山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp1801在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用

摘要

本发明提供了山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用，涉及生物技术领域。本发明还提供了基于M1801株的疫苗及其制备方法，所述疫苗能提高免疫保护效果，减少免疫副反应，可提供良好免疫保护效果；同时所述M1801株毒力强、免疫原性好、生长性能优良，该菌株制苗可诱导机体产生高水平抗体，抗体产生时间早，滴度高；疫苗安全性高；免疫羊4/5及以上保护，可显著减轻体温升高和咳嗽、打喷嚏、精神沉郁等症状或组织病变。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用。

背景技术

山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是山羊的一种接触性呼吸道传染病，由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp)引起，临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、纤维素性胸膜肺炎及肺脏肝样变为特征，是世界动物卫生组织(OIE) 法定报告的传染病之一。山羊传染性胸膜肺炎主要由接触传播、飞沫传播，新疫区疫病爆发时发病率高达100％，死亡率可高达80％。非洲、中东、亚洲等地区是该病的主要流行地区，近年来，该病感染的宿主范围越来越大，现已成为严重危害世界养羊业和野生反刍动物健康如野山羊、藏羚羊、阿拉伯羚羊等的重要疫病。

山羊传染性胸膜肺炎的防控主要有疫苗和药物等，临床药物使用时效果有限，很难将病原彻底清除。预防免疫是防控山羊传染性胸膜肺炎的重要措施。目前，山羊传染性胸膜肺炎的疫苗主要为灭活疫苗，包括菌体灭活疫苗和组织灭活疫苗。山羊传染性胸膜肺炎组织灭活疫苗存在很大的生物安全风险、制品标准化、病原含量不稳定，容易存在其他病原污染，且工艺复杂，对试验厂房场地要求高，产量有限、副反应较大等问题。菌体灭活疫苗可以克服组织灭活疫苗的部分缺陷，如对疫苗病原含量不稳定，可能其他病原污染等问题，在预防控制山羊传染性胸膜肺炎中发挥重要作用。目前菌体灭活疫苗，制苗菌株为十几年前或更早流行菌株，经甲醛等灭活剂灭活，配以油佐剂等佐剂制成，免疫后部分羊副反应较大，甲醛等灭活剂存在的有效抗原破坏或抗原表位失活的问题，以及对强毒山羊支原体山羊肺炎亚种感染的保护效果有限、成本高等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801 在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用，利用Mccp 1801创制的疫苗，可诱导机体产生高水平抗体，抗体产生时间早，滴度高，安全高效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae)Mccp 1801在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用。

优选的，所述疫苗的类型包括灭活疫苗。

本发明还提供了一种山羊传染性胸膜肺炎疫苗，所述疫苗中包括山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801的灭活抗原。

优选的，所述疫苗中还包含皂苷和ISA 201 VG双佐剂；

优选的，所述灭活抗原的制备方法，包括：(1)将复苏的山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801的菌株接种于改良MTB培养基，经活化培养和扩大培养后，得支原体菌液；所述改良MTB培养基中包括以下浓度的组分：葡萄糖2g/L、丙酮酸钠2g/L、PPLO肉汤21g/L，质量百分含量为25％的酵母浸出液100ml/L，质量百分含量为1％的酚红2.5ml/L、马血清200ml/L、10万IU青霉素，pH值为7.4～7.6；

(2)将所述支原体菌液离心，收集菌体沉淀，重悬后得浓度为100～400 μg/ml的支原体抗原溶液；

(3)将所述支原体抗原溶液与皂苷混合，在4℃条件下灭活24～48h，得灭活抗原。

优选的，步骤(1)所述活化培养和扩大培养，包括：在37℃培养12～24h，当培养物pH值下降至6.5～6.8时，以5～10％的接种量进行3～6次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6.5～6.8时，收获所述支原体菌液。

