一种利用油菜粕双菌发酵生产的肥料增效剂及方法、应用

摘要

本发明公开了一种利用油菜粕双菌发酵生产的肥料增效剂，其特征在于，该肥料增效剂为采用含油菜粕的培养基经过谷氨酸棒杆菌与芽孢杆菌发酵，一步法生产的含有聚γ‑谷氨酸与γ‑氨基丁酸混合物；且培养基的成分为：油菜粕分散液2.0％～8.0％、酵母生产废液0.2％～5.0％、氯化铵0.01％～6.5％、磷酸二氢钾0.1％～2.5％、七水硫酸镁0.05％～1.5％、硫酸锰0.001％～1.0％、柠檬酸铵0.05％～2.5％、氯化钠0.01％～0.05％、硫酸亚铁0.001％～0.006％、氯化亚铈0.001％～0.005％、椰子油油酸消沫剂0.05％～0.2％、吐温80为0.02％～0.25％、余量为去离子水。本发明还公开了肥料增效剂的制备方法及应用。利用油菜粕作为发酵培养基的原料，一步法生产含聚γ‑谷氨酸与γ‑氨基丁酸混合物的肥料增效剂PG，降低了生产成本，对环境污染少，安全可靠。

说明书

技术领域

本发明属于肥料增效剂制备方法技术领域，具体涉及一种利用油菜粕双菌发酵生产的肥料增效剂及其制备方法、应用。

背景技术

研究发现聚γ-谷氨酸(γ-PGA)和γ-氨基丁酸(GABA)对作为的生长均具有促进作用；其中聚γ-谷氨酸(γ-PGA)具有促进根系发达、增效、增产、改善品质的作用，明显提高化肥利用率。对于小白菜、玉米、烟叶的种植与栽培同样产量时肥料使用量减少10％以上，或在同样施肥量前提下提高作物产量10％以上；γ-氨基丁酸(GABA)在植物体内具有代谢物质和信号物质的双重身份，具有促进光合作用和能量代谢，促进植物营养生长生殖生长，提高植物对不同逆境抵抗能力促进植物对中微量元素的吸收、调控植物信号物质内源激素水平等作用，并且能够刺激作物生长兼抗逆突出，显著促进作物对中微量元素的吸收。

而聚γ-谷氨酸(γ-PGA)与γ-氨基丁酸(GABA)混合，组成一种促进作物生长提高产量的肥料增效剂PG(该增效剂由聚γ-谷氨酸γ-PGA与γ-氨基丁酸GABA混合组成，比例为1:0.1-10，取首字母命名为肥料增效剂PG)。肥料增效剂PG极易溶于水，能协同促进光合作用和能量代谢，促长抗逆，明显提高肥料利用率。

目前肥料增效剂PG的制备方法为：采用微生物发酵法来分别生产聚γ-谷氨酸与γ-氨基丁酸，然后混合搅拌包装为成品。一方面，传统的方法需要分别发酵后再混合，工艺上较为繁琐；另一方面，传统的发酵法培养基比较昂贵，需要使用L-谷氨酸、胰蛋白胨、葡萄糖、精制奶粉等价格昂贵的原材料，因此生产成本一直很高。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求中的一种或者多种，本发明提供了一种利用油菜粕双菌发酵生产的肥料增效剂及其方法、应用，利用油菜粕作为发酵培养基的原料，经过谷氨酸棒杆菌与芽孢杆菌发酵，一步法生产聚γ-谷氨酸与γ-氨基丁酸混合物肥料增效剂PG，降低了生产成本，对环境污染少，安全可靠。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供一种利用油菜粕双菌发酵生产的肥料增效剂，该肥料增效剂为采用含油菜粕的培养基经过谷氨酸棒杆菌与芽孢杆菌发酵，一步法生产的含有聚γ-谷氨酸与γ-氨基丁酸混合物。

