一种基于趋能运动性能预测电化学活性菌在氧化还原活性多孔介质中迁移行为的方法

摘要

本发明提供了一种基于趋能运动性能预测电化学活性菌在氧化还原活性多孔介质中迁移行为的方法。该预测方法包括电化学活性菌在饱和多孔介质中的迁移；迁移模型反演计算扩散系数；利用毛细管法和群集运动平板法计算趋能运动指数；建立扩散系数与趋能运动指数的线性相关关系。该方法成本低廉、操作简便，能够准确预测以扩散系数为指标的电化学活性菌迁移行为，利于在与电化学活性菌迁移行为相关的地下水污染修复及饮用水净化等过程中推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及细菌细胞在多孔介质中的迁移和分布行为，具体一种基于趋能运动性能预测电化学活性菌在氧化还原活性多孔介质中迁移行为的方法。

背景技术

在土壤和过滤砂柱等多孔介质环境中，微生物细胞会随降水、地下水及进水等对流和扩散水动力过程进行迁移。细菌在土壤中的迁移行为对于农业、工业、环保、给水处理以及水资源保护等具有重要影响。例如，在投加外源电化学活性细菌进行污染生物修复的过程中，细胞迁移能力下降所导致的滞留可能影响生物强化的效果。此外，致病菌通过地下水传播可导致水源地污染和水传疾病的爆发。因此，准确预测和分析细菌在地下水等多孔介质中的迁移行为十分必要。

污染生物修复效果除了与细菌本身的降解转化能力有关之外，还依赖于污染物的生物可利用性。细菌细胞能通过趋向运动感知并主动向污染物等化学效应物移动，提高污染物的生物可利用性。Ford R M等人在2007年Advances in Water Resources第30卷1608-1617页、Wang M等人在2009年Environmental Science and Technology第43卷5921-5927页指出，氯代烃类降解菌在多孔介质中迁移时，受到萘等可溶性底物浓度梯度的化学刺激后能够产生趋化运动。氯代烃类降解菌细胞的泳动速率与地下水流速相当，细胞的趋化运动能够使其沿着与水流不同的方向进行迁移，促进了细胞在多孔介质中向各个方向的扩散。Adadevoh J S T等人在2018年Environmental Science and Technology第52卷7289-7295页、Adadevoh J S T等人在2015年Environmental Science and Technology第50卷181-187页进一步分析胶体迁移模型反演结果发现，细胞的趋化运动越强，其在介质中的扩散系数越高；细胞的扩散增加了其在介质中的停留时间，有利于于细胞附着沉积在介质表面，导致出水细胞比例降低了40％左右。

不同于一般意义上的细菌趋化运动，电化学活性菌具有独特的趋能运动活性，即通过其直接或间接胞外电子传递能力，在不依赖效应物浓度梯度的条件下感受不溶性电子受体的存在并向其聚集和定向运动。Harris H W等人在2018年Frontiers inMicrobiology第8卷2568篇、Li R等人在2012年Environmental Science and Technology第46卷2813-2820页指出，铁/锰矿物、天然有机质及多种污染物等能够作为电化学活性菌的胞外电子受体和不溶性趋能运动效应物，极大地影响细胞在地下环境中的迁移分布。申请人前期研究发现，电化学活性菌的趋能运动与不溶性趋能运动效应物的种类、浓度及电化学活性菌自身的胞外电子传递能力有关。电化学活性菌的趋能运动越强，其在含不溶性电子受体的氧化还原活性介质中的迁移能力越弱。此外，可溶介体物质能够通过介导电化学活性菌的胞外电子传递，进一步促进电化学活性菌细胞的趋能运动，从而更大程度地抑制其在氧化还原活性介质中的迁移。通过胶体迁移模型反演发现，电化学活性菌的趋能运动指数与其迁移行为的扩散系数呈线性正相关关系。

基于以上分析，提出利用电化学活性菌向不溶性胞外电子受体的趋能运动指数预测其在含相应不溶电子受体多孔介质中的迁移行为。该方法操作简便且成本低廉，能够准确评估电化学活性菌在不同环境介质和水化学条件下的迁移行为。

发明内容

本发明提供一种基于电化学活性菌趋能运动性能预测其在氧化还原活性多孔介质中迁移行为的简便方法，目的在于评估电化学活性菌在氧化还原活性多孔介质中的迁移分布情况，为环境污染修复和水质净化等领域的相关应用提供参考。

