一种心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用

摘要

一种心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用，（1）100μmol/l Hcy干预内皮细胞建立凋亡模型，并且细胞活力染色及流式细胞术检测该浓度Hcy可以致内皮细胞凋亡，为后续实验奠定基础；（2）步骤（1）后，RT‑qPCR检测miR‑491‑5p表达水平；确定miR‑491‑5p在Hcy致内皮细胞凋亡中发挥作用；（3）转染miR‑491‑5p mimics及miR‑491‑5p inhibitor后，RT‑qPCR检测miR‑491‑5p表达水平；确定转染miR‑491‑5p mimics、miR‑491‑5p inhibitor成功后，为反向验证miR‑491‑5p对Hcy致内皮细胞凋亡的作用奠定基础；（4）分别转染miR‑491‑5p mimics及miR‑491‑5p inhibitor，流式细胞术再次检测细胞凋亡情况，明确miR‑491‑5p在Hcy致内皮细胞凋亡中作用。本发明涉及miR‑491‑5p在Hcy致内皮细胞损伤中具有重要作用，为以后在分子水平检测并诊断动脉粥样硬化提供理论依据，具有潜在的实用价值。

说明书

技术领域

本发明属于医学技术领域，特别涉及一种心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用。

背景技术

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是全球发病率和死亡率最高的疾病。目前我国心血管疾病患病人数为2.9亿，死亡率位居所有疾病首位，占居民疾病死亡构成的40％以上。CVD的发病机制尚不完全清楚，它的危险因素主要包括高血压、糖尿病、缺氧、高龄等，寻找心血管病发生和发展的分子机制成为了国内外研究和关注的热点。而大多数心血管疾病与动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的发展有关，近年来，随着人们生活水平的提高、饮食习惯的改变、工作压力的增加以及社会环境的变迁等因素影响，AS发病率呈明显上升的趋势，且发病年龄日趋年青化，因而早期发现、预防和控制动脉粥样硬化的发生和发展是目前临床科学的重要目标之一。但AS的早期分子诊断、机制及方法尚未完全阐明。目前，对于动脉粥样硬化的治疗大多还是药物治疗，常见药物有阿司匹林、氯吡格雷等，但药物副作用较大，造成过敏反应、肝损害、肾损害、胃肠道反应、血液系统毒性等，适用人群少，不能广泛普及；而作为检测血管病变金标准的颈动脉超声及血管造影，仅仅对已经发生了动脉结构改变的动脉粥样硬化有诊断意义，很难直接观察到尚未发生结构改变的动脉粥样硬化的病变；而且血管造影具有创伤性，尤其是那些对造影剂过敏、肾脏功能不好的患者无法适用。因此，寻找一种动脉粥样硬化发生发展的早期分子诊断标志物将对动脉粥样硬化的预防和诊断有着重要的意义。

AS斑块好发于异常血流形态区域，如血管弯曲和血管分支处，层流区域很少发生AS病变。而内皮细胞位于血管最内层，内侧直接与血流接触，外侧与细胞外基质连接，与细胞外基质共同构成了内皮细胞屏障，其屏障功能的完整性对维持血管系统稳态密切相关。内皮屏障功能的紊乱导致炎症细胞的入侵和血管壁脂质沉积，而这正是动脉粥样硬化发生发展的关键进程。因此动脉血管内皮细胞完整的结构及功能，能阻止血液中各种有害物质向内膜下的迁徙、移位、聚集，为防止造成动脉粥样硬化相关病变提供必要保障。细胞凋亡是机体的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。细胞凋亡是内皮细胞损伤的关键机制，因此了解内皮细胞凋亡的作用机制对于研究心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化显得尤为重要。

