技术领域
本发明总体上涉及个性化医学领域，并且具体地，涉及用于预测涉及用于预测胎儿患特雷彻·柯林斯综合征风险的组合物和方法。
背景技术
特雷彻·柯林斯综合征(Treacher Collins Syndrome，TCS)是一种颅面发育的先天性疾病，也称之为颅面发育障碍，最早在1990年被Treacher Collins描述。在1949年，Franceschetti和Klein称其为下颌骨面肌萎缩症。其是由第一咽弓的上颌骨衍生出来的神经嵴细胞(NCC)发育而来。典型的TCS临床特征包括面骨发育不全，尤其是上颌骨、下颌骨和颧骨复合体发育不全，在严重的病例中可能没有颧弓。颅面部骨骼发育不全常导致牙齿咬合错误，前牙开合，牙齿的间距可能很宽，位置可能不正确，数量也可能减少。在极少数情况下，上颚是高的，呈拱形，通常是半裂的形态。通常外耳的大小、形状和位置也会存在异常，具体表型如外耳道闭锁和中耳听骨异常。眼部的异常包括向下倾斜的眼睑与下眼睑的缺损。TCS的其他临床特征还包括大脑发育缺陷，如小头畸形、智力迟钝和精神运动迟缓等，严重影响了患者的发育和身心健康。
TCS主要发生在胚胎发育的第5～8周，在活产胎儿中平均发病率为1/50,000，波动频次在1/40,000～1/70,000之间。TCS在新生儿中的发病率是在万分之0.2-0.4，但性别差异不大，遗传基因具有变化不同的外显率和表达率。40％的TCS患者有家族史，60％的患者表现为新生突变。TCS的发病率虽低，但的确是人类最常见的下颌-面发育不良的疾病。及早预测和评估，识别出真正TCS高风险的胎儿是减少该病发生的关键。目前国内用于TCS发病风险评估的位点仍未见报道，亟待开发一种可用于检测特雷彻·柯林斯综合征的检测方法。
特雷彻·柯林斯综合征病人需要治疗的是多方面的，目前只能通过患儿出生后的整形外科手术来重建组织。牙齿、腭裂和下颌骨需要通过颌面外科会诊治疗，眼部疾病是需要去眼科治疗，小耳则是去耳科。治疗周期长，难度较大，且需要巨额花费才能部分修复。
及早预测和评估，识别出真正特雷彻·柯林斯综合征(TCS)高风险胎儿是减少该病发生的关键。针对特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的研究已发现了若干致病基因如TCOF1，POLR1C和POLR1D，但这些基因都是针对国外样本发现的。我国学者针对这三个基因在国内的特雷彻·柯林斯综合征(TCS)样本中也发现了多个变异，但针对该病的产前识别和风险评估仍未有有效的诊断手段和方法。因此开发中国人群的特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的致病突变检测手段和方法，并基于突变进行发病风险预测亟待解决。
随着现代分子生物学技术的发展，游离核苷酸被广泛研究并被应用的重要分子标记物。游离核酸又称为胞外核酸，是广泛存在于血浆、唾液、肺泡灌洗液、尿液、精液、胸腹水等体液以及细胞培养液中的细胞外游离DNA(cell free DNA，cfDNA)和RNA(cell freeRNA，cfRNA)。研究发现，孕妇的血浆中含有胎儿来源cfDNA和cfRNA，使无创产前检测技术得到了快速的发展，避免了创伤性产前检测引起的流产、致畸风险。
多项研究已证实可以使用导致疾病发生的生物标志物进行疾病风险预测，特别是遗传病风险的预测，但到目前为止特雷彻·柯林斯综合征(TCS)发病风险的精准预测在中国人群的胎儿风险预测方面仍未开展。原因之一就是我国特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的真正风险致病基因和致病突变仍需进一步挖掘，同时应用这些风险突变，开发相应的检测手段和方法仍未见应用。本专利针对中国特雷彻·柯林斯综合征(TCS)家系进行了二代测序研究，发掘了特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的新风险致病基因TCOF1、DDX21，并针对在该基因上的致病突变开发了在孕早期检测特雷彻·柯林斯综合征(TCS)发病风险的方法，对该病的评估和预防具有重要的意义。
本发明通过提供用于确定孕早期胎儿是否处于患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的组合物和方法解决了该需求，还提供了相关优势。
发明内容
发明概述
本发明提供了用于预测孕早期特雷彻·柯林斯综合征(TCS)发病风险的组合物和方法。
在一个方面，本发明提供了一组分离的生物标志物，其包含表1所列的N种生物标志物。在一些实施方式中，N是指选自由1组成的组中的数字。在实施方式中，所述生物标志物组包含选自表1所述的生物标志物组成的组中至少1种分离的生物标志物。
在一些实施方式中，本发明提供了包含至少1种分离的生物标志物的生物标志物组。所述生物标志物组选自TCOF1:c.1562_1574del:p.A521fs,
