提高碳利用率和/或增强碳固存并且减少有害大气气体的材料和方法

摘要

本发明公开了减少诸如温室气体等有害大气气体的材料和方法。在具体实施例中，通过增加植物碳利用和存储以及增加土壤中的碳固存来减少有害大气气体。在一些实施例中，可以使用本发明减少从事例如农业、畜牧业生产、废物管理或其他行业的经营者所使用的碳信用额度。在某些实施例中，本发明提供了可定制的基于微生物的产品，以及使用这些基于微生物的产品减少温室气体和/或增强碳固存的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月9日提交的第62/743354号美国临时专利申请的优先权，以及于2019年8月9日提交的第62/884720号美国临时专利申请的优先权，这些申请均通过引用方式以其整体并入本文。

背景技术

人们将大气中集热的气体称为“温室气体”或“GHG”，这些气体包括二氧化碳、甲烷、一氧化二氮和含氟气体(《美国气候变化指标》，2016年，第四版，美国环境保护局，第6页，以下简称为“2016年EPA报告”)。

二氧化碳(CO

在煤炭、天然气和石油的生产和运输过程中会排放甲烷(CH

在工业活动以及化石燃料和固体废物燃烧过程中会排放一氧化二氮(N

含氟气体包括诸如氢氟碳化物、全氟碳化物、六氟化硫和三氟化氮等，含氟气是合成的强温室气体，来自各种工业过程排放(《2016年温室气体概述》)。

根据世界各地监测站的最新测量结果，以及对南极和格陵兰冰层中包裹气泡内古老空气的测量结果，过去几百年中，全球大气中(例如)二氧化碳的浓度发生了显著上升(2016年EPA报告，例如第6、15页)。

特别是自17世纪工业革命开始以来，由于化石燃料燃烧、森林砍伐和进行其他行业活动，人类活动增加了大气中温室气体的量。排放到大气中的许多温室气体会在那里停留了很长一段时间，这个时间段从十年到几千年。随着时间的推移，通过化学反应或排放汇集，这些气体会从大气中去除，例如，海洋和植被会从大气中吸收温室气体。

由于每种温室气体的寿命不同，并且每种温室气体在大气中集热的能力也不同，所以，为了能够对不同气体进行比较，人们一般使用每种气体的全球变暖潜能值将排放量转化为二氧化碳当量，全球变暖潜能值会衡量一定量的气体在排放后的100年内对全球变暖的作用。

基于这些考虑，美国环境保护局确定，自1990年以来，温室气体(也称为“辐射强迫”)引起的热效应增加了约37％(2016年EPA报告，第16页)。

尽管1990年至2010年间全球所有主要温室气体的排放都增加了，但二氧化碳的净排放量(约占全球总排放量的四分之三)却增加了42％，而甲烷的排放量增加了约15％，含氟气体的排放量翻了一番，一氧化二氮的排放量增加了约9％(2016年EPA报告，第14页)。

世界各国领导人尝试通过条约和国家间的其他协议来遏制温室气体排放的增加。其中，一种尝试就是通过使用碳信用体系。碳信用是可交易证书或许可证的通用术语，其代表了排放一吨二氧化碳或等效温室气体的权利。在典型的碳信用体系中，管理机构对经营者能够产生的温室气体排放量设定配额。超过这些配额，就要求经营者从尚未使用其全部碳信用额度的其他经营者处购买另外的信用额度。

碳信用体系的一个目标是鼓励企业投资更多的绿色技术、机械和实践，以便从这些信用额度的交易中获益。根据《联合国气候变化框架公约京都议定书》(UNFCCC)，许多国家已经同意在国际范围接受温室气体减排政策的约束，包括通过排放信用额度交易。虽然美国不接受《京都议定书》的约束，并且美国没有国家中央排放交易体系，但在一些州(例如，加利福尼亚州和东北部的一些州)已经开始采用这种交易方案。

一种减少大气CO

根据碳汇的性质，可以通过几种方式实现碳固存：直接通过无机化学反应，使碳酸盐/重碳酸盐形式的CO

全球变暖可能导致更急剧的温度波动，增加全球降水、洪水和干旱以及改变海面温度和海平面；因此，需要减少温室气体，特别是CO

发明内容

本发明提供了减少诸如温室气体等有害大气气体的材料和方法。在具体实施例中，通过增加植物碳利用和存储以及增加土壤中的碳固存来减少有害大气气体。

增加植物碳利用可表现为以下形式：例如，增加植物叶片、增大茎和/或树干直径、增强根系生长和/或增加植物数量。

增加土壤固存可表现为以下形式：例如，增强植物根系生长、增加微生物对植物分泌的有机化合物(包括植物根系分泌物)的吸收，以及改善土壤的微生物定植。

在某些实施例中，通过减少产甲烷微生物的数量和/或活性，实现有害大气气体的减少。

减少产甲烷微生物可表现为以下形式：例如，加强对粪便和/或有机废物的管理和处置，以及加强对土地和作物的管理。

在某些实施例中，通过改进的农业氮基肥料施肥实践、改进土壤微生物群的生物多样性和改进农业土壤管理，实现有害大气气体的减少。

改进的农业施肥实践、土壤生物多样性和/或土壤管理可以是以下形式：减少富氮肥料，以及用一种或多种有益的土壤微生物替代部分或全部的肥料、农药和/或其他土壤改良剂。

本发明的一个实施例包括：进行测量，评估本发明的方法对诸如农业场地、草坪或草皮农场、牧场或草原、水生生态系统或森林生态系统等中产生和/或减少产生温室气体和/或碳含量的作用。

在某些实施例中，在采用本发明方法之前和之后测量温室气体排放量，可以采取这种形式评估温室气体的产生。测量温室气体排放量可包括直接测量排放或分析燃料输入。直接测量排放量可包括：例如，识别污染作业活动，通过连续排放监测系统(CEMS)直接测量这些活动的排放量。分析燃料输入可包括：计算所使用的能源资源的数量(例如，所消耗的电、燃料、木材、生物质等的数量)，确定燃料源中的(例如)碳含量，并将该碳含量应用于所消耗的燃料的数量以确定排放量。

在某些实施例中，可通过(例如)量化植物的地上和/或地下生物质，测量一处位置(例如，农业场地、草坪或草皮农场、牧场、水生生态系统或森林生态系统)的碳含量。通常，假设(例如)树的碳含量约为生物质的40％-50％。

可以采取以下形式量化生物质：例如，在采样区域收获植物，并在干燥之前和干燥后测量植物不同部分的重量。还可以使用非破坏性的观测方法进行生物质的量化，例如测量树干直径、高度、体积和植物的其他物理参数。还可以使用远程量化方式，例如，通过无人机进行激光轮廓测量和分析。

在一些实施例中，农业场地、草皮或草坪农场、牧场或草原、水生生态系统或森林生态系统中的碳含量可进一步包括取样和测量取样区域的凋落物、木质残体和/或土壤有机物的碳含量。

在一些实施例中，可采用本发明减少从事诸如农业、畜牧业生产、废物管理、林业/再造林、航空、石油和天然气生产以及其他行业的经营者所使用的碳信用额度。

在某些实施例中，本发明提供了基于微生物的产品，以及使用这些基于微生物的产品减少大气温室气体、增加碳利用和/或增强碳固存的方法。在一个实施例中，本发明提供了基于微生物的组合物，其可增强土壤的性质、增强植物的地上和地下生物质，并控制(例如)产甲烷微生物。有利地，本发明的基于微生物的产品和方法对环境友好、无毒和成本效益高。

附图说明

图1A-1B示出了未经处理的对照柑橘树(“种植者实践(Grower’sPractice)”)和采用根据本发明实施例的组合物处理的柑橘树的须根生物质之间的差异。1A描述了经处理和未经处理的柚子树的根系生物质的测量结果。1B描述了经处理和未经处理的柑橘树的根系生物质的测量结果。

图2A-2B示出了未经处理的对照柑橘树和采用根据本发明实施例的组合物处理的柑橘树的冠层密度等级之间的差异。2A描述了经处理和未经处理的幼龄桔树的冠层密度等级。2B描述了经处理和未经处理的成熟桔树的冠层密度等级。

图3示出了未经处理的对照杏树和采用根据本发明实施例的组合物处理的杏树的树干测量结果之间的差异。

图4A-4B示出了未经处理的对照草皮和采用根据本发明实施例的组合物处理的草皮的干根质量之间的差异。4A示出了经处理和未经处理的黑麦草草皮的干根质量。4B示出了经处理和未经处理的蓝色黑麦草皮的干根质量。

图5A-5B示出了未经处理的对照草皮和采用根据本发明实施例的组合物处理的草皮的干根质量和叶绿素评级之间的差异。5A示出了经处理和未经处理的草皮的干根质量。5B示出了经处理和未经处理的草皮的叶绿素等级(相对绿色度)。

图6A-6B示出了未经处理的对照烟草植物和采用根据本发明实施例的组合物处理的烟草植物的叶绿素含量、叶长和叶宽之间的差异。6A示出了经处理和未经处理的烟草的叶绿素含量。6B示出了经处理和未经处理的烟草的烟草的叶长(顶部)和宽度(底部)。

图7A-7B示出了未经处理的对照烟草植物和采用根据本发明实施例的组合物处理的烟草植物的须根湿质量和根长、根宽之间的差异。7A示出了经处理和未经处理的烟草的须根湿质量。7B示出了经处理和未经处理的烟草的根长和根宽。

