基于斑马鱼急性毒性试验测试固废浸出液生态毒性的方法

摘要

本发明公开了一种基于斑马鱼急性毒性试验测试固废浸出液生态毒性的方法，包括以下步骤：步骤1：设置培养实验仓以及培养对照仓；步骤2：固废浸出液等量分装于培养实验仓中，养殖用水等量装于培养对照仓；步骤3：将斑马鱼均分为若干组放置于斑马鱼实验仓；步骤4：通过光照进行交替照射驱赶以及摄像设备来分析鱼群游动速度，并与对照组鱼群的游动速度进行对比；步骤5：根据斑马鱼游动速度降低的速率变化进行判断斑马鱼检测毒性的效果。本发明为固废浸出液的生态毒性检测提供了一种新的检测方式，可作为固废浸出液中有毒物质含量鉴别的一个生物学补充方法，更能反映固废本身所具有的生态环境危害。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体是涉及一种基于斑马鱼急性毒性试验测试固废浸出液生态毒性的方法。

背景技术

危险废物是固体废物管理的重点，其中毒性特征鉴别是管理的技术基础和关键环节。目前的危险废物鉴别体系中，毒性特征鉴别主要包括急性毒性、浸出毒性和生态毒性等，其中急性毒性和浸出毒性都给出了测试与评估标准，而对于生态毒性则缺乏相应的测试与评估标准，这也易导致很多由于生态毒性可能产生生态危害而被忽视的问题。

由于一直缺乏相应的鉴别指标与鉴别方法，使得生态毒性评估工作得不到有效开展。同时在现行标准下，一些不在毒性物质清单上但具有生态毒性的物质，按标准难以将其所富集的固体废物归为危险废物，如按一般固体废物进行处置，可能将对生态环境造成危害，这也与固体废物环境管理要求不相符。

目前欧盟国家正在积极开展生态毒性测试标准建立方面的工作，并提出了生态毒性地区典型保护物种的框架需求，同时国外学者正努力尝试建立关于危险废物的生态毒性鉴别标准，而我国学者多围绕化学物质生态毒性测试及关于重金属、有机污染土壤生态毒性指标的评估，有研究也尝试开展应用斑马鱼对污染场地浸出污水进行生态毒性评估，但与危险废物鉴别相关的研究工作开展较少。

目前危险废物鉴别中针对生态毒性的评估主要通过对具有生态毒性的物质的定量检测，而对全面检测往往耗时耗力，且由于清单内有毒物质种类有限，多数的有毒物质种类往往被忽略，难以反应实际的危害程度，因此现需要一种针对固废浸出液新型毒性检测的方法来解决上述问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于斑马鱼急性毒性试验测试固废浸出液生态毒性的方法。

本发明的技术方案是：一种基于斑马鱼急性毒性试验测试固废浸出液生态毒性的方法，包括以下步骤：

步骤1：设置不少于3组的培养实验仓以及培养对照仓，所述培养实验仓、培养对照仓均为长条状的条形培养仓，有利于观察斑马鱼的游动测速；

步骤2：选择pH值、有机质含量以及盐离子浓度符合标准的固废浸出液并等量分装于培养实验仓中，调节养殖用水的pH值并等量装于培养对照仓；

步骤3：选择5～8d驯养期内斑马鱼幼鱼，并将斑马鱼均分为若干组放置于斑马鱼实验仓，在养殖用水中装入斑马鱼幼鱼作为对照；

步骤4：通过光照进行交替照射驱赶来分析鱼群游动速度，并与对照组鱼群的游动速度进行对比，以及摄像设备捕捉分析得出斑马鱼不同时间下的游动速度变化情况；

步骤5：根据斑马鱼游动速度降低的速率变化进行判断斑马鱼检测毒性的效果，以培养对照仓中斑马鱼作为标准游速，分别测定1h、2h、4h和8h时的各个培养实验仓的斑马鱼游动速度数据，并分析绘制其游动速率趋势图，其判断标准具体为：

