一种磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒

摘要

本发明属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒及其使用方法。包括抗FITC抗体包被的磁性微粒、FITC标记的NT‑proBNP捕获单抗、碱性磷酸酶标记的NT‑proBNP检测单抗和NT‑proBNP校准品。本发明试剂盒采用异硫氰酸荧光素(FITC)‑抗FITC抗体系统，与罗氏NT‑ProBNP试剂相关性良好，在提高分析灵敏度的同时，有效避免了人血清中的生物素干扰，并大大降低了生产成本。

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒及测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的方法。

背景技术

心力衰竭(心衰)是各种心脏疾病的严重和终末阶段。据统计，我国目前心衰患病率估计已达1.3％左右，现症患者约1000万，中国已成为世界上拥有最大心衰病患群体的国家。

当心肌细胞受牵拉或血管透壁压超负荷时，会产生含134个氨基酸的B型利钠肽原前体(pre-proBNP)，随后在相关酶的作用下切掉N端的信号肽序列，形成含108个氨基酸的BNP前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸无生物活性的氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)和含有32个氨基酸有活性的B型利钠肽(BNP)。

NT-proBNP和BNP是国内外心力衰竭指南均推荐的心力衰竭首选血清标志物。相对于BNP，NT-proBNP在人体的生物半衰期较长(NT-proBNP约1～2h，BNP约为20min)，血中浓度也相对较高(NT-proBNP约为BNP的15～20倍)。因此NT-proBNP检测早期或轻度心衰的敏感性更高，血样送至实验室的时间更充分，更适用于临床应用。

目前通常采用双抗体夹心法定量检测NT-proBNP的含量，方法主要有荧光免疫层析法、酶联免疫吸附法和化学发光法。荧光免疫层析法加样量较多、批内精密度和批间重复性差；酶联免疫吸附法存在灵敏度较低、线性范围较窄等问题；化学发光法灵敏度高、线性范围广、检测结果准确、自动化程度高，在临床应用中有更广泛的前景。

如中国专利申请文件(公开号：CN107656071A)公开了一种磁微粒化学发光法的NT-ProBNP检测试剂盒，包括校准品、清洗液、底物溶液、预处理液、酶结合物工作液和磁珠结合物工作液。但是该方法中采用NT-proBNP抗体与磁微粒直接包被，最低检测限为20pg/ml，线性范围为20～50000pg/ml，其灵敏度相对进口试剂较低。

而罗氏公司生产的NT-ProBNP试剂使用生物素-链霉亲和素系统，链霉亲和素包被磁性颗粒，两株抗体分别标记生物素和三联吡啶钌，其最低检测限为5pg/mL，检测范围为5～35000pg/mL。生物素-亲和素系统是一种非常有效的生物反应放大系统，具有高亲和力和多级放大效应，目前通常用来提高试剂反应灵敏度。但若待测样本中存在游离生物素，其与链霉亲合素结合后，阻止部分夹心复合物中生物素化抗体与链霉亲合素结合，造成捕获信号减弱，导致结果假性降低。因而，生物素会干扰某些检测，得出不准确的检测结果，且不容易被发现。且罗氏公司生产的NT-ProBNP试剂为进口试剂，价格昂贵，检测成本高。

