基因表达的选择性剪接调控及治疗方法

摘要

本文提供了嵌合反式激活子小基因，其中小基因的选择性剪接决定了反式激活子是否表达。反式激活子的表达导致受设计启动子序列控制下的靶基因转录。或者，本文提供嵌合靶基因小基因，其中小基因的选择性剪接直接决定靶基因是否表达。靶基因可以编码抑制性RNA、CRISPR‑Cas9蛋白或治疗性蛋白。

说明书

对相关申请的引用

本申请要求以下的优先权权益：2019年7月10日提交的美国临时申请号62/872,417，2019年4月24日提交的美国临时申请号62/838,223，2019年4月23日提交的美国临时申请号62/837,701，以及2018年8月7日提交的美国临时申请号62/715,756，上述每一临时申请的全部内容均通过引用并入本文。

背景技术

1.技术领域

本公开总体上涉及分子生物学和医学领域。具体而言，本公开涉及使用选择性剪接调控(alternative splicing regulation)来调节编码例如抑制性RNA、治疗性蛋白或CRISPR/Cas9系统的一部分的靶基因的表达。

2.相关技术描述

亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)是常染色体显性遗传性神经退行性疾病，主要影响成年人，而少见于儿童。HD是聚谷氨酰胺(polyQ)病症家族的一部分，聚谷氨酰胺病症包括至少9种不同的神经退行性疾病，是由特定基因中的三联体CAG重复序列的扩增导致的

已经采用了几种方法来降低HTT水平

但是，对患者重复或终生应用RNAi治疗时，需要考虑到非预期基因的沉默和细胞RNAi途径的持续共择可能随着时间的推移而诱发毒性。脱靶沉默是由于RNAi序列与完全或部分互补的非预期mRNA转录本的相互作用而发生的

发明概述

本发明利用前mRNA的选择性剪接作为调控节基因表达的机制。前mRNA剪接是转录后的调控过程，其可除去内含子并通过选择性包括或排除蛋白质编码外显子、部分外显子以及选择性5'和3'非编码外显子而产生蛋白质多样性。该选择性外显子剪接可用作控制特定蛋白质产生的调控开关，例如哺乳动物反式激活子(transactivator)被设计成与上游设计者启动子序列结合以用于非编码RNA(例如，siRNA)或蛋白质产生。本发明提供了用于调控哺乳动物细胞和个体中的非编码RNA和蛋白质表达的创新方法，所述个体例如人，包括例如患有诸如亨廷顿病和脊髓小脑共济失调等神经退行性疾病的人，和患有诸如三肽基肽酶1(tripeptidyl peptidase,1TPP1)缺乏症等遗传缺陷的人。

因此，本发明提供了控制细胞和个体(包括哺乳动物细胞和个体)中非编码RNA和蛋白质表达(即，调节表达，例如增加或减少表达)的方法。

在一个实施方案中，方法包括向细胞施用：第一表达盒，其包含与第一表达控制元件可操作地连接的嵌合基因，其中嵌合基因包含第一部分和第二部分，该第一部分包含选择性剪接的小基因，该第二部分编码RNA，所述RNA编码蛋白质，其中所述蛋白质的表达通过第一部分的选择性剪接控制，从而提供和/或控制蛋白质的表达。

在另一个实施方案中，提供蛋白质的方法包括向个体施用：第一表达盒，其包含与第一表达控制元件可操作地连接的嵌合基因，其中嵌合基因包含第一部分和第二部分，该第一部分包含选择性剪接的小基因，该第二部分编码RNA，所述RNA编码蛋白质，其中所述蛋白质的表达通过第一部分的选择性剪接控制。

本发明还提供了治疗诸如神经退行性疾病、遗传缺陷引起的疾病或基因表达缺陷引起的疾病等疾病状态的方法。

在一个实施方案中，治疗哺乳动物的疾病的方法包括向哺乳动物施用：第一表达盒，其包含与第一表达控制元件可操作地连接的嵌合基因，其中嵌合基因包括第一部分和第二部分，该第一部分包括选择性剪接的小基因，第二部分编码RNA，所述RNA编码蛋白质，其中所述蛋白质的表达通过第一部分的选择性剪接控制。

在一些实施方案中，编码编码蛋白质的RNA的第二部分包括翻译终止密码子，缺少起始(initiation)或启动(start)密码子，不是产生蛋白质的开放阅读框，或仅编码蛋白质的一部分。在一些实施方案中，第一部分的选择性剪接修饰转录本，从而使终止密码子缺失或无效，引入起始或启动密码子，恢复开放阅读框或提供蛋白质的缺失部分。

在一些实施方案中，第一部分位于第二部分的5′。在一些实施方案中，第一部分包括框内翻译终止密码子。在一些实施方案中，第一部分的选择性剪接除去了翻译终止密码子。

在一些实施方案中，该蛋白质是反式激活蛋白。在一些实施方案中，该蛋白不是报道蛋白。

在一个实施方案中，方法包括向细胞施用：第一表达盒，其包含与第一表达控制元件可操作地连接的嵌合基因，其中嵌合基因包含第一部分和第二部分，该第一部分包含选择性剪接的小基因，该第二部分编码与第二表达控制元件结合的反式激活蛋白，其中第一部分的选择性剪接控制反式激活子的表达；和第二表达盒，其包含编码RNA的核酸序列，该核酸序列可操作地连接于所述反式激活蛋白所结合的第二表达控制元件，从而增加了哺乳动物细胞中该RNA的表达。

在另一个实施方案中，控制RNA或蛋白质表达的方法包括向个体施用：第一表达盒，其包含与第一表达控制元件可操作地连接的嵌合基因，其中嵌合基因包含第一部分和第二部分，该第一部分包含选择性剪接的小基因，该第二部分编码与第二表达控制元件结合的反式激活蛋白，其中第一部分的选择性剪接控制反式激活子的表达；和第二表达盒，其包含编码RNA的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接于所述反式激活蛋白所结合的第二表达控制元件，从而增加在个体中该RNA的表达。