作为本发明的进一步改进，以干物质重量计，所述含油菜粕的培养基的成分为：油菜粕分散液2.0％～8.0％、酵母生产废液0.2％～5.0％、氯化铵0.01％～6.5％、磷酸二氢钾0.1％～2.5％、七水硫酸镁0.05％～1.5％、硫酸锰0.001％～1.0％、柠檬酸铵0.05％～2.5％、氯化钠0.01％～0.05％、硫酸亚铁0.001％～0.006％、氯化亚铈0.001％～0.005％、椰子油油酸消沫剂0.05％～0.2％、吐温80为0.02％～0.25％、余量为去离子水。

作为本发明的进一步改进，培养基中接入的谷氨酸棒杆菌种种子液和芽孢杆菌种子液的混合液比例为1:8～10。

本发明的主要原料油菜粕是一种利用价值极大的高蛋白饲料，通常含蛋白质35％-40％、钙0.61％、磷0.95％，还含有铁、铜、锰、硒等微量元素和多种维生素，消化能10.46-12.55kj/kg。

酵母生产废液为酵母制造行业内糖蜜发酵过程中经过分离机分离后排出的废液，一条生产线年产生废液达5万吨以上，长期属于环保处理难题。该废液能免费获得，富含活性酵母、黄腐酸，固体有机质含量大于50％。

按照本发明的另一方面，提供一种利用油菜粕双菌发酵生产肥料增效剂的方法，包括如下步骤：

在发酵罐中加入含油菜粕的培养基，将谷氨酸棒杆菌种子液和芽孢杆菌种子液按比例1:8～10混合接入发酵罐中，搅拌转速200～700r/min，通气量3L/(L-min)，pH6.5～7.0，在30℃～45℃温度下培养，24小时后流加30g/L的葡萄糖液，发酵培养36～72小时后即为成品。

作为本发明的进一步改进，以干物质重量计，所述含油菜粕的培养基的成分为：油菜粕分散液2.0％～8.0％、酵母生产废液0.2％～5.0％、氯化铵0.01％～6.5％、磷酸二氢钾0.1％～2.5％、七水硫酸镁0.05％～1.5％、硫酸锰0.001％～1.0％、柠檬酸铵0.05％～2.5％、氯化钠0.01％～0.05％、硫酸亚铁0.001％～0.006％、氯化亚铈0.001％～0.005％、椰子油油酸消沫剂0.05％～0.2％、吐温80为0.02％～0.25％、余量为去离子水。

作为本发明的进一步改进，所述油菜粕分散液的制备方法为：将油菜粕粉碎后，收集油菜粕颗粒，并过筛制备得油菜粕粉末，随后按质量比1:5，将菜籽粕粉末与水搅拌混合，再次研磨机研磨成浆，加入吐温80，在200～300W下超声分散5～10min，收集得油菜粕分散液。

作为本发明的进一步改进，所述谷氨酸棒杆菌种子培养基配比为：葡萄糖25g/L，玉米浆30g/L，K

作为本发明的进一步改进，所述芽孢杆菌种子培养基配比为：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠40g/L，琼脂25g/L，pH7.1～7.6。

按照本发明的又一方面，提供一种所述的利用油菜粕双菌发酵生产的肥料增效剂作为肥料增效剂PG在作物生长中的应用。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明利用油菜粕作为发酵培养基的原料，经过谷氨酸棒杆菌与芽孢杆菌发酵，谷氨酸棒杆菌能发酵产生聚γ-谷氨酸，芽孢杆菌能在发酵培养基上继续发酵产生γ-氨基丁酸；根据生产需要来调整配比可以得到不同比例的聚γ-谷氨酸γ-PGA与γ-氨基丁酸GABA混合物，即肥料增效剂PG(比例为1:0.1～10)。本发明一步法生产聚γ-谷氨酸与γ-氨基丁酸混合物肥料增效剂PG，降低了生产成本，对环境污染少，安全可靠。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明为克服现有技术中肥料增效剂PG制取方法上的不足，提供一种质优价廉、工艺简单、生产成本低、对环境污染少的一步法肥料增效剂PG的制备方法。本发明利用油菜粕双菌发酵生产肥料增效剂的方法，包括如下步骤：