1)极毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的5％以下，且游动速率趋势图的游速变化趋势极大，判定固废浸出液生态毒性为极毒；

2)高毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的5-35％，且游动速率趋势图的游速变化趋势较大，判定固废浸出液生态毒性为高毒；

3)中毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的35-65％，且游动速率趋势图的游速变化趋势一般，判定固废浸出液生态毒性为中毒；

4)低毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的65-95％，且游动速率趋势图的游速变化趋势较小，判定固废浸出液生态毒性为低毒；

5)微毒或无毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的95％以上，且游动速率趋势图的游速变化趋势基本不变，判定固废浸出液生态毒性为微毒或无毒。

进一步地，所述培养实验仓具体设置3～8组；所述培养实验仓、培养对照仓的长宽比10：0.5～1.5，且宽度在所培养的斑马鱼体长的3-5倍。通过上述参数对培养实验仓、培养对照仓的规格进行设定，有利于通过数字颗粒影像测速仪DPIV对斑马鱼游动速度进行测定，从而提高测定的准确性。

更进一步地，所述培养实验仓或培养对照仓的养殖密度具体满足以下公式：

其中，P为培养条数，m为培养实验仓或培养对照仓的仓长，n为培养实验仓或培养对照仓的仓宽，l为斑马鱼体长。

通过上述设定对培养实验仓或培养对照仓中斑马鱼的养殖密度进行控制，避免养殖密度过大或过小造成因非固废浸出液影响的其他因素对斑马鱼毒性试验的准确度影响。

进一步地，所述摄像设备采用数字颗粒影像测速仪DPIV对斑马鱼游动速度进行测速计算。

进一步地，所述照射驱赶方法具体为：根据培养实验仓、培养对照仓的长宽比值(m/n)划分培养实验仓或培养对照仓的光照区块数量，并分别将两端两个光照区块作为A、B培养区，通过交换启动光照区块的方式将培养实验仓或培养对照仓中斑马鱼在A、B培养区进行光照驱赶，且光照驱赶时相邻光照区块开启的间隔秒数为2～5s。通过上述光照驱赶可以尽可能的降低因光照因素对斑马鱼培养的影响，同时采用上述光照区块的划分以及间隔启动的时间间隔，从而满足较好的驱赶效果。

进一步地，所述测定方法适用于所述固废浸出液的pH值在4.50～10.50之间。在上述范围下的pH值固废浸出液能够利用斑马鱼进行较好的毒性试验，而超过该范围下的固废浸出液进行斑马鱼培养其死亡率均为100％，不能计算出其LC

进一步地，所述测定方法适用于所述固废浸出液有机质含量在0～80mg/L之间。在上述范围下的有机质含量其对固废浸出液的斑马鱼急性毒性测试基本没有明显的不利影响，在该范围下具有较好的适用性。

进一步地，所述测定方法适用于所述固废浸出液盐离子浓度在0～8mmol/L之间。在上述范围下的盐离子浓度其固废浸出液中Ca

进一步地，所述养殖用水选用曝气处理24h以上的自来水，pH值为6-8。

本发明的有益效果是：

(1)本发明方法为固废浸出液的生态毒性检测提供了一种新的检测方式，并针对斑马鱼毒性试验对固废浸出液典型环境条件下pH值、有机质和盐离子含量标准提供了指导选择，从浸出液生态毒性强弱可反映出固废中毒性物质的含量水平，可作为固废浸出液中有毒物质含量鉴别的一个生物学补充方法，更能反映固废本身所具有的生态环境危害。

(2)本发明测试方法相对于斑马鱼死亡率检测，其不会未及时得出斑马鱼死亡时间所产生的时长判断误差，或者需要较长时间测试斑马鱼是否死亡来得出生态毒性的高低，本发明利用游动速度趋势等对斑马鱼的活性进行判定，其不仅缩短了斑马鱼毒性试验的判断时长，同时也降低了人工检验死亡率的工作量和降低了判断误差，有助于更为精确的判断固废浸出液的生态毒性。

