基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型、构建方法及应用

摘要

本发明涉及一种基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型、构建方法及应用，该方法包括：预制条件性位置偏爱鱼缸；将斑马鱼在抽出挡板的鱼缸中适应性喂养2天，于第3天观察15min，以头部位置为准记录斑马鱼在棕色缸或白色缸中的停留时间，并根据停留时间确定斑马鱼的偏爱缸或非偏爱缸；将基线测定合格的斑马鱼分成空白对照组以及甲基苯丙胺组；于第2、4、6天注射甲基苯丙胺后放入白色缸中进行训练；在第3、5天注射鱼用生理盐水后放入棕色缸中进行训练；在第7天通过测定斑马鱼在白色缸中的停留时间、运动轨迹以及运动总路程确定位置偏爱。本发明可建立甲基苯丙胺依赖致认知功能损伤斑马鱼模型，便于对斑马鱼的偏爱及空间线索记忆进行深入研究。

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型构建技术领域，特别涉及一种基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型、构建方法及应用。

背景技术

斑马鱼是辐鳍亚纲鲤科短担尼鱼属的一种硬骨鱼，其生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，与人类基因同源性高达87％。其中，斑马鱼具有体积小、发育周期短、产卵量高、早期胚胎发育透明等特点。斑马鱼具有脊椎动物保守的神经系统构造以及丰富的行为模式，且幼龄斑马鱼脑部透明且结构简单，已日益成为神经系统疾病研究的理想动物模型。

近年来，斑马鱼也逐渐被应用于毒瘾医学以及认知功能研究领域。与大、小鼠等哺乳类动物相比较，斑马鱼用于药物成瘾及认知功能研究，具有如下优势：(1)斑马鱼成鱼器官与系统的简单性和复杂性之间具有良好的平衡，能更准确地反应药物对动物行为的影响。对于一些在大小鼠实验中难以观察到的行为改变和生理表现，如应激行为、潜水行为、侵略行为以及趋光反应等，斑马鱼有较明显的表现，且容易观察；(2)斑马鱼体积小，重量轻，用药量少，能明显减少实验用成瘾性物质，节约药物资源；(3)斑马鱼繁殖能力强，周期短，能明显缩短实验周期；(4)幼龄斑马鱼脑部透明，易于进行活体观察。

随着行为学跟踪检测系统、转基因及活体成像等技术的广泛应用，斑马鱼已成为研究药物成瘾和认知功能的良好模式生物。药物成瘾是一种慢性、复发性脑病，具有强迫性的觅药行为及持续性渴求等特点。甲基苯丙胺也是一种较为常见的成瘾药物，但现有技术中，对甲基苯丙胺对斑马鱼的运动行为以及认知损伤，缺乏较为系统的研究与评价。基于此，有必要提出一种基于甲基苯丙胺认知损伤的动物模型构建方法，以对此进行深入研究。

发明内容

基于此，本发明的目的是为了解决现有技术中，对甲基苯丙胺对斑马鱼的运动行为以及认知损伤，缺乏较为系统的研究与评价的问题。

本发明提出一种基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，所述方法包括如下步骤：

步骤一，实验材料准备：

预制条件性位置偏爱鱼缸，其中所述条件性位置偏爱鱼缸通过挡板分隔为体积相等的两个缸，包括棕色缸以及白色缸；

步骤二，基线测定：

将斑马鱼在抽出挡板的条件性位置偏爱鱼缸中适应性喂养2天，控制条件性位置偏爱鱼缸中的水位不低于5cm，于第3天观察15min，以头部位置为准记录斑马鱼在所述棕色缸或白色缸中的停留时间，并根据停留时间确定斑马鱼的偏爱缸或非偏爱缸；

步骤三，药物干预及行为学指标测定：

分组：将基线测定合格的斑马鱼分成空白对照组以及甲基苯丙胺组；

一次观察：于第1天，观察斑马鱼在白色缸内的停留时间以及在条件性位置偏爱鱼缸内的运动轨迹；

训练：对于甲基苯丙胺组，分别于第2天、第4天与第6天注射甲基苯丙胺后将斑马鱼放入白色缸中进行训练；在第3天与第5天注射鱼用生理盐水后将斑马鱼放入棕色缸中进行训练；对于空白对照组，每天对应注射等体积的鱼用生理盐水；

二次观察：分别在第7天通过斑马鱼在白色缸中的停留时间、运动轨迹以及运动总路程确定经甲基苯丙胺干预后的斑马鱼对应的位置偏爱。

本发明提出的基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，首先制备条件性位置偏爱鱼缸，然后在制备条件性位置偏爱鱼缸中进行基线测定，具体的，将斑马鱼在鱼缸中适应性喂养2天，通过观察斑马鱼在鱼缸内的停留时间以确定偏爱缸或非偏爱缸。再进行药物干预及行为学指标测定，具体的，经分组，一次观察斑马鱼在鱼缸内的运动轨迹，对斑马鱼注射甲基苯丙胺后进行训练，再经二次观察斑马鱼在鱼缸内的停留时间、运动轨迹以及运动总路程确定经甲基苯丙胺干预后的斑马鱼对应的位置偏爱，以对斑马鱼的位置偏爱及空间线索记忆进行深入研究。