(1)制备油菜粕分散液；

选取新鲜油菜粕，经气流粉碎，收集油菜粕颗粒，将油菜粕颗粒研磨并过200目筛，制备得油菜粕粉末，随后按质量比1:5，将菜籽粕粉末与水搅拌混合，再次研磨机研磨成浆，加入吐温80，在200～300W下超声分散5～10min，收集得油菜粕分散液；

(2)分别制备谷氨酸棒杆菌种子液和芽孢杆菌种子液；

其中谷氨酸棒杆菌种子培养基配比为：葡萄糖25g/L，玉米浆30g/L，K

芽孢杆菌种子培养基配比为：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠40g/L，琼脂25g/L，pH7.1～7.6；

谷氨酸棒杆菌和芽孢杆菌的接种量分别为3-6％(体积比)；

(3)在发酵罐中加入培养基，培养基(以干物质计)成分为：油菜粕分散液2.0％～8.0％、酵母生产废液0.2％～5.0％、氯化铵0.01％～6.5％、磷酸二氢钾0.1％～2.5％、七水硫酸镁0.05％～1.5％、硫酸锰0.001％～1.0％、柠檬酸铵0.05％～2.5％、氯化钠0.01％～0.05％、硫酸亚铁0.001％～0.006％、氯化亚铈0.001％～0.005％、椰子油油酸消沫剂0.05％～0.2％、吐温80为0.02％～0.25％、余量为去离子水。

(4)将谷氨酸棒杆菌种子液和芽孢杆菌种子液按比例1:8～10混合接入发酵罐中；搅拌转速200～700r/min，通气量3L/(L-min)；pH6.5～7.0，在30℃～45℃温度下培养，24小时后流加30g/L的葡萄糖液，发酵培养36～72小时后即为成品，并且发酵过程中间隔若干小时取样测定各项参数并进行调控。

为更好的说明本发明的产品及制备方法，提供以下具体实施例：

实施例1

选取新鲜油菜粕，经气流粉碎，收集油菜粕颗粒，将油菜粕颗粒研磨并过200目筛，制备得油菜粕粉末，随后按质量比1:5，将菜籽粕粉末与水搅拌混合，再次研磨机研磨成浆，加入吐温80，在200～300W下超声分散8min，收集得油菜粕分散液；

10L发酵罐中加入培养基(以干物质计)，成分为：油菜粕分散液6.0％、酵母生产废液3.0％、氯化铵2.5％、磷酸二氢钾1.5％、七水硫酸镁1.1％、硫酸锰0.5％、柠檬酸铵1.5％、氯化钠0.02％、硫酸亚铁0.003％、氯化亚铈0.003％、椰子油油酸消沫剂0.1％、吐温80为0.15％、余量为去离子水；

制备谷氨酸棒杆菌种子液和芽孢杆菌种子液；在本发明的具体实施例中谷氨酸棒杆菌选择谷氨酸棒杆菌S9114，芽孢杆菌选择地衣芽孢杆菌WX-02，当然选择其他种类的谷氨酸棒杆菌和芽孢杆菌，只要能够达到本发明的技术效果，均在本发明的保护范围之内。

其中，谷氨酸棒杆菌S9114种子培养基(g/L)配比：葡萄糖25，玉米浆30，K

谷氨酸棒杆菌S9114是目前我国国内味精工业应用非常广泛的生产菌种，为天津短杆菌T613的突变株。在江南大学工业生物技术教育部重点实验室、山东大学微生物技术国家重点实验室有保藏。公知常见的市场上有销售，一般商业途径即可获得。地衣芽孢杆菌WX-02由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室筛选和保藏，保藏编号为CCTCCM208065。

将谷氨酸棒杆菌S9114种子液和地衣芽孢杆菌WX-02种子液按比例1:9混合接入10L发酵罐中；搅拌转速380r/min，通气量3L/(L-min)，pH6.5～7.0，在37℃温度下培养，24小时后流加30g/L的葡萄糖液，发酵过程中每间隔6小时取样测定各项参数并进行调控，发酵培养48小时后即为成品。

经过检测，成品肥料增效剂PG中，聚γ-谷氨酸含量为55.88g/L，γ-氨基丁酸含量为9.32g/L。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，