附图说明

图1是本发明具体实施例极毒工业废水中斑马鱼游动速率趋势图。

图2是本发明具体实施例高毒工业废水中斑马鱼游动速率趋势图。

图3是本发明具体实施例中毒工业废水中斑马鱼游动速率趋势图。

图4是本发明具体实施例低毒工业废水中斑马鱼游动速率趋势图。

图5是本发明具体实施例微毒或无毒工业废水中斑马鱼游动速率趋势图。

图6是本发明具体实施例中pH对重铬酸钾斑马鱼急性毒性LC

图7是本发明具体实施例中腐植酸含量对重铬酸钾斑马鱼急性毒性LC

图8是本发明具体实施例中盐离子浓度对重铬酸钾斑马鱼急性毒性LC

图9是本发明具体实施例中固废土壤添加量与其浸出液对鱼类急性毒性之间关系。

具体实施方式

实施例1

一种基于斑马鱼急性毒性试验测试固废浸出液生态毒性的方法，包括以下步骤：

步骤1：设置5组的培养实验仓以及培养对照仓，所述培养实验仓、培养对照仓均为长条状的条形培养仓，有利于观察斑马鱼的游动测速；

其中，所述培养实验仓、培养对照仓的长宽比10：1，且宽度在所培养的斑马鱼体长的4倍。通过上述参数对培养实验仓、培养对照仓的规格进行设定，有利于通过市售数字颗粒影像测速仪DPIV对斑马鱼游动速度进行测定，从而提高测定的准确性。

步骤2：选择pH值、有机质含量以及盐离子浓度符合标准的固废浸出液并等量分装于培养实验仓中，调节养殖用水的pH值并等量装于培养对照仓；

其中，所述固废浸出液的pH值需符合在4.50～10.50之间。在上述范围下的pH值固废浸出液能够利用斑马鱼进行较好的毒性试验，而超过该范围下的固废浸出液进行斑马鱼培养其死亡率均为100％，不能计算出其LC

所述固废浸出液有机质含量需符合在0～80mg/L之间。在上述范围下的有机质含量其对固废浸出液的斑马鱼急性毒性测试基本没有明显的不利影响，在该范围下具有较好的适用性；

所述固废浸出液盐离子浓度需符合在0～8mmol/L之间。在上述范围下的盐离子浓度其固废浸出液中Ca

所述养殖用水选用曝气处理24h以上的自来水，水质硬度为127.0mg/L(以CaCO

步骤3：选择5～8d驯养期内斑马鱼幼鱼，斑马鱼的平均体重为0.285g，平均体长2.83cm，并将斑马鱼均分为若干组放置于斑马鱼实验仓，在养殖用水中装入斑马鱼幼鱼作为对照；取整得培养实验仓、培养对照仓的长(m)为120cm，宽(n)为12cm；

其中，所述培养实验仓或培养对照仓的养殖密度具体满足以下公式：

其中，P为培养条数，m为培养实验仓或培养对照仓的仓长，n为培养实验仓或培养对照仓的仓宽，l为斑马鱼体长；通过上述设定对培养实验仓或培养对照仓中斑马鱼的养殖密度进行控制，避免养殖密度过大或过小造成因非固废浸出液影响的其他因素对斑马鱼毒性试验的准确度影响；

m＝120，n＝12，l＝2.83，通过上述公式计算得出，P＝3.53，取整为4条；

步骤4：通过光照进行交替照射驱赶来分析鱼群游动速度，并与对照组鱼群的游动速度进行对比，以及市售数字颗粒影像测速仪DPIV捕捉分析得出斑马鱼不同时间下的游动速度变化情况；

