一种Serpine2基因小鼠模型构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种Serpine2基因小鼠模型构建方法与应用，属于生物技术领域。一种Serpine2基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：培养初代OC细胞；通过siRNA敲减所述OC细胞中的Serpine2基因；取新生Lgr5‑EGFP小鼠耳蜗，放入培养液中培养，并消化成单细胞；从含有Lgr5‑EGFP细胞的单细胞悬液中分选出Lgr5+细胞；用所述siRNA敲除Lgr5+细胞中的Serpine2基因；培养Serpine2基因敲减的Lgr5+细胞，扫描电子显微镜观察并记录成球细胞的数量和直径；培养第一代所述成球细胞，用EdU染色以及DAPI、Myo7a抗体标记染色，观察毛细胞分化的情况。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Serpine2基因小鼠模型构建方法与应用。

背景技术

听力残疾是个全球性的医学问题，此类患者占全球人口的7％-10％。听力下降随着年龄的老化而增多，我国老年性耳聋患者已经超过5000万人，并随着人口老龄化而日益增多。

感音性神经耳聋时内耳、耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变导致的听力下降的统称。据相关统计数据显示，我国绝大多数听力障碍患者均为感音性耳聋。感音性耳聋常见的病因多为耳蜗和耳蜗后等部位出现病变。耳蜗毛细胞的修复已成为重要的研究课题，相应地，提供一种非人动物模型作为该课题的研究平台，也同样具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了一种Foxg1和Serpine2基因小鼠构建方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种Serpine2基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：

培养初代OC细胞；

通过siRNA敲减所述OC细胞中的Serpine2基因；

取新生Lgr5-EGFP小鼠耳蜗，放入培养液中培养，并消化成单细胞；从含有Lgr5-EGFP细胞的单细胞悬液中分选出Lgr5+细胞；用所述siRNA敲除Lgr5+细胞中的Serpine2基因；

培养Serpine2基因敲减的Lgr5+细胞，扫描电子显微镜观察并记录成球细胞的数量和直径；

培养第一代所述成球细胞，用EdU染色以及DAPI、Myo7a抗体标记染色，观察毛细胞分化的情况。

可选地，所述培养液中含有DMEM/F12、B27、N2、IGF、EGF、b-FGF、肝素与氨苄青霉素。

可选地，通过流式细胞分选法分选出Lgr5+细胞。

可选地，通过RT-qPCR技术检测所述初代OC细胞中的Serpine2基因的敲减效率。

可选地，采用N1301、N885、N1082三种不同的siRNA敲减所述OC细胞中的Serpine2基因。

采用上述小鼠模型构建方法在研究毛细胞再生中的应用。

本发明的有益效果：

对Lgr5+内耳干细胞的分离培养，用siRNA对Lgr5+内耳干细胞中Serpine2基因敲减，通过成球统计、EdU染色Lgr5+内耳干细胞细胞增殖情况，通过Myo7a统计再生毛细胞数量，发现敲低Serpine2对Lgr5+内耳干细胞的增殖有抑制作用，但是对其分化无影响。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本申请的siRNA在OC-1细胞中对Serpine2基因的敲减效率；

图2为本申请的Serpine2基因敲减对Lgr5+细胞增殖的作用；

图3为本申请的Serpine2基因敲减对Lgr5+细胞再生毛细胞的作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1-3所示，本发明提出了一种Serpine2基因小鼠模型构建方法，具体地可以包括以下步骤：

1.OC-1细胞培养

将小玻片放入24孔皿中，加1mL ddH2O或PBS，吹洗，3遍。紫外照射半小时后进行种细胞。DMEM基本培养基：DMEM 45mL、FBS 5mL、Amp 50μL，细胞量为200μL/大皿，画“8”字或“十”字分散细胞。

2.siRNA敲除Serpine2基因

采用N1301、N885、N1082三种不同的siRNA敲减OC-1细胞中的Serpine2基因。细胞经三次传代后提取RNA，采用RT-qPCR技术检测OC-1细胞中Serpine2基因的敲减效率，并与未敲减的对照组作比较。如图1所示，在OC-1细胞中，用S2-315、S2-1106、S2-1243三种siRNA敲低Serpine2的结果如上图，与对照组(N.C.)相对比，三种敲低细胞的相关RNA表达量均有所降低，其中用S2-1243敲低效果最好。

3.Lgr5+祖细胞的分离培养及Serpine2基因敲除

取新生Lgr5-EGFP小鼠耳蜗放入装有50μL 1×PBS的1.5mL EP管中，用50μL0.25％胰酶-EDTA在37℃下培养8-12min后消化成单细胞。采用流式细胞分选技术从含有Lgr5-EGFP细胞的单细胞悬液中分选出Lgr5+细胞，在细胞培养皿中培养。用在OC-1细胞中敲除效率最佳的siRNA敲除Lgr5+细胞中的Serpine2基因。如图2所示，从电镜图和统计图可以看出，在Lgr5阳性细胞中，与对照组(N.C.)相比，Serpine2敲低的细胞增殖数量下降，而细胞大小的变化无统计学意义。

4.Serpine2基因敲除对Lgr5+祖细胞增殖/分化的影响

将Serpine2基因敲减的Lgr5+细胞接种在96孔皿上以2个/μl的密度培养5天，其中培养液含DMEM/F12、2％B27、1％N2、IGF、EGF、b-FGF、肝素、0.1％的氨苄青霉素。扫描电子显微镜观察并量化球形的数量和直径来评估Lgr5+细胞的增殖能力。

将第一代成球细胞接种在层粘连蛋白覆盖的4孔皿上培养10天，其培养液含DMEM/F12、2％B27、1％N2、0.1％的氨苄青霉素。10天后，用EdU染色以及DAPI、Myo7a(毛细胞标志物)相关抗体标记染色并结合细胞免疫荧光研究Serpine2基因敲减对Lgr5+细胞向毛细胞分化的调控。

如图3所示从免疫荧光染色图和统计图，可以看出，在Lgr5阳性细胞中，与对照组(N.C.)相比，Serpine2敲低细胞在Myo7a+、EdU+、Myo7a/EdU+染色时的细胞数量变化均无统计学意义。并且，在内耳毛细胞、外耳毛细胞与总毛细胞中，与对照组(N.C.)相比，Serpine2敲低细胞的数量变化也均无统计学意义。这说明，Serpine2敲低不会影响Lgr5+细胞的分化。

由上述分析可得，通过对Lgr5+内耳干细胞的分离培养，用siRNA对Lgr5+内耳干细胞中Serpine2基因敲减，通过成球统计、EdU染色Lgr5+内耳干细胞细胞增殖情况，通过Myo7a统计再生毛细胞数量，发现敲低Serpine2对Lgr5+内耳干细胞的增殖有抑制作用，但是对其分化无影响。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。