10L发酵罐中加入培养基(以干物质计)，成分为：油菜粕分散液2.0％、酵母生产废液0.2％、氯化铵0.01％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁0.5％、硫酸锰0.01％、柠檬酸铵0.1％、氯化钠0.01％、硫酸亚铁0.004％、氯化亚铈0.002％、椰子油油酸消沫剂0.05％、吐温80为0.1％、余量为去离子水；

将谷氨酸棒杆菌S9114种子液和地衣芽孢杆菌WX-02种子液按比例1:8混合接入10L发酵罐中；搅拌转速200r/min，通气量3L/(L-min)，pH6.5～7.0，在30℃温度下培养，24小时后流加30g/L的葡萄糖液，发酵过程中每间隔6小时取样测定各项参数并进行调控，发酵培养36小时后即为成品。

经过检测，成品肥料增效剂PG中，聚γ-谷氨酸含量为50.65g/L，γ-氨基丁酸含量为10.34g/L。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，

10L发酵罐中加入培养基(以干物质计)，成分为：油菜粕分散液8.0％、酵母生产废液5.0％、氯化铵4.0％、磷酸二氢钾2.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸锰1.0％、柠檬酸铵0.05％、氯化钠0.05％、硫酸亚铁0.001％、氯化亚铈0.001％、椰子油油酸消沫剂0.2％、吐温80为0.25％、余量为去离子水；

将谷氨酸棒杆菌S9114种子液和地衣芽孢杆菌WX-02种子液按比例1:10混合接入10L发酵罐中；搅拌转速700r/min，通气量3L/(L-min)，pH6.5～7.0，在45℃温度下培养，24小时后流加30g/L的葡萄糖液，发酵过程中每间隔6小时取样测定各项参数并进行调控，发酵培养72小时后即为成品。

经过检测，成品肥料增效剂PG中，聚γ-谷氨酸含量为56.36g/L，γ-氨基丁酸含量为12.16g/L。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，

10L发酵罐中加入培养基(以干物质计)，成分为：油菜粕分散液4.0％、酵母生产废液2.0％、氯化铵6.5％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.05％、硫酸锰0.001％、柠檬酸铵2.5％、氯化钠0.03％、硫酸亚铁0.006％、氯化亚铈0.005％、椰子油油酸消沫剂0.15％、吐温80为0.02％、余量为去离子水；

将谷氨酸棒杆菌S9114种子液和地衣芽孢杆菌WX-02种子液按比例1:9混合接入10L发酵罐中；搅拌转速580r/min，通气量3L/(L-min)，pH6.5～7.0，在40℃温度下培养，24小时后流加30g/L的葡萄糖液，发酵过程中每间隔6小时取样测定各项参数并进行调控，发酵培养60小时后即为成品。

经过检测，成品肥料增效剂PG中，聚γ-谷氨酸含量为56.12g/L，γ-氨基丁酸含量为9.05g/L。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，

10L发酵罐中加入培养基(以干物质计)，成分为：油菜粕分散液5.0％、酵母生产废液1.0％、氯化铵1.0％、磷酸二氢钾1.1％、七水硫酸镁0.1％、硫酸锰0.1％、柠檬酸铵0.8％、氯化钠0.04％、硫酸亚铁0.002％、氯化亚铈0.004％、椰子油油酸消沫剂0.08％、吐温80为0.2％、余量为去离子水；

将谷氨酸棒杆菌S9114种子液和地衣芽孢杆菌WX-02种子液按比例1:9混合接入10L发酵罐中；搅拌转速350r/min，通气量3L/(L-min)，pH6.5～7.0，在35℃温度下培养，24小时后流加30g/L的葡萄糖液，发酵过程中每间隔6小时取样测定各项参数并进行调控，发酵培养55小时后即为成品。

经过检测，成品肥料增效剂PG中，聚γ-谷氨酸含量为55.96g/L，γ-氨基丁酸含量为8.13g/L。

本发明利用油菜粕作为发酵培养基的原料，经过谷氨酸棒杆菌与芽孢杆菌发酵，能够实现一步法生产含聚γ-谷氨酸与γ-氨基丁酸混合物的肥料增效剂PG，降低了生产成本，对环境污染少，安全可靠。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。