将蛋白质和编码所述蛋白质的基因递送至活细胞的脂质体的应用

摘要

本发明提供了应用脂质体治疗癌症的组合物和方法。总的来说，脂质体包含蛋白质和对应所述蛋白质的基因编码的载体。多个脂质体中蛋白质和载体的量足以有效治疗癌细胞。至少一些脂质体可以包含识别并由此靶向表达癌细胞的蛋白质的抗体。

说明书

优先权声明

本申请要求2018年7月24日提交的申请号为62/702482的美国临时申请的优先权。62/702482申请和其他参考的外部材料通过引用整体并入本文。如果通过引用并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反，限定为本文所提供的术语的定义。

技术领域

本发明的领域为通过应用脂质体将蛋白质和蛋白质的基因递送至活细胞中的组合物及方法。

背景技术

以下背景描述包括可能有助于理解本发明的信息。本文提供的任何信息并不认为是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不认为明确或隐含引用的任何出版物为现有技术。

将肽、蛋白质和其他生物技术分子递送至患者涉及重要的制药和生物制药问题。解决这些问题的常见方法之一是使用脂质体作为载体。不幸的是，蛋白质的脂质体递送通常效率低下，并且不能有效地靶向目标细胞。此外，即使蛋白质被递送到细胞，然后被转运到细胞内，也会被细胞质基质中的蛋白酶迅速降解。

也可以通过用基因序列转染细胞，并使细胞表达相应的蛋白质，从而将蛋白质提供给细胞。通过磷酸钙转染可以很容易地传递基因，但是效率通常很低，仅为10％左右。使用病毒可以更高效地传递基因，但是在活人身上使用这种方法存在严重的问题。当然，即使完成了转染，细胞也需要时间来大量的表达相应的蛋白质。

因此，因治疗或其他目的而向细胞提供特定的蛋白质仍然存在困难，尤其是当细胞为活人或活体动物的一部分时。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种通过将外源与内源递送系统组合应用，以将蛋白质递送至活人或活体动物细胞的组合物及方法。使用所述组合应用，外源产生的蛋白质被迅速递送至细胞中，在此期间细胞可以准备内源性表达所述蛋白质的其他拷贝。

在优选的实施方案中，外源性递送应用脂质体完成，所述脂质体包括已经被细菌或酵母菌表达的蛋白质。预期转染细菌或酵母菌的载体包括pCMVA6-AC，所述载体含有强启动子。

同样在优选的实施方案中，应用脂质体递送来实现蛋白质的内源性递送，但是在这种情况下，所述脂质体包含载体，所述载体包含编码所述蛋白质的基因。

包含蛋白质的相同脂质体可以是但不必是包含基因的相同脂质体。无论如何，为了提高脂质体的递送效率，可以在脂质体表面上包括靶标特异性抗体，例如ESK1(可从Creative Biolabs

附图说明

图1为流程图，示出了将蛋白质及其序列递送至活细胞的过程的一个实施方案。

图2示出了含有Smad4基因的pCMV6-AC-GFP标记的克隆载体(可从OraGene

图3示出了蛋白质表达(Smad4)的电泳结果。

图4示出了蛋白质(Smad4)的凋亡效应图。

图5示出了蛋白质(Smad4)的增殖效应图。

具体实施方式

作为医药目的，脂质体已被广泛用于将外源分子导入细胞。然而，在将有效治疗量的这种分子递送至靶细胞方面，仍然存在未解决的问题。本发明通过应用脂质体将蛋白质及其基因序列递送至靶细胞来解决上述问题。

特别关注的是靶向癌细胞，尤其包括乳腺癌细胞和胰腺癌细胞。

图1示出了将蛋白质及其序列递送至活细胞中的优选步骤的流程图。对于蛋白质制备，应用蛋白质序列编码的载体(101)转化细菌或酵母菌(102)。蛋白质在细菌或酵母菌中表达(103)，然后通过常规方法纯化(104)。将纯化的蛋白质与蛋白质序列编码的载体混合(105)，将混合物包封在脂质体中(106)，在洗涤剂存在或不存在的情况下，将脂质体用于活细胞(107)。向细胞中加入洗涤剂以诱导脂质体被细胞内吞的效率。

