川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱的构建方法及鉴别方法

摘要

本发明属于药物分析技术领域，特别是涉及一种川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱的构建方法及鉴别方法。本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱的构建方法构建得到的川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱中共有色谱峰的出峰时间适中，纯度高，容易定位，可准确判定川牛膝或酒川牛膝的质量；有效解决了现有判定川牛膝质量时存在不准确的缺陷；且该构建方法重现性良好，准确可靠。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，特别是涉及一种川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱的构建方法及鉴别方法。

背景技术

川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，为2015版《中国药典》收载的常用中药材，具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋之作用，主要用于经闭癍瘕，胞衣不下，跌扑损伤，风湿痹痛，足痿筋挛，尿血血淋；其性味甘、微苦，平，归肝、肾经。川牛膝的化学成分主要为甾酮类、皂苷类、多糖类、异黄酮类等。现有的川牛膝饮片多以其主要活性成分杯苋甾酮的含量作为质量控制指标；但是单一的成分含量测定不能完全反映中药材的药效作用。因此，建立一种高效液相特征图谱，作为川牛膝饮片的质量控制标准是非常迫切的。

现有技术中公开了一种川牛膝药材的指纹图谱，具体地是在多波长切换的条件下采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Agilent ZORBAX SB-C18柱，以乙腈为流动相A，0.1-0.3％磷酸水溶液为流动相B，通过如下的梯度洗脱程序：0min-8min，1％流动相A，99％流动相B；8min-15min，1％→4％流动相A，99％→96％流动相B；15min-53min，4％→9％流动相A，96％→91％流动相B；53min-70min，9％-15％流动相A，91％-85％流动相B；70min-100min，15％→16％流动相A，85％→84％流动相B；100min-110min，16％→22％流动相A，84％→78％流动相B；

110min-130min，22％→33％流动相A，78％→67％流动相B；130min-145min，33％-42％流动相A，67％-58％流动相B；145min-160min，42％流动相A，58％流动相B；160min-160.01min，42％→1％流动相A，58％→99％流动相B；160.01min-170min，1％流动相A，99％流动相B。

得到川牛膝HPLC指纹图谱如图1所示，由图1可知该指纹图谱中有18个共有色谱峰，其中的峰1-峰3出峰时间接近溶剂峰，峰6、峰10、峰15、峰16、峰18面积过小等，杂峰过多，在实际操作中存在色谱峰定位困难，积分偏差较大的缺点，导致通过该指纹图谱判定川牛膝质量时存在不准确的缺陷。

现有技术中还公开了另一种川牛膝的指纹图谱，其以杯苋甾酮的特征峰作为参照；采用C18反相色谱柱；检测波长为266nm；流动相为不同浓度的甲醇-水溶液，采用非线性梯度洗脱方式，在检测时间内、不同时间段的流动相变化如下：0-5min：甲醇浓度(体积百分比浓度，下同)由5％匀速变至46％，5-32min：甲醇浓度由46％匀速变至66％，32-40min：甲醇浓度由66％匀速变至100％。所得川牛膝HPLC指纹图谱如图2所示，由图2可知，该指纹图谱中有10个共有色谱峰，其中，峰6太小，不易定位，峰10有分叉，纯度不高。在实际操作中同样存在色谱峰定位困难，积分偏差较大的缺点，导致通过该指纹图谱判定川牛膝质量时存在不准确的缺陷。

此外，现有技术中未见酒川牛膝特征图谱的构建方法，多以其主要活性成分杯苋甾酮的含量作为质量控制指标，无法准确检测酒川牛膝的质量。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的方法无法准确检测川牛膝和/或酒川牛膝质量的缺陷，从而提供一种川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱的构建方法以及川牛膝和/或酒川牛膝的质量检测方法。

本发明要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中的方法无法准确鉴别川牛膝与酒川牛膝的缺陷，从而提供一种川牛膝与酒川牛膝的鉴别方法。