又如中国专利申请文件(公开号：CN 112067826 A)中公开了一种基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒，包括：碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体和磁珠包被的NT-proBNP包被抗体。该方案中对酶与抗体，以及磁珠与抗体的连接进行了优化：使用高碘酸钠将抗体Fc端上的糖链氧化生成醛基；用过量的半胱氨酸盐酸盐与氰基硼氢化钠处理，使醛基与半胱氨酸盐酸盐发生醛胺缩合反应，生成有活性的巯基；将碱性磷酸酶用琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯(SMCC)处理，暴露出有活性的马来酰胺基团；然后与Fc端活性巯基的抗体混合，生成稳定的硫醚键。该方案标记过程略显繁琐，且使用的是非商品化的碱性磷酸酶CmAP，酶来源不够稳定成熟。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种灵敏度高，生产成本低的磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒，所述试剂盒包括：抗FITC抗体包被的磁性微粒、FITC标记的NT-proBNP捕获单抗、碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗和NT-proBNP校准品。本发明采用异硫氰酸荧光素(FITC)-抗FITC抗体系统，在提高分析灵敏度的同时，有效避免了人血清中的生物素干扰。在磁性微粒上预先包被抗FITC抗体，通过FITC-抗FITC抗体反应而使FITC标记的NT-ProBNP抗体间接偶联到磁性微粒上。一个抗FITC抗体分子可以结合3～4个FITC，特异性和亲和力都很强，两者一经结合就极为稳定；不仅可增加磁性微粒上的NT-ProBNP抗体数量，而且还可以通过改善空间位阻使抗体的结合位点充分暴露。本发明的方法偶联效率高，结合牢固，且工艺稳定，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本。

在上述磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒中，所述抗FITC抗体包被的磁性微粒的浓度为0.2～1.0mg/mL；所述FITC标记的NT-proBNP捕获单抗的浓度为0.5～5.0μg/mL；所述碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗的浓度为0.2～2μg/mL。若浓度过低会导致灵敏度低；而浓度高时则容易造成高成本，或高本底产生假阳结果，或比较差的信噪比产生漏检。在上述磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒中，所述抗FITC抗体包被的磁性微粒的制备方法包括：

将磁性颗粒用PBS缓冲液稀释；

将稀释后的磁性颗粒与抗FITC抗体混合；

加入硫酸铵反应；

加入封闭液封闭处理。

作为优选，磁性颗粒与抗FITC抗体的质量比为1:5～1:50。

作为优选，磁性颗粒的粒径为1.0-3.0μm。

作为优选，硫酸铵的量为磁性颗粒与抗FITC抗体总质量的0.5-2倍。

进一步优选，所述抗FITC抗体包被的磁性微粒的制备方法具体如下：

1)将磁性颗粒用PBS缓冲液稀释到5～20mg/mL；

2)按磁性颗粒与抗FITC抗体混合，磁性颗粒与抗FITC抗体的质量比为1:5～1:50；

3)然后加入硫酸铵，混悬反应4～24小时；

3)磁分离清洗后，采用含有BSA的封闭液，混悬反应6～24小时；

4)用含有BSA的封闭液稀释，获得抗FITC抗体包被的磁性微粒，2～8℃保存待用。

在上述磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒中，所述FITC标记的NT-proBNP捕获单抗的制备方法包括：将FITC溶于Na

作为优选，FITC与NT-proBNP的质量比为(3-5)：1。

进一步优选，所述FITC标记的NT-proBNP捕获单抗的制备方法如下：

1)取2mg FITC溶于1mL 50mmol/L pH值为9.3的Na

2)缓缓滴加0.5mg NT-proBNP捕获单抗，在5～8分钟间加完；

3)2～8℃条件下搅拌反应12～16小时；

4)将反应液装透析袋，置10mmol/L pH值为7.4的磷酸缓冲液中透析过夜，期间更换透析液3次，获得FITC标记的NT-proBNP捕获单抗，-20℃保存待用。

在上述磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒中，所述碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗的制备方法包括：

活化抗体：使用还原剂打开NT-proBNP检测单抗重链间的二硫键，生成巯基；

活化碱性磷酸酶：使用SMCC处理碱性磷酸酶，暴露出马来酰胺基团；

加成反应：将活化后的抗体和活化后的碱性磷酸酶混合反应，纯化即得到碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗。

作为优选，所述的还原剂为二硫代苏糖醇(DTT)或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)中的一种或两种。