可以应用任何适宜的载体。优选的载体包括细菌、酵母菌或哺乳动物。细菌和酵母菌载体是在细菌或酵母菌中有效表达蛋白质的载体，其中所述载体编码蛋白质的基因序列。而哺乳动物载体是哺乳动物细胞表达蛋白质所必需的，其中蛋白质的基因序列编码在载体中。此外，所述载体可以含有强启动子(组成型激活)。细菌或酵母菌中表达蛋白质的载体与脂质体中包含的载体可以相同或不同。类似地，也可以设想，将蛋白质和载体封装在不同的脂质体中，而不是将蛋白质和载体与给定的脂质体混合。在后一种情况下，不同的脂质体可以按照方案共同给药或者依次给予，在所述方案中，外源提供的蛋白质存在于靶细胞中，同时，由于靶细胞被载体转染因而所述蛋白质被内源性表达。

在优选的实施方案中，细菌中表达的蛋白质将与脂质体中含有的载体编码的蛋白质相同。这两种组合允许在开始时施用脂质体，由于蛋白质的直接递送而使细胞中含有蛋白质，并且由于蛋白质的转录因子被表达而使蛋白质在随后持续表达。或者，设想这两种蛋白质可以不同。例如，脂质体中包含的载体可以包含转录因子的基因序列，细菌中表达的蛋白质可以是其表达被转录因子诱导的蛋白质。

脂质体可以通过已知的方式施用，包括静脉施用、肌内施用、口服施用、局部施用、经皮施用、经粘膜施用和离子电渗施用。

实验

为了观察这种方法是否足以产生具有生理意义的效果，应用名为Smad4的蛋白质进行实验。Smad4是众所周知的肿瘤抑制蛋白，它诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖。因此，观察肿瘤细胞的凋亡和增殖情况，以确定该方法的有效性。附件中包含其他详细信息。

图2示出了含有Smad4基因(AAM74472)的载体设计。本文所用的载体包含GFP(绿色荧光蛋白)序列，因此可以在荧光下观察检测Smad4的表达。

图3是应用图1的方案绘制的Smad4蛋白在乳腺癌细胞中表达的蛋白质印迹图像。在本实验中，将Smad4蛋白和Smad4基因序列的混合物添加到含有ESK1抗体的脂质体中，并将脂质体靶向乳腺癌细胞。乳腺癌细胞从携带NF639乳腺癌细胞系细胞的转基因小鼠中获得的。裂解细胞，用RT-PCR检测Smad4序列的mRNA表达(中间一列)。左列显示相应的分子量梯状标志，右列显示Smad4蛋白的表达。印迹显示Smad4基因被递送至细胞核，细胞正在产生Smad4蛋白。就其本身而言，图3不排除在没有脂质体转染的情况下产生内源性Smad4的可能性。

图4为乳腺癌细胞凋亡的比较图，(a)应用含有Smad4基因序列的载体的脂质体和(b)应用具有空白(NULL)载体的脂质体的类似细胞。由于Smad4蛋白的存在与细胞凋亡呈正相关，这一数据表明，用含有Smad4序列的载体的脂质体转染的细胞表达的Smad4蛋白明显多于用空白载体转染的细胞。因此，可以得出结论，含有Smad4基因序列载体的脂质体在含有该序列的转染细胞中最有效。

图5为乳腺癌细胞增殖的比较图，(a)应用含有Smad4基因序列的载体的脂质体与(b)应用具有空白(NULL)载体的脂质体的类似细胞。由于Smad4蛋白的存在与增殖呈负相关，这一数据表明，用含有Smad4序列的载体的脂质体转染的细胞表达的Smad4蛋白明显多于使用空白载体转染的细胞。因此，可以得出结论，含有Smad4基因序列载体的脂质体在含有该序列的转染细胞时最有效。

更多的数据将证明脂质体的有效性，脂质体包括外源Smad4和含有Smad4基因序列的载体。

本领域的技术人员应当清楚，在不脱离本文发明构思的前提下，除了已经描述的内容，还可以进行更多的修改。因此，除所附权利要求的范围之外，本发明的主题不应被限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语都尽可能广泛地与上下文一致。特别地，术语“包括”和“包含”应当被解释为以非排他性的方式指代元素、组件或步骤，指示所引用的元素、组件或步骤可以存在、应用或与未明确引用的其他元素、组件或步骤组合。其中说明书权利要求书中涉及从由A、B、C......和N组成的组中选择的至少一种，则该文本应该被解释为仅需要组中的一种，而不是A+N，或者B+N等。