为解决上述难题，本发明采用如下技术方案：

一种基于趋能运动性能预测电化学活性菌在氧化还原活性多孔介质中迁移行为的方法，包括如下步骤：

步骤1、电化学活性菌在饱和多孔介质中的迁移：配制电化学活性菌细胞悬液作为进水，并添加电子供体后，泵入负载有不溶性电子受体的石英砂填充柱中，检测出水中细胞含量，得到细菌的穿透曲线；

步骤2、基于步骤1得到细菌的穿透曲线，通过迁移模型反演得到电化学活性菌迁移行为的扩散系数，作为反映电化学活性菌宏观迁移行为的指标；

步骤3、电化学活性菌直接和介体介导的趋能运动：配制步骤1所述电化学活性菌细胞悬液以及含不溶性电子受体的趋能运动待测液，采用毛细管法定量分析电化学活性菌向不溶性电子受体的直接趋能运动，测量毛细管中趋能运动待测液中的细胞浓度，计算直接趋能运动指数；采用群集运动平板法定量分析可溶介体物质介导的电化学活性菌向不溶性电子受体的趋能运动，测量群集运动范围直径，计算可溶介体物质介导的趋能运动指数；

步骤4、建立步骤2所述扩散系数和步骤3所述趋能运动指数之间的线性关系，据此通过测量电化学活性菌的趋能运动指数预测扩散系数；

将电化学活性菌第一设定菌株泵入含第一设定负载量不溶性电子受体的石英砂柱中进行迁移，通过迁移模型反演得到第一扩散系数，分析野生株细胞向第一设定浓度不溶性电子受体进行的趋能运动，计算得到第一趋能运动指数；

将电化学活性菌第一设定菌株泵入含第二设定负载量不溶性电子受体的石英砂柱中进行迁移，通过迁移模型反演得到第二扩散系数，分析野生株细胞向第二设定浓度不溶性电子受体进行的趋能运动，计算得到第二趋能运动指数；

将电化学活性菌第二设定菌株泵入含第二设定负载量不溶性电子受体的石英砂柱中进行迁移，通过迁移模型反演得到第三扩散系数，分析第二设定菌株细胞向第二设定浓度不溶性电子受体进行的趋能运动，计算得到第三趋能运动指数；

根据第一扩散系数、第一趋能运动指数、第二扩散系数、第二趋能运动指数、第三扩散系数和第三趋能运动指数，得到所述扩散系数和趋能运动指数之间的线性关系。

所述的电化学活性菌为Shewanella oneidensis MR-1的野生株和胞外电子传递关键基因缺失株ΔomcA/ΔmtrC。

所述的不溶性电子受体为水铁矿、二氧化锰或生物炭。

所述的石英砂平均粒径为500μm，填充后孔隙度为0.45。

所述的可溶介体物质为蒽醌-2,6-二磺酸钠。

本发明的有益效果是，通过简便快捷的毛细管实验和群集运动平板实验得到电化学活性菌的趋能运动指数，然后根据简单的线性关系即可得出其迁移行为的扩散系数，评估其在环境介质中的迁移分布情况。

附图说明

图1是空白石英砂介质的扫描电子显微镜照片。

图2是负载了二氧化锰的石英砂介质的扫描电子显微镜照片。

图3是电化学活性菌迁移行为实验装置示意图。

图4是电化学活性菌直接趋能运动实验装置示意图。

图5是可溶介体物质介导的电化学活性菌趋能运动实验装置示意图。

图6是实施例1中不溶性电子受体为二氧化锰且不存在可溶介体时，获得的迁移行为扩散系数(D

图7是实施例1中不溶性电子受体为二氧化锰且存在可溶介体时，获得的迁移行为扩散系数(D

图8是生物炭颗粒的扫描电子显微镜照片。

图9是实施例2中不溶性电子受体为生物炭且不存在可溶介体时，获得的迁移行为扩散系数(D

图10是实施例2中不溶性电子受体为生物炭且存在可溶介体时，获得的迁移行为扩散系数(D

图11是负载了水铁矿的石英砂介质的扫描电子显微镜照片。

图12是实施例3中不溶性电子受体为水铁矿且不存在可溶介体时，获得的迁移行为扩散系数(D

图13是实施例3中不溶性电子受体为水铁矿且存在可溶介体时，获得的迁移行为扩散系数(D

图中：1细胞；2蠕动泵；3阀；4石英砂柱；5聚四氟乙烯导管；6绘制穿透曲线；7自动部分收集器；8N2；9密封盖；10毛细管内含不溶性电子受体的趋能运动待测液；11细胞悬浮液；12群集运动范围；13电化学活性菌接种点；14含可溶介体和不溶性电子受体的琼脂平板。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲述的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