非编码RNA是不翻译蛋白质产物的RNA分子。人类全基因组中仅有2％的基因为蛋白质编码基因，其余大部分由非编码RNA组成。目前这些序列在病理和生理过程中具有重要作用，在动脉粥样硬化的脂质代谢、内皮细胞激活、增殖和功能异常、炎性相关的细胞募集和活化、平滑肌细胞增殖和转分化的一系列病理生理过程中，发挥着重要作用。miRNA(microRNAs)是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码。miRNA在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNA只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用。生化刺激降低内皮细胞中miRNA表达的同时也可以减少黏附分子表达和NF-kB通路上基因的表达，抑制AS发生。此外miRNA的表达还参与调控内皮细胞活化和增殖及内皮细胞衰老。由此可见，miRNA在内皮细胞中的改变是AS发生中的普遍现象，且有可能是AS形成的早期生物学标志物，因此，明确一个关键的miRNA在内皮细胞中的作用，在AS的早期诊断与预后评估中具有重要的潜在价值。此外，在定量检测方面，采用相对简单的RT-qPCR的方法检测miRNA的表达操作简单，特异性强，灵敏度高，且时间短，速度快。因此，如能检测并验证miRNA在内皮细胞凋亡中的表达及作用，对动脉粥样硬化筛查的实际临床应用具有重要意义，对提高人们生活水平和质量有不可估量的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种心血管疾病诊断用miRNA分子标志物及其应用，即miR-491-5p。验证其在Hcy致内皮细胞损伤过程中的表达及作用，进一步了解Hcy致内皮细胞损伤的分子机制，为预防和诊断心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化提供理论依据。

一种心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用，其具体技术方案为：

(1)100μmol/l Hcy干预内皮细胞建立内皮细胞凋亡模型，并且细胞活力染色及流式细胞术检测该浓度Hcy可以致内皮细胞凋亡，为后续实验奠定基础。

(2)100μmol/l Hcy干预内皮细胞后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平。确定miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中发挥作用。

(3)转染miR-491-5p mimics及miR-491-5p inhibitor后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平。确定转染miR-491-5p mimics、miR-491-5p inhibitor成功后，为反向验证miR-491-5p对Hcy致内皮细胞凋亡的作用奠定基础。

(4)分别转染miR-491-5p mimics及miR-491-5p inhibitor，流式细胞术再次检测细胞凋亡情况，明确miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中的作用。

在Hcy致内皮细胞凋亡的基础上，检测损伤细胞中miR-491-5p的表达水平，所述的miR-491-5p的序列如SEQ:ID:NO:1所示。

进一步，所述试剂包括引物由广州锐博生物科技公司合成，逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒由Takara公司提供。

进一步，检测miR-491-5p作用的步骤包括：①首先建立Hcy致内皮细胞凋亡的细胞模型；②RT-qPCR检测miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中的表达；③转染miR-491-5pmimics与miR-491-5p inhibitor后，验证转染成功；④在转染miR-491-5p mimics与miR-491-5p inhibitor的基础上，再次检测细胞凋亡改变，明确miR-491-5p在内皮细胞损伤中的作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明检测miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中的表达水平。

(2)本发明通过构建miR-491-5p mimics和miR-491-5p inhibitor，并在其基础上，验证其对细胞凋亡的作用，进而明确miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中的作用。

(3)本发明涉及的miR-491-5p在Hcy致内皮细胞损伤中具有重要作用，为以后在分子水平检测并诊断动脉粥样硬化提供理论依据，具有重大的理论指导和潜在的实用价值。

(4)本发明所涉及的方法简单易行，容易被广大群众所接受并推广。

附图说明

图1为本发明100μmol/l Hcy干预内皮细胞后，细胞活力染色检测0组(对照组)和Hcy组(实验组)红色(凋亡)细胞数改变情况。

图2为本发明100μmol/l Hcy干预内皮细胞后，流式细胞术检测0组、Hcy组细胞凋亡情况。与0组相比，**P＜0.01

图3为本发明100μmol/l Hcy干预内皮细胞后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平。与0组相比，**P＜0.01

图4为本发明miR-491-5p过表达的自身验证。转染miR-491-5p NC对照及miR-491-5p前体(miR-491-5p mimics)后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平。与NC组相比，**P＜0.01

图5为本发明miR-491-5p抑制的自身验证。转染miR-491-5p NC对照及miR-491-5p抑制物(miR-491-5p inhibitor)后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平。与NC组相比，**P＜0.01

