胶体金侧流层析法快速检测蓖麻毒素的方法及胶体金侧流层析试剂盒

摘要

本发明属于毒素检测领域，涉及胶体金侧流层析法快速检测蓖麻毒素的方法及胶体金侧流层析试纸和试剂盒。该方法包括以下步骤：(1)将H1‑AuNPs‑FAM抗体、FAM抗体‑AuNPs与含有蓖麻毒素的待测样品孵育；H1的序列如SEQ ID NO：1所示；AuNPs的颗粒尺寸为2‑10nm；(2)将步骤(1)孵育所得混合液滴加至侧流层析试纸上；所述侧流层析试纸包括样品垫、检测区、吸收垫和带塑料背卡NC膜；所述检测区包括T线结合区、C线结合区；所述T线结合区设置有检测线，所述C线结合区设置有控制线；(3)根据检测线和控制线上金纳米粒子的显色值判读检测结果。本发明建立了检测蓖麻毒素的胶体金侧流层析方法，该方法无需制备相应抗体，且操作简单，可满足现场检测的需求。

说明书

技术领域

本发明属于毒素检测领域，具体地，涉及一种胶体金侧流层析法快速检测蓖麻毒素的方法，以及一种快速检测蓖麻毒素的胶体金侧流层析试剂盒。

背景技术

蓖麻，拉丁学名Ricinus communis L.，原产于非洲东北部的索马里和肯尼亚，在全球热带地区均有广泛分布。蓖麻植株的茎、叶或蓖麻籽实中含有有毒物质，主要包括蓖麻毒素、蓖麻碱、蓖麻反应原等。蓖麻毒素(RT) 经化学提纯后能够溶于弱酸或水中，且理化性质较为稳定。从化学结构而言，蓖麻毒素是由A、B两条肽链所组成的高毒性植物蛋白。活性蓖麻毒蛋白通过B链介导内吞作用进入真核细胞，随后A链从28S rRNA中纯化出特定的腺嘌呤，从而诱导蛋白质合成失败，并最终激活细胞死亡途径。

蓖麻毒素作为剧毒蛋白质，其毒性高于氰化物6000倍。蓖麻毒蛋白由于其强毒性和易获得性，不但吸引科研人员的兴趣，同时也成为恐怖分子的利器，著名的马尔科夫毒伞案就是例子。开发灵敏、高效的检测手段是应对威胁的主要措施。传统的检测技术主要有放射免疫技术、酶联免疫吸附技术(ELISA)、高效液相色谱、免疫PCR、胶体金标记技术等。但这些检测方法需要依托昂贵仪器及专业技术人员进行，不利于在现场使用，限制其进一步应用和推广。

胶体金免疫层析法(colloidal gold immune-chromatographic assay， GICA)是20世纪末研发的一种利用胶体金纳米粒子作为显色元件，与免疫识别技术和层析技术相结合的一种现场、快速检测方法。其基本原理是利用抗原抗体的特异性识别结合，导致胶体金在侧向层析试纸条上出现颜色变化。利用侧向层析试纸条技术，已经实现了快速测定水中汞离子、以及通过信号放大实现超敏检测水产品中甲霜磷等。

蓖麻毒素毒性强、易获得，是潜在的生物恐怖战剂，因此，亟待建立快速检测蓖麻毒素的方法，以保障国家公共安全。

发明内容

本发明的目的是提供胶体金侧流层析法快速检测蓖麻毒素的方法及胶体金侧流层析试剂盒。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种胶体金侧流层析法快速检测蓖麻毒素的方法，包括以下步骤：

(1)将H1-AuNPs-FAM抗体与含有蓖麻毒素的待测样品孵育；H1的序列如SEQ IDNO：1所示；AuNPs的颗粒尺寸为2-10nm；

5’-FAM-GAC CTA CTT ATG AAA AAA AAA AAA TTA TAT CTA TCT- Biotin-3’(SEQID NO：1)

(2)将步骤(1)孵育所得混合液滴加至侧流层析试纸上；所述侧流层析试纸包括样品垫、检测区、吸收垫和带塑料背卡NC膜；所述检测区包括T线结合区、C线结合区；所述T线结合区设置有检测线，所述C线结合区设置有控制线；链霉亲和素和抗FAM抗体的二抗分别固定在所述检测线和控制线上；