所述基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，在所述步骤一中，所述条件性位置偏爱鱼缸的体积为16cm×9cm×9cm，挡板的高度为9em。

所述基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，在所述步骤二中，以所述棕色缸作为偏爱缸，以所述白色缸作为非偏爱缸，所述非偏爱缸即为伴药缸；

在后续基线测定实验中，以斑马鱼在偏爱缸中的停留时间至少为8min作为合格标准，以剔除对伴药缸有明显偏爱的斑马鱼。

所述基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，在所述步骤三中，所述分组步骤具体包括：

将基线测定合格的斑马鱼60条，称重，随机分为空白对照组以及甲基苯丙胺组，其中甲基苯丙胺组按照注射剂量不同分为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg以及80mg/kg共5组，每组10条，雌雄各半。

所述基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，在所述步骤三中，所述一次观察步骤具体包括：

于正式实验第1天，测定斑马鱼15min内于白色缸内的停留时间，并利用动物行为追踪分析系统软件追踪斑马鱼在条件性位置偏爱鱼缸中的运动轨迹。

所述基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，在所述步骤三中，所述训练步骤具体包括：

对于甲基苯丙胺组；

于正式实验第2天、第4天以及第6天，将斑马鱼浸入50mg/L的三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐溶液中进行麻醉，在各斑马鱼的腹腔内按照10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg以及80mg/kg的标准分别注射甲基苯丙胺，再将注射甲基苯丙胺后的各斑马鱼放入条件性位置偏爱鱼缸水中30s；

待斑马鱼麻醉恢复后，将各斑马鱼放入白色缸内40min，通过挡板将条件性位置偏爱鱼缸的内部分隔开，训练结束后将各斑马鱼移至蓝色环境鱼缸中并清洗条件性位置偏爱鱼缸；

于正式实验第3天以及第5天，对各斑马鱼的腹腔注射与甲基苯丙胺相同体积的鱼用生理盐水，将注射鱼用生理盐水后的各斑马鱼放入棕色缸内40min。

所述基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，所述步骤三中，所述训练步骤具体包括：

对于空白对照组，每天对各斑马鱼，在同一时间对应注射与甲基苯丙胺等体积的鱼用生理盐水。

所述基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，在所述步骤三中，所述二次观察步骤具体包括：

在末次注射甲基苯丙胺24h后，即第7天再次测定斑马鱼在白色缸中的停留时间、运动轨迹以及运动总路程。

本发明还提出一种基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型，其中，根据上述任意一项所述的构建方法构建得到。

本发明还提出一种基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型的应用，其中，应用如上任意一项所述的基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型对斑马鱼建立甲基苯丙胺依赖致认知功能损伤。

为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提出的基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法的流程图；

图2为本发明中条件性位置偏爱鱼缸的结构示意图；

图3为本发明中T迷宫的结构示意图；

图4为本发明中所建立的斑马鱼甲基苯丙胺依赖条件性位置偏爱模型及斑马鱼对应的运动总路程的结果示意图；

图5为本发明中所建立的甲基苯丙胺依赖致认知功能损伤斑马鱼模型及斑马鱼对应的EC区停留时间的结果示意图

主要符号说明：

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的首选实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

现有技术中，对甲基苯丙胺对斑马鱼的运动行为以及认知损伤，缺乏较为系统的研究与评价。基于此，有必要提出一种基于甲基苯丙胺认知损伤的动物模型构建方法，以对此进行深入研究。

实施例一：

1、诱导斑马鱼慢性METH(甲基苯丙胺)依赖CPP(条件性位置偏爱)模型

在本发明中，请参阅图1至图3，本发明提出一种基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，其中，所述方法包括如下步骤：

S101，实验材料准备

在本步骤中，预制条件性位置偏爱鱼缸(conditioned place preference，CPP鱼缸)。如图2所示，条件性位置偏爱鱼缸10通过挡板103分隔为体积相等的两个缸，包括棕色缸101以及白色缸102。

在本实施例中，上述条件性位置偏爱鱼缸的体积为16cm×9cm×9cm，挡板103的高度为9cm。

S102，基线测定

将斑马鱼在独立的CPP鱼缸(抽出挡板)中适应性喂养2天，CPP鱼缸中的水位不低于5cm。于第3天观察15min，以头部位置为准记录斑马鱼在两箱中的停留时间，也即在棕色缸或白色缸中的停留时间，并根据停留时间确定斑马鱼对应的偏爱缸或非偏爱缸。