优选的，步骤(2)所述离心为在4℃进行离心，所述离心的转速为12000 rpm，离心时间为20～40min，优选为30min；收集菌体沉淀后还包括利用PBS 缓冲液洗涤3次。

优选的，步骤(3)所述皂苷与所述支原体抗原溶液的质量体积比为1～4 mg/ml。

本发明还提供了上述疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将所述灭活抗原与质量百分含量为1％的硫柳汞溶液混合，得液相成分；

2)将ISA 201VG佐剂与所述液相成分混合，乳化10～30min，得水包油包水型乳化灭活疫苗；所述ISA 201VG佐剂与所述液相成分的体积比为 (50～55)：(45～50)。

优选的，步骤1)所述硫柳汞溶液的体积为所述灭活抗原体积的1％。

本发明提供了山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae)Mccp 1801(简称M1801)在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用，所述M1801株比现有疫苗株M1601、C87001毒力更强、免疫原性更好、生长性能优良，该菌株制苗可诱导机体产生高水平抗体，抗体产生时间早，滴度高，维持时间长；疫苗安全性高；免疫羊4/5及以上保护，可显著减轻体温升高和咳嗽、打喷嚏、精神沉郁等症状或肺脏等组织病变。

本发明还提供了基于M1801株的疫苗制备方法，尤其是灭活疫苗的制备方法，M1801株的抗原纯度高，皂苷作为灭活剂和佐剂，皂苷可破坏溶解支原体细胞膜，有效保留抗原有效成分，解决了现有甲醛等灭活剂存在的有效抗原破坏或抗原表位失活的问题。本发明使用皂苷、ISA 201 VG双佐剂；皂苷能够增强免疫反应，刺激机体细胞和体液免疫应答，免疫持续时间长； ISA 201 VG佐剂为新型佐剂，水包油包水型乳剂，免疫效果好，稳定、黏度低、易于注射、刺激反应小，所述双佐剂使用能够改善免疫应答，提高免疫保护效果，减少免疫副反应，可提供良好免疫保护效果。

附图说明

图1为疫苗免疫后山羊血清抗体水平；

图2为肺脏剖检病变；图中a为疫苗组，b为对照组；

图3为肺脏病理组织学变化，图中a为疫苗组，b为对照组。

具体实施方式

本发明提供了山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae)Mccp 1801在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用。

本发明所述Mccp 1801(M1801)已在文献中公开(吴娅琴，刘保红，袁婷等.山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用.中国兽医科学.2020,50(10):1257～1262)，在中国科学院兰州兽医研究所有保存。本发明所述菌株M1801优选由发病山羊肺脏分离得到，比现有疫苗株 M1601、C87001毒力更强，免疫原性更好、生长性能优良，该菌株制苗可诱导机体产生高水平抗体，抗体产生时间早，滴度高，安全性高且高效，可用于制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗。本发明所述疫苗的类型优选包括灭活疫苗。

本发明还提供了一种山羊传染性胸膜肺炎疫苗，所述疫苗中包括山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801的灭活抗原。

本发明所述灭活抗原的制备方法，优选包括：(1)将复苏的山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801的菌株接种于改良MTB培养基，经活化培养和扩大培养后，得支原体菌液；所述改良MTB培养基中包括以下浓度的组分：葡萄糖2g/L、丙酮酸钠2g/L、PPLO肉汤21g/L，质量百分含量为25％的酵母浸出液100ml/L，质量百分含量为1％的酚红2.5ml/L、马血清200ml/L、 10万IU青霉素，pH值为7.4～7.6；