(3)根据检测线和控制线上金纳米粒子的显色值判读检测结果。

根据本发明，H1-AuNPs-FAM抗体可由H1与AuNPs-FAM抗体孵育获得。

本发明中的所述侧流层析试纸可商购获得，也可自制得到。

根据本发明，步骤(3)中判读检测结果的方式既可以为肉眼观察，也可以为仪器成像，例如Image J成像。肉眼观察通常为定性判断，仪器成像通常为定量测试。

根据本发明，优选地，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照步骤 (1)、(2)的方法，检测一系列已知浓度的含有蓖麻毒素的待测样品，测得多个显色值，分别以浓度和显色值作为横纵坐标作图，得到标准曲线。此时，可基于标准曲线，计算含有蓖麻毒素的待测样品中蓖麻毒素的浓度。

本发明蓖麻毒素侧流层析试纸的检测原理如图1所示。它包括两个步骤：(1)H1-AuNPs-FAM抗体与蓖麻毒素孵育；(2)用侧流层析(lateral flow assay，LFA)试纸检测，进行结果判读。本发明以蓖麻毒素为目标物，根据活性蓖麻毒蛋白A链可以纯化腺嘌呤、使得含有腺嘌呤的寡核苷酸序列断裂的原理，设计含有连续腺嘌呤的寡核苷酸序列H1，如图1所示，当目标物蓖麻毒素存在时，会切割H1序列上的连续多个腺嘌呤，导致H1序列断裂。对于LFA条，如图1所示，它包括四个部分：样品垫、检测区(C 线结合区、T线结合区)、吸收垫和带塑料背卡NC膜。链霉亲和素和抗FAM 抗体的二抗分别固定在NC膜的检测线和控制线上。AuNPs表面修饰有FAM 抗体，当不存在目标物时，H1序列和FAM抗体-AuNPs的混合液滴加到样品垫上后，混合液在毛细管力的作用下向吸收垫迁移，标记了生物素和FAM 的H1将与修饰FAM抗体的金纳米颗粒特异性结合，形成复合物。当这些复合物通过检测线时，会被固定在检测线上的链霉亲和素捕获，在检测线上产生明显可见信号。过量的复合物继续在NC膜上迁移，并被固定在控制线上的抗FAM抗体的二抗捕获，从而显色。如果样品中存在蓖麻毒素，进行混合孵育后，H1序列会出现断裂和溶解，则检测线上三明治结构减少或消失，检测线颜色变浅或消失。简而言之，在目标物蓖麻毒素不存在的情况下，观察到两条红线(“on开启”)为阴性结果。随着目标物浓度的增加，检测线颜色逐渐变浅，当浓度达到一定程度时，仅在控制线上只观察到一条红线(“off关闭”)，作为阳性结果，控制线上的红色用于证明LFA试纸正常工作。

本发明的第二方面提供一种快速检测蓖麻毒素的胶体金侧流层析试剂盒，包括以下组分：

(1)胶体金侧流层析试纸；该试纸包括：样品垫、检测区、吸收垫和带塑料背卡NC膜；所述检测区包括T线结合区、C线结合区；所述T线结合区设置有检测线，所述C线结合区设置有控制线；链霉亲和素和抗FAM 抗体的二抗分别固定在所述检测线和控制线上；

(2)FAM抗体-AuNPs；其中AuNPs的颗粒尺寸为2-10nm；

(3)H1核酸链；H1的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的试剂盒中，FAM抗体-AuNPs和H1链可以分别提供，也可以以H1-AuNPs-FAM抗体的形式提供。

本发明基于胶体金免疫层析方法，根据蓖麻毒素A链可以纯化出腺嘌呤，使得含有腺嘌呤的寡核苷酸序列断裂的原理，设计了生物素和FAM共同修饰的寡核苷酸序列H1为识别探针，开发了以修饰FAM和生物素的H1 序列为识别元件的胶体金侧流层析试纸条，建立了一种快速半定量检测蓖麻毒素的方法，实现了蓖麻毒素的可视化半定量检测，并考察了检测方法的灵敏度和特异性。本发明的蓖麻毒素胶体金侧流层析试纸条最低检测值低于10ng/mL，可以满足检测需要。本发明的检测方法操作简单，无需大型仪器设备，可满足现场检测的需求。此外，本发明采用寡核苷酸链作为识别元件，无需制备蓖麻毒素抗体，降低了成本。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为本发明胶体金侧流试纸条定性检测蓖麻毒素的流程和原理示意图。