基线测定结果表明：大于95％的斑马鱼偏爱于棕色缸，故以棕色缸作为斑马鱼的偏爱缸，白色缸作为非偏爱缸(伴药缸)。在此需要补充说明的是，在后续的基线测定实验中，以斑马鱼在偏爱缸中的停留时间≥8min作为合格标准，以剔除对伴药缸有明显偏爱的斑马鱼。

S103，药物干预及行为学指标测定

(1)分组：取基线测定合格的斑马鱼60条，称重，随机分为空白对照组以及甲基苯丙胺组，每组10条，雌雄各半。

具体的，将基线测定合格的斑马鱼60条，称重，随机分为空白对照组以及甲基苯丙胺组，其中甲基苯丙胺组按照注射剂量不同分为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg以及80mg/kg共5组，每组10条，雌雄各半。

(2)一次观察：于第1天，观察斑马鱼在白色缸内的停留时间以及在条件性位置偏爱鱼缸内的运动轨迹。

具体的，于正式实验第1天，测定斑马鱼15min内于白色缸内的停留时间，并利用动物行为追踪分析系统软件(Noldus Etho Vision XT 8.5)追踪斑马鱼在条件性位置偏爱鱼缸中的运动轨迹(5min)。

(3)训练：对于甲基苯丙胺组，分别于第2天、第4天与第6天注射甲基苯丙胺后将斑马鱼放入白色缸中进行训练；在第3天与第5天注射鱼用生理盐水后将斑马鱼放入棕色缸中进行训练；对于空白对照组，每天对应注射等体积的鱼用生理盐水。

具体的，对于甲基苯丙胺组：

于正式实验第2天、第4天以及第6天，将斑马鱼浸入50mg/L的三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐(tricaine methanesulfonate)溶液中进行麻醉(麻醉以用手能顺利捞起斑马鱼但其仍保持正常游动姿势为度)，在各斑马鱼的腹腔内按照10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg以及80mg/kg的标准分别注射甲基苯丙胺，再将注射甲基苯丙胺后的各斑马鱼放入条件性位置偏爱鱼缸水中30s。

待斑马鱼麻醉恢复后，将各斑马鱼放入白色缸内40min。通过挡板将CPP鱼缸的内部分隔开，训练结束后将各斑马鱼移至较大的蓝色环境鱼缸中并清洗CPP鱼缸。

于正式实验第3天以及第5天，对各斑马鱼的腹腔注射与甲基苯丙胺相同体积的鱼用生理盐水，将注射鱼用生理盐水后的各斑马鱼放入棕色缸内40min。

对于空白对照组，每天对各斑马鱼，在同一时间对应注射与甲基苯丙胺等体积的鱼用生理盐水。

(4)二次观察：分别在第7天通过斑马鱼在白色缸中的停留时间、运动轨迹以及运动总路程确定经甲基苯丙胺干预后的斑马鱼对应的位置偏爱。

具体的，在末次注射甲基苯丙胺24h后，即第7天再次测定斑马鱼在白色缸中的停留时间、运动轨迹以及运动总路程。

2、T-迷宫评价METH(甲基苯丙胺)对斑马鱼的认知损伤：

如图3所示，测试装置为T型迷宫，由不透明的树脂材料制成。包括营养丰富区21、左臂222、右臂221以及甬道23。其中，甬道23与左臂222、右臂221的内壁均贴有白色贴膜，左臂222与右臂221的长度相等。从图3中可以看出，右臂221通向营养丰富区21，营养丰富区(EC区)21的内壁为黑色树脂。

在此需要指出的是，营养丰富区(EC区)21比迷宫其它地方水深5cm。在底部铺上细砂石，中间栽有人工绿植。测试开始时，将一条鱼置于甬道23的起点，测试6min，记录斑马鱼从起点到进入EC区的潜伏时间(只有当斑马鱼完全进入并连续停留超过20s才认为真正进入EC区)，以及在EC总的停留时间。测试后的每条斑马鱼放入编号的独立容器中，在全部测试后，再按顺序进行8、24及48、96h测试。

在本实施例中，利用T迷宫装置测试其空间学习记忆功能，并人为设置了一个符合斑马鱼天性偏爱的区域，即EC区，该区域较T迷宫其他位置水深，且富含水草。实验结果表明：正常的斑马鱼经过多次训练后，可明显形成对于EC区的偏爱及对空间线索的记忆。

实验结果：

(1)本发明成功建立了斑马鱼甲基苯丙胺依赖条件性位置偏爱模型，从图4中可以看出：甲基苯丙胺(40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)能显著增加斑马鱼在伴药缸的停留时间以及运动总路程。