(2)将所述支原体菌液离心，收集菌体沉淀，重悬后得浓度为100～400 μg/ml的支原体抗原溶液；

(3)将所述支原体抗原溶液与皂苷混合，在4℃条件下灭活24～48h，得灭活抗原。

本发明在制备步骤(1)所述改良MTB培养基时，优选将葡萄糖2g、丙酮酸钠2g分别加水25ml溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用；将 21g PPLO肉汤溶于650ml去离子水中，加入25％(m/m)酵母浸出液100ml， 1％(m/m)酚红2.5ml，混匀，经121℃高压灭菌20min，冷却后加入无菌的健康马血清200ml和上述经滤过除菌的8％(m/m)葡萄糖25ml、8％(m/m) 丙酮酸钠溶液25ml和10万IU/ml青霉素1ml，用灭菌的1mol/L NaOH调 pH值至7.4～7.6，无菌分装，置于2～8℃备用，即为改良MTB培养基。本发明将复苏的M1801菌株接种于所述改良MTB培养基上，本发明对所述复苏和接种的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段进行复苏和接种即可。本发明所述改良MTB培养基解决了Mccp病原生长速度慢、生长产量低等问题，降低了生产成本，可规模化生产。本发明对接种后的M1801 菌株进行活化培养和扩大培养，所述活化培养和扩大培养的培养基均为上述改良MTB培养基，且培养温度优选均为37℃，且所述活化培养的时间为 12～24h，培养物pH值下降至6.5～6.8时进行扩大培养。本发明所述扩大培养时的接种量为5～10％，优选10％，且进行连续扩大培养3～6次，直至培养物pH值下降至6.5～6.8，收获支原体菌液。

本发明步骤(2)所述离心优选在4℃进行，所述离心的转速优选为12000 rpm，离心时间20～40min，优选为30min，收集菌体沉淀，利用PBS缓冲液洗涤3次，所述PBS缓冲液的浓度优选为0.01M，pH7.2～7.4。本发明在得到所述菌体沉淀后，优选还包括利用BCA蛋白定量试剂盒测定菌体蛋白浓度，并使用所述PBS缓冲液，调整支原体抗原浓度至100～400μg/ml。

本发明步骤(3)中所述皂苷与所述支原体抗原溶液的质量体积比优选为1～4mg/ml。本发明所述灭活优选在4℃条件进行，所述灭活的时间优选为24～48h，期间每隔2～4h摇匀一次。本发明在所述灭活完成后，优选还包括灭活检验，更优选的包括吸取灭活的M1801菌液0.2ml，0.1ml接种改良 MTB培养基，10倍梯度浓度稀释至10

本发明所述疫苗中包含佐剂，优选为双佐剂，具体为皂苷、ISA 201 VG 双佐剂；所述皂苷能够增强免疫反应，刺激机体细胞和体液免疫应答，免疫持续时间长；所述ISA 201VG佐剂为新型佐剂，水包油包水型乳剂，免疫效果好，稳定、黏度低、易于注射、刺激反应小，所述双佐剂能够改善免疫应答，提高免疫保护效果，减少免疫副反应，可提供良好免疫保护效果。本发明所述疫苗对山羊安全，对山羊支原体山羊肺炎亚种引起的山羊传染性胸膜肺炎的免疫保护率均可达4/5以上。

本发明还提供了上述疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将所述灭活抗原与质量百分含量为1％的硫柳汞溶液混合，得液相成分；

2)将ISA 201VG佐剂与所述液相成分混合，乳化10～30min，得水包油包水型乳化灭活疫苗；所述ISA 201VG佐剂与所述液相成分的体积比为 (50～55)：(45～50)。

本发明将所述灭活抗原与质量百分含量为1％的硫柳汞溶液混合，得液相成分，所述硫柳汞溶液的体积优选为所述灭活抗原体积的1％。

得液相成分后，本发明将ISA 201VG佐剂与所述液相成分混合，乳化 10～30min，得水包油包水型乳化灭活疫苗；所述ISA 201VG佐剂与所述液相成分的体积比为(50～55)：(45～50)。本发明所述乳化时，优选先将所述佐剂加到灭菌容器中，再将液相成分加入，用乳化机乳化10～30min，乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)乳化灭活苗。本发明所述疫苗外观呈乳白色，为水包油包水型(w/o/w)。