图2示出了寡核苷酸序列筛选结果，其中，a为聚丙烯酰胺凝胶电泳图， b为寡核苷酸序列荧光光谱图，其中，Lane1：P1；Lane2：P2；Lane3：P3；Lane4：P3+RT；Lane5：A2；Lane6：A2+RT；Lane7：H1；Lane8：H2+RT。

图3示出了H1序列浓度优化结果，其中，1～5依次代表H1的浓度为： 100nM、50nM、25nM、10nM和1nM。

图4示出了蓖麻毒素与H1-AuNPs-FAM抗体混合孵育时间优化结果，其中，1～4依次为加入1μg/mL蓖麻毒素孵育30min、60min、90min、120min。

图5示出了蓖麻毒素胶体金侧流层析试纸条的目测灵敏度。其中，1～5 依次为蓖麻毒素100ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、10ng/mL和1ng/mL；6：空白对照。

图6示出了相对强度与蓖麻毒素对数浓度之间的线性关系。

图7为蓖麻毒素胶体金侧流层析试纸条特异性检测结果，其中，1：蓖麻毒素；2：相思子毒素；3：SEB；4：BSA；5：OVA；6：FB

图8为20nm AuNPs-FAM抗体TEM表征结果图。

图9示出了H1-AuNPs-FAM(20nm)检测蓖麻毒素结果。a：5μL 25pM H1检测蓖麻毒素，1～3依次为蓖麻毒素10μg/mL、500ng/mL和10ng/mL； 4为空白对照；b：5μL 25pM H1检测蓖麻毒素，1～3依次为蓖麻毒素 10μg/mL、100ng/mL和10ng/mL；4为空白对照。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

LX-200掌式离心机、ST70-2微孔恒温振荡器、OSE-DB-02制冷型五段程控金属浴、恒温孵育仪、蓖麻毒素标准品(北京翰谱医药生物研究所)、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)(自制)、伏马毒素标准品(山东蓝都生物科技有限公司)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)(Sigma-Aldrich)、相思子毒素凝集素(军事医学研究院毒物药物研究所，北京)、胶体金侧流层析试纸条(

表1 寡核苷酸序列

本发明以蓖麻毒素为目标物，设计了含有连续腺嘌呤的寡核苷酸P3序列、修饰生物素P1序列、修饰FAM的P2序列，使用NUPACK软件拟合优化分析；设计了修饰生物素的A1序列和修饰FAM的A2序列；设计了同时修饰生物素和FAM的H1序列，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验和SYBR Green1荧光实验对DNA序列进行筛选。

表1中列出了设计的含有连续A的寡核苷酸序列，其中，P1、P2序列分别与P3序列的两端互补配对，由此形成P1-P3-P2复合物，P1的5’端修饰有生物素，P2的3’端修饰有FAM，因此该复合物可被检测线上的链霉亲和素捕获而显色。A1序列可与A2序列互补配对，A1的3’端修饰有生物素， A2的3’端修饰有FAM，它们也可以被检测线上的链霉亲和素捕获而显色。根据上述设计的序列，在相同体积和浓度下，分别向不同寡核苷酸序列中加入相同浓度的蓖麻毒素，用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征毒素对寡核苷酸序列切割溶解能力。利用SYBRGreen 1只染色双链DNA的原理，考察序列互补配对情况，最终筛选出合适的寡核苷酸序列。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征目标物对寡核苷酸序列切割溶解能力。如图2的a所示，在相同体积和浓度下，分别向不同寡核苷酸序列中加入相同浓度的目标物，加入目标物后出现弥散条带，且亮度明显降低。说明目标物可以切割溶解含有连续腺嘌呤的寡核苷酸序列。后续采用P1-P3-P2复合物体系进行检测时，检出限过高，因此未使用该体系。利用SYBR Green 1只染色双链DNA的原理，将A1和A2序列混合孵育后用SYBR Green 1 染色，荧光结果(图2的b)显示，A1和A2序列混合孵育后会产生A1-A2 结合链及A1、A2自身折叠形成双链结构，从而影响毒素对A2序列的切割能力，干扰检测线颜色变化。因此最终选择H1序列为识别元件。

前期使用20nm修饰FAM抗体的金纳米颗粒(20nm金的透射电镜图见图8)，置于微孔恒温振荡器中与25pM的H1序列进行混合孵育，后加入目标物进行检测，取50μL反应液滴加在试纸条样品区，静止10min观察实验结果。结果如图9所示。从结果中可以看出，对于20nm的金颗粒来讲，即使10μg/mL浓度的毒素，也无法使其颜色变浅。因此，后续改用5nm的金颗粒来进行实验。