本实施例中，利用负载了二氧化锰的石英砂介质，建立了电化学活性细菌迁移行为扩散系数(D)和趋向运动指数(I)的线性相关关系：

(1)电化学活性菌在载锰多孔介质中的迁移：首先对高纯圆粒石英砂(SiO

(2)通过迁移模型对穿透曲线数据进行反演，得到电化学活性菌迁移行为的扩散系数：

采用基于ADE的单沉积位点截留模型对电化学活性菌的穿透曲线进行拟合，其方程如下：

其中，θ[-]为孔隙度；C为胶体颗粒浓度，mg/L或cells/L；S为沉积在介质表面的胶体颗粒浓度，mg/g或cells/g；D为胶体颗粒在迁移体系中的扩散系数，m

其中，k

其中S

(3)采用毛细管法定量分析电化学活性菌向不溶性电子受体的直接趋能运动，如图4所示，计算得到直接趋能运动指数：将新鲜的S.oneidensis MR-1第一设定菌株野生株细胞的培养液(5mL)离心(10000g,5min)，收集MR-1细胞并用磷酸缓冲溶液(PBS,20mM,pH7.0)洗涤三次，在厌氧培养箱内重悬至含有PBS的培养基中，细胞终浓度为5×10

其中，C

采用群集运动平板法定量分析由可溶介体物质介导希瓦氏菌向二氧化锰的趋向运动，如图5所示，计算得到介体介导的趋能运动指数。向0.25％琼脂培养基中加入40mM乳酸钠，加入第一设定浓度0.173g Mn/L作为不溶电子受体和趋近效应物，添加50μM可溶介体物质AQDS，充分混合后倒平板，冷却凝固后备用，同时设置仅含电子受体颗粒而不添加可溶介体物质的对照组。将2.2.1所述新鲜的S.oneidensis MR-1培养液(20mL)离心(10000g,5min)，收集MR-1细胞并用PBS(20mM,pH 7.0)洗涤三次，重悬至0.1mL羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(30mM,pH 7)中，加入微量介体物质(200nM)。用注射器将8μL菌液接种至琼脂内，放入厌氧培养箱中培养3d，测量细胞群集运动区域的直径D

其中，D

(4)重复步骤(1)-(3)，采用第二设定菌株胞外电子传递关键功能基因缺失ΔomcA/ΔmtrC代替野生株细胞，改变迁移行为中二氧化锰负载量为第二设定负载量0.034mgMn/g，改变趋能运动中二氧化锰浓度为第二设定浓度0.040g Mn/L。获得电化学活性细菌迁移行为扩散系数(D)和趋向运动指数(I)的线性相关关系，如图6和图7所示。从图中可以看出，电化学活性菌的迁移行为扩散系数(D)和趋向运动指数(I)之间存在线性关系，不存在可溶介体物质时关系式为D

实施例2

本实施例用于验证本发明实施例1中所获得的迁移行为扩散系数(D)和趋向运动指数(I)间线性相关关系可以适用于预测电化学活性菌在含其他不溶性电子受体的石英砂介质中的迁移行为。

(1)电化学活性菌在载炭多孔介质中的迁移：首先对高纯圆粒石英砂(SiO

(2)通过迁移模型对穿透曲线数据进行反演，得到电化学活性菌迁移行为的扩散系数：

采用基于ADE的单沉积位点截留模型对电化学活性菌的穿透曲线进行拟合，其方程如下：

其中，θ[-]为孔隙度；C为胶体颗粒浓度，mg/L或cells/L；S为沉积在介质表面的胶体颗粒浓度，mg/g或cells/g；D为胶体颗粒在迁移体系中的扩散系数，m

其中，k

其中S

(3)采用毛细管法定量分析电化学活性菌向不溶性电子受体的趋能运动，如图4所示，计算得到趋能运动指数：

将新鲜的S.oneidensis MR-1第一设定菌株野生株细胞的培养液(5mL)离心(10000g,5min)，收集MR-1细胞并用磷酸缓冲溶液(PBS,20mM,pH 7.0)洗涤三次，在厌氧培养箱内重悬至含有PBS的培养基中，细胞终浓度为5×10