在一个实施方案中，治疗哺乳动物的疾病的方法包括向哺乳动物施用：第一表达盒，其包含与第一表达控制元件可操作地连接的嵌合基因，其中嵌合基因包含第一部分和第二部分，该第一部分包含选择性剪接的小基因，该第二部分编码与第二表达控制元件结合的反式激活蛋白，其中第一部分的选择性剪接控制反式激活子的表达；或第二表达盒，其包含编码RNA的核酸序列，该核酸序列可操作地连接于反式激活蛋白所结合的第二表达控制元件，从而增加哺乳动物中该RNA的表达并治疗疾病。

在一些实施方案中，RNA是抑制性RNA，诸如，例如siRNA、shRNA或miRNA。在一些实施方案中，抑制性RNA抑制或降低与疾病相关的异常或反常蛋白质的表达，从而治疗疾病。

在一些实施方案中，RNA编码治疗性蛋白。在一些实施方案中，治疗性蛋白质矫正与疾病相关的蛋白质缺乏，从而治疗疾病。

在一些实施方案中，其中RNA编码Cas9蛋白。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用第三表达盒，该第三表达盒包含编码与第三表达控制元件可操作地连接的指导RNA的核酸序列。在一些实施方案中，第三表达控制元件是组成型启动子。在一些实施方案中，Cas9蛋白和指导RNA的表达矫正了遗传疾病。在一些实施方案中，Cas9蛋白缺乏核酸酶功能，其中Cas9蛋白和指导RNA的表达抑制基因的表达。

在一些实施方案中，第一表达控制元件是组成型启动子、细胞型特异性启动子或诱导型启动子。

在一些实施方案中，第一表达盒的第一部分和第一表达盒的第二部分由可切割的肽分开。在一些实施方案中，可切割的肽是自切割肽、药物敏感性蛋白酶或内源性内切蛋白酶的底物。

在一些实施方案中，通过小分子剪接调节剂(splicing modifier)调控选择性剪接的小基因的剪接。在一些实施方案中，通过细胞的疾病状态调控选择性剪接的小基因的剪接。在一些实施方案中，通过细胞类型或组织类型调控选择性剪接的小基因的剪接。

在一些实施方案中，通过在嵌合基因的第一部分中包括选择性剪接的外显子提供反式激活子或蛋白质的表达增加。在一些实施方案中，所包括的外显子包含翻译起始调控序列。

在一些实施方案中，通过SMN2外显子7内含(inclusion)提供反式激活子或蛋白质的表达增加。在一些实施方案中，通过小分子剪接调节剂的存在触发SMN2外显子7内含。在一些实施方案中，该方法还包括向细胞或个体施用小分子剪接调节剂，从而增加RNA或蛋白质的表达。在一些实施方案中，小分子剪接调节剂是：

RG7800化学结构

CAS号：1449598-06-4。

在一些实施方案中，通过嵌合基因第一部分中选择性剪接的外显子跳读提供反式激活子或蛋白质的表达增加。在一些实施方案中，跳读的外显子包含终止密码子。在一些实施方案中，通过MDM2外显子4-11跳读提供反式激活子或蛋白质的表达增加。在一些实施方案中，通过小分子剪接调节剂的存在触发MDM2外显子4-11跳读。在一些实施方案中，小分子剪接调节剂是舒德霉素(sudemycin)。

在一些实施方案中，通过将外显子插入反式激活子的转录本中提供反式激活子的表达增加。

在一些实施方案中，通过反式激活子转录本中外显子的跳读提供反式激活子的表达增加。

在一些实施方案中，将外显子插入编码全部或部分蛋白质的转录本中，例如治疗性蛋白。

在一些实施方案中，插入转录本中的外显子包括这样的序列，当引入转录本中时，使得外显子恢复蛋白质编码序列或使转录本蛋白质编码序列位于框内。因此，将外显子引入到转录本中允许转录本编码完整的蛋白质序列，或者外显子提供或恢复转录本中的开放阅读框，从而提供或恢复翻译蛋白质的序列，例如治疗性蛋白。

在一些实施方案中，插入转录本中的外显子包括转录本中不存在的启动密码子或起始密码子(例如，ATG)。当将外显子以框内的方式引入转录本中时，这允许翻译编码的蛋白质，例如治疗性蛋白。

在一些实施方案中，插入到转录本中的外显子使转录本中的翻译终止密码子缺失或无效。当将外显子引入转录本中时，翻译终止密码子的缺失或无效允许翻译编码的蛋白质，例如治疗性蛋白。

在一些实施方案中，第一或第二表达盒包含在病毒载体中。

在各种实施方案中，疾病是神经退行性疾病。在各种实施方案中，神经退行性疾病是聚谷氨酰胺重复疾病。在各种实施方案中，聚谷氨酰胺重复疾病包括亨廷顿病(HD)。

在各个实施方案中，神经退行性疾病是脊髓小脑性共济失调(SCA)。在具体方面，SCA是SCA1、SCA2、SCA3、SCA4、SCA5、SCA6、SCA7、SCA8、SCA9、SCA10、SCA11、SCA12、SCA13、SCA14、SCA16、SCA17、SCA18、SCA19、SCA20、SCA 21、SCA22、SCA23、SCA24、SCA25、SCA26、SCA27、SCA28或SCA29中的任一种。

在各种实施方案中，施用针对中枢神经系统(CNS)。在具体定方面，施用针对脑给。在具体面，施用针对脑室。

在各种实施方案中，第一表达盒或第二表达盒或包含编码蛋白质的核酸序列的表达盒包含病毒载体。在某些方面，病毒载体选自腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。