为此，本发明提供如下技术方案：一种川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：供试品溶液的制备：取川牛膝供试品制备得到川牛膝供试品溶液；和/或，取酒川牛膝供试品制备得到酒川牛膝供试品溶液；高效液相色谱检测：将川牛膝供试品溶液和/或酒川牛膝供试品溶液注入液相色谱仪，检测，即得；其中，高效液相色谱法的色谱条件包括：采用Kromasil 100-5C18的色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.18-0.22％含酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0min→20min，5％→10-12％流动相A，95％→88-90％流动相B；20min→35min，10-12％→18-20％流动相A，88-90％→80-82％流动相B；35min→40-45min，18-20％→23％流动相A，80-82％→77％流动相B；40-45min→60min，23-25％流动相A，77-75％流动相B；55-60min→70-75min，23-25％→45-50％流动相A，75-77％→50-55％流动相B；70-75min→80-85min，45-50％→100％流动相A，50-55％→0％流动相B。优选地，所述含酸水溶液选自磷酸水溶液、醋酸水溶液和甲酸水溶液中的至少一种；优选地，梯度洗脱条件如下：0min-20min，5％→10％流动相A，95％→90％流动相B；20min-35min，10％→18％流动相A，90％→82％流动相B；35min-45min，18％→23％流动相A，82％→77％流动相B；45min-60min，23％流动相A，77％流动相B；60min-75min，23％→45％流动相A，77％→55％流动相B；75min-85min，45％→100％流动相A，55％→0％流动相B。供试品溶液的制备中，所述川牛膝供试品可以采用药材、饮片或者制剂，例如选自川牛膝药材、川牛膝饮片、川牛膝饮片标准汤剂冻干粉、川牛膝配方颗粒中的至少一种。所述酒川牛膝供试品可以采用饮片或者制剂，例如选自酒川牛膝饮片、酒川牛膝饮片标准汤剂冻干粉、酒川牛膝配方颗粒中的至少一种。可选地，所述高效液相色谱仪分析的色谱条件还包括：柱温为25-35℃，流速为0.4-0.6mL/min，检测波长为210-275nm；优选地，柱温为30℃，流速为0.5mL/min，检测波长为266nm，流动相B为体积分数为0.2％磷酸水溶液。可选地，在所述川牛膝供试品溶液或者酒川牛膝供试品溶液的制备过程中包括采用溶剂对供试品进行提取、过滤，取滤液的步骤，优选地，采用的溶剂为体积分数为10-70％的甲醇水溶液，提取的方式为加热回流或超声提取，更优选地，溶剂为体积分数为30％的甲醇水溶液，提取的方式为加热回流，供试品的质量与溶剂的体积比为1:7.5-25g/ml。可选地，所述构建方法还包括对照品溶液的制备步骤和按照所述的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品特征图谱的步骤；在所述对照品溶液的制备过程中包括采用溶剂对杯苋甾酮进行溶解的步骤；优选地，采用的溶剂为体积分数≥50％的甲醇水溶液或纯甲醇，更优选地，溶剂为纯甲醇，对照品溶液中杯苋甾酮的浓度为10-50μg/mL。所述构建方法还包括参照物溶液的制备，所述参照物溶液的制备包括，取川牛膝对照药材与溶剂混合，经提取，过滤得到参照物溶液；所述高效液相色谱检测步骤中还包括将参照物溶液在所述的色谱条件下采用高效液相色谱仪进行分析，得到川牛膝对照药材的HPLC特征图谱；优选地，参照物溶液的制备中，采用的溶剂为体积分数为10-70％的甲醇水溶液；所述提取的方式为加热回流或超声提取。

可选的，所述构建方法还包括川牛膝对照特征图谱的构建，利用中国药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对得到的至少15批川牛膝HPLC特征图谱进行分析，生成川牛膝对照特征图谱；和/或，还包括酒川牛膝对照特征图谱的构建，利用中国药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对得到的至少15批酒川牛膝HPLC特征图谱进行分析，生成酒川牛膝对照特征图谱。

本发明还提供了一种上述的构建方法得到的川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱。

本发明还提供了一种川牛膝对照特征图谱，选自如下任意一项：

(1)其含有7个特征峰，各特征峰与峰5的相对保留时间在规定值的土10％、土5％或者土3％范围之内；规定值为0.63(峰1)、0.67(峰2)、0.96(峰3)、0.97(峰4)、1.26(峰6)、1.42(峰7)；

(2)使用单批次或多批次川牛膝道地药材并按照本发明任一项所述的构建方法得到的川牛膝HPLC特征图谱；

(3)使用多批川牛膝按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照谱图。

本发明还提供了一种酒川牛膝对照特征图谱，选自如下任意一项：

(1)所述酒川牛膝的HPLC特征图谱包含8个特征峰，各特征峰与峰6的相对保留时间在规定值的土10％、土5％或者土3％范围之内；规定值为0.30(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、0.96(峰4)、0.97(峰5)、1.26(峰7)、1.42(峰8)；

(2)所述酒川牛膝的HPLC特征图谱包含8个特征峰，其中6号峰为杯苋甾酮参照峰S；各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的土10％、土5％或者土3％范围之内；规定值为0.30(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、0.96(峰4)、0.97(峰5)、1.26(峰7)、1.42(峰8)；且峰1与S峰的相对峰面积不低于1.20；

(3)使用单批次或多批次川牛膝道地药材按照药典方法炮制的酒川牛膝药材并按照本发明任一项所述的构建方法得到的酒川牛膝HPLC特征图谱；

(4)使用多批酒川牛膝按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照谱图。峰1表示1号峰，以此类推。

本发明提供了一种川牛膝和/或酒川牛膝的质量检测方法，包括将待测川牛膝产品的特征图谱与川牛膝对照特征图谱进行比较的步骤和/或将待测酒川牛膝产品的特征图谱与酒川牛膝对照特征图谱进行比较的步骤；其中，所述待测川牛膝产品的特征图谱和待测酒川牛膝产品的特征图谱为使用待测产品按照上述任一所述的构建方法得到。

所述待测川牛膝产品可以采用药材、饮片或者制剂，例如选自川牛膝药材、川牛膝饮片、川牛膝饮片标准汤剂冻干粉、川牛膝配方颗粒中的至少一种。所述待测酒川牛膝产品可以采用饮片或者制剂，例如选自酒川牛膝饮片、酒川牛膝饮片标准汤剂冻干粉、酒川牛膝配方颗粒中的至少一种。