图6为本发明转染miR-491-5p mimics后，流式细胞术检测内皮细胞凋亡改变。与Hcy-NC相比，**P＜0.01

图7为本发明转染miR-491-5p inhibitor后，流式细胞术检测内皮细胞凋亡改变。与Hcy-NC相比，**P＜0.01

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

一种心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用，其具体技术方案为：

(1)100μmol/l Hcy干预内皮细胞建立内皮细胞凋亡模型，并且细胞活力染色及流式细胞术检测该浓度Hcy可以致内皮细胞凋亡，为后续实验奠定基础。

(2)100μmol/l Hcy干预内皮细胞后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平。确定miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中发挥作用。

(3)转染miR-491-5p mimics及miR-491-5p inhibitor后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平。确定转染miR-491-5p mimics、miR-491-5p inhibitor成功后，为反向验证miR-491-5p对Hcy致内皮细胞凋亡的作用奠定基础。

(4)分别转染miR-491-5p mimics及miR-491-5p inhibitor，流式细胞术再次检测细胞凋亡情况，明确miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中的作用。

本发明所述的miR-491-5p在Hcy致内皮细胞损伤中的作用，进一步阐明了Hcy致内皮细胞凋亡的分子机制。

1、实验对象

细胞株

人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，购自中国名劲生物技术有限公司。

2、仪器设备及实验试剂

2.1主要仪器

超净工作台(苏州，安泰)；CO

2.2主要试剂

同型半胱氨酸(美国，Sigma公司)；胎牛血清、DMEM培养基(澳大利亚，Gibco公司)；青链霉素、胰蛋白酶消化液、细胞活力荧光测定试剂盒(瑞士，Roche公司)；cDNA试剂盒、RT-qPCR试剂盒(日本，Takara公司)；Lipo2000(美国，Thermo Fisher公司)；miR-491-5p NC、miR-491-5p mimics及miR-491-5p inhibitor由天津舍为斯生物工程有限公司构建。

3方法

3.1细胞培养

用含10％胎牛血清DMEM培养基培养HUVECs，置于37℃、5％CO

3.2细胞活力染色检测细胞凋亡情况

弃去培养基，将激光共聚焦皿中的细胞用PBS清洗3次，在15ml离心管中加入5mlPBS，5μl Nuclei Dye、25μl Dead Dye、3μl Viable Dye，将三种染料混合后，在每个培养皿中依次加入200μl混合染料，于37℃孵育30min后取出，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。

3.3流式细胞术检测细胞凋亡情况

使用不含EDTA的胰酶消化内皮细胞，800rpm、4℃离心弃上清。冷PBS洗涤细胞3次后，用400μl×Annexin V结合液重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀，4℃避光孵育15min，加入5μl PI染色液后混匀，避光孵育5min，立即置于流式细胞仪检测细胞凋亡改变。

3.4荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-491-5p的表达

3.4.1内皮细胞RNA的提取

按照试剂盒说明书提取内皮细胞总RNA，整个操作在超净台(经紫外照射杀毒30min)内进行，在6孔板中加入裂解液RZ裂解细胞，每孔加1ml RZ。用取样器抽打若干次至溶液透明。将透明溶液在室温放置5min，使得核酸复合物完全分离。4℃，12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。加入200μl氯仿，盖好瓶盖，涡旋振荡15sec，室温放置3min。4℃，12000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为500μl。把水相转移到新管中，缓慢加入250μl无水乙醇，混匀，将得到的溶液转入吸附柱CR3中，4℃，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心1min，弃废液，将CR3放入收集管中。向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000rpm离心1min，弃废液，再次重复加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱CR3放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去除残余液体，将吸附柱CR3在室温放置5min，以充分晾干。将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加60μl RNase-FreeddH

