一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用，构建方法包括以下步骤：步骤一、从若干株人脐带中原代分离、扩增脐带间充质干细胞，传代培养至P5代；步骤二、进行淋巴细胞亚群Th1亚群和Th17亚群流式分析和淋巴细胞亚群调节性T细胞亚群流式分析；步骤三、将步骤二所获得的流式结果采用Flowjo软件分析，计算各组的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率和Treg的促进增殖比率；分别取平均值，获得相应的筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准。本发明为干细胞治疗自身免疫性疾病与免疫紊乱相关疾病基础研究和临床转化提供一种细胞选取标准，提高治疗效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种筛选干细胞的量化标准，尤其涉及一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)可以从一系列组织中分离培养，包括但不限于骨髓、脂肪、脐带、羊膜和胎盘等，具有自我更新和多向分化潜能，是一种能分化为成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肝细胞和神经细胞等多种间质组织细胞的多源细胞。因此间充质干细胞成为基础医学和临床学组织器官损伤修复及再生领域研究的热点。

其中，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived MSCs，HUCMSCs)来源广泛、取材属于无侵入性操作以及细胞使用无伦理争议等优势，并且能够大量产业化扩增存储，同时人脐带间充质干细胞具有更强的增殖能力，免疫原性更低，可用于异体移植而受到广泛的关注。但是目前还存在一些问题，如不同供者来源的HUCMSCs移植到受者体内后移植治疗效果差异性大，同种细胞在分化潜能和免疫调节方面具有明显的个体异质性。具有异质性的MSCs在应用于某些疾病治疗时可以表现出功能变异。

发明内容

本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用，以克服目前缺乏有效检测MSCs免疫调节方法的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法，具有这样的特征：包括以下步骤：

步骤一、从若干株人脐带中原代分离、扩增脐带间充质干细胞，传代培养至P5代；

步骤二、淋巴细胞亚群Th1亚群和Th17亚群流式分析：若干株P5代脐带间充质干细胞分别与新鲜分离的人外周血单个核细胞共培养，作为Th-MSC组；另取人外周血单个核细胞作为对照组，培养三天后，进行淋巴细胞亚群Th1亚群和Th17亚群流式分析；

淋巴细胞亚群调节性T细胞亚群流式分析：若干株P5代脐带间充质干细胞分别与新鲜分离的人外周血单个核细胞共培养，并加入人重组IL-2刺激剂，作为T-MSC组；另取人外周血单个核细胞加入人重组IL-2刺激剂，作为阳性对照组，培养条件下五天后，进行淋巴细胞亚群调节性T细胞亚群流式分析；

步骤三、将步骤二所获得的流式结果采用Flowjo软件分析，得到各Th-MSC组的Th1细胞比例、Th17细胞比例及各T-MSC组的T细胞比例；

根据细胞比例计算各组的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率和Treg的促进增殖比率；

将若干株脐带间充质干细胞的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率和Treg的促进增殖比率分别取平均值，获得相应的筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准。

进一步，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法，还可以具有这样的特征：

Th1的抑制增殖比率为[(对照组的Th1细胞比例-Th-MSC组的Th1细胞比例)/对照组的Th1细胞比例]％；

Th17的抑制增殖比率为[(对照组的Th17细胞比例-Th-MSC组的Th17细胞比例)/对照组的Th17细胞比例]％；

Treg的促进增殖比率为[(T-MSC组的T细胞比例-阳性对照组的T细胞比例)/阳性对照组的T细胞比例]％。

进一步，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法，还可以具有这样的特征：步骤一中，人脐带间充质干细胞的分离及扩增方法为：无菌条件下采集人脐带，清洗脐带血迹、剔除脐带动静脉血管、剪碎、贴壁培养、消化、离心、重悬、接种后培养至80～90％融合，细胞消化传代扩增培养，第5代处于对数期的脐带间充质干细胞待用。

进一步，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法，还可以具有这样的特征：步骤一中，若干株脐带间充质干细胞的株数为12株不同性别、不同年龄的脐带间充质干细胞。

进一步，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法，还可以具有这样的特征：步骤二中，淋巴细胞亚群Th1亚群和Th17亚群流式分析的具体方法为：