图8A-8B示出了未经处理的植物(左侧)和采用根据本发明实施例的组合物处理的植物(右侧)的湿根质量(8A)和根须密度(8B)。

图9示出了未经处理地块中土壤分析的堆积密度结果与采用根据本发明实施例的组合物处理地块中土壤分析的堆积密度结果的比较。

图10示出了未经处理的对照地块中土壤分析得出的总有机碳(TOC)结果与采用根据本发明实施例的组合物处理地块中土壤分析得出的总有机碳(TOC)结果的比较。

图11示出了未经处理的对照地块中存储在土壤碳池中的CO

图12示出了土壤一氧化二氮排放量，该排放量是对采用根据本发明实施例的组合物、NPK肥料处理地块和/或未经处理的地块测量的结果。

具体实施方式

本发明提供了减少诸如温室气体等有害大气气体的材料和方法。在具体实施例中，通过增加植物碳利用和存储以及增加土壤中的碳固存来减少有害大气气体。

在某些实施例中，通过减少产甲烷微生物，实现有害大气气体的减少。

在某些实施例中，通过改进的农业氮基肥料施肥实践和改进农业土壤管理(例如，通过改进土壤微生物群落的生物多样性)，实现有害大气气体的减少。

本发明的一个实施例包括：进行测量，评估本发明的方法对诸如农业场地、草坪或草皮农场、牧场、水生生态系统或森林生态系统等中产生和/或减少产生温室气体和/或碳含量的作用。

在一些实施例中，本发明可用于减少从事诸如农业、畜牧业生产、林业/再造林、废物管理、航空、石油和天然气生产或其他行业的经营者所使用的碳信用额度。

在一个实施例中，本发明提供了基于微生物的组合物，其可增强土壤的性质、增强植物的地上和地下生物质，并控制(例如)产甲烷微生物。

选择的定义

本发明使用“基于微生物的组合物”，意指包含微生物或其他细胞培养物生长而产生组分的组合物。因此，基于微生物的组合物可以包含微生物本身和/或微生物生长的副产品。微生物可以处于植物状态、孢子或分生孢子形式、菌丝形式、任何其他形式的繁殖体，或它们的混合物。微生物可以是浮游生物或生物膜形式，或两者的混合物。生长的副产物可以是诸如代谢物、细胞膜组分、蛋白质和/或其他细胞组分等。微生物可以是完好无损的或裂解的。在优选实施例中，微生物与生长它们的生长培养基一起存在于基于微生物的组合物中。微生物可以以下列浓度存在：每克或每毫升组合物至少1x 10

本发明还提供了“基于微生物的产品”，其是在实践中将被应用以实现期望结果的产品。基于微生物的产品可以简单地是从微生物培养过程中收获的基于微生物的组合物。替代性地，基于微生物的产品可以包含已经添加的其他成分。这些另外的成分可以包括诸如稳定剂、缓冲剂、适当载体(例如，水、盐溶液或任何其他适当载体)、支持微生物进一步生长而添加的营养物质、非营养生长促进剂和/或有助于在应用环境中跟踪微生物和/或组合物的制剂。基于微生物的产品还可以包含基于微生物的组合物的混合物。基于微生物的产品还可以包含已经以某种方式(诸如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等)加工过的基于微生物的组合物的一种或多种组分。

如本文所用，在基于微生物的组合物发酵的上下文中，“收获”是指从生长容器中移出部分或全部基于微生物的组合物。

如本文所用，“生物膜”是微生物的复杂聚集体，其中细胞彼此粘附和/或粘附到表面。在一些实施例中，细胞分泌出包围整个聚集体的多糖隔层。生物膜中的细胞在生理上不同于同一生物的浮游细胞，这些浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或游动的单个细胞。

如本文所用，“分离的”或“纯化的”化合物基本上不含天然与其连在一起的其他化合物，例如，细胞材料。纯化的或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含处于其天然存在状态的侧翼基因或序列。纯化的或分离的多肽不含处于其天然存在状态的侧翼氨基酸或序列。在微生物菌株的上下文中，“分离的”是指将菌株从其天然存在的环境中移出。因此，分离的菌株可以以例如生物学纯的培养物或与载体结合的孢子(或菌株的其他形式)存在。

如本文所用，“生物纯培养物”是将其从天然与其连在一起的材料分离开的培养物。在优选的实施方式中，已经从所有其他活细胞中分离出培养物。在另外的优选的实施方式中，与天然存在的相同微生物的培养物相比，生物学上纯净的培养物具有有利的特征。有利特征可以是(例如)增强生产一种或多种生长副产物。

在某些实施方式中，按重量计，纯化的化合物为感兴趣的化合物的至少60％。优选地，按重量计，制剂为感兴趣的化合物的至少75％、更优选为至少90％、以及最优选为至少99％。例如，纯化化合物是以重量计占所需化合物重量的至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的化合物。通过任何适当的标准方法，例如通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析来测量纯度。

“代谢物”是指由代谢产生的任何物质(例如，生长副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是有机化合物，它是代谢的起始材料、中间产品或最终产品。代谢物的实例包括但不限于生物表面活性剂、生物聚合物、酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素和氨基酸。

如本文所用，“调制”意指引起改变(例如，增加或减少)。通过现有技术已知方法标准，检测这种改变。

本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写。例如，从1到20的范围应理解为包括选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20组成的组的任何数字、数字的组合或子范围，以及上述整数之间的所有中间十进制值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别地考虑了从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1到50的嵌套子范围可以在一个方向上包括1到10、1到20、1到30和1到40，或者在另一个方向上包括50到40、50到30、50到20和50到10。

如本文所用，“减少”是指负改变，术语“增加”是指正改变，其中负改变或正改变为至少0.25％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

如本文所使用的，“参考”是指标准或对照条件。

如本文所用，“表面活性剂”是指降低各相间表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂用作例如清洁剂、湿润剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。“生物表面活性剂”是由活生物体产生的表面活性剂。

如本文所用，“农业”是指为食品、纤维、生物燃料、药品、化妆品、补充剂、装饰目的和其他用途而种植和培育植物、藻类和/或真菌。根据本发明，农业还可以包括园艺、园林绿化、造园、植物保护、林业和再造林、牧场和草原恢复、果园、树木栽培和农学。农业还包括土壤的养护、监测和维护。

如本文所用，“增强”意指改进或增加。例如，增强植物健康状况意指提高植物的能力生长和茁壮成长，包括提高种子发芽率和/或出苗率，提高抵御病和/或虫害的能力，以及提高抵御诸如干旱和/或水涝等环境压力的能力。增强植物生长和/或增强植物生物质意指增加植物在地上和地下的大小和/或质量(例如，增加冠层/叶片体积、高度、树干直径、分枝长度、芽长、蛋白质含量、根系大小/密度和/或总生长指数)和/或提高植物达到所需尺寸和/或质量的能力。提高产量意指通过诸如增加每株植物的果实、叶子、根和/或块茎的数量和/或大小，和/或改善果实、叶子、根和/或块茎的质量(例如，改善口感、质地、含糖量、叶绿素含量和/或颜色)等，改善作物中植物产生的最终产品。

如本文所用，术语“植物”包括但不限于木本植物、观赏植物或装饰植物、作物或谷类植物、水果或蔬菜、果树或菜苗、花卉或树木、大型藻类或微藻、浮游植物和光合藻类(例如，绿藻莱茵衣藻)。“植物”还包括单细胞植物(例如，微藻)和多种植物细胞，其会大量分化成菌落(例如，团藻虫属)或在植物发育的任何阶段存在的结构。这种结构包括但不限于果实、种子、芽、根、茎、叶、花等。此外，植物可以独立存在(例如，在草坪或花园中)，或者其可以是许多植物中的一种(例如，作为果园、森林或作物的一部分)。在示例性实施例中，植物是选自柑橘、番茄、草皮、草坪、马铃薯、甘蔗、葡萄、莴苣、杏、洋葱、胡萝卜、浆果和棉花中的作物；和/或生长在小树林、森林或果园中的树木；生长在水环境中的水生植物或大型植物；和/或生长在田地、草皮或草坪农场、大草原或牧场中的草、灌木或草本植物。

术语“植物组织”包括植物的分化的和未分化的组织，包括存在于根、芽、叶、花粉、种子和肿瘤或瘿中的组织，以及培养基中的细胞(例如，单细胞、原生质体、胚胎、细胞团等)。植物组织可以是在植物、器官培养基、组织培养基或细胞培养基中。本文所用的术语“植物部分”是指植物结构或植物组织。

如本文所用，“防止”或“预防”情况或事件发生意指延迟、抑制、压制、预防和/或最小化情况或事件的开始、扩展或进展。预防可以包括但不要求不确定的、绝对的或完全的预防，这意指迹象或症状可以仍会在以后发展。预防可以包括降低这些疾病、状况或紊乱发生的严重性，和/或抑制状况或紊乱朝更严重状况或紊乱发展。

如本文所用，提及有害生物时使用的术语“控制”意指杀死、禁用、固定或减少有害生物的种群数量，或以其他方式使有害生物基本上不能造成伤害。

如本文所使用，“有害生物”是所有对人类或人类问题(例如，农业、园艺)具有破坏性、有害和/或不利的非人类生物。在某些情况下，但并非所有情况下，有害生物都可以是致病生物。有害生物可以引起或成为感染、侵染和/或疾病的媒介，或者它们可以简单地以活组织为食或对活组织造成其他物理伤害。有害生物可以是单细胞或多细胞生物，包括但不限于病毒、真菌、细菌、寄生虫、原虫和/或线虫。

如本文所用，“土壤改良剂”或“土壤调节剂”是添加到土壤中以增强土壤和/或根际性质的化合物、材料或化合物或材料的组合。土壤改良剂可以包括有机物和无机物，并且可以进一步包括诸如肥料、杀虫剂和/或除草剂等。营养丰富、排水良好的土壤对植物的生长和健康至关重要，因此，土壤改良剂可以通过改变土壤的营养物质和水分含量来提高植物的生物质。土壤改良剂也可用于改善许多不同质量的土壤，包括但不限于土壤结构(例如，防止压实)；提高营养物质浓度和储存能力；改善干土的保水性；以及，改善水淹土壤的排水性。

如本文所用，“非生物压力源”是对具体环境中的活生物体具有负面影响的非生命状态。非生物压力源对环境的影响必须超出其正常的变化范围，从而对生物种群表现或个体生理状况产生重大的不利影响。非生物压力源包括但不限于干旱、极端温度(高温或低温)、洪水、大风、自然灾害(例如，飓风、雪崩、龙卷风)、土壤pH值变化、高辐射、土壤压实、污染等。或者，“生物压力源”是另一种活生物体对活生物体造成的损害和/或有害作用。生物压力源可包括诸如有害生物引起的损害和/或疾病、与其他生物体争夺资源和/或空间以及各种人类活动等。