在各种实施方案中，AAV载体包括包含AAV衣壳蛋白的AAV颗粒，并且将第一表达盒或第二表达盒或包含编码蛋白质的核酸序列的表达盒插入一对AAV末端反向重复(ITR)之间。在具体方面，AAV衣壳蛋白衍生自或选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10和AAV-2i8 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10或AAV-2i8 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有70％或更高同一性的衣壳蛋白。在具体方案，ITR对中的一个或多个衍生自、包含或组成为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10或AAV-2i8 ITR，或与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10或AAV-2i8 ITR序列具有70％或更高同一性的ITR。

在各种实施方案中，第一表达盒或第二表达盒或包含编码蛋白质的核酸序列的表达盒包含启动子。

在各种实施方案中，第一表达盒或第二表达盒或包含编码蛋白质的核酸序列的表达盒包含增强子元件。

在各种实施方案中，第一表达盒或第二表达盒或包含编码蛋白质的核酸序列的表达盒包含CMV增强子或鸡β肌动蛋白启动子。

在各种实施方案中，第一表达盒或第二表达盒或包含编码蛋白质的核酸序列的表达盒还包含下列的一种或多种：内含子、填充聚核苷酸序列和/或聚A(poly A)信号或其组合。

在各种实施方案中，施用多个AAV颗粒。

在一些实施方案中，以约1×10

在一些实施方案中，以约1x10

在一些实施方案中，以1x10

在一些实施方案中，方法包括施用多个AAV空衣壳。

在一些实施方案中，将空AAV衣壳与施用于哺乳动物的AAV颗粒一起配制。在各种方面，将AAV空衣壳与1.0-100倍过量的AAV载体颗粒一起施用或配制。在各种方面，将AAV空衣壳以AAV空衣壳比AAV颗粒约1.0至100倍过量进行施用或配制。

在一些实施方案中，施用是脑室内注射和/或实质内注射(intraparenchymalinjection)。

在一些实施方案中，施用针对脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内间隙(intrathecalspace)。

在一些实施方案中，施用针对神经细胞，例如室管膜细胞、软膜细胞、内皮细胞、脑室、脑膜细胞、胶质细胞和/或神经元。在各个方面中，室管膜细胞、软膜细胞、内皮细胞、脑室、脑膜、胶质细胞和/或神经元表达RNAi。

在各种实施方案中，施用针对以下部位：前侧脑室(rostral lateralventricle)；和/或后侧脑室(caudal lateral ventricle)；和/或右侧脑室；和/或左侧脑室；和/或右前侧脑室；和/或左前侧脑室；和/或右后侧脑室；和/或左后侧脑室。

在各种实施方案中，在脑中的单个位置进行施用。

在各种实施方案中，在脑中的1-5个位置进行施用。

在各种实施方案中，向哺乳动物的小脑延髓池、脑室内间隙(intraventricularspace)、脑室、蛛网膜下腔、鞘内间隙和/或室管膜中的任一种进行单次剂量或多次剂量施用。

在各种实施方案中，方法减轻了亨廷顿病(HD)或脊髓小脑共济失调(SCA)的不良症状。在各个方面，不良症状是早期或晚期症状、行为、性格或语言症状、运动功能症状和/或认知症状。

在各种实施方案中，方法增加、改善、保存、恢复或拯救哺乳动物的记忆缺失、记忆缺陷或认知功能。

在各种实施方案中，方法改善或抑制或减少或预防协调障碍、移动缓慢或身体僵硬的恶化。

在各个实施方案中，方法改善或抑制或减少或预防痉挛或不安运动(fidgetymovement)的恶化。

在各种实施方案中，方法改善或抑制或减少或预防抑郁或易激惹的恶化。

在各种实施方案中，方法改善或抑制或减少或预防掉落物品、跌倒、失去平衡、说话困难或吞咽困难的恶化。

在各种实施方案中，方法改善或抑制或减少或预防组织能力的恶化。

在各种实施方案中，方法改善或抑制或减少或预防共济失调或反射减弱的恶化。

在各种实施方案中，方法改善或抑制或减少或预防癫痫或震颤发作或震颤的恶化。

在各种实施方案中，哺乳动物是非啮齿类动物。在各个方面，非啮齿类动物是灵长类。在各个方面，灵长类是人。在各个方面，人都在50岁或以上。在各个方面，人是儿童。在各个方面，儿童为约1至约8岁。

在各种实施方案中，方法包括施用一种或多种免疫抑制剂。在各个方面，在载体施用之前或与施用载体同时，施用免疫抑制剂。在各个方面，免疫抑制剂是抗炎剂。

如本文所用，就指定的组分而言，“基本上不含”在本文中是指，有意未将指定的组分配制到组合物中和/或该组分仅以污染物或痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的组合物是，在该组合物中用标准分析方法无法检测到指定的组分。

如本说明书中所用，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以表示一个/种或多个/种。如本文在权利要求中所用，当与词“包含”结合使用时，词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以表示一个/种或多个/种。

除非明确指出权利要求中的术语“或”仅是指替代方案或者替代方案相互排斥，否则，尽管本公开支持仅是指替代方案和“和/或”的定义，权利要求中的术语“或”的使用是用来表示“和/或”。如本文所用，“另一个/种(another)”可以表示至少第二个/种或更多个/种。

在整个本申请中，术语“约”用于表示一个值包括用于测定该值的方法、设备的固有误差变化，或研究对象之间存在的变化。

通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点会变得显而易见。然而，应该理解，尽管表明了本发明的优选实施方案，但依然仅以示例的方式给出了详细描述和具体实施例，因为通过详细描述，本发明精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言应当是显而易见的。

本文使用肯定性语言描述众多实施方案和方面来一般性地公开本发明。本发明还具体包括全部或部分地排除特定主题的实施方案，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，不包括材料和/或方法步骤。因此，即使本文就本发明不包括什么而言未一般性地表达本发明，但是本文公开了本发明未明确排除的方面。

附图简要说明

以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合在此呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1显示了共择用于在哺乳动物细胞中沉默表达的RNAi途径。