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本发明提供了检测上述生物标志物的方法，其包括测定得自所述孕早期胎儿母亲的生物样品中选自表1中所列的生物标志物的Ν种生物标志物中的每一种的可测量特征，并分析所述可测量特征以确定所述所怀胎儿发生特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的风险。所述方法包括芯片、试剂盒和测序产品。其中，所述芯片包括Sequenom MassARRAY技术芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒，所述测序包括二代、质谱等通过获取核酸/蛋白序列的方式获取生物标志物可测量特征的方法，可测量特征包括生物标志物的基因型、核酸序列、蛋白序列，但不限于此，还包括可识别样本间生物标志物差异的可测量特征。
在一些实施方式中，本发明使用Sequenom MassARRAY技术芯片系统来检测生物标志物的可测量特征，所述Sequenom MassARRAY技术芯片系统包括检测SNP位点引物、芯片基质以及质谱仪，所述SNP位点信息包括用于检测所有20种分离的生物标志物组的可测量特征的引物，所述分离的SNP位点引物选自表1所列的生物标志物的20种生物标志物中的每一种的可测量特征。
在一些实施方式中，本发明使用测序方法来检测一组生物标志物的可测量特征，所述测序方法包含用于检测至少1种分离的生物标志物组的可测量特征的富集探针或随机探针，所述分离的生物标志物选自表1所列的生物标志物的N种生物标志物中的每一种的可测量特征。
本发明专利还提供了获得生物标志物可测量特征后，确定胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的方法，其包括测定表1中所列生物标志物的20种生物标志物的可测量特征后，采用基于通过判断生物标志物的异同来确定生物样本是否具有患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的风险。
在一些实施方案中，本发明提供了预测胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的高低，所述方法包括：(a)将孕妇分为训练组和验证组；(b)从训练组受试者采集的标本中测定表1所列的生物标志物组的20种生物标志物中的可测量特征；(c)建预测模型，使用验证组对风险预测模型进行验证，检验所建模型的预测准确度；(d)将待测样本的生物标志物的可测量特征代入模型，计算该样本的患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的风险高低。在其他实施方案中，任何待检样本的生物标志物不同于表1所提供选自选自人类基因组区域的生物标志物，即可判断为高风险。
根据详细说明和权利要求，本发明的其他特征和优势将是显而易见的。
发明详述
本发明公开部分地基于以下发现：相对于对照，从胎儿母亲的生物样品中分离的来自胎儿的核酸/蛋白物质中某些变异位点/序列在具有高特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的胎儿中携带不同于表1所列的生物标志物的基因型或序列。本发明公开还部分基于以下发现:可以在确定胎儿高特雷彻·柯林斯综合征(TCS)发生风险的方法中高灵敏度和高特异性地使用混合这些变异位点的一个或多个的组。本文所公开的这些变异位点单独或以一组生物标志物用作对测试样品分类、预测患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险。
本发明公开提供了用于确定胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的生物标志物组、方法和试剂盒。本发明公开的一个主要优势在于可以在妊娠早期评价胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的风险，从而可以及时的方式起始适当的监控和临床管理以应对胎儿发育异常。本发明对于缺少任何出生缺陷风险因素和将不会被鉴别和治疗的胎儿是特别有用的。
举例来说，本发明公开包括通过获得与样品有关的数据集来产生在确定胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险中有用的结果的方法，其中所述数据集至少包括有关已鉴别为患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)指示的生物标志物和生物标志物组的分析数据，和将所述数据集输入至使用所述数据集产生在确定胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险中有用的结果的分析方法。如以下进一步描述的，该分析数据可以包括单碱基变异、染色体结构变异，核苷酸序列变异、氨基酸序列变异以及氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、代谢产物、抗体、用作生物大分子的替代物的感兴趣区及其组合。