其中，上述照射驱赶方法具体为：采用市售灯具进行光照，光照强度选择在500lx，根据培养实验仓、培养对照仓的长宽比值(m/n)为10划分培养实验仓或培养对照仓的光照区块数量为10个，并分别将两端两个光照区块作为A、B培养区，中间的6组光照区块为游动测速区，通过交换启动光照区块的方式(斑马鱼在A培养区时，其余8组光照区块进行光照照射避免斑马鱼游动至该区域，进行斑马鱼游动测速时，关闭8组光照区块并将A培养区的光照区块开启随后由A→B培养区依次常亮光照区块直至点亮B培养区紧邻的光照区块，即完成一次斑马鱼游动的光照驱赶；随后反之可执行B→A培养区的光照驱赶)将培养实验仓或培养对照仓中斑马鱼在A、B培养区进行光照驱赶，且光照驱赶时相邻光照区块开启的间隔时间为3s。通过上述光照驱赶可以尽可能的降低因光照因素对斑马鱼培养的影响，同时采用上述光照区块的划分以及间隔启动的时间间隔，从而满足较好的驱赶效果；

步骤5：根据斑马鱼游动速度降低的速率变化进行判断斑马鱼检测毒性的效果，以培养对照仓中斑马鱼作为标准游速，分别测定1h、2h、4h和8h时的各个培养实验仓的斑马鱼游动速度数据，并通过计算机分析绘制其游动速率趋势图，其判断标准具体为：

1)极毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的5％以下，且游动速率趋势图的游速变化趋势极大，判定固废浸出液生态毒性为极毒；

2)高毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的5-35％，且游动速率趋势图的游速变化趋势较大，判定固废浸出液生态毒性为高毒；

3)中毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的35-65％，且游动速率趋势图的游速变化趋势一般，判定固废浸出液生态毒性为中毒；

4)低毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的65-95％，且游动速率趋势图的游速变化趋势较小，判定固废浸出液生态毒性为低毒；

5)微毒或无毒：当培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的95％以上，且游动速率趋势图的游速变化趋势基本不变，判定固废浸出液生态毒性为微毒或无毒。

实施例2

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤1中培养实验仓、培养对照仓的长宽比不同，具体为长宽比为10：1.5，且宽度在所培养的斑马鱼体长的3倍；

即m＝60，n＝9，l＝2.83，通过实施例1公式计算得出，P＝2.36，取整为3条。

实施例3

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤1中培养实验仓、培养对照仓的长宽比不同，具体为长宽比为10：0.5，且宽度在所培养的斑马鱼体长的5倍；

即m＝300，n＝15，l＝2.83，通过实施例1公式计算得出，P＝7.06，取整为7条。

实施例4

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤4光照驱赶时相邻光照区块开启的间隔时间不同，具体为间隔时间为2s。

实施例5

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤4光照驱赶时相邻光照区块开启的间隔时间不同，具体为间隔时间为5s。

利用斑马鱼对固废浸出液生态毒性测定实例

工业废水毒性等级划分标准，参考《工业废水毒性等级划分标准》评估毒性等级，利用工业废水(96h)LC50百分浓度范围及急性毒性单位(Tua)来划分等级，则：极毒：Tua＞100；高毒：Tua＝10～100；中毒：Tua＝2～10；低毒：Tua＝1～2；微毒或无毒：Tua＜1。

分别选用上述调配上述毒性工业废水，得到极毒工业废水样本(Tua＝110)、高毒工业废水样本(Tua＝60)、中毒工业废水样本(Tua＝8)、低毒工业废水样本(Tua＝1.5)以及微毒或无毒工业废水样本(Tua＝0.2)，采用本发明实施例1的测试方法分别进行测试，测试时间节点均为2h，结果示例如下表1所示：

表1培养实验仓及培养对照仓中斑马鱼游动速度对比表

并根据分别测定1h、2h、4h和8h时的各个培养实验仓的斑马鱼游动速度数据分析绘制其游动速率趋势图，具体如图1-5所示，可以根据表1以及图1-5所示的游动速率趋势图，

极毒工业废水样本：培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的2.86％，且根据图1游动速率趋势图可以看出其在1h、2h、4h和8h的游速变化趋势极大，并且其在4h之后为0；