其中，C

采用群集运动平板法定量分析可溶介体物质介导希瓦氏菌向生物炭的趋向运动，如图5所示，计算得到介体介导的趋能运动指数。向0.25％琼脂培养基中加入40mM乳酸钠，加入第一设定浓度5.80g BC/L作为不溶电子受体和趋近效应物，添加50μM可溶介体物质AQDS，充分混合后倒平板，冷却凝固后备用，同时设置仅含电子受体颗粒而不添加可溶介体物质的对照组。将2.2.1所述新鲜的S.oneidensis MR-1培养液(20mL)离心(10000g,5min)，收集MR-1细胞并用PBS(20mM,pH 7.0)洗涤三次，重悬至0.1mL羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(30mM,pH 7)中，加入微量介体物质(200nM)。用注射器将8μL菌液接种至琼脂内，放入厌氧培养箱中培养3d，测量细胞群集运动区域的直径D

其中，D

(4)重复步骤(1)-(3)，采用第二设定菌株胞ΔomcA/ΔmtrC代替野生株细胞，改变迁移实验中生物炭负载量为第二设定负载量2mg BC/g，改变趋能运动中生物炭浓度为第二设定浓度2.32g BC/L。实例2中实测直接趋能运动指数分别为4.5、6.5和20.3，由可溶介体物质介导的趋能运动指数分别为1.0、1.3和2.5。根据实例1获得的迁移行为扩散系数(D)和趋向运动指数(I)之间的线性相关关系，预测不存在可溶介体时迁移行为的扩散系数D

实施例3

本实施例用于进一步验证本发明实施例1中所获得的迁移行为扩散系数(D)和趋向运动指数(I)间的线性相关关系可以适用于预测电化学活性菌在含其他不溶性电子受体的石英砂介质中的迁移行为。

(1)电化学活性菌在载铁多孔介质中的迁移：首先对高纯圆粒石英砂(SiO

(2)通过迁移模型对穿透曲线数据进行反演，得到电化学活性菌迁移行为的扩散系数：

采用基于ADE的单沉积位点截留模型对电化学活性菌的穿透曲线进行拟合，其方程如下：

其中，θ[-]为孔隙度；C为胶体颗粒浓度，mg/L或cells/L；S为沉积在介质表面的胶体颗粒浓度，mg/g或cells/g；D为胶体颗粒在迁移体系中的扩散系数，m

其中，k

其中S

(3)采用毛细管法定量分析电化学活性菌向不溶性电子受体的趋能运动，如图4所示，计算得到趋能运动指数：

将新鲜的S.oneidensis MR-1第一设定菌株野生株细胞的培养液(5mL)离心(10000g,5min)，收集MR-1细胞并用磷酸缓冲溶液(PBS,20mM,pH 7.0)洗涤三次，在厌氧培养箱内重悬至含有PBS的培养基中，细胞终浓度为5×10

其中，C

采用群集运动平板法定量分析可溶介体物质介导希瓦氏菌向水铁矿的趋向运动，如图5所示，计算得到介体介导的趋能运动指数。向0.25％琼脂培养基中加入40mM乳酸钠，加入第一设定浓度0.271g Fe/L作为不溶电子受体和趋近效应物，添加50μM可溶介体物质AQDS，充分混合后倒平板，冷却凝固后备用，同时设置仅含电子受体颗粒而不添加可溶介体物质的对照组。将2.2.1所述新鲜的S.oneidensis MR-1培养液(20mL)离心(10000g,5min)，收集MR-1细胞并用PBS(20mM,pH 7.0)洗涤三次，重悬至0.1mL羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(30mM,pH 7)中，加入微量介体物质(200nM)。用注射器将8μL菌液接种至琼脂内，放入厌氧培养箱中培养3d，测量细胞群集运动区域的直径D

其中，D

(4)重复步骤(1)-(3)，采用第二设定菌株ΔomcA/ΔmtrC代替野生株细胞，改变迁移实验中水铁矿负载量为第二设定负载量0.063mg Fe/g，改变趋能运动中水铁矿浓度为第二设定浓度0.073g Fe/L。实例3中实测的直接趋能运动指数分别为1.2、13.5和15.6，由可溶介体物质介导的趋能运动指数分别为3.0、1.5和5.5。根据实例1获得的迁移行为扩散系数(D)和趋向运动指数(I)之间的线性相关关系，预测不存在可溶介体时迁移行为的扩散系数D

结合实施例1、实例2和实施例3，证明本实施例方法可适用于含不同种类不溶性电子受体的石英砂介质。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述具体实施例的限制，上述具体实施例和说明书中的描述只是为了进一步说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由权利要求书及其等效物界定。