若待测川牛膝产品的特征图谱与川牛膝对照特征图谱不能匹配，则可以认为是伪品。若待测酒川牛膝产品的特征图谱与酒川牛膝对照特征图谱不能匹配，则可以认为是伪品。

当待测产品为川牛膝产品时，待测产品的特征图谱与川牛膝对照特征图谱的相似度如果不低于0.95，则为质量合格；如果低于0.95，则为不合格。当待测产品为酒川牛膝产品时，待测产品的特征图谱与酒川牛膝对照特征图谱的相似度如果不低于0.95(除了峰1外)，则为质量合格；如果低于0.95，则为不合格。具体地，所述相似度通过国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统得到。

优选地，当待测产品为酒川牛膝产品时，峰1与S峰的相对峰面积不低于1.20，说明炮制工艺合格，产品质量合格。

本发明还提供了一种川牛膝和/或酒川牛膝的鉴别方法，包括将待测产品的特征图谱与川牛膝对照特征图谱和/或酒川牛膝对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测产品的特征图谱为使用待测产品按照上述任一所述的构建方法得到。

待鉴别产品可以是川牛膝或者酒川牛膝产品，也可以是除了川牛膝或者酒川牛膝之外的其他产品，可以采用药材、饮片或者制剂，例如选自川牛膝药材、川牛膝饮片、川牛膝饮片标准汤剂冻干粉、川牛膝配方颗粒、酒川牛膝饮片、酒川牛膝饮片标准汤剂冻干粉、酒川牛膝配方颗粒等。

若待鉴别产品与川牛膝对照特征图谱相一致，则为川牛膝；若与酒川牛膝对照特征图谱相一致，则为酒川牛膝；若与川牛膝对照特征图谱和酒川牛膝对照特征图谱均不相一致，则不是川牛膝和酒川牛膝。

将本发明构建得到的酒川牛膝HPLC特征图谱与川牛膝HPLC特征图谱进行共有峰的指认，其中特征峰数量发生了一定变化，参见图40，主要体现为酒川牛膝HPLC特征图谱中的峰1存在炮制后的酒川牛膝饮片中，川牛膝HPLC特征图谱中相应位置缺失。也就是说通过酒川牛膝HPLC特征图谱中的峰1可用于鉴别川牛膝(生品)与酒川牛膝(炮制品)。

而且峰1与S峰的相对峰面积受不同炮制程度有所影响，除峰1外，其余7个特征峰与川牛膝HPLC特征图谱中特征峰保留时间一致，其他7个特征峰未发生明显变化，特征性成分量值传递关系良好。说明可以通过控制酒川牛膝HPLC特征图谱中峰1的相对峰面积可作为酒川牛膝的炮制程度的评价指标。目前酒川牛膝HPLC特征图谱中峰1暂未知其结构，但通过质谱分析，确认其分子量为126.03(图50)，分子式为C

通过规定酒川牛膝HPLC特征图谱中峰1与S峰的相对峰面积，可起到区分和控制酒川牛膝饮片的质量。故分析15批酒川牛膝饮片的图谱中峰1的相对峰面积在1.20-7.64之间，均值3.15，考虑到不同批次间在炮制时随炮制酒量、闷润程度以及炒制程度等都可能有所差异，以及本次研究15批酒川牛膝样品代表局限性，建议规定峰1与S峰的相对峰面积的比值限度以最低值计算，定为1.20。即计算峰1与S峰的相对峰面积，应不低于1.20，作为川牛膝和酒川牛膝的区分以及酒川牛膝饮片的质量控制。可根据今后的饮片情况，研究更多批次的样品，考察相对峰面积限度的合理性。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱的构建方法，采用高效液相色谱法对川牛膝和/或酒川牛膝的有效成分进行检测，经过多次反复试验，采用Kromasil100-5C18的色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.18-0.22％磷酸水溶液为流动相B，并在特定的梯度洗脱下构建得到川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱，该HPLC特征图谱中共有色谱峰的出峰时间适中，色谱峰分离完全，峰形佳且无干扰，容易定位，可以全面反映样品的特征信息，可准确检测川牛膝或酒川牛膝的质量，具有重现性好，精密度高，准确可靠的优点，可以对川牛膝和酒川牛膝进行真伪和品质鉴定，有效解决了现有方法对川牛膝或者酒川牛膝质量检测不准确的缺陷。

2.本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱，川牛膝的HPLC特征图谱中包含7个共有色谱峰；构建得到的酒川牛膝的HPLC特征图谱中包含8个共有色谱峰；特征峰信息量丰富：确定了7个特征峰为川牛膝和酒川牛膝共有，1个特征峰为川牛膝炮制后得到产生的，是炮制后的酒川牛膝特有的，该特征峰的分子结构暂未知，但通过高分辨的质谱分析确认了其分子量为126.03(图50)，分子式为C

3.本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定饮片质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性；而且特征图谱中共有色谱峰出峰时间适中，纯度高，容易定位，可准确判定川牛膝或酒川牛膝的质量；有效解决了现有判定川牛膝质量时存在不准确存在不准确的缺陷；且该特征图谱重现性良好，准确可靠。

4.本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的质量检测方法，通过待检测产品的特征图谱特征峰的信息，例如相对保留时间与相对峰面积，或者通过采用相似度综合评价，与川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱进行比较，较传统的单指标成分含量测定作为质量控制依据更具科学性和可持续性，能够全面的对川牛膝和/或酒川牛膝进行质量控制。