与“包含”或“具有”同义的过渡术语“包括”是包含性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的要素或方法步骤。相反，连接词“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。连接词“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及实质上不影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。术语“包括”的使用涵盖了“由所列举的组件组成”或“基本上由所列举组件组成”的其他实施例。

除非特别声明或从上下文中显而易见，否则如本文所使用的，术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或根据上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“一(a/an)”、和“该”应理解为单数或复数。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所使用的，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差之内。“约”可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。

在本文对变量的任何定义中列举化学基团的列举包括将该变量定义为所列基团的任何单个基团或组合。本文中对变量或方面的实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合。

本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。

减少有害大气气体的方法

本发明提供了减少诸如温室气体(GHG)等有害大气气体的方法。温室气体可以是诸如二氧化碳、一氧化二氮和/或甲烷等。

有利地，在一些实施例中，本发明可用于减少例如从事农业、畜牧业生产、林业/再造林、废物管理、航空、石油和天然气生产或其他行业的经营者运营者所使用的碳信用额度。

在具体实施例中，本发明提供了减少地球大气中存在的有害大气气体量的方法，该方法包括：向有害大气气体的来源场所施用包含一种或多种有益微生物和/或微生物生长副产物的组合物，并且，可选地，促进微生物生长的营养物质(例如，益生元)。

在一些实施例中，这些场所包含可通过诸如呼吸或分解等自然过程转化为有害大气气体排放的有机物。本发明可用于诸如控制和/或防止这些过程中有害大气气体副产物的释放。

在一些实施例中，在将组合物施用于这些位置之前，该方法包括：评估该位置当地条件，确定针对这些当地条件定制的组合物的优选配方(例如，微生物和/或生长副产物的类型、组合和/或占比)，以及采用优选配方制备组合物。

当地条件可包括诸如土壤条件(例如，土壤类型、土壤微生物群落物种、土壤有机物含量的数量和/或类型、温室气体前体物质的数量和/或类型、肥料或其他土壤添加剂或改良剂的数量和/或类型)；作物和/或植物条件(例如，植物类型、植物数量，植物的年龄和/或健康状况)；环境条件(例如，当前气候、当年季节/时间)；该场所处温室气体排放量和/或类型；该组合物的施用方式和/或速率，以及该场所相关的其他因素。

在评估之后，可以确定该组合物的优选配方，从而可以确定针对这些当地条件定制的组合物。然后，优选在施用场所300英里范围内，优选200英里范围内，甚至更优选在100英里内的微生物生长设施中培养该组合物。

在一些实施例中，周期性地评估当地条件，例如，一年一次、半年一次、甚至每月一次。这样，可以根据需要实时修改组合物配方，以满足当地条件变化所带来的独特需求。

施用模式

如本文所用，在一场所“施用”组合物或产品是指将组合物或产品与场所接触，使得该组合物或产品可以对该场所产生影响。可由诸如微生物生长和定植，和/或代谢物、酶、生物表面活性剂或其他微生物生长副产物等造成这种影响。由组合物配方确定施用模式，施用模式可以包括诸如喷涂、浇注、喷洒、注射、摊铺、混合、浸泡、雾化和喷雾等。配方可包括诸如液体、干燥的和/或可湿性粉末、可流动粉末、粉尘、颗粒、丸剂、乳液、微胶囊、厚块、油、凝胶、糊状物和/或气溶胶。在示例性实施例中，在通过诸如将组合物溶解于水中等方式来制备组合物之后，施用该组合物。

在一个实施例中，施用组合物的场所为将在其中种植植物或植物将在其中生长(例如，作物、田地、果园、小树林、牧场/草原或森林)的土壤(或根际)。本发明的组合物可与灌溉液预混合，其中该组合物会渗透穿过土壤，并且能够被输送到诸如植物的根等，以影响根部微生物群落。

在一个实施例中，用水或不用水将该组合物应用于土壤表面，其中可通过降雨、洒水、漫灌或滴灌激活土壤施用的有益效果。

在一个实施例中，该场所为存放和/或处理牲畜粪便的蓄粪池。在一个实施例中，该场所为稻田或作物田在生长季节会被淹没的类似农业作业。施用可包括通过浇注、喷洒、注入等方式将本发明的组合物与蓄粪池和/或淹没稻田的液体接触，并且任选地将该组合物混合在其中。

在一个实施例中，该场所为植物或植物部分。该组合物可作为种子处理直接施用于其上，或施用到植物或植物部分的表面(例如，施用于根、块茎、茎、花、叶、果实或花的表面)。在具体实施例中，该组合物与植物的一个或多个根接触。可将该组合物(例如，通过喷洒或浸泡根)直接施用于根和/或(例如，通过将该组合物投药至植物生长的土壤(或根际))间接地施用。可在种植之前或种植时，将该组合物施用于植物的种子，或施用于植物的任何其他部分和/或其周围环境中。

在一个实施例中，其中大规模环境中使用该方法，例如在柑橘林、牧场或草原、森林、草皮或草坪农场，或农业作物中使用该方法，该方法可包括将组合物投药至与灌溉系统相连的水箱中，该灌溉系统用于供应水、肥料、杀虫剂或其他液体组分。因此，可以诸如通过土壤注入、土壤淋洗、使用中心枢轴灌溉系统、在播种沟上喷洒、使用微喷射、使用淋洗喷雾器、使用吊杆喷雾器、使用洒水器和/或使用滴灌器等方式，采用该组合物处理植物和/或植物周围的土壤。有利地，该方法适合处理数百英亩的土地。

在一个实施例中，其中在较小规模环境中使用该方法，例如在家庭花园或温室中，该方法可包括将该组合物(与水和其他可选添加剂混合)倒入手持式草坪和花园喷雾器的水箱中，并用该组合物喷洒土壤或其他场所。还可以将该组合物混合到标准的手持式洒水罐中，然后在场所倾倒。

在植物栽培过程中的任何时候都可以对植物和/或其环境进行处理。例如，可以在将种子种植到土壤之前、同时或之后将组合物施用于土壤。也可以在植物发育和生长后的任何时候对其施用，包括植物开花、结果、以及叶片脱落期间和/或之后。

减少有害大气气体

在一些实施例中，根据本发明方法，通过增加植物碳利用和存储以及增加土壤中的碳固存来减少有害大气气体。例如，增强植物碳利用可表现为以下形式：例如，增加植物叶片、增大茎和/或树干直径、增强根系生长和/或增加植物数量。

此外，增加土壤固存可表现为以下形式：例如，增强植物根系生长、增加微生物对植物分泌的有机化合物(包括植物根系分泌物)的吸收，以及改善土壤的微生物定植。

如本文所用，“减少”是指负改变，术语“增加”是指正改变，其中负改变或正改变为至少0.01％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施例中，在相对较短的时间段内实现期望的减少，例如，在1周、2周、3周或4周内。在一些实施例中，在采用本发明的方法后，在诸如1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月内实现期望的减少。在一些实施例中，在采用本发明的方法后，在诸如1年、2年、3年、4年或5年内实现期望的减少。

在具体实施例中，使用该方法减少大气二氧化碳。通过增加植物地上和地下的生物质，植物在光合作用中固定碳，并将碳储存为生物质，从而起到碳汇的作用。此外，增加植物根系生物质不仅会增加微生物可以定居的根系结构，而且还会增加分泌速率和从植物根系渗出的糖和其他营养物质的量，其会为施用的和原生的微生物生物质提供食物。这些微生物反过来将基于植物的材料转化为储存在土壤中更高水平的碳。因此，地下受刺激的微生物种群(既有添加的，也有原生的)会进一步起到碳储存系统的作用。在具体实施例中，微生物细胞生物质为酵母生物质。

在某些实施例中，通过改进的农业肥料施肥实践和改进农业土壤管理，实现有害大气气体的减少。

改进的农业施肥实践可以是以下形式：例如，减少富氮肥料，以及用包含一种或多种环境友好的土壤微生物的组合物替代部分或全部的肥料、农药和/或其他土壤改良剂。有利的是，减少使用化肥和其他化学物质会减少这些化学物质在植物无法吸收时对土壤和地下水造成的污染，并进一步减少流入其他水源的径流。此外，减少化肥的施用会减少土壤中因施用化肥而产生的一氧化二氮和二氧化碳的排放量。

本发明的方法可增加植物地上或地下生物质，包括诸如增加叶片体积、增大茎和/或树干直径、增强根系生长和/或密度和/或增加植物数量。在一个实施例中，通过改善植物根系生长的根际的整体适宜性来实现，例如，通过改善根际的营养物质和/或水分保持特性。

因此，本发明可有益于再造林以及恢复枯竭草原和/或牧场。在一些实施例中，因诸如牲畜过度放牧、伐木、商业、城市和/或住宅开发和/或倾倒等人为原因而导致草原/牧场和/或森林中的植被量枯竭。在一些实施例中，因火灾、疾病或其他自然和/或环境压力，而导致植被量枯竭。

此外，在一个实施例中，可使用该方法来采用有益微生物培植土壤和/或植物的根际。可通过诸如需氧细菌、酵母和/或真菌促进根和/或根际以及植物的维管系统促进本发明的基于微生物的组合物的微生物在根部和/或根际定植。

在某些实施例中，可使用该方法直接从空气和/或土壤中去除一氧化二氮。例如，根据本发明的某些微生物(例如，发酵成对杆菌)能够将一氧化二氮还原为土壤氮素，无需进行反硝化。反硝化是将硝酸盐和亚硝酸盐还原成分子氮。还原过程的中间产物包括氮氧化物产品(例如一氧化二氮)，其会泄漏到大气中。