S1、第一天将步骤一中12株P5代脐带间充质干细胞，经过消化、离心、重悬、计数后，加至12孔板内培养，每孔定量细胞为5×10

S2、第二天：分离人PBMC，新鲜血液加入PBS 1:1稀释后，加入到等体积的淋巴细胞分离液中，1000g，2037rpm，20mim，slow and off程序；

S3、吸取白膜层，加入到盛有10mL PBS的15mL离心管，1500rpm，离心5min；弃上清后，加入1mL 1640完全培养基重悬，计数；

S4、铺有MSC的12孔板中每孔加入5×10

S5、第五天，收取PBMC细胞，1500rpm，离心5min后弃上清，每管细胞内加入500μL刺激培养基：10％灭活胎牛血清，1×Cell Stimulation Cocktail的1640培养基；

S6、37℃孵育箱刺激5h后1500rpm，离心5min，PBS清洗一次，离心弃上清，固定破膜；

S7、Th1检测：流式抗体标记为CD3

S8、细胞沉淀内加入150μL PBS，涡旋混匀后，流式仪器上机检测。

进一步，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法，还可以具有这样的特征：步骤二中，淋巴细胞亚群调节性T细胞亚群流式分析的具体方法为：

S1、第一天将步骤一中12株P5代脐带间充质干细胞，经过消化、离心、重悬、计数后，加至12孔板内培养，每孔定量细胞为5×10

S2、第二天：分离人PBMC，新鲜血液加入PBS 1:1稀释后，加入到等体积的淋巴细胞分离液中，1000g，2037rpm，20mim，slow and off程序；

S3、吸取白膜层，加入到盛有10mL PBS的15mL离心管，1500rpm，离心5min；弃上清后，加入1mL 1640完全培养基重悬，计数；

S4、铺有MSCs的12孔板中每孔加入5×10

S5、第七天，收取PBMC细胞，1500rpm，离心5min后弃上清，固定破膜；

S6、Tregs检测：流式抗体标记为CD4

S7、细胞沉淀内加入150μL PBS，涡旋混匀后，流式仪器上机检测。

进一步，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法，还可以具有这样的特征：步骤四中，取均值的得到的Th1的抑制增殖比率量化标准为13％，Th17的抑制增殖比率量化标准为26％，Treg的促进增殖比率量化标准为2.4倍。

本发明还提供上述筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的应用，具有这样的特征：根据干细胞移植到体内的免疫调节能力需求，检测和计算待筛选干细胞的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率或Treg的促进增殖比率；将其与相应的量化标准比较，大于量化标准的干细胞则为可筛选的优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞。即在干细胞治疗时，根据干细胞移植到体内的免疫调节能力需求，选取Th1抑制增殖比率量化为大于13％，或Th17抑制增殖比率量化为大于26％，或Tregs促进增殖比量化为大于2.4倍的干细胞，提高治疗效果。

进一步，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的应该用，还可以具有这样的特征：检测和计算待筛选干细胞的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率的方法为：将待筛选干细胞与新鲜分离的人外周血单个核细胞共培养，作为Th-MSC组；另取人外周血单个核细胞作为对照组，培养三天后，进行淋巴细胞亚群Th1亚群和Th17亚群流式分析；流式结果采用Flowjo软件分析，得到待筛选干细胞的Th1细胞比例、Th17细胞比例；根据细胞比例计算Th1的抑制增殖比率和Th17的抑制增殖比率；Th1的抑制增殖比率为[(对照组的Th1细胞比例-Th-MSC组的Th1细胞比例)/对照组的Th1细胞比例]％；Th17的抑制增殖比率为[(对照组的Th17细胞比例-Th-MSC组的Th17细胞比例)/对照组的Th17细胞比例]％。