图2显示了受调控的启动子系统的作用。SMN2的Exon7内含是由LMI070诱导的，它允许e6/7/8:反式激活子的翻译。

图3a-b显示了优化的启动子构建体对反式激活子有反应。图3a显示反式激活子与RNAip的结合诱导萤光素酶的表达。图3b显示测试的启动子变体(TA、TF2、TF4和TF5)具有最小表达，并且类似于用空启动子质粒(NO)转染的对照细胞，并且响应于反式激活而被完全活化，如HEK293细胞转染后24小时通过萤光素酶活性所测定的。

图4a-c显示了修饰的SMN2/反式激活子小基因表达剪接的RNA转录本同工型，以在组成上排除(CSI3)或包括(CSI5)外显子7，从而影响优化的RNAi启动子的背景表达。图4a显示反式激活子被克隆到自切割2A肽和包含概括SMN2剪接所需的外显子6-7和外显子8的5'末端以及最小内含子间插序列的SMN2小基因的下游。SMN2/反式激活子小基因中的3'和5'外显子7剪接位点经修饰在组成上排除(CSI3、3'修饰)或包括(CSI5、5'修饰)外显子7。图4b示出了对于CSI，10％的转录本包括外显子7，对于CSI3和CSI5，包括或排除外显子7。图4c显示修饰以在组成上排除外显子7(CSI3、3′修饰)使RNAi启动子背景激活最小化。

图5a-b显示了CSI和CSI3小基因响应LIM070的剪接和活性。图5a显示在LMI070处理后20h，通过半定量RT-PCR确定了HEK293细胞中的Exon 7内含。图5b显示，在用SMN2小基因和TF5 RNAi启动子质粒共转染的HEK293细胞中，通过萤光素酶活性20h处理，确定了TF5RNAi启动子响应于LMI070的激活。

图6a-b显示了转染后对HEK293中mi2.4v1、miHDS1v6a及其种子匹配miRNA对照的HTT沉默进行的定量评估。图6a显示了Q-PCR(24h)，图6b显示了蛋白质印迹(48h)。

图7显示了LMI070调控的RNAi的模型。LMI070的施用会诱导miRNA表达和mHTT抑制(黑色，LM1070单次给药对RNAi影响)。LMI070剂量给药后24-48小时，RNAi表达应达到峰值，此后，人工miRNA会减少到背景水平。显示了单次(红色)或两次(蓝色虚线)LMI070剂量后一周内预测的RNAi表达。

图8显示了响应于LMI070的HTT重新剪接。来自用DMSO(CTL)或LMI070(25nM)处理的HEK293细胞的RNAseq数据。Sashimi图(Sashimi plot)描绘了通过RNA-seq鉴定的新小基因(在处理过的样品中的圆圈内)。

图9显示了响应于LMI070的苄氯素1(BECN1)重新剪接。来自用DMSO(CTL)或LMI070(25nM)处理的HEK293细胞的RNAseq数据。Sashimi图描绘了通过RNA序列鉴定的新小基因(在处理过的样品中的圆圈内)

图10显示了响应于LMI070的第12号染色体开放阅读框4(C12orf4)重新剪接。来自用DMSO(CTL)或LMI070(25nM)处理的HEK293细胞的RNAseq数据。Sashimi图描绘了通过RNA-seq鉴定的新小基因(在处理过的样品中的圆圈内)。

图11显示了响应于LMI070的5'-3'外切核糖核酸酶2(XRN2)重新剪接。来自用DMSO(CTL)或LMI070(25nM)处理的HEK293细胞的RNAseq数据。Sashimi图描绘了通过RNA-seq鉴定的新小基因(在处理过的样品中的圆圈内)。

图12显示了响应于LMI070的剪接因子3b亚基3(SF3B3)重新剪接。来自用DMSO(CTL)或LMI070(25nM)处理的HEK293细胞的RNAseq数据。Sashimi图描绘了通过RNA-seq鉴定的新小基因(在处理过的样品中的圆圈内)。

图13显示了响应于LMI070的含形成蛋白同源性2结构域3(formin homology 2domain containing 3,FHOD3)重新剪接。来自用DMSO(CTL)或LMI070(25nM)处理的HEK293细胞的RNAseq数据。Sashimi图描绘了通过RNA序列鉴定的新小基因(在处理过的样品中的圆圈内)

图14显示了响应于LMI070的葡糖苷木糖基转移酶1(GXYLT1)重新剪接。来自用DMSO(CTL)或LMI070(25nM)处理的HEK293细胞的RNAseq数据。Sashimi图描绘了通过RNA序列鉴定的新小基因(在处理过的样品中的圆圈内)

图15显示了响应于LMI070的含吡哆醛依赖性脱羧酶结构域1(pyridoxaldependent decarboxylase domain containing 1,PDXDC1)和核孔复合体相互作用蛋白(PDXDC2P-NPIPB14P)非编码RNA重新剪接。来自用DMSO(CTL)或LMI070(25nM)处理的HEK293细胞的RNAseq数据。Sashimi图描绘了通过RNA-seq鉴定的新小基因(在处理过的样品中的圆圈内)。

图16显示了在HEK293细胞中由LMI070(25nM)诱导的外显子重新剪接。PCR证实响应于LMI070处理，包括了新的外显子(通过RNA-seq鉴定)。

图17显示了用于控制基因表达的XonSwitch策略1。在没有剪接调节剂的情况下，新的外显子被排除在外，下游蛋白也不在框内。因此，在这种情况下不制造蛋白质。用剪接调节剂处理后，开放阅读框得以恢复，并生成了下游蛋白质。

图18显示了用于控制基因表达的XonSwitch策略2。消除了上游ATG翻译起始密码子，并将其插入到新的假外显子中。在没有剪接调节剂的情况下，不会发生翻译，因为在转录本中不存在ATG翻译起始密码子，并且仅生成非蛋白质编码RNA。当添加剪接调节剂时，ATG起始密码子以假外显子的方式包括在转录本中，该假外显子会被翻译以表达蛋白质。这提供了蛋白质表达的严格调节。