且共有的7个特征峰能够从川牛膝到酒川牛膝中稳定传递，同时出峰时间稳定适中，纯度高，容易定位和计算相对峰面积；且酒川牛膝在泡制过程中，不同批次间炮制的酒量、闷润程度以及炒制程度等均不影响特征图谱的构建及得到的特征图谱中特征峰的相对保留时间、相对峰面积等。

5.本发明提供的川牛膝与酒川牛膝的鉴别方法，准确可靠，且川牛膝与酒川牛膝饮片图谱的检测方法可靠，线性梯度洗脱的条件简单，便于操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是现有技术中川牛膝的指纹图谱；图2是现有技术中川牛膝的另一种指纹图谱；图3是本发明实验例1中检测波长210nm下的HPLC色谱图；图4是本发明实验例1中检测波长243nm下的HPLC色谱图；图5是本发明实验例1中检测波长266nm下的HPLC色谱图；图6是本发明实验例1中检测波长275nm下的HPLC色谱图；图7是本发明实验例1中梯度1的HPLC色谱图；图8是本发明实验例1中梯度2的HPLC色谱图；图9是本发明实验例1中梯度3的HPLC色谱图；图10是本发明实验例1中0.2％磷酸-乙腈流动相的HPLC色谱图；图11是本发明实验例1中0.2％醋酸-乙腈流动相的HPLC色谱图；图12是本发明实验例1中0.2％甲酸-乙腈流动相的HPLC色谱图；图13是本发明实施例1中Kromasil 100-5C18色谱柱的HPLC色谱图；图14是本发明实施例1中Agilent ZORBAX SB C18色谱柱的HPLC色谱图；图15是本发明实施例1中Thermo accliam C18色谱柱的HPLC色谱图；图16是本发明实施例1中0.4mL/min流速的HPLC色谱图；图17是本发明实施例1中0.5mL/min流速的HPLC色谱图；图18是本发明实施例1中0.6mL/min流速的HPLC色谱图；图19是本发明实施例1中柱温25℃的HPLC色谱图；图20是本发明实施例1中柱温30℃的HPLC色谱图；图21是本发明实施例1中柱温35℃的HPLC色谱图；图22是本发明实施例1中水提取溶剂的HPLC色谱图；图23是本发明实施例1中纯甲醇提取溶剂的HPLC色谱图；图24是本发明实施例1中30％甲醇水溶液提取溶剂的HPLC色谱图；图25是本发明实施例1中50％甲醇水溶液提取溶剂的HPLC色谱图；图26是本发明实施例1中70％甲醇水溶液提取溶剂的HPLC色谱图；图27是本发明实施例1中提取时间30min的HPLC色谱图；图28是本发明实施例1中提取时间45min的HPLC色谱图；图29是本发明实施例1中提取时间60min的HPLC色谱图；图30是本发明实施例1中溶剂体积15mL的HPLC色谱图；图31是本发明实施例1中溶剂体积25mL的HPLC色谱图；图32是本发明实施例1中溶剂体积50mL的HPLC色谱图；图33是本发明实施例1中专属性实验中空白溶剂的HPLC色谱图；图34是本发明实施例1中专属性实验中样品的HPLC色谱图；图35是本发明实施例1中精密度实验的HPLC色谱图；图36是本发明实施例1中重复性实验的HPLC色谱图；图37是本发明实施例1中稳定性实验的HPLC色谱图。图38是15批次酒川牛膝饮片HPLC特征图谱共有峰模式；图39是酒川牛膝对照特征图谱；图40是川牛膝饮片、酒川牛膝饮片共有峰指认结果；图41是本发明实施例1中对照品杯苋甾酮的定位图；图42是本发明实施例2中专属性实验中空白溶剂的HPLC色谱图；图43是本发明实施例2中专属性实验中样品的HPLC色谱图；图44是本发明实施例2中精密度实验中的HPLC色谱图；图45是本发明实施例2中重复性实验的HPLC色谱图；图46是本发明实施例2中稳定性实验的HPLC色谱图。图47是15批次川牛膝饮片HPLC特征图谱共有峰模式；图48是川牛膝对照特征图谱；图49是川牛膝对照药材特征图谱；图50是图39中峰1的二级质谱图(+ESI)。其中，图48是15批川牛膝饮片HPLC特征图谱利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，生成的川牛膝对照特征图谱；图39是15批酒川牛膝饮片HPLC特征图谱利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，拟合生成的酒川牛膝对照特征图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本发明实施例及实验例采用的实验仪器、试剂与对照品见表1。

表1实验仪器、试剂与对照品

实施例1酒川牛膝饮片HPLC特征图谱的构建方法

1、试验方法

1.1溶液的制备

对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为30％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流45min，取出，冷却至室温，再次称定重量，并用体积分数为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。

对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液。

1.2供试品溶液的制备：

将酒川牛膝饮片粉碎后过三号筛，取筛下物(粉末)2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为30％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流45min，取出，冷却至室温，再次称定重量，用体积分数为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得酒川牛膝饮片供试品溶液。

2、测定方法

分别精密吸取对照药材溶液、对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图；

初步拟定的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil 100-5-C18；250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为266nm；柱温为30℃；流速为0.5mL/min；洗脱梯度如下表所示：

表2洗脱梯度

3、色谱分析条件的确定

3.1检测波长的选择

参照上述测定方法中的初步拟定的色谱条件，取同一份酒川牛膝饮片供试品溶液，然后考察不同吸收波长(210nm，243nm，266nm，275nm)对酒川牛膝饮片中各成分的分离度的影响，不同检测波长得到供试品溶液的色谱图如图3-6所示。不同检测波长得到的主要特征峰的系统适应性参数如下表所示。

