检测肝脏组织中的miR-122的试剂在制备肝硬化筛查试剂盒中的用途

摘要

本发明提供了检测肝脏组织中的miR‑122的试剂在制备肝硬化筛查试剂盒中的用途。本发明首次发现，miR‑122在乙肝肝硬化患者的肝脏组织中的表达水平显著低于健康人群的肝脏组织(P<0.01)。因此，检测肝脏组织中的miR‑122的试剂能够用来制备乙肝肝硬化筛查试剂盒，实现乙肝肝硬化的有效筛查。本发明提供的筛查试剂盒能够快速、高效、准确的对肝硬化(特别是乙肝肝硬化)患者进行筛查和诊断，为肝硬化筛查试剂盒提供了一种新的选择。

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及检测肝脏组织中的 miR-122的试剂在制备肝硬化筛查试剂盒中的用途。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性流行，据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。全球肝硬化患者中，由HBV感染引起的比例为30％，我国肝硬化患者中，由HBV感染引起的比例为60％。

目前肝硬化临床诊断手段主要包括彩色多普勒超声、CT、胃镜、血浆学指标等。但是这些单一技术或指标的临床应用都存在一些局限性和不足，均不能准确、及时诊断肝硬化进展程度。对于由HBV感染所致的肝硬化(简称乙肝肝硬化)，更是缺少简单、高效的诊断方法。

microRNA(miRNA)是一类非编码单链小RNA分子，它可以通过降解靶基因或抑制靶基因翻译来实现转录后的基因沉默，并通过对下游靶基因的调控，在疾病发生、发展中行使着重要的抑癌基因的功能。近年来的研究表明，与HBV感染相关的肝硬化和miRNA密切相关，miRNA可以通过作用于病毒本身或作用于免疫系统从而影响前述疾病进程。研究表明，病毒感染的肝病患者miRNA表达谱和健康人组织的miRNA表达谱有明显不同。研究者们还发现在人类血清/血浆中存在大量稳定的小的核糖核酸分子，即miRNA，这为临床上通过检测血清/血浆中microRNA分子表达量诊断肝硬化奠定了基础。

申请号为CN2009100514930的中国专利申请公开了一种通过检测血浆或血清中hsa-mir-122的含量来早期预测慢性乙肝发展成为肝硬化的试剂盒。该申请公开了肝硬化患者血浆当中hsa-mir-122的含量高于健康人群，约是健康人群的3倍左右。但是，该方法是通过检测血浆或血清中hsa-mir-122的含量来进行肝硬化的早期预测，血浆或血清中hsa-mir-122的含量可能会受到除肝脏以外的其他组织的影响，影响检测准确度。

目前，还未见通过检测肝脏组织中的miR-122水平来筛查肝硬化的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供检测肝脏组织中的miR-122的试剂在制备肝硬化筛查试剂盒中的用途。

miRNA-122，简写作miR-122。

本发明提供了一种检测肝脏组织中的miR-122的试剂在制备肝硬化筛查试剂盒中的用途。

进一步地，所述肝硬化为乙肝肝硬化。

进一步地，所述试剂为PCR试剂、核酸恒温扩增反应试剂、核酸印迹检测试剂、胶体金检测试剂、核酸测序试剂或基因芯片检测试剂。

进一步地，所述PCR试剂为荧光定量PCR试剂。

进一步地，所述PCR试剂中包括对miR-122进行PCR扩增的引物，该引物序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种肝硬化筛查试剂盒，它包括用于检测肝脏组织中的miR-122的试剂。

进一步地，所述试剂为PCR试剂、核酸恒温扩增反应试剂、核酸印迹检测试剂、胶体金检测试剂、核酸测序试剂或基因芯片检测试剂。

进一步地，所述PCR试剂为荧光定量PCR试剂。

进一步地，所述PCR试剂中包括对miR-122进行PCR扩增的引物，该引物序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明首次发现，miR-122在乙肝肝硬化患者的肝脏组织中的表达水平显著低于健康人群的肝脏组织(P<0.01)。因此，检测肝脏组织中的miR-122的试剂能够用来制备乙肝肝硬化筛查试剂盒，实现乙肝肝硬化的有效筛查。本发明提供的筛查试剂盒能够快速、高效、准确的对肝硬化(特别是乙肝肝硬化)患者进行筛查和诊断，为肝硬化筛查试剂盒提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1：乙肝肝硬化检测试剂盒的组成

本发明提供的乙肝肝硬化检测试剂盒由检测人肝脏组织中的 miR-122的荧光定量PCR试剂组成。该荧光定量PCR试剂中包括对miR-122进行PCR扩增的引物，引物序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

5′-GTCAGATCTATGCCTGTAATCCCAGCACTT-3′(SEQ ID NO.1)；

5′-GTCAAGCTTTCTTTTTCAACACCGGAGTCA-3′(SEQ ID NO.2)。

实施例2：miR-122在乙肝肝硬化患者肝脏组织中的表达测试

1、实验方法

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测健康人肝脏组织、乙肝肝硬化患者肝脏组织及肝癌患者肝脏组织中的miR-122水平。具体方法如下：

(1)临床资料

选取乙肝肝硬化患者20例，肝癌患者20例，健康对照20例。

(2)检测方法

采用RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)分别提取乙肝肝硬化患者、肝癌患者、健康对照的肝脏组织细胞的总RNA，经反转录得cDNA。采用定量PCR仪(Bio-RAD)对miR-122进行 PCR扩增，采用2-ΔΔCt法对miR-122表达水平进行定量分析。 miR-122上游引物序列： 5′-GTCAGATCTATGCCTGTAATCCCAGCACTT-3′(SEQ ID NO.1), 下游引物序列5′-GTCAAGCTTTCTTTTTCAACACCGGAGTCA-3′ (SEQ ID NO.2)。

采用SPSS 20.0版软件进行处理。数据采用均数±标准差表示，两组较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、实验结果

表1不同人群肝脏组织中miR-122表达水平测定结果

表1中，*表示与正常肝组织相比，P<0.01。

结果显示，miR-122在乙肝肝硬化患者的肝脏组织中的表达水平显著低于健康人群的肝脏组织(P<0.01)。

实施例3：利用双荧光素酶实验验证miR-122的靶基因CCNG1

(1)实验方法

采用双荧光素酶实验来验证miR-122对CCNG1的靶向调控作用。

按照3x10

(2)实验结果

表2双荧光素酶实验结果

表2中，*表示与Mimic NC相比，P<0.01。

双荧光酶活性检测结果显示，miR-122的靶基因是CCNG1。

综上，本发明提供了检测肝脏组织中的miR-122的试剂在制备肝硬化筛查试剂盒中的用途。本发明首次发现，miR-122在乙肝肝硬化患者的肝脏组织中的表达水平显著低于健康人群的肝脏组织 (P<0.01)。因此，检测肝脏组织中的miR-122的试剂能够用来制备乙肝肝硬化筛查试剂盒，实现乙肝肝硬化的有效筛查。本发明提供的筛查试剂盒能够快速、高效、准确的对肝硬化(特别是乙肝肝硬化) 患者进行筛查和诊断，为肝硬化筛查试剂盒提供了一种新的选择。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都医学院

<120> 检测肝脏组织中的miR-122 的试剂在制备肝硬化筛查试剂盒中的用途

<130> GYKH1825-2020P0112290CCR4

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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