图19显示了响应于剪接调节剂RG7800的SMN2小基因剪接。PCR剪接测定显示，响应于不同剂量(10nM、100nM、1μM和10μM)下的剪接调节剂(RG7800)处理，诱导Exon 7包括在SMN2小基因中。

图20显示了响应于剪接调节剂(RG7800)处理调控的Cas9表达沉默诱导型CRISPR表观遗传。在缺少RG7800的情况下，Cas9蛋白不在框内，且不表达。用RG7800进行处理可诱导Exon7内含并恢复Cas9的表达。作为Cas9响应于RG7800而表达的结果，形成了特定的Cas9/sgRNA/RBP-Krab复合物，该复合物与HTT启动子结合，诱导突变HTT等位基因的表观遗传沉默。

图21显示了mHTT等位基因的调控编辑。蛋白质印迹显示SMN2_CRISPRi调控系统响应于剪接调节剂(RG7800)诱导的HTT表观遗传沉默。RG7800(1μM)处理后，用SMN2_CRISPRi系统转染的HEK293细胞中显示了HTT和Cas9蛋白质水平。如图所示，Cas9蛋白水平响应于RG7800而增加，而HTT表达水平由于Cas9介导的表观遗传沉默而降低了约45％。

发明详述

本文公开了嵌合反式激活子小基因，其中小基因的选择性剪接决定了下游反式激活子是否表达。反式激活子的表达导致靶基因在设计启动子序列的控制下转录。靶基因可以编码抑制性RNA、CRISPR-Cas9蛋白或治疗性蛋白。

在一个实例中，小基因包括三个外显子，即外显子1-3，并且在基础状态下外显子2跳读。当外显子2跳读时，外显子3的阅读框发生移动，从而导致在外显子3中产生无义突变。这样，编码蛋白的翻译在外显子3中终止，并且没有下游翻译。由于反式激活子编码序列位于小基因的下游，因此反式激活子在基础状态下不表达。或者，翻译起始调控序列位于外显子2中，因此当外显子2跳读时，不会发生翻译。

为了打开反式激活子的表达，必须诱导跳读外显子的内含。这能够作为小分子剪接调节剂的存在的结果而发生。例如，小基因可以包含SMN2基因的外显子6-8，在这种情况下，外显子7在基础状态下跳读。但是，在某些剪接调节剂小分子(例如，LMI070)存在的情况下，外显子7被包括在内(见图2)

或者，可以在一种细胞类型中诱导跳读外显子的内含，而在另一种细胞类型中不诱导。例如，FGFR2的外显子8和9是互斥的，外显子9仅包括在间充质组织中(Takeuchi etal,2010)。这样，小基因可以包含FGFR2基因的外显子7、8、9、10，以使反式激活子仅在间充质细胞中表达。在这种情况下，将终止密码子改造到小基因的外显子8中，以防止反式激活子在非间充质细胞中表达。

可以在本公开的表达控制系统中使用的细胞类型特异性选择性剪接事件的其他实例包括Eps8外显子18B(chr12:15,792,360–15,792,395)和Eps8外显子18C(chr12:15,787,673–15,787,696)，它们对于听神经毛细胞是特异性的。

作为另一种替代方案，可以通过某种疾病状态来诱导跳读外显子的内含。例如，亨廷顿病导致通过选择性剪接产生转录本同种型

在另一个实例中，小基因包含三个外显子，即外显子1-3，并且在基础状态中包括外显子2。外显子2的内含可以导致下游移码，从而使翻译在外显子3中终止，或者可以改造外显子2以包括终止密码子。这样，当包括外显子2时，即在基础状态下，反式激活子不表达。

为了打开反式激活子的表达，必须诱导外显子2跳读。由于小分子剪接调节剂的存在可以发生这种情况。例如，小基因可以包含MDM2基因的外显子3、4、10、11、12(Singh etal.,2009)，在基础状态下，它们全部是内含的。但是，在存在某些剪接调节剂小分子(例如舒德霉素)的情况下外显子4、10、11发生跳读(Singh et al.,2009)。这样，下游反式激活子会在存在舒德霉素的情况下表达，而在舒德霉素不存在的情况下不表达。在这种情况下，可以将终止密码子改造到小基因的外显子4中，以确保在不存在舒德霉素的情况下不产生蛋白质。

或者，可以在一种细胞类型中诱导选择性包括的外显子的跳读，而在另一种细胞类型中不诱导。Nin的外显子18在神经元中发生跳读(Zhang et al.,2016)。这样，小基因可以包含Nin基因的外显子17、18、19，以使得反式激活子仅在神经元中表达。在这种情况下，将终止密码子改造到小基因的外显子18中，以防止非神经元细胞在包括外显子18的情况下表达反式激活子。

作为另一种替代方案，可以通过某种疾病状态来诱导选择性包括的外显子发生跳读。例如，亨廷顿病导致通过选择性剪接产生转录本同种型

嵌合反式激活子小基因的表达可以受各种类型的启动子调控，这取决于所需的表达方式。例如，启动子可以是通用的组成型启动子，例如持家基因(例如ACTB)的启动子。作为另一个实例，启动子可以是细胞类型特异性启动子，例如用于神经元表达的突触蛋白的启动子。作为另一个实例，启动子可以是诱导型启动子。