高毒工业废水样本：培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的22.86％，且根据图2游动速率趋势图可以看出其在1h、2h、4h和8h的游速变化趋势较大，并且其在8h之后为0；

中毒工业废水样本：培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的54.29％，且根据图3游动速率趋势图可以看出其在1h、2h、4h和8h的游速变化趋势一般；

低毒工业废水样本：培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的85.71％，且根据图4游动速率趋势图可以看出其在1h、2h、4h和8h的游速变化趋势较小；

微毒或无毒工业废水样本：培养实验仓中斑马鱼游速为标准游速的97.14％，且根据图5游动速率趋势图可以看出其在1h、2h、4h和8h的游速变化趋势基本不变；

由此可见，采用本发明测试方法及判断标准能够很好的判断出工业废水样本的毒性级别，且判断周期耗费时间周期显著缩减。

为了测定不同培养实验仓、培养对照仓设置规格对斑马鱼游动速度测定及生物毒性测定准确性的影响，考虑到极毒、高毒对斑马鱼致死率过高，故选择中毒工业废水样本进行试验测定，结果如下表2所示：

表2不同规格培养实验仓、培养对照仓下斑马鱼游动速度对比表

结论：由上述表2结果可以看出，对培养实验仓、培养对照仓的规格进行调整后，其同样能检测判断出中毒工业废水样本，但是实施例2、3均相对于实施例1而言游速略高，这对于Tua值相近的两类工业废水毒性标准时，其准确性相对实施例1而言有一定降低，因此，实施例1的培养实验仓、培养对照仓的规格在配合市售数字颗粒影像测速仪DPIV进行斑马鱼游动速度测定及后续生物毒性分析效果最优。

为了测定光照驱赶时相邻光照区块开启的间隔时间不同对斑马鱼游动速度测定及生物毒性测定准确性的影响，考虑到极毒、高毒对斑马鱼致死率过高，故选择中毒工业废水样本进行试验测定，结果如下表3所示：

表3不同光照驱赶参数下斑马鱼游动速度对比表

结论：由上述表3结果可以看出，采用不同时间间隔光照驱赶间隔时间对斑马鱼游动速度测定有一定影响，其同样能检测判断出中毒工业废水样本，但实施例4、5均相对于实施例1而言游速略低，其实施例4可能因为间隔时间相对较短，斑马鱼无法及时被光驱赶造成驱赶过程中大部分时间处于光照下游动，使驱赶效果降低，实施例5可能因为间隔时间相对较长，斑马鱼的驱赶效果降低，这对于Tua值相近的两类工业废水毒性标准时，其准确性相对实施例1而言有一定降低，因此，实施例1的培养实验仓、培养对照仓的规格在配合市售数字颗粒影像测速仪DPIV进行斑马鱼游动速度测定及后续生物毒性分析效果最优。

固废浸出液的典型环境条件对鱼类生态急性毒性测试方法适用性的影响

一、材料与方法

1试验材料

1.1试验生物

选择斑马鱼作为试验生物，由广东宏发水产养殖中心所提供。在7d驯养期内驯养鱼死亡率为0，斑马鱼的平均体重为0.285g，平均体长2.83cm。

1.2试验用水

试验用水为曝气处理24h以上的自来水，水质硬度为127.0mg/L(以CaCO

1.3参比物质

重铬酸钾，CAS:7778-50-9，分析纯(纯度：≥99.8％)，购自南京化学试剂有限公司。

2鱼类急性毒性试验方法

试验方法参照《工业废水的试验方法-鱼类毒性试验》(GB/T21814-2008)和OECD鱼类急性毒性试验方法。采用重铬酸钾为参比物质，试验用鱼为斑马鱼，每组试验用鱼为7条，每个处理组设置3个平行。质量控制要求重铬酸钾对斑马鱼的24h急性毒性LC

3浸出液中pH值对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响

采用重铬酸钾为参比物质进行参比试验，分析不同pH条件对参比试验有效性的影响。选用HCL和NaOH调节pH值分别为3.50、4.50、6.00、7.00、8.00、10.00、10.50、11.00和12.00的处理组，每个处理组均设置重铬酸钾浓度为0、100、200、300、400、500mg·L