3.4.2 miR-491-5p的逆转录

此步骤在紫外灯照射30min的超净台中进行，操作过程中均使用无RNase的枪头，依次分别加入以下表1中的试剂，整个过程在冰上操作：

表1：miR-491-5p逆转录体系

以上体系混匀后，瞬时离心，进行逆转录反应，反应体系为42℃15min，85℃5sec，4℃无限循环，产物短期保存与-20℃，长期保存于-80℃，切忌反复冻融。

3.4.2 RT-qPCR检测miR-491-5p的表达

将以下表2中体系依次分别加到200μl无RNase离心管中：

表2：RT-qPCR反应体系

所有样品加样完成后，涡旋振荡混匀，瞬时离心后去除气泡，将样品放到荧光定量PCR仪进行反应，反应体系为37℃10min，95℃2sec，60℃20sec，70℃10sec，反应进行40个循环，将U6作为内参对照。根据目的基因的相对量＝2

3.5转染miR-491-5p mimics与miR-491-5p inhibitor

将HUVECs细胞接种于6孔板中培养24h，细胞密度至达70％，严格按照Lipofectamine 2000试剂盒操作说明书进行转染操作，分别将5μl阴性对照NC和miR-491-5p mimics/miR-491-5p inhibitor加入250μl无血清培养基，轻柔混匀，将6μlLipofectamine TM 2000脂质体与250μl无血清培养基混匀，室温放置5min。5min后，两者混匀，室温放置20min。6孔板中每孔用不含血清的培养基定容至2ml，放入恒温培养箱继续培养，转染6h后更换完全培养基，继续培养72h。

4统计学方法

本研究实验结果均为计量资料，用Prism7.0统计软件进行统计学分析，结果以

5结果

5.1细胞活力染色检测细胞凋亡

细胞活力染色检测Hcy对内皮细胞凋亡的影响，用激光共聚焦显微镜观察，结果显示：与0组相比，Hcy组凋亡细胞数(红色细胞数)显著增加，细胞活力显著降低。

5.2流式细胞术检测细胞凋亡

流式细胞术分析Hcy干预后内皮细胞凋亡水平变化，结果显示：与0组相比，Hcy组内皮细胞凋亡水平增加，提示Hcy能够促进内皮细胞凋亡。与0组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。

5.3内皮细胞中miR-491-5p表达

采用RT-qPCR检测两组内皮细胞中miR-491-5p表达，结果显示，与0组相比，Hcy组miR-491-5p表达降低(P＜0.01)，差异有统计学意义。

5.4转染miR-491-5p mimics，检测内皮细胞中miR-491-5p表达

转染miR-491-5p mimics后，为了验证转染效率，RT-qPCR检测内皮细胞中miR-491-5p表达，结果显示，与NC组相比，Hcy组miR-491-5p表达增高(P＜0.01)，差异有统计学意义。

5.5转染miR-491-5p inhibitor，检测内皮细胞中miR-491-5p表达

转染miR-491-5p inhibitor后，为了验证转染效率，RT-qPCR检测内皮细胞中miR-491-5p表达，结果显示，与NC组相比，Hcy组miR-491-5p表达降低(P＜0.01)，差异有统计学意义。

5.6转染miR-491-5p mimics，流式细胞术检测细胞凋亡

为了更加明确miR-491-5p对于细胞凋亡的作用，转染miR-491-5p mimics后，流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，在Hcy干预的前提下，与NC组相比，mimics组细胞凋亡率明显下降(P＜0.01)，差异有统计学意义。

5.7转染miR-491-5p inhibitor，流式细胞术检测细胞凋亡

转染miR-491-5p inhibitor后，流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，在Hcy干预的前提下，与NC组相比，inhibitor组细胞凋亡率明显增加(P＜0.01)，差异有统计学意义。

6结论

Hcy干预内皮细胞，可造成内皮细胞凋亡，对内皮细胞有损伤作用，而miR-491-5p在其中表达降低，且细胞凋亡的改变可随miR-491-5p的改变而改变，明确了miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中起保护作用。

本发明用Hcy干预内皮细胞，复制内皮细胞细胞凋亡模型，观察内皮细胞损伤过程中miR-491-5p在其中的作用，为对于动脉粥样硬化等心血管疾病提供新的理论基础，为临床预防与治疗提供新的方向。

以上所述，仅为本发明较佳的、较具体的实施方法，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，对技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 宁夏医科大学

<120> 一种心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用

<141> 2021-03-16

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-491-5p

<400> 1

aguggggaac ccuuccauga gg 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-491-5p inhibitor

<400> 2

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