嵌合反式激活子小基因可以具有位于小基因和反式激活子之间的可切割肽。在一些情况下，可切割肽可以是可自切割肽，例如2A肽。2A肽可以是T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。该肽的存在提供了翻译后从反式激活蛋白中分离小基因编码的肽。在某些情况下，可切割肽可以是广泛表达的内源性内切蛋白酶的切割位点，例如弗林蛋白酶、激素原转化酶7(PC7)、成对的碱性氨基酸裂解酶4(PACE4)或枯草杆菌蛋白酶kexin同工酶2(SKI-1)。在某些情况下，可切割肽可以是组织特异性或细胞特异性内切蛋白酶(例如激素原转化酶2(PC2；主要在内分泌组织和大脑中表达)、激素原转化酶1/3(PC1/3)；主要在内分泌组织和大脑中表达)、激素原转化酶4(PC4；主要在睾丸和卵巢中表达)和蛋白质原转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9(PSCK9；主要在肺和肝脏中表达)的切割位点。

本文还公开了嵌合反式激活子小基因，其中将小基因插入反式激活子的编码序列中，并且其中小基因的选择性剪接决定反式激活子是否表达。例如，可以将包含外显子4、10、11的MDM2小基因插入反式激活子的编码序列中(Shi et al.,2015)。在基础状态下，包括小基因的外显子，从而破坏了反式激活子编码序列。为了确保当包括小基因外显子时不产生有害的蛋白质，可以对嵌合反式激活子小基因进行改造，使得小基因部分位于反式激活子编码序列的5'末端或附近，并且可以将终止密码子改造到小基因的外显子4中。为了诱导反式激活子的表达，用剪接调节剂分子(例如，舒德霉素)诱导MDM2小基因的外显子4、10、11发生跳读。同样，可以使用细胞类型特异性或疾病状态的选择性剪接事件作为插入反式激活子的编码序列中的小基因。

本文还公开了嵌合靶基因小基因，其中将小基因插入靶基因的编码序列中，并且其中小基因的选择性剪接决定靶基因是否表达。靶基因可以编码抑制性RNA、CRISPR-Cas9蛋白或治疗性蛋白。例如，可以将包含外显子4、10、11的MDM2小基因插入靶基因的编码序列中(Shi et al.,2015)。在基础状态下，包括小基因的外显子，从而破坏了靶基因编码序列。为了确保当包括小基因外显子时不产生有害蛋白，可以对嵌合靶基因小基因进行改造，使得小基因部分位于靶基因编码序列的5'端或附近，并且可以将终止密码子改造到小基因的外显子4中。为了诱导靶基因的表达，使用剪接调节剂分子(例如，舒德霉素)诱导MDM2小基因的外显子4、10、11发生跳读。同样，可以使用细胞类型特异性或疾病状态的选择性剪接事件作为插入靶基因的编码序列中的小基因。

在嵌合反式激活子小基因或嵌合靶基因小基因的小基因插入在反式激活子编码序列或靶基因编码序列的5'末端处的情况下，选择性包括的外显子可以含有必要的翻译起始调控序列。另外，如上所述的可切割肽可位于小基因序列与反式激活子或靶基因之间。

注意，其他类型的选择性剪接事件也可以用于提议的系统中。例如，本领域技术人员会认识到，可以改造选择性3'剪接位点或选择性5'剪接位点，以达到与选择性跳读或包括的外显子相同的目的。同样，还可以相应地改造保留的内含子剪接事件。

I.选择性剪接调控的靶基因

A.抑制性RNA

“RNA干扰(RNA interference,RNAi)”是由siRNA引发的序列特异性转录后基因沉默过程。在RNAi期间，siRNA诱导靶mRNA降解，随后发生基因表达的序列特异性抑制。表达可以使用本公开的表达系统来抑制的基因的实例包括但不限于HTT(对于亨廷顿病)、SCA(对于脊髓小脑共济失调(1、2、3、6、7型))、FXTAS(对于脆性X共济失调综合征)和FMRP(对于脆性X)。

“抑制性RNA”、“RNAi”、“小干扰RNA”或“短干扰RNA”或“siRNA”分子、“短发夹RNA”或“shRNA”分子或“miRNA”是靶向感兴趣的核酸序列的RNA核苷酸双链体。如本文所用，术语“siRNA”是涵盖shRNA和miRNA的子集的通用术语。“RNA双链体”是指由RNA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。siRNA之所以“靶向”基因，是因为siRNA双链体部分的核苷酸序列与靶向基因的核苷酸序列互补。在某些实施方案中，siRNA靶向编码亨廷顿蛋白的序列。在一些实施方案中，siRNA双链体的长度小于30个碱基对。在一些实施方案中，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个碱基对。在一些实施方案中，双链体的长度为19-25个碱基对。在某些实施方案中，双链体的长度为19或21个碱基对。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分外，发夹结构还可以含有位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在某些实施方案中，环的长度为18个核苷酸。发夹结构还可以含有3'和/或5'单链突出部分(overhang portion)。在一些实施方案中，单链突出端(overhang)是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3'和/或5'单链突出端。

shRNA由经设计含有5'侧翼区、siRNA区片段、环区、3'siRNA区和3'侧翼区的茎环结构组成。大多数RNAi表达策略都利用了polIII基强启动子驱动的短发夹RNA(shRNA)。许多shRNA已展示了在体外以及体内均可有效地抑制靶序列，然而，也发现一些展示有效抑制靶基因的shRNA在体内具有毒性。

miRNA是从前体茎环转录本加工而成的小细胞RNA(约22nt)。可以对已知的miRNA茎环进行修饰，使其含有对感兴趣的基因具有特异性的RNAi序列。miRNA分子优于shRNA分子，因为miRNA是内源性表达的。因此，miRNA分子不太可能诱导dsRNA响应性干扰素途径，它们的加工比shRNA更有效，并且已被证明它们的沉默效率高80％。

最近发现的替代方法是，使用人工miRNA(pri-miRNA支架穿梭siRNA序列)作为RNAi载体。人工miRNA更自然地类似于内源性RNAi底物，并且更易于Pol-II转录(例如，允许RNAi的组织特异性表达)和多顺反子策略(例如，允许递送多个siRNA序列)。参见美国专利号10,093,927，其通过引用并入。