以色谱峰数量和峰面积作为指标，由图3-6及表3可知，在266nm检测波长下，得到的各特征峰峰形最好，数量最多，且峰大小适中，分布较为均匀，因此，最终确定266nm作为检测波长。

表3不同检测波长得到的供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

3.2梯度的选择

参照上述测定方法中的初步拟定的色谱条件，取同一份酒川牛膝饮片供试品溶液，考察以下不同的洗脱梯度对酒川牛膝饮片中各成分的分离度的影响，不同的洗脱梯度分别见表4-6所示，不同洗脱梯度得到的色谱图如图7-9所示，不同洗脱梯度得到的主要特征峰的系统适应性参数如表7所示。由图7-9及表7可知，采用梯度3洗脱呈现图谱的信息更丰富，主要色谱峰分离度更好，基线较平稳且出峰时间较为合理，因此，确定洗脱梯度为梯度3。

表4洗脱梯度1

表5洗脱梯度2

表6洗脱梯度3

表7不同梯度下得到供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

3.3流动相成分的选择

参照上述测定方法中的初步拟定的色谱条件，取同一份酒川牛膝饮片供试品溶液，考察以下不同的流动相成分对酒川牛膝饮片中各成分的分离度的影响：0.2％磷酸-乙腈、0.2％醋酸-乙腈、0.2％甲酸-乙腈，不同流动相成分得到的色谱图如图10-12所示，不同流动相成分得到的主要特征峰的系统适应性参数如表8所示。由图10-12及表8可知，与其他流动相比，0.2％磷酸-乙腈的流动相成分得到的酒川牛膝饮片供试品溶液的色谱图的分离度更好，说明0.2％磷酸-乙腈的流动相成分更适合酒川牛膝饮片所有成分的分离。

表8不同流动相得到供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

3.4不同色谱柱的考察

参照上述测定方法中的初步拟定的色谱条件，取同一份酒川牛膝饮片供试品溶液，考察以下不同色谱柱对酒川牛膝饮片中各成分的分离效果：(1)Kromasil 100-5C18 5μm 4.6mm×250mm；(2)Agilent ZORBAX SB C18 5μm4.6mm×250mm；(3)Thermo accliam C185μm 4.6mm×250mm；不同色谱柱得到的色谱图如图13-15所示，不同色谱柱得到的主要特征峰的系统适应性参数如表9所示。由图13-15及表9可知，Agilent ZORBAX SB C18 5μm4.6mm×250mm和Thermo accliam C18 5μm 4.6mm×250mm两种色谱柱不能满足分离要求，Kromasil 100-5C18色谱柱对酒川牛膝饮片中各成分的分离效果较好。

表9不同色谱柱得到供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

3.5不同流速的考察

参照上述测定方法中的初步拟定的色谱条件，取同一份酒川牛膝饮片供试品溶液，考察以下不同流速对酒川牛膝饮片中各成分的分离效果：0.4mL/min、0.5mL/min，0.6mL/min，不同流速得到的色谱图如图16-18所示，不同流速得到的主要特征峰的系统适应性参数如表10所示。由图16-18及表10可知，三种流速都能对酒川牛膝饮片中各成分进行分离，结合色谱峰系统适应性参数(峰的保留时间、宽度、高度、分离度、对称因子、理论板数等)，0.5mL/min流速对酒川牛膝饮片中各成分的分离效果更好。

表10不同流速得到供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

3.6不同柱温的选择

参照上述测定方法中的初步拟定的色谱条件，取同一份酒川牛膝饮片供试品溶液，考察以下不同柱温对酒川牛膝饮片中各成分的分离效果：25℃、30℃、35℃，不同柱温得到的色谱图如图19-21所示，不同柱温得到的主要特征峰的系统适应性参数如表11所示。由图19-21及表11可知，三种柱温都能对酒川牛膝饮片中各成分进行分离，结合色谱峰系统适应性参数(峰的保留时间、宽度、高度、分离度、对称因子、理论板数等)，故选择柱温为30℃。

表11不同柱温得到供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

3.7最终确定的色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，洗脱梯度如表6所示；流速：0.5mL/min；柱温为30℃；检测波长为266nm，理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于2000。

4、供试品溶液制备方法的确定

4.1提取溶剂的选择

采用上述3.7中最终确定的色谱条件，参照1.2中供试品溶液的制备的制备方法，考察以下不同的提取溶剂提取所得供试品溶液的色谱图的系统适应性参数：水、纯甲醇、体积分数为30％甲醇水溶液、体积分数为50％甲醇水溶液、体积分数为70％甲醇水溶液；不同提取溶剂得到供试品溶液的色谱图如图22-26所示。不同溶剂提取得到的主要特征峰的系统适应性参数如下表所示。

表12不同提取溶剂得到供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

由上表中的数据及图22-26可知，当供试品溶液的提取溶剂为体积分数为30％的甲醇时，所得供试品溶液的色谱图中各成分的峰型较好，系统适应性参数相对较优。

4.2提取时间的选择

采用上述3.7中最终确定的色谱条件，参照1.2中供试品溶液的制备的制备方法，考察以下不同的提取时间提取所得供试品溶液的色谱图的系统适应性参数：30min、45min、60min；不同提取时间得到供试品溶液的色谱图如图27-29所示。不同提取时间得到的主要特征峰的系统适应性参数如下表所示。