4浸出液中有机质含量对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响

采用重铬酸钾为参比物质进行参比试验，设置重铬酸钾系列处理组浓度为0、100、200、300、400、500mg·L

5浸出液中盐离子浓度对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响

采用重铬酸钾为参比物质进行参比试验，将重铬酸钾溶解在去离子水中使重铬酸钾系列处理组浓度为0、100、200、300、400、500mg·L

6典型杀虫剂农药生产场地固废土壤浸出液对鱼类急性毒性试验

采集典型杀虫剂生产企业废弃生产场地土壤，采集后土壤经研磨混合均匀，按质量比5％、10％、20％、30％、40％分别添加进天然无污染土壤制成混合土壤。按照《危险废物鉴别标准-浸出毒性鉴别》(GB5085.3-2007)制备混合土壤的浸出液，各混合土壤浸出液分别标记为A、B、C、D、E。将浸出液作为原始供试物，分别配置不同浓度的供试物溶液，于96h的试验期间每天观察并记录试验用鱼的中毒症状和死亡率，并求出24h、48h、72h和96h的LC

7数据分析

采用SPSS软件进行LC

二、结果与讨论

2.1浸出液中pH值对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响

每个处理组调节的最终pH值范围分别为3.50(3.45～3.52)、4.50(4.46～4.52)、6.00(5.96～6.01)、7.00(6.98～7.03)、8.00(7.97～8.05)、10.00(9.96～10.04)、10.50(10.47～10.52)、11.00(10.95～11.01)和12.00(11.95～11.99)，均控制在±0.05范围内。本组试验结果，如图6所示，表明了浸出液中pH值对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响，从图6中可以看出，浸出液pH值在4.50～10.50范围内时，每个pH处理条件下重铬酸钾对斑马鱼急性毒性LC

2.2浸出液中有机质含量对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响

本部分试验分析了浸出液中有机质含量对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响，结果如图7所示，从图7中可以看出，浸出液中有机质含量为0、5、10、20、40、80mg·L

2.3浸出液中盐离子浓度对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响

本试验中，采用以氯化钙作为添加用无机盐，分析了盐离子含量强度对鱼类急性毒性试验方法适用性的影响，结果如图8所示，从图8中可以看出，浸出液中Ca2+浓度在0～8mmol·L

2.4典型杀虫剂农药生产场地固废土壤浸出液对鱼类急性毒性试验的案例分析

本研究中将典型杀虫剂生产企业废弃生产场地土壤按一定比例与天然无污染土壤混合，并制备浸出液，各混合土壤浸出液分别标记为A、B、C、D、E，以制得的浸出液作为原始供试物，利用鱼类急性毒性试验测定浸出液A、B、C、D、E的LC

2.5固体废物浸出生态毒性评估判别标准的建立

在建立适用于固废浸出液生态毒性测试的方法后，还需建立起合适的毒性评估判别标准(鱼类急性毒性)，才可判别固体废物浸出生态毒性的危害程度。本研究参照国际标准组织(ISO)推荐的方法，参考《工业废水毒性等级划分标准》评估毒性等级，利用工业废水(96h)LC

表4工业废水毒性等级划分标准

三、结论

本研究中通过开展鱼类急性毒性试验方法对固体废物浸出液生态毒性评估中的适应性分析，分析了鱼类急性毒性试验方法适用的环境条件适用范围，当固体废物浸出液中的pH值在4.50～10.50，有机质含量在0～80mg·L

根据国际标准组织(ISO)推荐的方法，参照工业废水毒性等级法，以急性毒性单位(Tua)来划分等级，本研究中初步建立了固体废物浸出液(鱼类急性毒性)生态毒性评估判别标准，Tua值越高毒性越强，参照工业废水毒性评估标准，Tua值高于10，即表明待测固废样品的浸出液具有生态毒性。