将5μL 100nM、50nM、25nM、10nM和1nM的寡核苷酸序列H1置于金属浴中孵育1h(设置4段程：95℃5min，80℃10min，50℃10min， 37℃10min)，向反应管中加入10μL 50ng/mLFAM-AuNPs和85μL Tris-HCl 缓冲液，配制成100μL的反应体系，取50μL反应液滴加在试纸条样品区，静止10min观察实验结果。

同时修饰FAM和生物素的H1序列是侧流条带中的识别元件，它可与固定在试纸条检测线上的链霉亲和素特异性结合，在检测线上形成的三明治结构会产生明显的可见信号。因此，H1序列加入浓度对检测线颜色影响较大。在本发明中，观察加入不同浓度的H1序列(100nM、50nM、25nM、 10nM和1nM)下检测线和控制线颜色变化，结果如图3所示，由图3可知，加入最佳的H1浓度为10nM。

向含有5μL H1-AuNPs-FAM抗体的反应管中分别加入不同浓度的蓖麻毒素标准品，置于微孔恒温振荡器中，在37℃700rpm分别孵育30min、 60min、90min和120min，待反应结束后，取50μL反应液滴加在试纸条样品区，静止10min观察实验结果。

当目标物蓖麻毒素存在时，切割溶解含有腺嘌呤的H1序列，导致H1 序列断裂，检测线颜色变浅或消失。因此，加入目标物与H1序列孵育时间对检测效果影响较大。在本发明中，观察加入相同浓度H1序列和目标物在不同孵育时间(30min、60min、90min和120min)的条件下，检测线和控制线颜色变化，结果如图4所示，由图4可知，加入目标物与H1序列进行混合孵育最佳时间为120min。

将蓖麻毒素用Tris-HCl缓冲液稀释至100ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、 10ng/mL、1ng/mL，每个浓度检测3次。用样本处理液作为阴性对照。取 95μL不同浓度的蓖麻毒素加入5μL H1-AuNPs-FAM抗体混合物进行混合孵育120min，待反应结束后，取50μL反应液滴加在试纸条样品区，静置10min 观察实验结果，用image J软件进行结果分析。

蓖麻毒素用Tris-HCl缓冲液稀释至100ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、 10ng/mL和1ng/mL，用胶体金侧流层析试纸条进行检测。结果如图5所示，直接目测的灵敏度为10ng/mL。

基于上述结果，用image J软件进行分析，以蓖麻毒素浓度的对数 (100ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、10ng/mL、1ng/mL)为横坐标，以各浓度检测的相对强度为纵坐标，相对强度表示检测线和控制线的集成密度比，误差条表示三次测量的标准差。如图6所示，线性方程为y＝-0.1563x+0.9521； R

用制备好的胶体金侧流层析试纸条在相同实验条件下，检测相思子毒素、胎牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、金黄色葡萄球菌肠毒素B、伏马毒素。重复3次，判断试纸条的特异性。

用Tris-HCl缓冲液将卵清蛋白(OVA)、胎牛血清白蛋白(BSA)、相思子毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)、伏马毒素(FB

在线性检测范围内，检测高、中、低3个浓度(100ng/mL、60ng/mL、 20ng/mL)，每个浓度测6次，以拟合曲线计算浓度，以方差(STDEVA) 与平均值(AVERAGE)的比值计算重复率(CV)。结果如表2所示。

表2 蓖麻毒素胶体金侧流层析试纸条的重复性检测

本发明利用修饰生物素和FAM的寡核苷酸序列为识别探针，与标记 FAM抗体的胶体金颗粒结合；在硝酸纤维素膜上包被链霉亲和素作为检测线，包被抗FAM抗体的二抗作为控制线，建立蓖麻毒素裸眼检测方法，评价其特异性和重复性，并利用image J软件进行数据处理分析，绘制检测曲线。胶体金侧流层析试纸条在120min内完成检测，最低可检测到1ng/mL，特异性、重复性良好。本发明建立了检测蓖麻毒素的胶体金侧流层析方法，该方法无需制备相应抗体，且操作简单，可满足现场检测的需求。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所

<120> 胶体金侧流层析法快速检测蓖麻毒素的方法及胶体金侧流层析试剂盒

<130> BJI2002405PY

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacctactta tgaaaaaaaa aaaattatat ctatct 36

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttttttta tatatata 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taacataatt aggtcttttt t 21

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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