进一步，本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的应该用，还可以具有这样的特征：检测和计算待筛选干细胞的Treg的促进增殖比率的方法为：将待筛选干细胞与新鲜分离的人外周血单个核细胞共培养，并加入人重组IL-2刺激剂，作为T-MSC组；另取人外周血单个核细胞加入人重组IL-2刺激剂，作为阳性对照组，培养条件下五天后，进行淋巴细胞亚群调节性T细胞亚群流式分析；流式结果采用Flowjo软件分析，得到T细胞比例；根据细胞比例计算各组的Treg的促进增殖比率；Treg的促进增殖比率为[(T-MSC组的T细胞比例-阳性对照组的T细胞比例)/阳性对照组的T细胞比例]％。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用，以缓解现有技术中间充质干细胞的质量良莠不齐的问题，克服了HUCMSCs治疗自身免疫性疾病与免疫紊乱相关疾病基础研究和临床转化细胞选择的盲从性，供干细胞治疗自身免疫性疾病与免疫紊乱相关疾病基础研究和临床转化提供细胞选取标准作量化参考，以期提高治疗效果，可用于推进间充质干细胞免疫调节能力技术领域。

附图说明

图1是实施例1人脐带间充质干细胞抑制PBMC Th1亚群增殖流式图；

图2是实施例1人脐带间充质干细胞抑制PBMC Th17亚群增殖流式图；

图3是实施例1人脐带间充质干细胞促进PBMC Tregs亚群增殖流式图；

图4是实施例1的12株人脐带间充质干细胞抑制PBMC Th1亚群增殖统计图；

图5是实施例1的12株人脐带间充质干细胞抑制PBMC Th17亚群增殖统计图；

图6是实施例1的12株人脐带间充质干细促进PBMC Treg亚群增殖统计图；

图7是实施例2Tregs促进增殖能力不同的HUCMSCs治疗小鼠肝纤维化效果差异图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法，包括以下步骤：

步骤一、从12株人脐带中原代分离、扩增脐带间充质干细胞，传代培养至P5代。12株脐带间充质干细胞为不同性别、不同年龄的脐带间充质干细胞。

其中，人脐带间充质干细胞的分离及扩增方法为：无菌条件下采集人脐带，清洗脐带血迹、剔除脐带动静脉血管、剪碎、贴壁培养、消化、离心、重悬、接种后培养至80～90％融合，细胞消化传代扩增培养，第5代处于对数期的脐带间充质干细胞待用。

本实施例中步骤一的具体操作为：

1)筛选符合生物样本供者健康要求的产妇进行样本的采集，确保生物样本的安全性，排除包括HIV，HBV，HCV，CMV，HIV-1&2，EBV以及其他可能检测的病毒，避免传播传染性疾病的风险。

2)脐带来源：经产妇知情同意，实验方案经鼓楼医院干细胞研究伦理委员会批准，

采集要求满足以下两点：①健康顺产儿或剖腹产后进行Apgar评分，总分在8～10分；②无菌条件下取近胎儿端脐带长约10-20cm。两端各剪去2cm，将脐带浸泡于含2％青链霉素的DPBS中，并用医用保温箱运输，于4h内处理。

3)工作人员进入设施，全程在生物安全柜中进行操作。

4)将脐带剪成2cm左右的小段，用含2％青链霉素的DPBS洗至无血液存在。

5)剔除脐带中的3根血管，即两根动脉、一根静脉。剔除血管后的脐带用眼科剪剪碎成大约1mm3的细小组织块。

6)组织剪碎直接贴至T75培养瓶中，倒置4h，再正置培养瓶，加入10ml人间充质干细胞完全培养基(完全培养基配方：10％MSC级胎牛血清+DMEM低糖培养基)。

7)14天左右细胞爬出，会形成集落CFU-F,轻轻拍打培养瓶，使组织块脱落，弃之，

8)用PBS轻轻洗细胞表面，换10ml新鲜的间充质干细胞完全培养基，放置培养箱继续培养，待原代细胞长至40％～50％融合时传代。

9)弃掉旧培养液，加入室温放置的DPBS洗一遍，吸去DPBS。加入适量Tryple，37℃孵育消化3min。

10)轻柔吹打细胞，收集细胞悬液至离心管中，室温1200r/min离心5min，弃上清。加入人间充质干细胞培养基细胞培养液重悬细胞，轻柔吹打均匀，接种密度约1.5×10