除了通过(例如)公众数据库中的变异位点编号、序列或参考在本发明公开中鉴别的具体的生物标志物外，本发明还考虑了与所举例说明的和上述具体生物标志物碱基或氨基酸特征不同的已知或随后将发现的并且对本发明所述的方法有用的生物标志物变体的使用。这些变体可以代表多态性、突变、结构变异等。在这点上，本说明书在本发明的背景下公开了多种本领域已知的变异位点并且提供了与一个或多个公共数据库有关的示例性变异位点编号。在本发明的背景中，适合的样品包括(例如)血液、血浆、血清、羊膜水。在一些实施方式中，所述生物样品选自全血、血浆和血清。在具体的实施方式中，所述生物样品是血浆。如本文所述，可以通过本领域中已知的多种测定和技术检测生物标志物。如本文进一步所述的，这些测定无限制地包括基于芯片、探针、测序的测定。
本文提供了包含N种生物标志物的分离的生物标志物组，所述生物标志物选自表1中所列的组。在所公开的生物标志物组中，N可以是选自1至20的数。在所公开的方法中，所检测的并且确定其水平的生物标志物的数目可以是1或大于1，如2、3、4等等。在某些实施方式中，所检测的并且确定其水平的生物标志物的数目可以是1或大于1，如2、3、4等等。本发明公开所述的方法对确定胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险是有用的。
在一些实施方式中，分离的生物标志物组包含一种、两种、三种或多种分离的生物标志物，所述分离的生物标志物包含人类基因组区：TCOF1:c.1562_1574，TCOF1:c.4328，DDX21:c.533，DDX21:c.2324，TCOF1:c.3047，TCOF1:c.489，TCOF1:c.648，TCOF1:c.1427，TCOF1:c.1072_1073，TCOF1:c.1872_1875，TCOF1:c.4420，TCOF1:c.4369_4373，TCOF1:c.1658，TCOF1:c.2392_2409，TCOF1:c.4339_4340，TCOF1:c.4169，TCOF1:c.1269，TCOF1:c.1578，TCOF1:c.1993，TCOF1:c.2842.
应注意除非内容中明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用的“一个”和“所述”包括多个对象。因此，例如，对"生物标志物"的提及包括两种或更多种生物标志物等的混合物。
如本文所使用的，术语“孕早期”是指怀孕开始至怀孕第22周。本研究实施方案中所采用的孕早期为怀孕8-12周。本发明专利的使用范围包括(但不限于)孕早期，怀孕其他时期亦可采用本发明提供的生物标志物和方法来检测胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的风险。
如本文所使用的，术语“包含”、“包括”、“含有”及其任何变化旨在涵盖非排他的包括，如包含、包括或含有元素或元素列表的过程、方法、过程产物或物质组合物不仅包括这些成分，但是可以包括这些过程、方法、过程产物或物质组合物中未明确列出或固有的其他成分。
如本文所使用的，术语“组”是指包含一个或多个生物标志物的组合物，如阵列或集合。该术语还可以表示本文所述的一种或多种生物标志物的表达类型的谱图或指数。用于生物标志物组的生物标志物的数目基于生物标志物值的特定组合的灵敏度和特异性值。
如本文所使用的并且除非另作说明，术语“分离”通常描述以从其天然环境(例如，如果它是天然存在的，自然环境)中除去并因此通过人手从其自然状态改变的物质组合物。分离的蛋白质或核酸不同于其自然存在的方式。
术语“生物标志物”是指生物分子或生物分子基因型，其变化与样本特征有关。在整个发明公开中，术语“标志物”和“生物标志物”是可互换使用的。例如，本发明的生物标志物与特雷彻·柯林斯综合征(TCS)发生可能性提高有关。这些生物标志物包括(但不限于)变异位点、拷贝数变异、结构性变异、蛋白质变异。
本发明还提供了确定孕早期胎儿母亲所怀胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的方法，所述方法包括测定得自所述孕早期胎儿母亲的生物样品中选自表1中所列的生物标志物的Ν种生物标志物中的每一种的可测量特征，并分析所述可测量特征以确定所述胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的风险。
本发明还提供了检测上述生物标志物的方法，其包括测定得自所述孕早期胎儿母亲的生物样品中选自表1中所列的生物标志物的Ν种生物标志物中的每一种的可测量特征，并分析所述可测量特征以确定所述所怀胎儿发生特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的风险。所述方法包括芯片、试剂盒、捕获测序、全基因组测序产品。其中，所述芯片包括SequenomMassARRAY技术芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、捕获试剂盒，所述测序包括二代、质谱等通过获取核酸/蛋白序列的方式获取生物标志物可测量特征的方法，可测量特征包括生物标志物的基因型、核酸序列、蛋白序列，但不限于此，还包括可识别样本间生物标志物差异的可测量特征。