作为优选，活化后的抗体和活化后的碱性磷酸酶的质量比为(0.8-1.5)：1。

作为优选，活化后的抗体和活化后的碱性磷酸酶混合后还包括加入氯化镁溶液。

进一步优选，所述碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗的制备方法如下：

1)将1mgNT-proBNP检测单抗用透析或PD-10脱盐柱更换为无氨基及巯基缓冲液，用浓缩管浓缩到2～4mg/mL；

2)按抗体体积每毫升加入0.5‰～2.5‰微升还原剂，室温反应10～30分钟；

3)加入1M甘氨酸pH7.3，体积同还原剂的加入量，室温反应5～10min，使用PD-10脱盐柱更换缓冲液，浓缩到2～4mg/mL备用；

4)将1mg碱性磷酸酶用透析或PD-10脱盐柱更换为无氨基及巯基缓冲液，用浓缩管浓缩到2～4mg/mL；

5)称取SMCC，用DMF溶解到5～8mg/mL，按碱性磷酸酶体积2.5‰～7.5‰加入，室温反应10～30分钟；

6)加入1M甘氨酸pH7.3，体积同SMCC溶液加入量。室温反应10～20min，使用PD-10脱盐柱更换缓冲液，浓缩到2～4mg/ml备用；

7)将活化后的抗体和碱性磷酸酶按照质量比1:1进行混合，加入0.1～0.5M氯化镁溶液，加入体积为反应总体积的1‰～5‰毫升。2～8℃反应8～20小时；

8)将连接物进行纯化，2-8℃保存备用。

本发明中所述的碱性磷酸酶为购买得到的商品化的碱性磷酸酶BIAP。

在上述磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒中，NT-proBNP校准品中稀释液为含有5-10％海藻糖，5-10％甘油，5-15％环糊精，3-8％山梨醇的PBS缓冲液，其pH为6.5～7.4；NT-proBNP校准品中的抗原为NT-proBNP短肽，线性结构为：NT-proBNP捕获抗体表位肽段-连接肽-NT-proBNP检测抗体表位肽段。

本发明还提供一种用上述试剂盒采用磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的方法。

具体测定方法包括以下步骤：

将抗FITC抗体包被的磁性微粒和FITC标记的NT-proBNP捕获单抗混合，形成磁珠-抗FITC抗体-FITC-NT-proBNP捕获单抗复合物；

将所述的磁珠-抗FITC抗体-FITC-NT-proBNP捕获单抗复合物和待测样本、碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗在37℃孵育10min，形成磁性复合物悬浮液；

将所述的磁性复合物悬浮液置于磁场内，磁分离2min，洗涤所述磁性复合物；

向洗涤后的磁性复合物中加入化学发光底物液，检测化学发光光子强度。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明提供的技术方案采用了异硫氰酸荧光素(FITC)-抗FITC抗体系统，在提高分析灵敏度的同时，有效避免了人血清中的生物素干扰。一个抗FITC抗体分子可以结合3～4个FITC，不仅可增加磁性微粒上的NT-ProBNP抗体数量，而且还可以通过改善空间位阻使抗体的结合位点充分暴露。本发明的方法偶联效率高，结合牢固，且工艺稳定，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本。磁珠偶联抗FITC抗体的过程简单，其产物还可通用于其他项目。

2.本发明采用SMCC定向偶联的方法将碱性磷酸酶标记在抗体Fc端：使用三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)还原剂打开抗体两条重链间的二硫键，生成有活性的巯基；将碱性磷酸酶用SMCC处理后定向地偶联在抗体的两条重链中间的位置。该方法操作相对简单，且对抗体的结合位点不产生空间位阻，有利于提高试剂灵敏度。

3.本发明所提供的校准品采用了多肽抗原，并在校准品稀释液中引入了海藻糖、甘油、环糊精和山梨醇等成分，有效地提高了其稳定性。天然的NT-proBNP分子量小，易降解。而原核重组表达的NT-proBNP蛋白缺乏糖基化，其稳定性较天然蛋白更差。人工设计的多肽抗原在保证其生物学活性的同时，通过剔除不稳定的氨基酸序列，选择较为稳定的表位，并用稳定的连接肽将两个表位连接，由此获得更加稳定的抗原。同时，稀释液中添加的化学成分也可以帮助维持抗原的空间结构，有助于延长校准品的保存周期。