在一个实施例中，促进定植能导致土壤微生物群落生物多样性的改善。如本文所用，改善生物多样性是指增加土壤中微生物种类的多样性。优选地，改善生物多样性包括需氧细菌种类、酵母种类和/或真菌种类与土壤中厌氧微生物的占比提高。

例如，在一个实施例中，本发明组合物的微生物可定植于根、土壤和/或根际，并鼓励其他营养物质固定微生物(例如，根瘤菌和/或菌根)和其他促进植物生物质积累的内源和/或外源微生物的定植。

在一个实施例中，通过向土壤中施用生物刺激剂或促进微生物生长速率增加的物质，可以进一步增强土壤生物多样性和根系定植。

在一个实施例中，改善土壤生物多样性会促进营业物质的增溶和/或吸收。例如，某些需氧菌种类能使土壤酸化，并溶解氮磷钾肥料成为植物可用的形式。

在又一个实施例中，可使用该方法来消除和/或阻止有害的或可能与有益土壤微生物竞争的土壤微生物对根际的定植。例如，当土壤中存在更多的需氧微生物时，可以茁壮成长并产生有害的大气副产品(例如，一氧化二氮)的厌氧微生物(例如，硝酸盐还原微生物)较少。

在一个实施例中，可使用该方法增强有益分子渗透通过根细胞外层，例如在根际的根-土界面处。

可使用本发明来改善任何类型土壤的任何数目的质量，例如，粘土、砂质、粉质、泥炭质、白垩质、壤土和/或它们的组合。此外，可使用该方法和组合物，改善干燥、浸水、多孔、贫化、压实土壤和/或它们的组合的质量。土壤可包括根际土壤或根际以外的土壤。

在一个实施例中，可使用该方法来改善淹水土壤的排水和/或水扩散。在一个实施例中，可使用该方法来改善干燥土壤的保水性。

在一个实施例中，可使用该方法来改善多孔和/或贫化土壤中营养物质的保留。

在一个实施例中，可使用该方法来改善侵蚀土壤的结构和/或营养物质含量。

在一个实施例中，可使用该方法来减少和/或替换化学或合成肥料，其中该组合物包含能够在土壤中固定、溶解和/或调动氮、钾、磷(或磷酸盐)和/或其他微量营养物质的微生物。

在某些实施例中，通过减少动物源和环境源的产甲烷微生物，实现有害大气气体的减少。减少产甲烷微生物可表现为以下形式：例如，加强对粪便和/或有机废物的管理和处置，以及加强对土地和作物的管理。

在一个实施例中，施用本发明的组合物的场所为蓄粪池。蓄粪池是厌氧池，里面装满了畜牧业所产生的动物粪便。一些蓄粪池也用于工业和/或城市废水的预处理。由于存在以废水中有机物为食的产甲烷微生物，所以，蓄粪池是甲烷排放的主要来源。

在一个实施例中，施用本发明组合物的场所是稻田。标准的水稻种植实践是在生长季节中将稻田淹没。然而，在被水淹没期间，产甲烷微生物依靠水中腐烂的有机物生长，从而，会释放出大量的甲烷排放。

通过将本发明的组合物施用于蓄粪池或稻田中的水和其他液体之中，本发明方法可通过控制产甲烷微生物而有效地减少大气甲烷排放。例如，在一个实施例中，当该组合物包含生物表面活性剂和/或产生生物表面活性剂的微生物时，该组合物可展现出对产甲烷菌的抗菌特性。在另一实施例中，当该组合物包含嗜杀酵母(例如，异常威克汉姆酵母)时，由于嗜杀酵母分泌的外毒素，则该组合物可有效地控制产甲烷微生物。

本发明方法的一个实施例包括：进行测量，评估组合物对有害大气气体源场所中产生和/或减少产生温室气体和/或碳含量的作用。

可在将基于微生物的组合物施用到场所后的特定时间点进行测量。在一些实施例中，在大约1周或更短的时间、2周或更短的时间、3周或更短的时间、4周或更短的时间、30天或更短的时间、60天或更短的时间、90天或更短的时间、120天或更短的时间、180天或更短的时间和/或1年或更短时间后进行测量。

此外，可以随时间重复进行测量。在一些实施例中，每天、每周、每月、双月、半月、半年和/或每年重复进行测量。

在某些实施例中，测量一场所的温室气体排放量，可以采取这种形式评估温室气体的产生。通常，在实验室环境中，使用气相色谱法和电子捕获法检测样品。在某些实施例中，还可以使用诸如通量测量和/或原位土壤探测等，现场进行温室气体排放。通量测量分析从土壤表面到大气的气体排放，例如，使用封闭土壤区域的腔室，然后通过观察一段时间内腔室内气体的积聚量来估算通量。可使用探头生成土壤气体剖析，首先测量土壤中特定深度处的相关气体浓度，并直接将其与探头和周围地表条件进行比较(Brummell和Siciliano2011年，第118页)。

测量温室气体排放量还可包括其他形式的直接测量排放和/或分析燃料输入。直接测量排放量可包括：例如，识别污染作业活动(例如，燃油汽车)，通过连续排放监测系统(CEMS)直接测量这些活动的排放量。分析燃料输入可包括：计算所使用的能源资源的数量(例如，所消耗的电、燃料、木材、生物质等的数量)，确定燃料源中的(例如)碳含量，并将该碳含量应用于所消耗的燃料的数量以确定排放量。

在某些实施例中，可通过(例如)量化植物的地上和/或地下生物质，测量一处植物生长的位置(例如，农作物、草皮或草坪农场、牧场/草原或森林)的碳含量。通常，假设(例如)树的碳含量约为生物质的40％-50％。

可以采取以下形式量化生物质：例如，在采样区域收获植物，并在干燥之前和干燥后测量植物不同部分的重量。还可以使用非破坏性的观测方法进行生物质的量化，例如测量树干直径、高度、体积和植物的其他物理参数。还可以使用远程量化方式，例如，通过激光轮廓测量和/或无人机分析。

在一些实施例中，一处场所的碳含量可进一步包括取样和测量取样区域的凋落物、木质残体和/或土壤的碳含量。尤其是，可以分析土壤，例如，使用干式燃烧测定总有机碳百分比(TOC)；通过高锰酸钾氧化分析检测活性碳；以及，通过体积密度测量(单位体积重量)将碳百分比转换为吨/英亩。

在一些实施例中，本发明可用于减少从事诸如农业、林业/再造林、畜牧业生产、废物管理、航空、石油和天然气或其他行业的经营者所使用的碳信用额度。

组合物

在一个实施例中，本发明提供了基于微生物的组合物，其包含一种或多种微生物和/或微生物生长副产物，其中，一种或多种微生物为有益、非致病性、土壤定植微生物。可以使用该组合物减少温室气体、提高碳利用率、增强碳固存和/或控制产甲烷微生物。在一些实施例中，该组合物包含一种或多种微生物，其还能够有助于增强根际特性，提高植物生物质和/或控制诸如产甲烷微生物等。

在优选实施例中，尽管组合物中还可能存在其他代谢物，但该微生物生长副产物为生物表面活性剂和/或酶。

有利地，在优选实施例中，根据本发明的基于微生物的组合物是无毒的，并且可以高浓度施用而不会对诸如人类或其他非害虫动物等的皮肤或消化道造成刺激。因此，当在诸如种植者和牲畜等活生物体的存在下施用基于微生物的组合物时，本发明特别有用。

在一个实施例中，可将多种微生物一起使用，其中这些微生物对减少温室气体和/或碳固存会产生协同效益。

可针对施用时的具体当地条件对该组合物中微生物和其他成分的种类和比例进行定制和优化，例如，被处理的土壤类型、植物和/或作物；施用组合物时的季节、气候和/或时间；以及所采用的施用模式和/或速率。因此，该组合可以针对任何给定场所进行定制。

在一个实施例中，该组合物包含酵母，例如，球拟假丝酵母、布拉氏酵母、绿针假单胞菌、和/或木霉属真菌(例如,西方毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母和/或季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)(季也蒙迈耶氏酵母(Meyerozyma guilliermondii))。

在一个实施例中，该组合物包含至少一种嗜杀酵母。优选地，该组合物包含非致病性“嗜杀酵母”菌株(例如，异常威克汉姆酵母)或同科和/或同属的其他酵母。异常威克汉姆能够产生多种代谢物，包括酶(例如，植酸酶、糖苷酶和外显β-1,3葡聚糖酶)和生物表面活性剂(例如，磷脂)。

在一个实施例中，该组合物包含真菌，例如，白腐菌、香菇或木霉属真菌(例如，哈茨木霉、绿木霉、哈氏木霉和/或里氏木霉)。

在一个实施例中，该组合物包含细菌，例如，绿针假单胞菌或芽孢杆菌属细菌(例如，枯草芽孢杆菌)和/或解淀粉芽孢杆菌(例如,解淀粉芽孢杆菌亚种绿木霉)。

在一个实施例中，包括粘细菌，其中粘细菌为黄色粘球菌。

在一个实施例中，该组合物包含能够在土壤中固定、溶解和/或调动氮、钾、磷(或磷酸盐)和/或其他微量营养物质的微生物。在一个实施例中，可包括钾调动细菌，例如，金黄弗拉特氏菌。在一个实施例中，可包括固氮细菌，例如，棕色固氮菌、多粘类芽孢杆菌和/或解淀粉芽孢杆菌。

在一个实施例中，该组分包含能够将大气中的一氧化二氮转化为土壤中氮的非反硝化微生物，例如，发酵成对杆菌。

在具体实施例中，组合物中所包含的每一种微生物的浓度为组合物的1x10

在一个实施例中，组合物的总微生物细胞浓度为至少1x 10

该组合物可包含残留发酵基质和/或纯化或未纯化的生长副产物，例如，酶、生物表面活性剂和/或其他代谢物。这些微生物可以是活的，也可以是不活跃的。

本发明的微生物和基于微生物的组合物具有许多有益性质，这些有益性质有助于诸如增加植物生物质和控制产甲烷菌等。例如，该组合物可包含微生物生长产生的产物，例如，纯化或粗料形式的生物表面活性剂、蛋白质和/或酶。此外，微生物可以促进植物生长，诱导生长素的产生，使营养物质在土壤中增溶、吸收和/或达到平衡，并且保护植物免受害虫和病原体的侵害。