在一些实施方式中，本发明使用Sequenom MassARRAY技术芯片来检测生物标志物的可测量特征，所述Sequenom MassARRAY技术芯片系统包括检测SNP位点引物、芯片基质以及质谱仪，所述SNP位点信息包括用于检测所有20种分离的生物标志物组的可测量特征的引物，所述分离的SNP位点引物选自表1所列的生物标志物的20种生物标志物中的每一种的可测量特征。
Sequenom MassARRAY芯片系统用于本发明的生物标志物的捕获和检测。在本领域中可使用Sequenom MassARRAY芯片系统检测SNP位点。一般地，Sequenom MassARRAY系统包含PCR技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术和质谱技术进行分型检测。所述延伸产物即是PCR扩增产物，通过扩增不同的生物标志物来体现差异进行检测。
生物样品中mRNA的测量可以用作生物样品中相应基因生物标志物的基因型检测的替代。因此，还可以通过检测适当的RNA来检测本文所述的任何生物标志物或生物标志物组。
在一些实施方式中，本发明使用基因检测试剂盒来检测一组生物标志物的可测量特征，所述基因检测试剂盒包含用于检测至少1种分离的生物标志物组的可测量特征的引物或芯片，所述分离的生物标志物选自表1的生物标志物的N种生物标志物中的每一种的可测量特征。
在一些实施方式中，本发明使用试剂盒结合测序方法来检测一组生物标志物的可测量特征，所述测序方法包含用于检测至少1种分离的生物标志物组的可测量特征的富集探针或随机探针，所述分离的生物标志物选自表1所列的生物标志物的N种生物标志物中的每一种的可测量特征。
所述试剂盒可以包括用于检测生物标志物的一种或多种试剂，用于容纳分离自孕早期胎儿母亲的生物样品的容器；和将试剂与生物样品或生物样品的一部分反应以检测生物样品中分离的生物标志物的存在或量的打印的说明书。所述试剂可以包装在单独的容器中。所述试剂盒还可以包含一个或多个对照参考样品和用于实施基因型测定的试剂。
所述测序产品试剂盒可以包含用于包含在所述试剂盒内的组合物的一个或多个容器。组合物可以处于液体形式或者可以是冷冻干燥的。适合用于所述组合物的容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器和试管。所述容器可以由多种材料形成，包括玻璃或塑料。所述试剂盒还可以包含包装说明书，其含有确定特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的方法的书面说明。
“可测量特征”是可以确定并且与受试者中胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险相关的任何性质、特性或方面。对于生物标志物，这些可测量特征可以包括(例如)生物样品中生物标志物或其基因型中等位基因的存在状态，如核苷酸组合形式，如核苷酸修饰的存在或量，如拷贝数的多少，如结构变异的形式，蛋白质的氨基酸存在形式，如氨基酸序列，结构变异形式。
在本发明的背景中，术语“样品”、“生物样品”包括采集自孕早期胎儿母亲并且含有表1中所列的一种或多种生物标志物的任何样品。在本发明的背景中，适合的样品包括(例如)血液、血浆、血清、羊膜水。在一些实施方式中，所述生物样品选自全血、血浆和血清。在具体的实施方式中，所述生物样品是血浆。如本领域技术人员将理解的，生物样品可以包括血液的任何部分或组分，无限制地，T细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、红细胞、血小板和微囊，如外来体和外来体样微囊。在具体的实施方式中，所述生物样品是血浆。
在本发明中，术语“探针”指能与另一个分子的特定序列或亚序列或其他部分相结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能喝与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可以直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
在本发明中，“试剂盒”中还含有用于标记核酸、蛋白质样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