11)置于37℃，5％CO

步骤二、淋巴细胞亚群Th1亚群和Th17亚群流式分析：12株P5代脐带间充质干细胞分别与新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMC)共培养，作为Th-MSC组；另取人外周血单个核细胞作为对照组，培养三天后，进行淋巴细胞亚群Th1亚群和Th17亚群流式分析。

具体方法为：

S1、第一天将步骤一中12株P5代脐带间充质干细胞，经过消化、离心、重悬、计数后，加至12孔板内培养，每孔定量细胞为5×10

S2、第二天：分离人PBMC，新鲜血液加入PBS 1:1稀释后，加入到等体积的淋巴细胞分离液中，1000g，2037rpm，20mim，slow and off程序；

S3、吸取白膜层，加入到盛有10mL PBS的15mL离心管，1500rpm，离心5min；弃上清后，加入1mL 1640完全培养基重悬，计数；

S4、铺有MSC的12孔板中每孔加入5×10

S5、第五天，收取PBMC细胞，1500rpm，离心5min后弃上清，每管细胞内加入500μL刺激培养基：10％灭活胎牛血清，1×Cell Stimulation Cocktail的1640培养基；

S6、37℃孵育箱刺激5h后1500rpm，离心5min，PBS清洗一次，离心弃上清，固定破膜；

S7、Th1检测：流式抗体标记为CD3

S8、细胞沉淀内加入150μL PBS，涡旋混匀后，流式仪器上机检测。结果如图1和2所示。

淋巴细胞亚群调节性T细胞(Treg)亚群流式分析：若干株P5代脐带间充质干细胞分别与新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMC)共培养，并加入人重组IL-2刺激剂，作为T-MSC组；另取人外周血单个核细胞加入人重组IL-2刺激剂，作为阳性对照组，培养条件下五天后，进行淋巴细胞亚群调节性T细胞亚群流式分析。

具体方法为：

S1、第一天将步骤一中12株P5代脐带间充质干细胞，经过消化、离心、重悬、计数后，加至12孔板内培养，每孔定量细胞为5×10

S2、第二天：分离人PBMC，新鲜血液加入PBS 1:1稀释后，加入到等体积的淋巴细胞分离液中，1000g，2037rpm，20mim，slow and off程序；

S3、吸取白膜层，加入到盛有10mL PBS的15mL离心管，1500rpm，离心5min；弃上清后，加入1mL 1640完全培养基重悬，计数；

S4、铺有MSCs的12孔板中每孔加入5×10

S5、第七天，收取PBMC细胞，1500rpm，离心5min后弃上清，固定破膜；

S6、Tregs检测：流式抗体标记为CD4

S7、细胞沉淀内加入150μL PBS，涡旋混匀后，流式仪器上机检测。结果如图3所示。

步骤三、将步骤二所获得的流式结果采用Flowjo软件分析，得到各Th-MSC组的Th1细胞比例、Th17细胞比例及各T-MSC组的T细胞比例。

具体的，Flowjo软件分析获得Th1细胞(或Th17细胞)比例的具体方法为：第一步圈出所有淋巴细胞，横坐标选择FSC-A，纵坐标选择SSC-A；第二步圈出所有的T细胞，横坐标选择CD3+Percp-A，纵坐标选择SSC-A；第三步圈出所有的CD4+T细胞，横坐标选择CD8-APC-A，纵坐标选择SSC-A；第四步圈出所有的Th1细胞(或Th17细胞)，横坐标选择IFN-γ+FITC-A(或IL-17A+PE-A),纵坐标选择SSC-A；即为Th1细胞的比例(或Th17细胞的比例)。

Flowjo软件分析获得T细胞比例的具体方法为：第一步圈出所有淋巴细胞，横坐标选择FSC-A,纵坐标选择SSC-A；第二步圈出所有的CD4+T细胞，横坐标选择CD4+FITC-A,纵坐标选择SSC-A；第三步圈出所有的Treg细胞，横坐标选CD25+APC-A,纵坐标选择Foxp3+PE-A；即为Treg细胞的比例。

根据细胞比例计算各组的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率和Treg的促进增殖比率。结果如图4-6所示。