在一个实施例中，本发明组合物的微生物能够产生生物表面活性剂。在一个实施例中，可由其他微生物单独产生生物表面活性剂，并以纯化形式或粗料形式添加至组合物中。粗料形式生物表面活性剂可包含诸如由生物表面活性剂产生微生物得到的剩余发酵培养基中的生物表面活性剂和其他细胞生长产的产物。粗料形式生物表面活性剂组合物可包含自约0.001％至约90％、约25％至约75％、约30％至约70％、约35％至约65％、约40％至约60％、约45％至约55％或约50％纯生物表面活性剂。

生物表面活性剂形成一类重要的由诸如细菌、真菌和酵母等多种微生物产生的次生代谢产物。作为两亲性分子，微生物表面活性剂会降低液体、固体和气体分子之间的表面张力和界面张力。此外，根据本发明的生物表面活性剂是可生物降解的，低毒，会有效溶解和降解土壤中的不溶性化合物，并且可以使用低成本和可再生资源生产。它们可以抑制不需要的微生物粘附到各种表面上，防止生物膜的形成，并可以具有很强的乳化和破乳性质。此外，还可使用生物表面活性剂来改善土壤的润湿性，实现肥料、营养物质和水在土壤中均匀增溶和/或分配。

根据本发明方法的生物表面活性剂可选自诸如低分子量糖脂(例如，槐脂、纤维二糖脂、鼠李糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如，表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、节活性素和地衣素)、黄酮脂、磷脂(例如，心磷脂质)、脂肪酸酯和高分子量聚合物(例如，脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物。

该组合物可包含按重量计浓度为0.001％至10％、0.01％至5％、0.05％至2％和/或0.1％至1％的一种或多种生物表面活性剂。

该组合物可包含发酵培养基，该发酵培养基含有活的和/或非活性培养物、纯化的或粗料形式生长副产物(例如生物表面活性剂、酶和/或其他代谢物)和/或任何残余营养物质。

可直接使用发酵产物，经过或未经提取或纯化。如果需要，可以使用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术容易地实现提取和纯化。

该组合物中微生物可以是活性或非活性形式，或者是营养细胞、生殖孢子、菌丝体、菌丝、分生孢子的形式或任何其他形式的微生物繁殖体。该组合物还包含这些微生物形式的任何组合。

在一个实施例中，当该组合物包含微生物菌株的组合时，将不同的微生物菌株分开培养，然后混合在一起形成组合物。

有利地，根据本发明，该组合物可包含微生物成长的培养基。该组合物可以是生长培养基(以重量计)的(例如)至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％。该组合物中生物质的量(按重量计)可以是(例如)0％至100％的任何百分比，包括其间的所有百分比。

在一个实施方式中，优选地将所述组合物配制成施用于土壤、种子、整株植物或植物部分(包括但不限于根、块茎、茎、花和叶)。在某些实施方式中，所述组合物被配制成例如液体、粉尘、颗粒、微粒、丸剂、可湿性粉末、可流动性粉末、乳剂、微胶囊、油或气雾剂。

为了改善或稳定所述组合物的效果，可以将其与合适的佐剂混合，然后就这样使用或在必要时稀释后使用。在优选的实施方式中，将所述组合物配制成液体、浓缩液、或者可以与水和其他组分混合以形成液体产品的干燥粉末或颗粒。在一个实施例中，该组合物除了渗透性物质之外还可包含(例如，糖蜜形式的)葡萄糖，以确保在干燥产品的储存和运输期间的最佳渗透压。

既可以单独使用该组合物，也可以将该组合物与其他化合物和/或方法组合使用，以有效地增强植物的健康状况、生长和/或产量，并/或补充该组合物中微生物的生长。例如，在一个实施例中，该组合物可包含和/或可同时与营养物质和/或微量营养物质一起施用，以增强植物和/或微生物生长，例如，镁、磷酸盐、氮、钾、硒、钙、硫、铁、铜和锌，以及/或一种或多种益生元(例如，昆布提取物、富里酸、甲壳素、腐植酸盐和/或腐植酸。受益于本公开的种植者或农业科学家可以确定确切的材料及其数量。

所述组合物也可以与其他农业化合物和/或作物管理系统组合使用。在一个实施方式中，所述组合物可以可选地包含例如天然和/或化学杀虫剂、驱虫剂、除草剂、肥料、水处理剂、非离子表面活性剂和/或土壤改良剂或与之一起施用。然而，优选地，所述组合物不包含苯菌灵、十二烷基二甲基氯化铵、过氧化氢/过氧乙酸、抑霉唑、丙环唑、戊唑醇或氟菌唑和/或不与之一起使用。

如果所述组合物与相容的化学添加剂混合，则在添加本发明的组合物之前，优选地用水稀释化学药品。

可以将另外的组分添加到所述组合物中，例如缓冲剂、载体、在相同或不同设施下生产的其他基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养物质、示踪剂、杀生物剂、其他微生物、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、pH调节剂、防腐剂、稳定剂和抗紫外线剂。

基于微生物的组合物的pH应适合于感兴趣的微生物。该组合物的pH值为约3.5至7.0、约4.0至6.5或约5.0。

可选地，所述组合物可以在使用前储存。储存时间优选为短时。因此，储存时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在优选实施例中，如果产品中存在活细胞，则在低温下储存产品，例如，低于20℃、15℃、10℃或5℃。

但是，可在不进一步稳定、保存和储存的情况下使用基于微生物的产品。有利地，直接使用这些基于微生物的组合物，会保持微生物的高活性，减少来自外来试剂和不需要微生物污染的可能性，并且保持微生物生长的副产物的活性。

在其他实施例中，可将组合物(微生物、生长培养基或微生物和培养基)置于适当大小的容器中，考虑诸如预期用途、预期施用方法、发酵容器的大小，以及从微生物生长设施到使用地点的运输方式。因此，放置基于微生物的组合物的容器可以是例如1品脱至1000加仑或更多。在某些实施方式中，容器是1加仑、2加仑、5加仑、25加仑或更大的。

根据本发明的微生物生长

本发明利用用于培养微生物和产生微生物代谢产物和/或微生物生长的其他副产物的方法。本发明进一步利用适合于以所需规模培养微生物和产生微生物代谢产物的培养方法。这些培养过程包括但不限于深层培养/发酵，固态发酵(SSF)及其改进、混杂和/或组合。

如本文所用，“发酵”是指在受控条件下细胞的培养或生长。所述生长可以是有氧的或厌氧的。在优选的实施方式中，微生物使用SSF和/或其改进的形式生长。

在一个实施例中，本发明提供了生产生物质(例如，活细胞材料)、细胞外代谢物(例如，小分子和蛋白质)、残余营养物质和/或细胞内组分(例如，酶和其他蛋白质)的材料和方法。

根据本发明使用的微生物生长容器可以是任何用于工业用途的发酵器或培养反应器。在一个实施方式中，容器可以具有功能控件/传感器或可连接至功能控件/传感器以测量培养过程中的重要因素，例如pH、氧气、压力、温度、湿度、微生物密度和/或代谢物浓度。

在另一个实施方式中，容器还能够监测容器内微生物的生长(例如，细胞数量和生长阶段的测量)。替代性地，可以从所述容器中取出每日样品，并通过本领域已知的技术(诸如稀释平板技术)对所述样品进行计数。稀释平板技术是一种用于估计样品中生物数量的简单技术。该技术还可以提供一个指标，通过该指标可以比较不同的环境或处理。

在一个实施方式中，所述方法包括：用氮源补充培养物。氮源可以是例如硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以单独使用或者以两种或更多种的组合使用。

该方法可以为生长的培养物提供氧合。一个实施方式利用了空气的慢速运动去除含低氧的空气并引入含氧空气。在浸没式发酵的情况下，含氧空气可以是通过机构(包括用于机械地搅动液体的叶轮和用于向液体供应气体气泡以将氧气溶解到液体中的空气分布器)每天补充的环境空气。

所述方法还可以包括：用碳源补充培养物。碳源可以是碳水化合物，例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和/或麦芽糖；有机酸，例如，乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇，例如，乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油；脂肪和油，例如，大豆油、菜籽油、米糠油、橄榄油、玉米油、葵花籽油、芝麻油和/或亚麻籽油等。可以单独使用这些碳源，也可以两种或两种以上的碳源组合使用。

在一个实施方式中，培养基中包括微体生物的生长因子和微量营养物质。这在无法产生其所需的所有维生素的微生物生长时是特别优选的。培养基中还可以包括无机营养物质，包括微量元素，诸如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴。此外，维生素、必需氨基酸和微量元素的来源可以例如以面粉或粗粉(meals)的形式(诸如玉米粉)或以提取物的形式(诸如酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物、香蕉皮提取物等)或以纯化形式被包括在内。也可以包括氨基酸，诸如对于蛋白质的生物合成有用的那些氨基酸。

在一个实施方式中，还可以包括无机盐。可用的无机盐可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、氯化钠、碳酸钙和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用或者以两种或更多种的组合使用。

在一些实施方式中，用于培养的方法可以进一步包括在培养过程之前和/或期间在培养基中添加另外的酸和/或抗微生物剂。抗菌剂或抗生素用于保护培养物免受污染。

此外，还可添加消泡剂，防止在浸没培养期间形成和/或积聚泡沫。

混合物的pH值应适合感兴趣的微体生物。可以使用缓冲剂和pH调节剂(诸如碳酸盐和磷酸盐)将pH稳定在优选值附近。当金属离子以高浓度存在时，可能需要在培养基中使用螯合剂。

微生物可以以浮游形式或生物膜形式生长。在生物膜的情况下，容器中可以具有基质，微生物可以在该基质上以生物膜状态生长。该系统还可以具有例如施加激励和/或改善生物膜生长特征的刺激(诸如剪切应力)的能力。