在本发明的背景中，术语“捕获试剂”是指可以特异性结合至靶标，具体地生物标志物的化合物。该术语包括核酸、抗体、抗体片段、核酸基蛋白结合试剂、核酸捕获试剂、小分子或其变体。可以配置捕获试剂以特异性结合至靶标，具体地生物标志物。捕获试剂可以包括(但不限于)有机分子，如多肽、多核苷酸以及技术人员可鉴别的其他非聚合物分子。在本文所公开的实施方式中，捕获试剂包括可以用于检测、纯化、分离或富集靶标，具体地生物标志物的任何试剂。任何本领域已知的亲合捕获技术可以用于选择性分离和富集/浓缩作为在所公开的方法中使用的生物培养基的复杂混合物的成分的生物标志物。
术语“基因型”或“等位基因”是指染色体DNA上的碱基位置上碱基组成，包括“A”、“T”、“C”、“G”四种碱基中的任意两种的组成形式。当生物标志物为插入或缺失时，也可表现为上述四种碱基的特定序列组成形式。
本文所公开的一些实施方式涉及确定孕早期胎儿母亲中胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的评估和预后方法。一种或多种生物标志物的基因型检测和/或生物标志物比值的确定可以用于确定胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险。可以将这些检测方法(例如)用于状况的早期评估以确定受试者是否对特雷彻·柯林斯综合征(TCS)易感，以监控特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的发展或者治疗规程的进展，以评价特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的严重性，以帮助确定适合的治疗和预防措施。
可以无限制地通过如上所述的方法以及本领域中已知的任何其他方法确定生物样品中生物标志物的基因型和序列。然后，将因此所获得的基因型/序列数据进行分析分类法。在该方法中，根据算法调控原始数据，其中已通过训练数据组对算法进行预定义，例如，如本文所提供的实例中所述的。算法可以使用本文所提供的训练数据组，或者可以使用本文所提供的指导以通过不同的数据组产生算法。
在一些实施方式中，分析可测量特征来确定胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险包括预测模型的使用。在其他实施方式中，分析可测量特征来确定胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险包括将所述可测量特征与参考特征相比较。如本领域技术人员可以理解的，这种比较可以是与参考特征的直接比较或者是其中已将参考特征引入预测模型的间接比较。
为了产生特雷彻·柯林斯综合征(TCS)预测模型，在训练组中使用稳健数据集，其包括已知对照样品和对应于所关心的特雷彻·柯林斯综合征(TCS)分类的样品。可以使用公认标准选择样本容量。如以上所讨论的，可以使用不同的统计方法来获得高精度预测模型。
在一些实施方案中，在一些实施方案中，本发明提供了预测胎儿患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险的高低，所述方法包括：(a)将孕妇分为训练组和验证组；(b)从训练组受试者采集的标本中测定表1所列的生物标志物组的N种生物标志物中的可测量特征；(c)建预测模型，使用验证组对风险预测模型进行验证，检验所建模型的预测准确度；(d)将待测样本的生物标志物的可测量特征代入模型，计算该样本的患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的风险高低。
根据上述说明，显而易见的是可以对本文所述的本发明做出改变和变化以使其适合于多种用途和条件。这些实施方式也在以下权利要求的范围内。
在本文中，对变量的任何定义中的元素列表的列举包括该变量作为任何单个元素或所列元素组合(或子组合)的定义。在本文中，对实施方式的列举包括作为任何单个实施方式或者与任何其他实施方式或其部分组合的实施方式。
表1特雷彻·柯林斯综合征致病变异位点列表
附图说明
图1Sequenom MassARRAY芯片的检测步骤框图；
图2Sequenom MassARRAY芯片检测的原理及实验流程示意图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
验证生物标志物判断特雷彻·柯林斯综合征(TCS)可靠性
样本：从从中国医学科学院整形外科医院获取了14个特雷彻·柯林斯综合征(TCS)家系。家系1包含7名成员，有2名成员患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)，家系2-14均为3名成员的家系，其中家系的结构均为父母和一名患病孩子。我们获取所有家系成员的外周血开始检测。
实验检测：使用天根生物的全血DNA提取试剂盒获取DNA，使用安捷伦公司提供的全外显子捕获试剂盒(v6)捕获所有样本的全外显子组，使用Illumina公司的Hi-seq X10完成二代测序，所使用的生物标志物为表1中的20种。
数据分析：使用fastqc、cutadapt软件对数据进行质控，使用BWA软件将测序数据和人类参考基因组进行比对，使用GATK软件获取外显子组上的突变位点。提取本发明提供的20个生物标志物的基因型如表2：