附图说明

图1为NT-proBNP校准品的标准曲线图。

图2为本发明的试剂盒与罗氏公司的NT-ProBNP检测试剂盒检测结果的相关性的结果图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

一种磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒，包括抗FITC抗体包被的磁性微粒、FITC标记的NT-proBNP捕获单抗、碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗和NT-proBNP校准品。

FITC抗体包被的磁性微粒通过如下方法制得：

1)将粒径为3.0μm的磁性颗粒用0.01M PH7.4的PBS缓冲液稀释到10mg/mL。

2)按质量比磁性颗粒：抗FITC抗体＝1:10的比例添加抗FITC抗体。

3)加入3M硫酸铵，体积同磁性颗粒与抗体总体积。

4)37℃条件下混悬反应18小时。

5)磁分离清洗后，采用含有BSA的封闭液，于37℃条件下混悬反应18小时。

6)用上述封闭液稀释到10mg/mL，获得抗FITC抗体包被的磁性微粒，4℃保存待用。

7)使用时进行稀释，终浓度0.5mg/mL。

所述FITC标记的NT-proBNP捕获单抗由以下方法制备：

1)取2mg FITC溶于1mL 50mmol/L pH值为9.3的Na

2)缓缓滴加0.5mg NT-proBNP捕获单抗中，约在5分钟间加完。

3)4℃条件下搅拌反应16小时。

4)将反应液装透析袋，置10mmol/L pH值为7.4的磷酸缓冲液中透析过夜，期间更换透析液3次，获得FITC标记的NT-proBNP捕获单抗，-20℃保存待用。

5)使用时进行稀释，终浓度2.0μg/mL。

所述碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗由以下方法制备：

1)将1mgNT-proBNP检测单抗用透析或PD-10脱盐柱更换为无氨基及巯基缓冲液，用浓缩管浓缩到2mg/mL。

2)使用三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)，按抗体体积每毫升加入1‰微升，室温反应20分钟。

3)加入1M pH值为7.3的甘氨酸，体积同TCEP的加入量，室温反应5～10min。使用PD-10脱盐柱更换缓冲液，浓缩到2mg/mL备用。

4)将1mg碱性磷酸酶用透析或PD-10脱盐柱更换为无氨基及巯基缓冲液，用浓缩管浓缩到2mg/mL。

5)称取SMCC，用DMF溶解到5mg/mL，按碱性磷酸酶体积5‰加入，室温反应20分钟。

6)加入1M甘氨酸pH7.3，体积同SMCC溶液加入量。室温反应20min。使用PD-10脱盐柱更换缓冲液，浓缩到2mg/ml备用。

7)将活化后的抗体和碱性磷酸酶按照质量比1:1进行混合，加入0.2M氯化镁溶液，加入体积为反应总体积的2‰毫升。4℃反应16小时。

8)将连接物进行纯化，4℃保存备用。

9)使用时进行稀释，终浓度为1μg/mL。

所述NT-proBNP校准品由以下方法制备：

1)配制校准品稀释液，为含有5％海藻糖，5％甘油，5％环糊精，5％山梨醇的PBS缓冲液，其pH为7.0。

2)选择NT-proBNP短肽抗原，其线性结构为：NT-proBNP捕获抗体表位肽段-连接肽-NT-proBNP检测抗体表位肽段。

3)将NT-proBNP短肽抗原添加至校准品稀释液中，浓度分别为0pg/mL、50pg/mL、250pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、35000pg/mL。

本发明采用磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的方法为：

将抗FITC抗体包被的磁性微粒和FITC标记的NT-proBNP捕获单抗混合，形成磁珠-抗FITC抗体-FITC-NT-proBNP捕获单抗复合物；

将磁珠-抗FITC抗体-FITC-NT-proBNP捕获单抗复合物和待测样本、碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测单抗在37℃孵育10min，形成磁性复合物悬浮液；

