一系列重要的基本生命反应。与传统荧光显微镜相比，其具有高信噪比、探测单分子荧光信号，而且可以快速实时动态成像。

附图说明

图1 为利用本发明所述方法对血管内皮细胞内NO合成实时动态监测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明提供了一种利用全内反射荧光显微成像系统实时动态监测内皮细胞释放一氧化氮的方法，包括以下步骤：

（1）2型胶原酶法体外原代分离血管内皮细胞，并用内皮细胞特异性标志物CD31对所分离得到的血管内皮细胞进行鉴定；

（2）待内皮细胞培养2代后，使用胰酶消化重悬，按每平方毫米1000个细胞的密度，将细胞加入细胞培养皿中，贴壁培养2小时；

（3）将DAF-FM用磷酸盐缓冲液PBS稀释1000倍，使得终浓度为5µM；细胞静置好后去除细胞培养液，加入稀释好的DAF-FM，加入的体积以能完全覆盖细胞皿底为宜；置于37℃细胞培养箱中避光孵育30分钟；用PH7.4的磷酸盐缓冲液PBS洗涤3次，以充分去除未进入细胞的DAF-FM，整个过程需要避光；

（4）在培养皿中加入190µL PSS液进行荧光检测实验；其中所述PSS液体配方如下：Nacl 137mM，Kcl 6mM，Mgcl

（5）打开TIRFM-EMCCD机器系统上的NIS-Elements AR软件，设置好主要参数；主要参数设置如下：Zyla Settings参数设置：Format：No Binning，Auto Exposure：100ms，Readout Mode：Rolling shutter，Readout Rate：540 MHz，Dynamic Range：12-bit & Gain4，Sensor Mode：Overlap；Ti Pad主要参数设置：Intensilight：1，Filters：绿色；

（6）在显微镜下选取合适的细胞视野后开始记录细胞荧光值变化，通过荧光值实时动态曲线图观察细胞的荧光值，等荧光值趋于稳定后开始加入Ach，通过荧光值变化观察细胞对Ach的动态反应；

（7）实验结束后将实验数据用NIS-Elements AR Analysis软件打开后分析，用Graph Pad Prism 5.0软件对数据进行整理作图。

如图1所示，血管内皮细胞被DAF-FM染色后，呈现出绿色荧光。选出代表细胞（白色圆圈圈出）后，利用TIRFM成像系统监测活细胞产生NO的动态变化。当在细胞培养基中加入Ach（乙酰胆碱）时，荧光强度明显增强（图1A），图1A是加入不同浓度Ach前后的荧光强度实时动态变化图。加Ach前的荧光值可定位F0，加Ach后的最大荧光峰值为Fmax。可根据F0与Fmax的比值相对定量内皮细胞对Ach的反应能力及合成NO的能力。此外，根据图1C的X轴（时间轴）可得到从F0-Fmax、Fmax-F1的时间间隔，从而计算NO产生和降解效率（图1B和1C）。

综上所述，本发明首次将DAF-FM和TIRFM相结合，发现一种可以实时动态检测活细胞NO合成能力、并且能够对其进行相对定量的实验方法的实验方法。