在一个实施方式中，用于培养微生物的方法在约5℃至约100℃、优选15至60℃、更优选25至50℃下进行。在另外的实施方式中，可以在恒定温度下连续地进行培养。在另一实施方式中，可以使培养经历温度变化。

在一个实施方式中，所述方法和培养过程中使用的装备是无菌的。培养装备(诸如反应器/容器)可以与灭菌单元(如高压釜)是分开的但连接至该灭菌单元。培养设备还可以具有在开始接种前进行原位灭菌的灭菌装置。可以通过本领域已知的方法对空气进行灭菌。例如，环境空气在被引入到容器中之前可以通过至少一个过滤器。在其他实施方式中，可以对培养基进行巴氏灭菌，或者任选地，根本不添加热量，其中，可以利用低水分活度和低pH来控制不良细菌的生长。

在一个实施方式中，本发明进一步提供了一种通过在适于生长和代谢产物生产的条件下培养本发明的微生物菌株、以及任选地纯化代谢产物来生产微生物代谢产物的方法，所述微生物代谢产物比如为生物表面活性剂、酶、蛋白质、乙醇、乳酸、β-葡聚糖、肽、代谢中间体、多不饱和脂肪酸和脂质。该方法生成的代谢物含量可为例如至少为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

可以将由感兴趣的微体生物产生的微生物生长副产品保留在微体生物中或分泌到生长培养基中。培养基可以包含稳定微生物生长副产物活性的化合物。

发酵培养基的生物质含量可以为例如5g/l至180g/l或更高，或10g/l至150g/l。

细胞浓度可为例如至少1x 10

用于培养微生物和产生微生物副产物的方法和设备可以分批、准连续过程或连续过程进行。

在一个实施方式中，在培养完成时(例如，在例如达到期望的细胞密度或特定代谢产物的密度时)除去所有微生物培养组合物。在该批次程序中，在收获第一批次后启动全新的批次。

在另一实施方式中，在任何一次仅去除一部分发酵产品。在该实施方式中，具有活细胞、孢子、分生孢子、菌丝和/或菌丝体的生物质作为新培养批次的接种剂保留在容器中。被去除的组合物可以是无细胞的培养基或包含细胞、孢子或其他繁殖繁殖体和/或其组合。以这种方式，创建了准连续系统。

有利地，该方法不需要复杂的装备或高能耗。感兴趣的微生物可以就地小规模或大规模培养并利用，甚至仍与它们的培养基混合。

有利地，可以远程生产基于微生物的产品。微生物生长设施可通过利用诸如太阳能、风能和/或水力发电等方式进行脱网外运行。

微生物菌株

根据本发明有用的微生物可以是诸如细菌、酵母和/或真菌的非植物病原菌株等。这些微体生物可以是天然的或基因修饰的微体生物。例如，可以用特定基因变换微体生物以表现出特定特征。所述微体生物也可以是所需菌株的突变体。如本文所使用的，“突变体”是指参考微体生物的菌株、遗传变异体或亚型，其中，与参考微体生物相比，突变体具有一种或多种遗传变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、重复、移码突变或重复扩增)。制备突变体的程序是微生物学领域众所周知的。例如，为此目的广泛使用了紫外线诱变和亚硝基胍。

在一个实施例中，该微生物是酵母或真菌。适合根据本发明用途的酵母和真菌种类包括短梗霉属(例如，出芽短梗酶菌)、三孢霉属、念珠菌属(例如，假丝酵母、假丝酵母、隐球酵母)、隐球菌属、德巴利酵母属(例如，汉逊德巴利酵母)、虫霉属、孢汉逊酵母(例如，葡萄有孢汉逊酵母)、汉逊氏酵母属、伊萨酵母、克鲁维酵母属(例如，克鲁维酵母噬菌体)、香菇、被孢霉属、菌根,迈耶氏酵母(Meyerozyma)(季也蒙迈耶氏酵母(Meyerozymaguilliermondii))、青霉属、须霉属、毕赤酵母属(例如，异常毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、西方毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母)、侧耳属(例如，白腐菌)、假曲霉菌(例如，蚜虫假酵母)、酵母属(例如，布拉氏酵母继代(Saccharomyces boulardii sequela)、酿酒酵母、酿酒圆酵母)、斯塔摩酵母(Starmerella)(例如，球拟假丝酵母(Starmerella bombicola))、球拟酵母属、木霉属(例如，里氏木霉、哈茨木霉、钩状木霉、绿木霉)、黑粉菌属(例如，玉蜀黍黑粉菌)、威克汉姆酵母(例如，异常威克汉姆酵母)、拟威尔酵母属(例如，姆拉克拟威尔酵母(Williopsis mrakii))、接合酵母(例如，拜耳接合酵母)等。

在一些实施例中，可以使用本发明减少从事例如农业、畜牧业生产、废物管理或其他行业的经营者所使用的碳信用额度。在示范性实施例中，本发明使用嗜杀酵母，其是可产生对其他微生物种类有毒的酶和其他化合物的酵母。优选地，这些酵母能够在植物的根的根-土界面上定植，并为根际提供许多益处。更具体地说，嗜杀酵母包括异常威克汉姆酵母(异常毕赤酵母)。发明人还设想了其他密切相关的种类，例如，威克汉姆酵母和/或毕赤酵母单系支的其他成员。

异常威克汉姆具有许多对本发明有用的有益特性，包括它们产生有利代谢物的能力。例如，异常威克汉姆能够具有exo-β-1,3-葡聚糖酶活性，使其能够控制或抑制包括产甲烷菌在内的多种微生物的生长。此外，如果培养5-7天，常威克汉姆会产生能够降低水的表面/界面张力的生物表面活性剂，并表现出抗菌和抗真菌的特性。

除了各种副产品外，这些酵母还能够产生植酸酶，并提供多种蛋白质(包含达干细胞生物质的50％)、脂质和碳源，以及全谱矿物质和维生素(B1；B2；B3(PP)；B5；B7(H)；B6；E)。

在某些实施例中，微生物可以是另一种酵母，例如，球拟假丝酵母、布拉氏酵母、绿针假单胞菌、和/或毕赤酵母(例如,西方毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母和/或季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)(季也蒙迈耶氏酵母(Meyerozyma guilliermondii))。

在一个实施例中，微生物可以是真菌，例如，香菇、白腐菌或木霉属真菌(例如，哈茨木霉、绿木霉、哈氏木霉和/或里氏木霉))。

在某些实施例中，微生物是细菌，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。细菌可以是诸如土壤杆菌属(例如，放射形土壤杆菌)、固氮菌(棕色固氮菌、褐球固氮菌)、固氮螺菌属(例如，巴西固氮螺菌)、杆菌(例如，解淀粉芽孢杆菌、环状芽胞杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌、枯草杆菌)、弗拉托菌属(例如，金黄弗拉特氏菌)、细杆菌(例如，产左聚糖微杆菌(Microbacterium laevaniformans)、粘细菌(例如，黄色粘球菌、橙色标桩菌(Stignatella aurantiaca)、纤维堆囊菌、玫瑰小囊虫(Minicystis rosea))、多粘类芽孢杆菌、泛菌(例如，成团泛菌)、假单胞菌属(例如，绿脓杆菌、绿针假单胞菌金色亚种(P.chlororaphis subsp.aureofaciens)(Kluyver)、恶臭假单胞菌)、根瘤菌属、红螺菌属(例如，深红螺菌)、鞘氨醇单胞菌(例如，少动鞘氨醇单胞菌和/或氧化硫硫杆菌(嗜酸性氧化硫硫杆菌)等。

在一个实施例中，微生物是细菌，例如，绿针假单胞菌或芽孢杆菌属细菌(例如，枯草芽孢杆菌)和/或解淀粉芽孢杆菌(例如,解淀粉芽孢杆菌亚种绿木霉)。有利地，尤其是，解淀粉芽孢杆菌能够降低土壤的pH值并溶解营养物质(例如，氮磷钾肥料中的营养物质)，从而更容易被植物根系吸收。在一些情况下，解淀粉芽孢杆菌还可以固定大气中的氮，并将氮还原为氨。

在一个实施例中，微生物为粘细菌或黏液形成菌。具体地，在一个实施例中，粘细菌是粘球菌属细菌，例如，黄色粘球菌。

在某些实施例中，微生物是能够固定和/或溶解土壤中氮、钾、磷和/或其他微量营养物质的微生物。

在一个实施例中，微生物是固氮微生物或固氮生物，选自：例如，固氮螺菌属、固氮菌、绿菌科、蓝杆菌、弗兰克氏菌属、克雷白杆菌属、根瘤菌、束毛藻属和一些古细菌。在具体实施例中，固氮细菌为棕色固氮菌。

在一个实施例中，微生物为选自下列的钾调动微生物或KMB：例如，胶质芽孢杆菌、金黄弗拉特氏菌或摩西球囊霉菌。在一个具体的实施方案中，钾调动微生物是金黄弗拉特氏菌。

在一个实施例中，微生物是能够将大气中的一氧化二氮转化为土壤中的氮的非反硝化微生物，例如，发酵成对杆菌。

在一个实施例中，将微生物的组合用于本发明的基于微生物的组合物中，其中微生物彼此协同工作以增强植物生物质和/或增强根际的性质。

基于微生物的产品的制备

本发明的一种基于微生物的产品仅是含微生物和/或微生物产生的微生物代谢物和/或任何残留营养物质的发酵培养基。发酵产品无需提取或纯化即可直接使用。如果需要，可以使用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术容易地实现提取和纯化。

基于微生物产品中的微生物可以是活性或非活性形式，或者是营养细胞、生殖孢子、菌丝体、菌丝、分生孢子的形式或任何其他形式的微生物繁殖体。基于微生物的产品还可以包含这些形式微生物的组合。