“shRNA”的转录单位由通过未配对核苷酸环连接的有义序列和反义序列组成。shRNA通过输出蛋白5(Exportin-5)从细胞核中输出，一旦进入细胞质，就被Dicer加工而生成功能性siRNA。“miRNA”茎环由通过未配对核苷酸环连接的有义序列和反义序列组成，这些核苷酸通常表达为较大的初级转录本(pri-miRNA)的一部分，被Drosha-DGCR8复合体切除，生成称为前-miRNA(pre-miRNA)的中间体，随后通过输出蛋白5从细胞核中输出，一旦进入细胞质，就被Dicer加工以生成功能性siRNA。如本文可互换使用的，“人工miRNA”或“人工miRNA穿梭载体”是指具有双链茎环区(至少约9-20个核苷酸)的初级miRNA转录本，该双链茎环区经Drosha和Dicer加工切除，被靶基因的siRNA序列取代，同时将茎环中的结构元件保留在有效Drosha加工所必需的位置。术语“人工”是由于以下事实而产生的：侧翼序列(上游约35个核苷酸，下游约40个核苷酸)来自siRNA的多克隆位点中的限制酶位点。如本文所用，术语“miRNA”涵盖天然存在的miRNA序列以及人工产生的miRNA穿梭载体。

siRNA可以由核酸序列编码，并且该核酸序列也可以包括启动子。核酸序列还可以包括多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号是合成的最小化多腺苷酸化信号或六个T的序列。

在设计RNAi时，需要考虑几个因素，例如siRNA的性质、沉默效果的持久性以及递送系统的选择。为了产生RNAi效果，引入生物体的siRNA通常会含有外显子序列。此外，RNAi过程是同源性依赖的，因此必须仔细选择序列，以使基因特异性最大化，同时使同源性序列而不是基因特异性序列之间的交叉干扰可能性最小化。优选，siRNA在siRNA的序列与要抑制的基因之间显示出大于80％、85％、90％、95％、98％甚至100％的同一性。与靶基因的同一性小于约80％的序列的效率实际上较低。因此，siRNA与要抑制的基因之间的同源性越高，无关基因的表达受到影响的可能性就越小。

另外，siRNA的大小是重要的考虑因素。在一些实施方案中，本发明涉及包括至少约19-25个核苷酸并且能够调节基因表达的siRNA分子。在本发明的上下文中，siRNA的长度优选小于500、200、100、50或25个核苷酸。更优选，siRNA的长度为约19个核苷酸至约25个核苷酸。

siRNA靶标通常是指包含编码多肽的区域的多核苷酸，或调控复制、转录或翻译或对多肽表达重要的其他过程的多核苷酸区域，或既包含编码多肽的区域又包含与之可操作地连接并且调控表达的区域的多核苷酸。可以靶向在细胞中表达的任何基因。优选，靶基因是参与对疾病重要或作为研究对象特别感兴趣的细胞活动的进展或与之相关的一个基因。

B.CRISPR系统

基因编辑是允许修饰活细胞内靶基因的技术。最近，利用CRISPR的细菌免疫系统按需进行基因编辑彻底改变了科学家进行基因组编辑的方式。CRISPR系统的Cas9蛋白是RNA指导的DNA内切核酸酶，通过改变其指导RNA序列，可以被改造成相对容易地靶向新位点。这一发现使序列特异性基因编辑在功能上有效。

一般而言，“CRISPR系统”共同表示与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性有关的转录本和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣序列(tracr-mate sequence)(在内源性CRISPR系统的语境中，包括“直接重复”和tracrRNA加工的部分直接重复)、指导序列(在内源性CRISPR系统的语境中，也称为“间隔子”)和/或CRISPR基因座的其他序列和转录本。可以使用本发明的CRISPR表达系统来抑制基因的表达，或使用本发明的CRISPR表达系统来编辑基因的序列，这样的基因的实例包括但不限于HTT(用于亨廷顿病)、SCA(用于脊髓小脑共济失调(1、2、3、6、7型)、FXTAS(用于脆性X共济失调综合征)和FMRP(用于脆性X)。

CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括以序列特异性方式结合DNA的非编码RNA分子(指导)RNA和具有核酸酶功能(例如两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如Cas9)。CRISPR系统的一个或多个元件可以源自I型、II型或III型CRISPR系统，例如源自包含内源性CRISPR系统的特定生物，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

CRISPR系统可以在靶位点诱导双链断裂(DSB)，随后如本文所述进行破坏。在其他实施方案中，被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点使单链产生切口。可以使用成对的切口酶，例如以提高特异性，每个切口酶都由一对不同的gRNA靶向序列指导，使得在同时引入切口时，引入了5'单链突出端。在其他实施方案中，将无催化活性的Cas9融合至异源效应子结构域，例如转录阻遏物(例如，KRAB)或激活剂，以影响基因表达。或者，具有无催化活性的Cas9的CRISPR系统还包含与核糖体结合蛋白融合的转录阻遏物或激活剂。

在一些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列具有特异性的crRNA和固定的tracrRNA的融合)引入细胞中。通常，使用互补碱基配对，gRNA的5'末端的靶位点将Cas核酸酶靶向靶位点，例如基因。可以基于原间隔序列邻近基序(PAM)序列(例如，通常为NGG或NAG)的5'的紧邻位置选择靶位点。在这方面，通过修饰指导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸以对应于靶DNA序列，将gRNA靶向所需序列。通常，CRISPR系统的特征在于促进CRISPR复合体在靶序列位点处形成的元件。通常，“靶序列”通常是指指导序列经设计具有互补性的序列，其中靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合体的形成。只要存在的互补性足以引起杂交并促进CRISPR复合体的形成，则不一定需要完全的互补性。

靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可以位于细胞的细胞核或细胞质中，例如在细胞的细胞器内。通常，可用于重组到包含靶序列的靶向基因座的序列或模板，称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源模板多核苷酸可以称为编辑模板。在一些方面，重组是同源重组。