(2)本发明成功建立了甲基苯丙胺依赖致认知功能损伤斑马鱼模型。从图5中可以看出：甲基苯丙胺(40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)能显著增加斑马鱼进入EC区的潜伏时间，且使斑马鱼在EC区的停留时间显著减少。

本发明提出的基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型构建方法，首先制备条件性位置偏爱鱼缸，然后在制备条件性位置偏爱鱼缸中进行基线测定，具体的，将斑马鱼在鱼缸中适应性喂养2天，通过观察斑马鱼在鱼缸内的停留时间以确定偏爱缸或非偏爱缸。再进行药物干预及行为学指标测定，具体的，经分组，一次观察斑马鱼在鱼缸内的运动轨迹，对斑马鱼注射甲基苯丙胺后进行训练，再经二次观察斑马鱼在鱼缸内的停留时间、运动轨迹以及运动总路程确定经甲基苯丙胺干预后的斑马鱼对应的位置偏爱，以对斑马鱼的位置偏爱及空间线索记忆进行深入研究。

本发明还提出一种基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型，其中，根据上述任意一项所述的构建方法构建得到。

本发明还提出一种基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型的应用，其中，应用如上任意一项所述的基于甲基苯丙胺认知损伤研究的动物模型对斑马鱼建立甲基苯丙胺依赖致认知功能损伤。

实施例二：

作为补充的，为了进一步研究光照条件对斑马鱼METH(甲基苯丙胺)依赖CPP(条件性位置偏爱)模型的影响，具体的构建方法包括如下步骤：

S201，实验材料准备

本步骤与上述第一实施例中的步骤相同，在此不再赘述。

S202，基线测定

本步骤与上述第一实施例中的步骤相同，在此不再赘述。

S203，药物干预及行为学指标测定

(1)一次分组：取基线测定合格的斑马鱼40条，称重，随机分为空白对照组以及甲基苯丙胺组，每组10条，雌雄各半。其中，空表对照组分为两组，甲基苯丙胺组也设置两组。

具体的，将基线测定合格的斑马鱼20条，称重，随机分为空白对照组以及甲基苯丙胺组，其中甲基苯丙胺组按对应的注射剂量为40mg/kg。在此需要说明的是，由于在第一实施例中，当甲基苯丙胺组中当注射剂量为40mg/kg时，对应的潜伏时间最长，因此将该注射剂量作为最优选剂量。

(2)光照条件设置：

将上述的两组空白对照组的斑马鱼，分别在暗箱以及亮光照射条件下处理48h；同理，将上述的两组甲基苯丙胺组的斑马鱼，分别在暗箱以及亮光照射条件下处理48h。

(3)一次观察：于进行光照条件设置完成后的第1天，分别观察斑马鱼在白色缸内(空白对照组的暗箱环境以及亮光照射环境；甲基苯丙胺组的暗箱环境以及亮光照射环境)的停留时间以及在条件性位置偏爱鱼缸内的运动轨迹。

具体的，于进行光照条件设置完成后的第1天，测定斑马鱼15min内于白色缸内的停留时间，并利用动物行为追踪分析系统软件(Noldus Etho Vision XT8.5)追踪斑马鱼在条件性位置偏爱鱼缸中的运动轨迹(5min)。

(4)训练：对于甲基苯丙胺组(暗箱组以及光照条件组)，分别于第2天、第4天与第6天注射甲基苯丙胺(40mg/kg)后将斑马鱼放入白色缸中进行训练；在第3天与第5天注射鱼用生理盐水后将斑马鱼放入棕色缸中进行训练；对于空白对照组(暗箱组以及光照条件组)，每天对应注射(40mg/kg)等体积的鱼用生理盐水。

在此需要说明的是，在进行正式实验的第1至6天的时间内(不包括前期的48h的光照条件设置)，空白对照组中的暗箱组以及光照条件组，分别在暗箱黑暗条件以及光照条件下进行。同理，甲基苯丙胺组中的暗箱组以及光照条件组，分别在暗箱黑暗条件以及光照条件下进行。

(5)二次观察：分别在第7天通过斑马鱼在白色缸中的停留时间、运动轨迹以及运动总路程，以确定光照条件的设置与否，对空白对照组以及甲基苯丙胺组的斑马鱼对应的位置偏爱的影响。

在本实施例中，对于空白对照组中的暗箱组以及光照条件组，经对比可以得知：在暗箱条件下，能在一定程度上增加斑马鱼在伴药缸的停留时间以及运动总路程。此外，对于甲基苯丙胺组中的暗箱组以及光照条件组，在暗箱条件下，能在一定程度上增加斑马鱼在伴药缸的停留时间以及运动总路程。综上两种情况可知：在暗箱条件下，能在一定程度上增加斑马鱼在伴药缸的停留时间以及运动总路程。

最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。