表13不同提取时间得到供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

由上表中的数据及附图27-29可知，不同的提取时间对供试品溶液的溶解效果及其得到的色谱图无明显差异，故暂定提取时间为45min。

4.3提取溶剂用量的考察

采用上述3.7中最终确定的色谱条件，参照1.2中供试品溶液的制备的制备方法，考察以下不同的提取溶剂用量提取所得供试品溶液的色谱图的系统适应性参数：15mL、25mL和50mL，不同提取溶剂用量得到供试品溶液的色谱图如图30-32所示。不同提取溶剂用量得到的主要特征峰的系统适应性参数如下表所示。

表14不同提取体积溶剂用量得到供试品溶液的色谱图的系统适应性参数

上表中的数据经浓度换算转化后，各拟定特征峰峰面积较为接近，说明不同的提取溶剂的用量均能够将酒川牛膝饮片中的成分完全提取出来，结合附图30-32，综合考虑后，选择25mL体积分数为30％甲醇水溶液作为酒川牛膝饮片提取溶剂用量。

4.4最终提取方案的确定

供试品溶液的制备方法为：将酒川牛膝饮片粉碎后过三号筛，取筛下物(粉末)2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为30％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流45min，取出，冷却至室温，再次称定重量，用体积分数为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得酒川牛膝饮片供试品溶液。

5.方法学验证

5.1专属性考察

取同一批号的酒川牛膝饮片，按供试品溶液制备方法制备成酒川牛膝供试品溶液和空白溶剂(体积分数为30％甲醇水溶液)，按照3.7中确定的色谱条件进样测定，记录色谱图。结果如图33-34所示，由图33-34可知，各色谱峰不受空白溶剂的干扰，本发明提供的酒川牛膝饮片的HPLC特征图谱的构建方法具有良好的专属性。

5.2精密度考察

取同一批号的酒川牛膝饮片，按供试品溶液制备方法制备成酒川牛膝供试品溶液，按照3.7中确定的色谱条件连续进样6次，以杯苋甾酮色谱峰(6号峰)为参照峰S，考察各特征峰的相对保留时间，并计算RSD值。结果如下表15-16所示，精密度实验的色谱图如图35所示。

表15仪器精密度相对保留时间的试验结果

表16仪器精密度相似度结果

由上表15-16中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD均小于2％，因峰1的大小与炮制程度有关，因此15批次酒川牛膝之间差异较大，拟合生成的酒川牛膝对照特征图谱与单一批次酒川牛膝之间亦有差异，计入峰1后，相似度会明显下降。无法表征其余7个峰的稳定传递关系，因此建议计算相似度时峰1不计入内，除峰1外，与酒川牛膝对照特征图谱(图39，15批酒川牛膝饮片HPLC特征图谱利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，拟合生成的酒川牛膝对照特征图谱)的相似度均大于0.990，表明本发明提供的酒川牛膝饮片的HPLC特征图谱的构建方法精密度良好。

5.3重复性考察

分别取同一批号酒川牛膝饮片样品6份，按供试品溶液制备方法制备成酒川牛膝饮片供试品溶液，按照3.7中确定的色谱条件连续进样分析，以杯苋甾酮色谱峰为参照峰S(6号峰)，考察各特征峰的相对保留时间，并计算RSD值。结果如表17-18所示，重复性实验的色谱图如图36所示。

表17重复性相对保留时间试验结果

表18重复性相似度结果

由上表17-18中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD均小于2％。除峰1外，与酒川牛膝对照特征图谱(图39)的相似度均大于0.990，表明本发明提供的酒川牛膝饮片的HPLC特征图谱的构建方法的重复性良好。

5.4稳定性实验

取同一批号酒川牛膝饮片样品，按供试品溶液制备方法制备成酒川牛膝饮片供试品溶液，按照3.7中确定的色谱条件，在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h分别进样，共测定24h，以杯苋甾酮色谱峰为参照峰S，考察各特征峰的相对保留时间，并计算RSD值。结果如表19-20所示，稳定性实验的色谱图如图37所示。

表19稳定性试验相对保留时间试验结果

表20稳定性相似度结果

由上表19-20中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD均小于2％。除峰1外，与酒川牛膝对照特征图谱(图39)的相似度均大于0.990，表明供试品溶液24h内稳定，本发明提供的酒川牛膝饮片的HPLC特征图谱的构建方法的稳定性良好。

实施例2

本实施例提供了一种酒川牛膝饮片对照特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备

取经过基原鉴定为川牛膝的15批川牛膝样品，参照《中国药典》2015版一部对酒川牛膝饮片炮制方法的规定经炮制得到酒川牛膝样品，具体操作方法为：取合格的净川牛膝饮片，加入饮片重量10％的黄酒，拌匀，闷润至透(约1.0小时)，将润透完成的物料置于炒药机对其进行炒制。设置炒制温度为150℃，待锅体温度升至工艺要求温度后，投入净川牛膝片，记录炒制开始时间，炒至表面浅黑色或灰褐色，略有酒香气，每锅炒制时间约20-25min；得到酒川牛膝饮片。

取上述炮制所得15批酒川牛膝饮片，按照实施例1“1.2”项中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液。