将磁性复合物悬浮液置于磁场内，磁分离2min，洗涤磁性复合物；

向洗涤后的磁性复合物中加入化学发光底物液，检测化学发光光子强度。

采用实施例1中的试剂盒按照上述测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的方法进行检测。

具体实验内容如下：

1.标准曲线

平行检测实施例1中校准品0pg/mL、50pg/mL、250pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、35000pg/mL，计算平均发光值，用四参数方程拟合标准曲线。校准品测试发光值如表1所示，标准曲线如图1所示。

表1：校准品测试发光值

2.空白限和检出限性能测试

1).空白限

平行测定20次零值校准品的发光值(RLU)，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-发光值(RLU)结果进行两点回归拟合得出一次方程，求出零值校准品(或样本稀释液)的对应浓度，应至少有17次结果不高于空白限值(2pg/mL)。结果如表2所示。

表2：空白限测试结果

2).检出限

取5份浓度近似检出限(5pg/mL)的低值样本进行检测，每份样本检测5次，低于空白限(2pg/mL)的检测结果小于或等于3个，无高于检出限(5pg/mL)的数值。结果如表3所示。

表3：检出限测试结果

表2和表3的结果显示，20次零值校准品测试结果均小于2pg/mL，25次低值样本测试结果均处于2～5pg/mL。

可见，本发明的NT-ProBNP试剂盒空白限为2pg/mL，检出限为5pg/mL。

3.线性验证

取接近线性范围上限的高浓度样本和接近线性范围下限的低浓度样本，按照一定比例混合成至少5个稀释浓度。每个稀释浓度测试3次，计算出检测结果均值。以稀释浓度作为自变量，检测结果均值作为应变量，求出线性回归方程，计算相关系数r。结果如表4所示。

表4：线性测试结果

表4结果显示，在浓度为5～35000pg/ml的范围内，相关系数r>0.99。

可见，本发明的NT-ProBNP试剂盒检测范围为5～35000pg/ml。

4.精密度验证

取高值质控品、中值质控品和低值质控品各一份，各重复测试10次，计算平均值和标准差。根据公式：变异系数CV＝(标准差/平均值)×100％，计算精密度。结果如表5所示。

表5：精密度测试结果

表5结果显示，高值质控品CV为3.62％；中值质控品CV为3.73％；低值质控品CV为3.43％。

可见，本发明的NT-ProBNP试剂盒精密度良好。

5.校准品稳定性

将实施例1中的校准品分别储存于37℃和4℃，进行跟踪测试。

储存于37℃的校准品于第0天、第3天、第7天和第9天，测试两次发光值(RLU)。计算平均值，并与第0天结果计算相对偏差。结果如表6所示。

表6：校准品37℃稳定性测试结果

储存于4℃的校准品于第0个月、第6个月、第9个月、第12个月和第14个月，测试两次发光值(RLU)。计算平均值，并与第0个月结果计算相对偏差。结果如表7所示。

表7：校准品4℃稳定性测试结果

表6和表7的结果显示，所有相对偏差均<15％。

可见，本发明的NT-ProBNP校准品稳定性良好。

6.样本测试相关性验证

取200份血清样本，比较本发明实施例1的试剂盒与罗氏公司的NT-ProBNP检测试剂盒检测结果的相关性，样本测试相关性测试结果如图2所示。图2的结果显示，两个试剂线性回归方程Y＝0.996X+13.374，相关系数R

综上所述，本发明试剂盒采用异硫氰酸荧光素(FITC)-抗FITC抗体系统，在提高分析灵敏度，达到与罗氏生产的NT-ProBNP试剂的灵敏度，同时有效避免了人血清中的生物素干扰，并大大降低了生产成本。

本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内，并且本发明方案所有涉及的参数间如未特别说明，则相互之间不存在不可替换的唯一性组合。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。