表2.针对14个家系成员验证特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险
结果：从结果可见所有患特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的家庭成员均至少存在一个生物标志物和本发明提供的生物标志物基因型不同，均被认定为高风险。而所有不患病的家系成员的基因型均和本发明提供的生物标志物相比没有差异，被认定为低风险。可见，本发明专利能极好的使用生物标志物重现特雷彻·柯林斯综合征(TCS)患病状态。
实施例2
一种用于无创产前评估特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的Sequenom MassARRAY SNP分型芯片系统，所述系统包括PCR Enzyme custom,PCR Accessory Set,SpectroCHIPResin Kit等。该系统没有用于检测特雷彻·柯林斯综合征(TCS)相关基因的PCR SNP引物。所述引物组包括表1中的20个位点，各个SNP，有两条引物。各个引物的序列如表3所示：
表3：SNP位点引物序列
在本实施例中，检测评估特雷彻·柯林斯综合征(TCS)时，只需要准备样本、引物进行PCR扩增以后，通过质谱检测，最后根据质谱结果进行相应的评估。
实施例3
用于检测特雷彻·柯林斯综合征(TCS)的Sequenom MassARRAY芯片的检测步骤，依次如下：(1)根据表1给出的SNP位点设计引物(表2)；(2)设计多孔PCR反应；(3)SAP消化；(4)产物延伸；(5)样品树脂脱盐；(6)样品放置在样品靶上，自然结晶；(7)质谱分析。流程如图1，图2。
在本实施例中，制备方法可按常规方法制备也可以，重点是SNP位点即生物标志物选择，而非其制备方法。
实施例4
使用Sequenom MassARRAY芯片系统检测方法检测出特雷彻·柯林斯综合征(TCS)
样本：从中国医学科学院整形外科医院特雷彻·柯林斯综合征(TCS)患者群中选取了65个怀孕孕妇，孕龄为8-14周。
实验检测：父母外周血采集使用天漠游离DNA(cfDNA)保存管(货号TS002)，cfDNA提取使用Zymo公司的快速cfDNA提取试剂盒(货号R1072)，血液保存和cfDNA提取的方法遵照试剂盒说明书。Sequenom MassARRAY SNP检测在康普森生物公司进行，使用Sequenom公司提供的SpectroCHIP Resin Kit等，参考图1，图2。
数据分析：针对Sequenom MassARRAY芯片检测结果，使用质谱检测，结合医学彩超检检测，基因型的1-20是表1的编号1-20的位点(N:normal.M:mutated)。结果见表4。
表4Sequenom MassARRAY芯片检测获得样本的基因型结果
结果：在65个检测的生物样本中，发现17个样本携带的生物标志物与本发明提供的生物标志物相同，判定为高风险。对这17个样本后期的三维彩超检查中均发现胎儿颌面发育不全的存在。但同时实施例还发现有3个生物样本携带的生物标志物与本发明提供的生物标志物相同，但后期的三维彩超中发现颌面发育不全，提示：本发明专利提供的位点存在假阴性，未发现假阳性。假阴性的引入是由于特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险致病因素复杂，致病基因较多，仍需要更多的研究来挖掘新的特雷彻·柯林斯综合征(TCS)风险生物标志物。
实施例5
对象：采集怀孕8-12周的孕妇的外周血，且所采集的孕妇均为带有特雷彻·柯林斯综合征(TCS)表型或其家族近亲含有特雷彻·柯林斯综合征(TCS)；
采集地点：在全国范围将近11个医院进行采；时间：2019.5-2020.6.；
数量：40个；
方法：按照实施例4所述的方法进行检测。
结果：25例样本判断为特雷彻·柯林斯综合征(TCS)高风险，其中20例胎儿经三维彩超验证为特雷彻·柯林斯综合征(TCS)阳性。15例样本判断为特雷彻·柯林斯综合征(TCS)低风险，其中1例胎儿经三维彩超验证为特雷彻·柯林斯综合征(TCS)阳性。
本实例通过采集怀孕初期孕妇的外周血，采用本发明的试剂盒进行了检测，并统计其阳性率；后期跟踪检测，结果发现，所得的实际结果均在本申请的预测结果范围内。由此可进一步获知，本申请的试剂盒准确率高，预测精确，基本可精确到80％左右，使得孕妇能够及早知道胎儿情况，有助于及早进行治疗或干预，对于优生优育具有极其重要的价值。
更重要的是，在孕妇怀孕8-12周，99％左右的孕妇便能够进行该项目的检测，最晚12周便能检测到，从而进行较为精确的预估；当然12周以后更能检测到，但越早检测到意义越大。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
机译： 治疗雷特综合征的方法和组合物
机译： 治疗雷特综合征的方法和组合物
机译： 生产用于治疗包含哌嗪衍生物的图雷特氏综合征的药物组合物的方法