(3)高效液相色谱检测

在实施例1“3.7”项中确定的色谱条件下获取15批酒川牛膝饮片的供试品HPLC特征图谱和对照品特征图谱。

结果分析：参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，并对所得图谱的进行相似度比较。对15批酒川牛膝饮片共有峰信息进行分析(图38)，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为酒川牛膝饮片特征图谱共有峰，建立酒川牛膝对照特征图谱(图39)。

15批酒川牛膝饮片特征图谱具有8个特征峰，以杯苋甾酮相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，如下：0.30(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、0.96(峰4)、0.97(峰5)、1.26(峰7)、1.42(峰8)。15批酒川牛膝饮片特征图谱的8个特征峰相对保留时间RSD值在0.02％-0.38％，均小于2.0％，符合酒川牛膝饮片特征图谱的标准要求。因此，将8个特征峰的相对保留时间纳入酒川牛膝质量检测中，质量标准包括：酒川牛膝的HPLC特征图谱包含8个特征峰，其中6号峰为杯苋甾酮参照峰S；各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的土10％范围之内；规定值为0.30(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、0.96(峰4)、0.97(峰5)、1.26(峰7)、1.42(峰8)。对于不同批次的酒川牛膝饮片来说，炮制酒量、闷润程度以及炒制程度等都可能有所差异，8个特征峰与S峰的相对峰面积的RSD在86.44％-307.36％，表明不同批次特征成分含量有较大差异，因此考虑到不同批次间在炮制时随炮制酒量、闷润程度以及炒制程度等都可能有所差异，以及本次研究15批酒川牛膝样品代表局限性，8个特征峰的相对峰面积不列入质量标准，而检测发现峰1与S峰的相对峰面积均在1.20-7.64之间，且峰1为炮制后新产生的特征峰，因此，还可以将峰1与S峰的相对峰面积纳入酒川牛膝质量检测中，质量标准还包括：峰1与S峰的相对峰面积不低于1.20。

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，除峰1外，供试品特征图谱与酒川牛膝饮片对照特征图谱经Mark峰相似度计算，相似度不得低于0.950。

具体的15批川牛膝饮片产地及实验结果见下表21-24所示。

表21 15批川牛膝饮片产地信息表

表22 15批酒川牛膝饮片相对保留时间

表23 15批酒川牛膝饮片相对峰面积

表24 15批酒川牛膝饮片特征图谱相似度结果

注：对照图谱是指图39酒川牛膝对照特征图谱。

实施例3川牛膝饮片HPLC特征图谱的构建方法和方法学验证

本实施例提供了一种川牛膝饮片HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

1.对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为30％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流45min，取出，冷却至室温，再次称定重量，并用体积分数为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。

2.对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液。

3.供试品溶液的制备：将待测川牛膝饮片粉碎后过三号筛，取筛下物(粉末)2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为30％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流45min，取出，冷却至室温，再次称定重量，用体积分数为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测川牛膝饮片供试品溶液。

4.高效液相色谱法：分别精密吸取对照药材溶液、对照品溶液与待测供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录待测川牛膝饮片的特征图谱、对照药材特征图谱和对照品特征图谱。色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil 100-5-C18；250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为266nm；柱温为30℃；流速为0.5mL/min；洗脱梯度同实施例1中的测定方法部分的洗脱梯度。

5.方法学验证

5.1专属性考察

取同一批号的川牛膝饮片，按供试品溶液制备方法制备成酒川牛膝供试品溶液和空白溶剂(体积分数为30％甲醇水溶液)，按照“4”项下中确定的色谱条件进样测定，记录色谱图。结果如图42-43所示，由图可知，各色谱峰不受空白溶剂的干扰，本发明提供的川牛膝饮片的HPLC特征图谱的构建方法具有良好的专属性。

5.2精密度考察

取同一批号的川牛膝饮片，按供试品溶液制备方法制备成川牛膝供试品溶液，按照“4”项下中确定的色谱条件连续进样6次，以杯苋甾酮色谱峰(5号峰)为参照峰S，考察各特征峰的相对保留时间，并计算RSD值。结果如下表25-26所示，精密度实验的色谱图如图44所示。

表25仪器精密度相对保留时间的试验结果

表26仪器精密度相似度结果

由上表25-26中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD均小于2％，与川牛膝对照特征图谱(图48，15批川牛膝饮片HPLC特征图谱利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，拟合生成的川牛膝对照特征图谱)的相似度均大于0.980，表明本发明提供的川牛膝饮片的HPLC特征图谱的构建方法精密度良好。

5.3重复性考察

分别取同一批号川牛膝饮片样品6份，按供试品溶液制备方法制备成川牛膝饮片供试品溶液，按照“4”项下中确定的色谱条件连续进样分析，以杯苋甾酮色谱峰为参照峰S(5号峰)，考察各特征峰的相对保留时间，并计算RSD值。结果如表27-28所示，重复性实验的色谱图如图45所示。

表27重复性相对保留时间试验结果

表28重复性相似度结果

由上表27-28中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD均小于2％。与川牛膝对照特征图谱(图48)的相似度均大于0.980，表明本发明提供的川牛膝饮片的HPLC特征图谱的构建方法的重复性良好。