Th1的抑制增殖比率为[(对照组的Th1细胞比例-Th-MSC组的Th1细胞比例)/对照组的Th1细胞比例]％；

Th17的抑制增殖比率为[(对照组的Th17细胞比例-Th-MSC组的Th17细胞比例)/对照组的Th17细胞比例]％；

Treg的促进增殖比率为[(T-MSC组的T细胞比例-阳性对照组的T细胞比例)/阳性对照组的T细胞比例]％。

将12株脐带间充质干细胞的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率和Treg的促进增殖比率分别取平均值，得到的Th1的抑制增殖比率量化标准为13％，Th17的抑制增殖比率量化标准为26％，Treg的促进增殖比率量化标准为2.4倍，即为相应的筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准。

实施例2

本实施例提供一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的应用：根据干细胞移植到体内的免疫调节能力需求，检测和计算待筛选干细胞的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率或Treg的促进增殖比率；将其与相应的量化标准比较，大于量化标准的干细胞则为可筛选的优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞。

其中，检测和计算待筛选干细胞的Th1的抑制增殖比率、Th17的抑制增殖比率的方法为：将待筛选干细胞与新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMC)共培养，作为Th-MSC组；另取人外周血单个核细胞作为对照组，培养三天后，进行淋巴细胞亚群Th1亚群和Th17亚群流式分析。具体方法与构建方法中的流式分析具体方法相同。流式结果采用Flowjo软件分析，得到待筛选干细胞的Th1细胞比例、Th17细胞比例。根据细胞比例计算Th1的抑制增殖比率和Th17的抑制增殖比率。Th1的抑制增殖比率为[(对照组的Th1细胞比例-Th-MSC组的Th1细胞比例)/对照组的Th1细胞比例]％；Th17的抑制增殖比率为[(对照组的Th17细胞比例-Th-MSC组的Th17细胞比例)/对照组的Th17细胞比例]％。

检测和计算待筛选干细胞的Treg的促进增殖比率的方法为：将待筛选干细胞与新鲜分离的人外周血单个核细胞共培养，并加入人重组IL-2刺激剂，作为T-MSC组；另取人外周血单个核细胞加入人重组IL-2刺激剂，作为阳性对照组，培养条件下五天后，进行淋巴细胞亚群调节性T细胞亚群流式分析。具体方法与构建方法中的流式分析具体方法相同。流式结果采用Flowjo软件分析，得到T细胞比例。根据细胞比例计算各组的Treg的促进增殖比率。Treg的促进增殖比率为[(T-MSC组的T细胞比例-阳性对照组的T细胞比例)/阳性对照组的T细胞比例]％。

本实施例选择实施例1中12株HUCMSCs中编号11，12的两株细胞，分组记为UC11、UC12，作为待筛选干细胞。其中，UC11的Treg促进增殖能力为(1.05±0.34)倍，小于Treg的促进增殖比率量化标准均值2.4倍，UC12的Treg促进增殖能力为(12.87±0.95)倍，大于Treg的促进增殖比率量化标准均值2.4倍。

两组待筛选干细胞对小鼠肝纤维化模型治疗：

1)小鼠肝纤维化模型造模：将CCl

2)制备HUCMSCs悬液：将两组待筛选干细胞UC11和UC12，培养到第五代(P5)时，消化、离心、重悬、计数。

3)肝脏原位注射两株不同的HUCMSCs：小鼠麻醉后仰卧固定，剃毛，上腹部消毒，从正中切口进入腹腔，暴露出肝脏；将微灌注探针由空心引导针穿入小鼠肝左中叶，微灌注探针留微孔的中段置于肝脏内，收回空心引导针；将微灌注探针的两端分别连接微量注射泵和空置的微量注射器；5×10

4)治疗后三周，无痛处死小鼠，取小鼠肝脏标本，通过病理染色比较两株Tregs促进增殖能力不同的HUCMSCs治疗小鼠肝脏纤维化的效果，结果如图7所示，发现体外Tregs促进增殖能力更强的细胞UC12，具有更好的治疗效果，与UC11细胞的治疗效果有统计学差异，该动物体内实验结果与本申请的筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准及应用一致，体外Treg调控能力大于均值的UC，具有更优的治疗效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。