利用本发明所述制备方法制备得到所述疫苗后，优选还包括对所述疫苗进行检测，更优选包括物理性状检验、无菌检验、安全性检测和效力检测。本发明所述物理性状检验包括：疫苗外观呈乳白色，略带粘滞性的乳状液，水包油包水型(w/o/w)；3000rpm离心15min不分层；所述无菌检验包括：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长；所述安全性检测包括：将山羊支原体山羊肺炎亚种灭活疫苗接种健康山羊(Mccp抗体、抗原阴性)，每只羊颈部肌肉注射2ml疫苗，对照组注射等量的PBS，连续观察14d。结果疫苗组和对照组山羊均健活，羊只无咳嗽、打喷嚏等症状，采食、饮水无异常，无明显不良反应，疫苗应安全；所述效力检测包括：将健康山羊(Mccp 抗体、抗原阴性)，分为疫苗组和对照组，每组5只，免疫组每只羊颈部皮下注射疫苗2ml，两周后再次注射2ml，对照组以相同方式和剂量注射PBS，首免后第35d，免疫组和对照组山羊进行山羊支原体山羊亚种攻毒，M1801 菌液，攻毒剂量为10

下面结合实施例对本发明提供的山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

试剂来源：山羊支原体山羊肺炎亚种M1801株来源于中国农业科学院兰州兽医研究所；PPLO肉汤购自BD公司，丙酮酸钠为AMRESCO公司产品，马血清为Gibco公司产品，酚红、皂苷为Sigma公司，ISA 201 VG佐剂购自Seppic上海公司；葡萄糖等为国产分析纯试剂。

实施例1

灭活疫苗制备

(1)抗原液的制备

1)培养基制备方法：将葡萄糖2g、丙酮酸钠2g分别加水25ml溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用；将21g PPLO肉汤溶于650ml去离子水中，加入25％酵母浸出液100ml，1％酚红2.5ml，混匀，经121℃高压灭菌 20min，冷却后加入无菌的健康马血清200ml和上述经滤过除菌的8％葡萄糖25ml、8％丙酮酸钠溶液25ml和10万IU/ml青霉素1ml，用灭菌的1mol/L NaOH调pH值至7.4～7.6，无菌分装，置4℃备用，即为改良MTB培养基。

2)支原体抗原制备：

将山羊支原体山羊肺炎亚种M1801菌种复苏，接种至4.5ml改良MTB 培养基，37℃培养24h，当培养物pH值下降至6.5～6.8时，按培养基总量的 10％进行3次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6.5～6.8时，收获支原体菌液1000ml，4℃12000rpm离心30min，收集菌体沉淀，PBS缓冲液 (0.01M，pH7.2～7.4)离洗3次；使用BCA蛋白定量试剂盒测定菌体蛋白浓度，利用PBS缓冲液(0.01M，pH7.2～7.4)，调整支原体抗原浓度至300μg/ml。

(2)抗原的灭活：支原体抗原中加入经0.22μm微孔滤膜过滤除菌皂苷，皂苷终浓度为2mg/ml，在4℃条件下灭活24h，期间每隔个2h摇匀一次。待灭活完成后，进行灭活检验，吸取灭活的M1801菌液0.2ml，0.1ml 接种改良MTB培养基，10倍梯度稀释至10

(3)疫苗的制备

采用一步乳化法，制成水包油包水乳剂灭活疫苗。

液相成分：山羊支原体山羊肺炎亚种M1801灭活抗原20ml，按抗原总量的1％加入1％硫柳汞溶液0.2ml，共20.2ml，占总量48％。

油相成分：ISA 201VG佐剂22.22ml，占总量的52％。

乳化方法：先将ISA 201VG佐剂加到灭菌瓶中，再将液相成分加入，用小型乳化机Fluko调1档(5000rpm)乳化12min，乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)乳剂灭活苗。