5.4稳定性实验

取同一批号川牛膝饮片样品，按供试品溶液制备方法制备成川牛膝饮片供试品溶液，按照“4”项下中确定的色谱条件，在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h分别进样，共测定24h，以杯苋甾酮色谱峰为参照峰S，考察各特征峰的相对保留时间，并计算RSD值。结果如表29-30所示，稳定性实验的色谱图如图46所示。

表29稳定性试验相对保留时间试验结果

表30稳定性相似度结果

由上表29-30中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD均小于2％。与川牛膝对照特征图谱(图39)的相似度均大于0.980，表明供试品溶液24h内稳定，本发明提供的川牛膝饮片的HPLC特征图谱的构建方法的稳定性良好。

实施例4

本实施例提供了一种川牛膝对照特征图谱及其构建方法，包括如下步骤：

随机取15批川牛膝样品，依据2015版《中国药典》对川牛膝药材来源的规定，本发明中所使用的川牛膝药材为通过资源调研、道地产区考察后自行采收，并经安徽中医药大学基原鉴定为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根。具体的15批川牛膝饮片产地见下表31。

按照实施例3中“供试品溶液的制备”得到15批川牛膝饮片供试品溶液，按照实施例3“高效液相色谱法”检测，得到15批川牛膝饮片特征图谱。参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件生成对照特征图谱，并对所得图谱的进行相似度比较。

对得到的待测川牛膝饮片的特征图谱进行分析(图47)，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为川牛膝饮片特征图谱共有峰，建立川牛膝对照特征图谱(图48)。15批川牛膝饮片特征图谱具有7个特征峰，且7个特征峰均与川牛膝对照药材特征图谱相一致(图49)。川牛膝对照特征图谱中具有7个特征峰，其中峰5与杯苋甾酮相应峰保留时间相同；以杯苋甾酮相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间应该在规定值的土10％范围之内；规定值为：0.63(峰1)、0.67(峰2)、0.96(峰3)、0.97(峰4)、1.26(峰6)、1.42(峰7)，实验结果见下表32-34所示。

15批川牛膝饮片特征图谱的7个特征峰相对保留时间RSD值在0.02％-0.20％，均小于2.0％，符合川牛膝饮片特征图谱的标准要求。15批川牛膝饮片特征图谱的7个特征峰相对峰面积的RSD在22.55％-67.97％，表明不同批次特征成分含量有较大差异。因此不列入质量标准。

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品特征图谱与川牛膝饮片对照特征图谱经Mark峰相似度计算，相似度不得低于0.950。

表31 15批川牛膝饮片产地信息表与15批川牛膝饮片特征图谱相似度结果

注：对照图谱是指图48川牛膝对照特征图谱。

表32 15批川牛膝饮片相对保留时间

表33 15批川牛膝饮片相对峰面积

实施例5

本实施例提供了一种酒川牛膝饮片的鉴别方法，包括如下步骤：

(1)溶液的制备：

对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为30％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流45min，取出，冷却至室温，再次称定重量，并用体积分数为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液。待鉴别样品溶液的制备：为验证标准的普遍适应性，随机抽取医院或者药店市售的3批酒川牛膝饮片为待鉴定样品，分别取待鉴别样品2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为30％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流45min，取出，冷却至室温，再次称定重量，并用体积分数为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)高效液相色谱法测定：

分别精密取对照药材溶液、对照品溶液与待鉴别样品溶液各20μL，注入液相色谱仪分析，记录色谱图。液相色谱仪分析的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil 100-5-C18；250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为266nm；柱温为30℃；流速为0.5mL/min；洗脱梯度如表6所示。

(3)结果分析：

待鉴别样品的特征图谱中有8个特征峰，其中6号峰为杯苋甾酮参照峰S；各特征峰与S峰的相对保留时间均在规定值的土10％范围之内；规定值为0.30(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、0.96(峰4)、0.97(峰5)、1.26(峰7)、1.42(峰8)，将供试品特征图谱与酒川牛膝饮片对照特征图谱经Mark峰相似度计算(除峰1外)，相似度均高于0.950。且峰1与S峰的相对峰面积均高于1.20，结果表明随机抽取的3批待鉴别样品均为酒川牛膝饮片，3批酒川牛膝饮片均符合质量要求。

实施例6

本实施例提供了一种川牛膝饮片的鉴别和质量检测方法，包括如下步骤：

(1)溶液的制备：

待鉴别样品溶液的制备：为验证标准的普遍适应性，随机抽取医院市售的3批川牛膝饮片为待鉴别样品，取待鉴别样品2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数为30％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流45min，取出，冷却至室温，再次称定重量，并用体积分数为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)高效液相色谱法测定：

精密取待鉴别样品溶液各20μL，注入液相色谱仪分析，记录色谱图。液相色谱仪分析的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil 100-5-C18；250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表6中的规定进行梯度洗脱；检测波长为266nm；柱温为30℃；流速为0.5mL/min。

(3)结果分析：待鉴别样品的色谱呈现7个特征峰，各特征峰与S峰的相对保留时间均在规定值的土10％范围之内；规定值为0.63(峰1)、0.67(峰2)、0.96(峰3)、0.97(峰4)、1.26(峰6)、1.42(峰7)，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，将供试品特征图谱与川牛膝饮片对照特征图谱经Mark峰相似度计算，相似度均高于0.950。结果表明随机抽取的3批待鉴别样品均为川牛膝饮片，3批川牛膝饮品均符合质量要求。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。