在一个实施例中，将不同的微生物菌株分开培养，然后混合在一起产生基于微生物的产品。任选地，在混合之前，可以将微生物与其将生长于其中培养基混合并干燥。

在一个实施例中，不将不同的微生物菌株混合在一起，而是将其作为单独的基于微生物的产品施用于植物和/或其环境中。

无需进一步稳定、保存和储存即可使用基于微生物的产品。有利地，这些基于微生物的产品的直接使用保持了微体生物的高活力，降低了被外来试剂和不希望有的微体生物污染的可能性，并维持了微生物生长的副产品的活性。

在从生长容器中收获基于微生物的组合物时，当收获的产品被放置到容器中或以其他方式运输以供使用时，可添加其他组分。添加剂可以是诸如缓冲剂、载体、在相同或不同设施下生产的其他基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养物质、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、示踪剂、溶剂、杀生物剂、抗生素、pH调节剂、螯合剂、稳定剂和抗紫外线剂、通常用于此类制剂的其他微生物和其他合适的添加剂等。

在一个实施例中，可以添加包括有机酸和氨基酸或它们的盐的缓冲剂。合适的缓冲剂包括柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸盐、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、半乳酸盐、葡糖酸盐、丙醇二醇盐、谷氨酸盐、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸和它们的混合物。也可以使用磷酸和亚磷酸或其盐。适合使用合成缓冲剂，但是优选使用天然缓冲剂，例如上面列出的有机酸和氨基酸或其盐。

在另一个实施方式中，pH调节剂包括氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾或碳酸氢盐、盐酸、硝酸、硫酸或混合物。

基于微生物的组合物的pH值应适合感兴趣的(多种)微生物。该组合物的pH值为约3.5至7.0、约4.0至6.5或约5.0。

在一个实施例中，在配方中可以包括其他组分，例如，诸如碳酸氢钠或碳酸钠、硫酸钠、磷酸钠、磷酸二钠等盐的水性化制剂。

在某些实施例中，可向组合物中添加粘结物质以延长产品对植物部分的粘附。可使用聚合物(例如，带电聚合物)或多糖基物质(例如，黄原胶、瓜尔豆胶、黎凡胶、木聚糖、结冷胶、凝胶多糖、普鲁兰多糖、右旋糖酐及其他)。

在优选实施例中，使用商业级黄原胶作为粘结剂。。应根据商业产品中的胶含量来选择胶的浓度。如果黄原胶是高纯度的，那么0.001％(w/v-黄原胶/溶液)就足够了。

在一个实施例中，可将葡萄糖、丙三醇和/或甘油添加到基于微生物的产品中，例如，在储存和运输期间作为渗透剂。在一个实施例中，可以包括糖蜜。

在一个实施例中，可将益生元添加到基于微生物的产品中和/或与基于微生物的产品同时施用，以增强微生物生长。合适的益生元包括(例如)昆布提取物、富里酸、腐殖酸盐和腐殖酸。在具体实施例中，施用益生元的量为约0.1L/英亩至约0.5L/英亩，或约0.2L/英亩至约0.4L/英亩。

在一个实施例中，将具体营养物质添加到基于微生物的产品中和/或与基于微生物的产品同时施用，以增强微生物接种和生长。这些可包括诸如可溶性钾(K2O)、镁、硫、硼、铁、锰和/或锌等。营养物质可来自诸如氢氧化钾、硫酸镁、硼酸、硫酸亚铁、硫酸锰和/或硫酸锌等。

任选地，产品可以在使用之前被储存。储存时间优选为短时。因此，储存时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在优选实施例中，如果产品中存在活细胞，则在低温下储存产品，例如，低于20℃、15℃、10℃或5℃。

基于微生物产品的本地生产

在本发明的某些实施例中，微生物生长设施会以期望的规模产生新鲜的、高密度的微生物和/或感兴趣的微生物生长副产物。微生物生长设施可以位于施用位置处或附近。所述设施在分批的、准连续的或连续的培养中生产高密度的基于微生物的组合物。

本发明的微生物生长设施可位于将使用基于微生物的产品的地点(例如，柑橘林)。例如，微生物生长设施可以距使用地点少于300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1英里。

由于可以在当地生产基于微生物的产品，而无需传统微生物生产的微生物稳定、保存、储存和运输过程，因此，可以产生更高密度的微生物，由此现场施用需要更小体积的微生物基产品，或需要取得所需效率时能够施用更高密度的微生物。这使得生物反应器能够减小规模(例如，更小的发酵容器、更小的接种体材料、营养物质和pH值控制剂的供应量)，这使得系统更有效，并且可以无需稳定细胞或将细胞从培养基中分离。当地生产基于微生物的产品还有助于将生长培养包含在产品中。培养基可含有发酵过程中产生的特别适合本地使用的制剂。

在田间，当地生产的高密度、健壮的微生物培养基比那些在供应链中保留了一段时间的微生物培养基更有效。与传统产品(其中，细胞已与发酵生长培养基中存在的代谢物和营养物质分离)相比，本发明的基于微生物的产品是特别有利的。减少的运送时间允许根据本地需求以一定的时间和体积生产和递送新鲜批次的微生物和/或其代谢物。

本发明的微生物生长设施会生产新鲜的基于微生物的组合物，其包含微生物本身、微生物代谢物和/或微生物生长介质的其他组分。如果需要，该组合物可以具有高密度的营养细胞或繁殖体，或营养细胞和繁殖体的混合物。

在一个实施例中，微生物生长设施位于或靠近施用微生物产品的场所(例如，柑橘林)，例如，在300英里、200英里或甚至100英里范围内。有利地，这允许对组合物进行定制以在指定位置使用。可针对施用时的具体当地条件对配方和基于微生物组合物的效力进行定制，例如，被处理的土壤类型、植物和/或作物；施用组合物时的季节、气候和/或时间；以及所采用的施用模式和/或速率。

有利地，分布式微生物生长设施对目前依赖遥远的工业规模生产商的问题提供了解决方案，这些生产商的产品质量会因上游延迟加工、供应链瓶颈、不当储存和其他意外事件而受到影响，这些意外事件会阻碍及时交付和施用诸如活的、高细胞数的产品和细胞最初生长的相关培养基和代谢物。

此外，通过当地生产组合物，可根据具体位置和施用时存在的条件实时调整配方和效力。这提供在中央位置预制组合物的优点，并且例如具有针对给定位置可能不是最佳的设定比率和配方。

本微生物生长设施能够定制基于微生物的产品，从而提高与目的地地理情况的协同效应，进而提供制造的多功能性。有利地，在优选实施例中，本发明的系统会利用当地自然产生的微生物及其代谢副产物的力量，改善温室气体管理。

单个容器的培养时间可以是诸如1至7天或更长。可以以多种不同的方式中的任何方式收获培养产品。

在例如发酵的24小时之内的本地生产和递送引致纯净的、高细胞密度的组合物并且大大降低了运输成本。鉴于在开发更有效和更强大的微生物接种剂方面有快速发展的前景，消费者将从这种快速递送基于微生物的产品的能力中受益匪浅。

实施例

通过以例示的方式给出的以下实施方式，可以更好地理解本发明及其许多优点。以下实施方式例示了本发明的一些方法、应用、实施方式和变体。不应认为它们是对本发明的限制。可以关于本发明进行许多改变和修改。

实施例1——基于微生物产品的组合物

本文举例说明的是根据本发明某些实施例的用于减少温室气体、提高碳利用率和/或增强碳固存的组合物。本实施例并不意在成为限制。组合物中可包括包含种类其他微生物的制剂，这些微生物会替代或补充本文所举例的那些微生物。

组合物包含微生物接种剂，其包含木霉属。真菌和芽孢杆菌属细菌。在特定实例中，该组合物包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌。更具体地说，解淀粉芽孢杆菌的菌株可以为解淀粉芽孢杆菌亚种绿木霉。

在一个实施例中，该组合物可包含以重量计1至99％的木霉和以重量计99至1％的杆菌。在一些实施例中，木霉与杆菌的细胞数之比为约1:9至约9:1、约1:8至约8:1、约1:7至约7:1，约1:6至约6:1，约1:5至约5:1或约1:4至约4:1。

组合物可包含约1x 10

组合物可与另外的“接种体”材料混合和/或同时施用，以促进组合物中微生物的初始生长。这些可以包括诸如益生元和/或纳米肥料(例如，Aqua-Yield，NanoGro

这种促生长“接种体”材料的一种示例性配方，其包含：

可溶性钾(K2O)(1.0％至2.5％，或约2.0％)

镁(Mg)(0.25％至0.75％，或约0.5％)

硫(S)(2.5％至3.0％，或约2.7％)

硼(B)(0.01％至0.05％，或约0.02％)

铁(Fe)(0.25％至0.75％，或约0.5％)

锰(Mn)(0.25％至0.75％，或约0.5％)

锌(Zn)(0.25％至0.75％，或约0.5％)

腐植酸(8％至12％，或约10％)

昆布提取物(5％至6％，或约6％)

水(70％至85％，或约77％至80％)

微生物接种剂和/或可选的促生长“接种体”材料与灌溉系统水箱中的水混合，并施用于土壤。

在具体实施例中，组合物包含以重量计10.0％的微生物接种剂和以重量计90％的水，其中，该接种剂包含1x 10

实施例2——柑橘树地下生物质(根质量)的增加

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的组合物，每两个月施用三次于生长着桔树和柚子树的土壤中。在处理前后，测量根质量，并与未经处理的对照树(“种植者实践”)进行比较。

如图1A-1B所示，未经处理的对照树和经处理树的须根生物质之间差异显著。

实施例3——柑橘树地上生物质(冠层密度)的增加

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的组合物，每两个月施用三次于生长着桔树和幼龄桔树的土壤中。在处理前后，测量冠层密度，并将增长与未经处理的对照树(“种植者实践”)进行比较。

如图2A-2B所示，当与未经处理的同龄对照树的分级相比时，成熟和幼龄桔树的冠层密度等级都更高。

实施例4——杏树地上生物质(树干测量)的增加

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的组合物，每两个月施用两次于生长着杏树的土壤中。在处理前后，测量树干(直径)，并与未经处理的对照树(“种植者实践”)进行比较。

