免疫组化的免疫酶标方法以及用于免疫酶标方法的试剂盒

摘要

本发明公开了一种免疫组化的免疫酶标方法，主要包括，石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水、阻断、抗原修复、封闭、加入一抗、加入二抗以及加入SP、显色复染等步骤。该方法操作简易化，且通过镜检可以准确控制颜色，以免过染，确保染色效果。各个溶液的制备方法简单，且剂量适合，使用方便，避免造成浪费。还包括用于免疫酶标方法的试剂盒，包括内源性过氧化酶阻断剂、高效封闭液、生物素标记的羊抗鼠IgG和链霉菌抗生物素蛋白‑过氧化酶。该试剂盒中包括上述免疫酶标方法所需的溶剂，各个溶剂采用滴瓶分瓶包装，使用方便。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及免疫组化的免疫酶标方法以及用于免疫酶标方法的试剂盒。

背景技术

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组化对于肿瘤病理诊断和基础形态学研究具有重要功能意义。此种方法用于检测细胞内或细胞间正常或异常产物，进行蛋白成分定位，探讨发病机制，确定某些肿瘤组织发生及类型，筛选具有临床潜力的标志物。

免疫组化技术包括两个方面，一、识别系统，即特异性抗体识别组织或细胞中抗原；二、显示系统，即抗原抗体特异性结合通过显微镜显示出来，变为形态学上肉眼可见的反应。免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。其中，免疫酶法是免疫组织化学研究中最常用的技术，基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。

然而，目前的免疫组化的方法中操作复杂，染色效果极不稳定，各个染液或溶液的制备方法也极为复杂，制作成本高昂，且剂量配备不合理，在使用过程中会遇见剂量不足或过多的情况，造成使用的不方便。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种免疫组化的免疫酶标方法，包括如下步骤：

将石蜡切片，并放置于60℃的烘箱中烘烤1h；

将烘烤过的所述切片置于二甲苯中进行脱蜡，重复3次，每次5min；

将脱蜡完成的所述切片依次放入无水乙醇中1min、95％乙醇中30s、75％乙醇中30s，自来水中浸洗1-2min，再用PBS冲洗3次，每次3min；

将脱水后的所述切片浸于0.01M柠檬酸盐缓冲液中,微波修复5min，自然冷却至室温，再更换柠檬酸盐缓冲液，微波修复5min；

将抗原修复完成后的所述切片置于阻断剂中，室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min；

将所述切片平铺于湿盒中，滴加100ul封闭液，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min，并且用免疫组化笔在所述切片上组织外3-5mm处画一个防水圈，防止液体流干；

将所述切片平铺于湿盒中，滴加50-100ul一抗，于四度冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加50-100ul生物素标记的二抗，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加50-100ul亲和素标记的HRP，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加100ulDAB显色液，显色5-10min，期间在镜下观察，组织出现阳性即可在自来水中终止反应；

在所述切片中加入苏木素复染30s，水洗返蓝。

将返蓝完成后的所述切片依次置于75％乙醇1min、95％乙醇1min、无水乙醇1min、二甲苯2次，每次1min；

将酒精脱水后的所述切片用中性树胶封片，自然晾干。

进一步地，所述阻断剂为0.3％过氧化氢的甲醇溶液。

进一步地，所述一抗为CD276抗体，并且所述CD276抗体经过稀释，抗体稀释比例1:200。

进一步地，所述生物素标记的二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG。

进一步地，所述亲和素标记的HRP为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶。

进一步地，所述阻断剂为内源性过氧化酶阻断剂，所述内源性过氧化酶阻断剂的制备方法包括：将150μl的30％过氧化氢，缓慢加入到15ml的无水甲醇溶液中，并充分混匀。

进一步地，还包括所述封闭液的制备方法，包括：将600mg的牛血清蛋白，加入到14.8ml的磷酸盐缓冲液，充分溶解后加入200μl的30％的Triton。

进一步地，所述生物素标记的羊抗鼠IgG的制备方法包括：将150mg牛血清蛋白，加入到14.8ml的磷酸盐缓冲液中，再加入200μl的30％的Triton，以及1μl的储存液。

进一步地，所述链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶的制备方法包括：储存液，将0.2mg链霉亲和素与0.8mg辣根过氧化物酶交联，融入1ml去离子水中；将75μl储存液加入到15ml的磷酸盐缓冲液中。

进一步地，本发明还包括一种用于免疫酶标方法的试剂盒，包括：

内源性过氧化酶阻断剂，包括：150μl的30％过氧化氢和15ml的无水甲醇溶液；

高效封闭液，包括：600mg的牛血清蛋白、14.8ml的磷酸盐缓冲液，以及200μl的30％的Triton；

生物素标记的羊抗鼠IgG，包括：150mg牛血清蛋白、14.8ml的磷酸盐缓冲液、200μl的30％的Triton和1μl的储存液；

链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，包括：75μl储存液，以及15ml的磷酸盐缓冲液，其中储存液由0.2mg链霉亲和素、0.8mg辣根过氧化物酶交联，融入1ml去离子水中形成。