疫苗检验：

物理性状检验：该疫苗为外观呈乳白色，略带粘滞性的乳状液，水包油包水型(w/o/w)。疫苗稳定，3000rpm离心15min不分层。

无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

实施例2

灭活疫苗的安全性试验

将山羊支原体山羊肺炎亚种灭活疫苗接种8～9月龄健康山羊(Mccp抗体、抗原阴性)，每只羊颈部肌肉注射2ml疫苗，对照组注射等量的PBS，连续观察14d。结果疫苗组和对照组山羊均健活，羊只无咳嗽、打喷嚏等症状，采食、饮水无异常，注射部分无明显肿块等不良反应，本发明疫苗安全。

实施例3

灭活疫苗的效力试验

将8～9月龄健康山羊(Mccp抗体、抗原阴性)，分为疫苗组和对照组，每组5只，免疫组每只羊颈部皮下注射疫苗2ml，两周后再次注射2ml，对照组以相同方式和剂量注射PBS，首免后第35d，免疫组和对照组山羊进行山羊支原体山羊亚种攻毒，M1801菌液，攻毒剂量为10

间接ELISA方法检测Mccp抗体水平，操作方法如下：将1.6μg/mL M1801菌体蛋白包被ELISA板，0.05M pH9.6的碳酸盐包被液，100μL/孔， 37℃1h，4℃包被过夜；PBST洗液，300μL/孔，室温洗拍3次；5％的脱脂奶粉100μL/孔，37℃封闭2h后洗拍3次；孵一抗：将待测血清用封闭液1/200稀释，设立阴阳性对照，每个样品至少两个重复，100μL/孔，37℃ 1h后洗拍4次；将兔抗羊二抗用封闭液1/5000稀释，100μL/孔，37℃1h 后洗拍4次；避光条件下，加入TMB 100μL/孔，37℃显色10min；加入 2M H

结果：疫苗组免疫后Mccp抗体水平升高，免疫7d有80％(4/5)山羊血清抗体转阳，14d后抗体全部转阳(5/5)(图1，其中077、079、081、093、 318为动物编号)，表明，疫苗诱导机体产生抗体时间早，水平抗体高。疫苗免疫可明显减轻体温升高，咳嗽、打喷嚏、精神沉郁等症状，提高感染山羊的存活率；本发明所述疫苗可以明显减轻肺脏组织剖检病变和病理损伤 (图2、图3)。

实施例4

疫苗的比较试验

将12月龄左右健康山羊(Mccp抗体、抗原阴性)，分为M1601疫苗组、M1801疫苗组、对照组，每种疫苗各免疫5只羊，对照组4只羊，免疫组每只羊颈部皮下注射疫苗2ml，对照组以相同方式和剂量注射PBS，免疫后第21d，免疫组和对照组使用山羊支原体山羊肺炎亚种组织毒攻毒，10

结果，疫苗组均能显著改善山羊的发病和死亡，减轻山羊发热、临床症状和剖检病变，M1801疫苗组较M1601疫苗组相比，改善发热、临床症状和减轻肺脏、胸水等组织病变，降低肺脏病原检出效果更好，因此，M1801 疫苗组免疫保护效果优于山羊支原体山羊肺炎亚种M1601疫苗。

实施例5

菌株的毒力比较

将10月龄左右健康山羊(Mccp抗体、抗原阴性)，分为M1801、C87001 攻毒组和空白对照组，C87001株由中国兽医药品监察所制备并提供(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号：CVCC87001，该菌原分类名为丝状支原体山羊肺炎亚种；见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社， 2002年，p89)，中国农业科学院兰州兽医研究所保存。攻毒组山羊进行山羊支原体山羊亚种攻毒，攻毒剂量为10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp 1801在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atcattttta atcccttcaa g 21

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

tactatgagt aattataata tatgcaa 27