如图3所示，经处理和未经处理的树的树干的测量结果有显著差异。

实施例5——草皮地下生物质(根质量)的增加

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的组合物，每两个月施用三次于生长着黑麦草草皮和蓝色黑麦草皮的土壤中。在处理前后，测量干根质量，并与未经处理的对照草皮(“种植者实践”)进行比较。

如图4A-4B所示，经处理的黑麦草和未经处理的黑麦草的干根质量在统计学上有显著差异(约35％)，经处理的黑麦草和未经处理的蓝色黑麦的干根质量在统计学上有显著差异(约31％)。

实施例6——草皮的根系生物质和叶绿素等级的提升

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的组合物，每两个月施用三次于生长着草皮草的土壤中。在处理前后，测量干根质量和叶绿素等级(相对绿色度)，并与未经处理的对照草皮(“种植者实践”)进行比较。

如图5A-5B所示，与未经处理的对照草皮相比时，草皮草的干根质量和叶绿素等级都增加了。

实施例7——烟叶叶绿素、叶长和叶宽的增加

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的组合物施用一次于生长着烟草的土壤中。在处理前后，测量平均叶绿素等级(相对绿色度)、叶长和叶宽，并与未经处理的对照烟草(“种植者实践”)进行比较。

如图6A-6B所示，与种植者实践种植的烟草植株相比，经处理的烟草植株的叶绿素含量增加了4％(6A)，叶长增加了16-18％，叶宽增加了7-35％(6B)。

实施例8——烟草根系发育的增强

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的组合物施用两次于移植了烟草植株的土壤中(第一次施用是在移植后立刻进行的，第二次施用是在其后30天进行的)。在处理前后，测量根的平均湿重和平均大小(长度和宽度)，并与未经处理的对照烟草植株(“种植者实践”)进行比较。

如图7A-7B所示，与种植者实践种植的烟草植株相比，经处理的烟草植株的须根湿重增加了61％(7A)，并且叶长增加了高达49％，叶宽增加了3％(7B)。

如图8A所示，未经处理的植株(左侧)的湿根质量(8A)和根须密度(8B)明显小于经处理的植株(右侧)。

实施例9——温室气体排放和碳固存取样方案

为确定本发明缓解温室气体排放的能力，以及根据本发明处理土壤固碳和固氮的能力，将采用根据本发明实施例制备的组合物处理的农业土壤与采用种植者实践的对照土壤以及原生未开垦的土壤进行比较。

在柑橘林中进行该工作，柑橘林包括用组合物处理约1年的成熟和幼龄的佛罗里达柑橘树；以及用该组合物处理约6个月的加利福尼亚鲜食葡萄。确定取样位置，比较经处理土壤和采用种植者实践的土壤。在相同条件下，对对照组和处理组的位置进行监测，使用土壤改良剂对处理组的位置进行处理，该土壤改良剂包含实施例1中制备的组合物。

对每种作物类型进行采样的所有位置都是在相邻地块中，这样限制了土壤类型、地理情况和作物类型之间的可变性。此外，还测试了与经处理土壤和对照组土壤相邻的原生土壤，以确定未采进行农业实践的原生土壤的背景排放量。

通量测量(CO2、N2O、CH4)

采用配有Li-Cor 8100-103 20-cm测量腔的Gasmet DX-4040便携式FTIR(傅里叶变换红外)多气体分析仪，测量土壤的CO

土壤样品

使用7/8x 21英寸土壤样品探头采集土壤样品。在每个位置，在通量测量土壤套环周围都测量出半径约为2英尺的圆，并沿着圆的圆周以彼此大致相等的距离采集12个土壤样品。

每个单独的土壤样品都采集至6英寸的深度。将其中10个样品收集到棕色纸袋中，并聚集在一起，以便在每个位置都会形成均匀样品。分析这些样品的有机碳、总氮、高锰酸盐可氧化碳、pH值和三天微生物呼吸。将另外两个土壤样品放在单独的塑料袋中，并分析其体积密度。

土壤样品

使用POGO土壤水分传感器测量每个采样位置的土壤温度、含水量和土壤的体积电导率。

结果

从4个地点采集了样品：佛罗里达州的三个柑橘园和加利福尼亚州的一个鲜食葡萄园。在这些采样点，经处理的土壤中，柑橘的土壤有机碳的增加高达4.38公吨CO

温室气体排放

在其中一个柑橘地点，我们观测到减少了2.53公吨CO

实施例10——2个佛罗里达柑橘园的土壤碳测量

小树林1

在10个月的成长期后，测量了4个柑橘园(包含成熟的桔树)的堆积密度和总有机碳水平。根据标准种植者实践(对照组)种植了一块地。采用根据本发明实施例的组合物处理其他三块地，如下面的表1所示。

在施用组合物之前，对每个地块进行15分钟的灌溉。将组合物混合到注射装置中并泵入灌溉系统，然后在施用后直接冲洗30分钟。

对地块进行取样并分析，结果见下表2和表3。

小树林2

在10个月的成长期后，测量了4个柑橘园(包含成熟的桔树)的堆积密度和总有机碳水平。根据标准种植者实践(对照组)种植了2块地。采用根据本发明实施例的组合物处理其他2块地，如下面的表4所示。

在施用组合物之前，对每个地块进行15分钟的灌溉。将组合物混合到注射装置中并泵入灌溉系统，然后在施用后直接冲洗30分钟。

对地块进行取样并分析。结果见下面的表5和表6。

实施例11——土壤碳数据——多种作物

在3个不同的州，从种植各种作物的经处理地块和对照组地块采集表层土壤样品。具体来说，这些作物包括加利福尼亚州3个不同农场的杏、樱桃和葡萄，以及亚利桑那州、加利福尼亚州和北卡罗来纳州的草皮农场。

对土壤样品进行了堆积密度和总有机碳(TOC)分析，以确定在不足单一生长季的时间内采用组合物处理的地块的土壤是否比种植相同作物的相邻对照地块的有机碳储量更大。数据表明，经处理的土壤的有机碳含量高于对照组的土壤。

将根据本发明的包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的组合物与水混合，并通过在每种作物的底部配有微喷头的灌溉系统或滴灌进行分配。对于草皮，使用喷雾杆，然后进行高架灌溉。

并排比较种植相同作物状况和采取相同耕种实践的经处理地块与相邻、未经处理地块。在施用2-3种处理后，从经处理地块和相邻、未经处理地块内的多个位置采集表层土壤样品(即顶部的6或12英寸)。对土壤样品进行总有机碳(TOC)和堆积密度分析，量化土壤的总碳含量(例如，每英亩)。

分析总有机碳的土壤样品由10个单独的土壤样品组成，每个样品都是在直径约5英尺的圆圈内采集的。将从同一采样区域内采集的两个另外的土壤样品混合得到堆积密度样品。

在施用处理的第一个生长季节采集所有的样品。在采集土壤样品之前，所有地块都采用组合物处理了2-3次，自第一次处理后的总时间约为3-11个月。从每个地块采集3-5个重复的表层土壤样品，(参见下面的表7)。

对土壤样品进行总有机碳百分比分析(以干重计)和堆积密度分析(例如，每立方厘米干燥土壤的克数)。将总有机碳含量乘以堆积密度，计算出每个地块内的总碳储存量，从而量化给定区域(如英亩)土壤样品取样深度(6英寸或12英寸)范围内的碳的质量。碳的质量除以二氧化碳的重量分数，即可将其转换为二氧化碳当量，即碳(27.7％)。

对有机碳结果和碳储存数据进行评估，评估使用组合物处理的地块是否具有较高水平的有机碳含量。

图9示出了未经处理的对照组地块中和经处理的地块中土壤的原始堆积密度结果。组合物不一定会对土壤的堆积密度产生显著影响，这些数据表明对照组地块和经处理的地块的土壤特性相似。在6块地中的5块中，对照组地块的堆积密度与经处理的地块相同。

除北卡罗来纳州的草皮农场(图10)外，所有评估地块的土壤总有机碳均低于1％，北卡罗来纳州的草皮农场的土壤总有机碳处于高于3％至低于1％的范围内。经处理地块的土壤总有机碳倾向高于对照组地块，有两组相反结果。

将堆积密度结果与总有机碳结果结合，计算土壤中的总碳储存量，作为二氧化碳当量(图11)。与总有机碳结果一致的是，无论地点或作物类型如何，经处理地块的土壤有机质中的碳储存量均较高。平均而言，采用组合物处理2-3次后，经处理地块的碳储储存高于相邻对照组地块(见下表8)。平均结果表明，尽管总有机碳和堆积密度存在一定变化，但所有农场中经处理土壤的碳储存量均高于对照组土壤。

实施例12——加利福尼亚州草皮的土壤碳测量

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的根据本发明实施例的组合物与NanoGro

一旦土壤温度上升到55°F以上，组合物与NanoGro

对地块进行取样并分析，结果见下表10。

实施例13——加利福尼亚州杏的土壤碳测量

将包含哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌的根据本发明实施例的组合物通过标准灌溉系统施用于其中生长着杏树的土壤中：根据下表11进行总共3次处理。

对20英亩的杏树地块进行处理和取样，并对20英亩的未经处理的杏树地块进行了取样作为对照。下面的表12和表13给出了结果。

实施例14——土壤中一氧化二氮排放的减少——马铃薯

马铃薯田中，测试根据本发明实施例的组合物(见下表14)降低肥料需求(例如，氮磷钾使用)的能力。减少氮磷钾的使用将直接帮助减少土壤盐分、营养物质流失和土壤中一氧化二氮的排放。

将采用种植者实践耕种的地块与采用本发明处理组合物的各种实施例进行比较(表14)。在两个月的时间中，(约)每两周进行4次处理。一氧化二氮土壤排放量减少了60％。图12.

还将采用本发明组合物处理的地块与不使用肥料的地块进行比较。这对于未施肥作物/再生农业尤其重要，例如，在重新造林和牧场开垦方面。结果表明，未经处理的地块起到一氧化二氮汇的作用，而经处理的地块会固存更大量的一氧化二氮(高出20％)。

参考文献

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