本发明的有益效果如下：

本发明中的免疫组化的免疫酶标方法，操作简易化，且通过镜检可以准确控制颜色，以免过染，确保染色效果。各个溶液的制备方法简单，且剂量适合，使用方便，避免造成浪费。

本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒中包括上述免疫酶标方法所需的溶剂，各个溶剂采用滴瓶分瓶包装，使用方便。

为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例涉及一种免疫组化的免疫酶标方法，包括如下步骤：

将石蜡空白切片，并放置于60℃的烘箱中烘烤1h；

将烘烤过的所述切片置于二甲苯中进行脱蜡，重复3次，每次5min；

将脱蜡完成的所述切片依次放入无水乙醇中1min、95％乙醇中30s、75％乙醇中30s，自来水中浸洗1-2min，再用PBS冲洗3次，每次3min；

将脱水后的所述切片浸于0.01M柠檬酸盐缓冲液中,微波修复5min，自然冷却至室温，再更换柠檬酸盐缓冲液，微波修复5min；

将抗原修复完成后的所述切片置于阻断剂中，室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min；

将所述切片平铺于湿盒中，滴加100ul封闭液，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min，并且用免疫组化笔在所述切片上组织外3-5mm处画一个防水圈，防止液体流干；

将所述切片平铺于湿盒中，滴加50-100ul一抗，于四度冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加50-100ul生物素标记的二抗，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加50-100ul亲和素标记的HRP，室温孵育15-20min，PBS冲洗3次，每次3min；

在所述切片中滴加100ulDAB显色液，显色5-10min，期间在镜下观察，组织出现阳性即可在自来水中终止反应；

在所述切片中加入苏木素复染30s，水洗返蓝。

将返蓝完成后的所述切片依次置于75％乙醇1min、95％乙醇1min、无水乙醇1min、二甲苯2次，每次1min；

将酒精脱水后的所述切片用中性树胶封片，自然晾干。

采用本实施例中的免疫酶标方法，染色后的石蜡切片，其蛋白呈棕色或棕黄色。

其中，该免疫酶标方法中的PBS为0.01M磷酸盐缓冲液(PH7.4)。

该免疫酶标方法中的阻断剂为0.3％过氧化氢的甲醇溶液。该阻断剂作为内源性过氧化酶阻断剂，其制备方法包括：将150μl的30％过氧化氢，缓慢加入到15ml的无水甲醇溶液中，并充分混匀。

该免疫酶标方法中的封闭液为高效封闭液，其制备方法包括：将600mg的牛血清蛋白，加入到14.8ml的磷酸盐缓冲液，充分溶解后加入200μl的30％的Triton。

该免疫酶标方法中的一抗为CD276抗体，并且CD276抗体经过稀释，抗体稀释比例1:200。

该免疫酶标方法中的生物素标记的二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG。生物素标记的羊抗鼠IgG的制备方法包括：将150mg牛血清蛋白，加入到14.8ml的磷酸盐缓冲液中，再加入200μl的30％的Triton，以及1μl的储存液。

该免疫酶标方法中的亲和素标记的HRP为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶的制备方法包括：将0.2mg链霉亲和素与0.8mg辣根过氧化物酶交联，融入1ml去离子水中形成储存液；将75μl储存液加入到15ml的磷酸盐缓冲液中。

该免疫组化的免疫酶标方法，操作简易化，且通过镜检可以准确控制颜色，以免过染，确保染色效果。各个溶液的制备方法简单，且剂量适合，使用方便，避免造成浪费。

本发明还包括一种用于免疫酶标方法的试剂盒，包括：

内源性过氧化酶阻断剂，包括：150μl的30％过氧化氢和15ml的无水甲醇溶液；

高效封闭液，包括：600mg的牛血清蛋白、14.8ml的磷酸盐缓冲液，以及200μl的30％的Triton；

生物素标记的羊抗鼠IgG，包括：150mg牛血清蛋白、14.8ml的磷酸盐缓冲液、200μl的30％的Triton和1μl的储存液；

链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，包括：75μl储存液，以及15ml的磷酸盐缓冲液，其中储存液由0.2mg链霉亲和素、0.8mg辣根过氧化物酶交联，融入1ml去离子水中形成。

其中，该试剂盒内的内源性过氧化酶阻断剂、高效封闭液、生物素标记的羊抗鼠IgG和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶分别采用一个滴瓶包装，每个滴瓶内装有15ml液体。

该试剂盒中包括免疫酶标方法所需的溶剂，各个溶剂采用滴瓶分瓶包装，使用方便。

本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。