通常，在内源性CRISPR系统的语境中，CRISPR复合体(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致靶序列中或其附近(例如靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)一条或两条链被切割。tracr序列可以包含或组成为全部或部分野生型tracr序列(例如，野生型tracr序列的约或大于约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸)，也可以形成CRISPR复合体的一部分，例如通过沿着至少一部分tracr序列与可操作地连接于指导序列的tracr伴侣序列的全部或一部分杂交。tracr序列与tracr伴侣序列具有充足互补性，从而发生杂交并参与CRISPR复合体的形成，例如当最佳比对时，沿着tracr伴侣序列的长度，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。

可以将驱动CRISPR系统的一种或多种元件表达的一种或多种载体引入细胞，以使CRISPR系统元件的表达指导CRISPR复合体在一个或多个靶位点处形成。也可以将组分作为蛋白质和/或RNA递送到细胞。例如，Cas酶、连接于tracr伴侣序列的指导序列和tracr序列可各自可以可操作地连接至单独载体上的单独调控元件。如本文所公开的，Cas酶可以是在受调控的选择性剪接事件控制下的靶基因，作为嵌合靶基因小基因或作为嵌合小基因反式激活子的靶基因。gRNA可以受组成型启动子的控制。

或者，可以将由相同或不同调控元件表达的两种或更多种元件组合在单个载体中，而一个或多个其他载体提供不包括在第一载体中的CRISPR系统的任何成分。载体可包含一个或多个插入位点，例如限制性内切核酸酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点位于一个或多个载体的一种或多种序列元件的上游和/或下游。当使用多种不同的指导序列时，单个表达构建体可以用于将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同的相应靶序列。

载体可包含与编码CRISPR酶例如Cas蛋白的酶编码序列可操作连接的调控元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，酿脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到。

CRISPR酶可以是Cas9(例如来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(S.pneumonia))。CRISPR酶可以在靶序列的位置指导一条或两条链的切割，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内。载体可以编码相对于相应野生型酶发生突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，在来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中，天冬氨酸-到-丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链核酸酶转化成切口酶(切割单链)。在一些实施方案中，Cas9切口酶可以与指导序列组合使用，例如两个指导序列，这个两个指导序列分别靶向DNA靶的有义链和反义链。这种组合允许两条链都被切成切口并用于诱导NHEJ或HDR。

在一些实施方案中，对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化，以在具体细胞，例如真核细胞中表达。真核细胞可以是具体生物的细胞或衍生具体生物的细胞，例如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类。一般而言，密码子优化是指，通过用在感兴趣的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子，来修饰核酸序列以在该宿主细胞中增强表达，同时保持天然氨基酸序列的过程。各物种都对具体氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率又被认为尤其依赖于被翻译的密码子的性质和具体转移RNA(tRNA)分子的可利用性。所选tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此，可以基于密码子优化来定制基因以在给定生物中进行最佳基因表达。

通常，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够的互补性，以与靶序列杂交并且指导CRISPR复合体与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法最佳比对时，指导序列与其相应靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。

可使用任何合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对，算法的非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(NovocraftTechnologies,ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn上获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net上获得)。

CRISPR酶可以是包含一个或多个异源蛋白结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任何其他蛋白序列，以及任选地包含在任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白结构域的实例包括但不限于表位标签、报道基因序列和具有一种或多种下述活性的蛋白结构域：甲基化酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报道基因的实例包括但不限于谷胱甘肽5转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。CRISPR酶可以与编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白质或蛋白质片段的基因序列融合，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S标签、Lex ADNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4A DNA结合域结构融合物和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。在US 20110059502中描述了可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外的结构域，US20110059502通过引用并入本文。

C.治疗性蛋白

一些实施方案涉及重组蛋白和多肽的表达。可以使用本公开的表达系统表达的蛋白质的实例包括但不限于STXBP1(也称为Munc18-1；用于STXBP1缺乏症，是新生儿癫痫，发育迟缓的一种形式)、SCN1a(用于Dravet综合征，也称为遗传癫痫性脑病(geneticepileptic encephalopathy)，也称为婴儿期严重肌阵挛癫痫(severe myoclonicepilepsy of Infancy,SMEI)；Nav1.1发生突变)、SCN1b(Nav1.1β亚基发生突变)、SCN2b(用于家族性房颤；II型电压门控钠通道的β2亚基)、KCNA1(用于显性遗传的发作性共济失调；伴随或不伴随共济失调的僵硬肌肉痉挛)、KCNQ2(KCNQ2相关癫痫)、GABRB3(早发性癫痫(early onset epilepsy)；GABAA受体的β3亚基)、ACNA1A(用于家族性共济失调和偏瘫性偏头痛；P/Q型电压门控钙通道的跨膜成孔亚基)、CHRNA2(用于常染色体显性夜间额叶癫痫(autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy)；神经元烟碱胆碱能受体(nAChR)的α亚基)、KCNT1(用于常染色体显性夜间额叶癫痫(ADNFLE)和婴儿期恶性迁移性部分发作(malignant migrating partial seizures of infancy,MMPSI)；钠激活的钾通道)、SCN8A(用于癫痫和神经发育障碍；Nav1.6缺乏症，电压依赖性钠通道)、CHRNA4-α亚基(用于常染色体显性夜间额叶癫痫；烟碱乙酰胆碱受体α亚基发生突变)、CHRNB2-b2亚基(常染色体显性夜间额叶癫痫；烟碱乙酰胆碱受体α亚基发生突变)、ARX(用于Otohara综合征(Otohara syndrome)，ARX基因中的polyAla扩展)、MECP1(用于Rett综合征)、FMRP(用于脆性X)和CLN3(用于CLN疾病，也称为青少年型巴顿氏病(Juvenile form of Batten'sdisease)，也称为JNCL)。可以使用本公开的表达系统表达的蛋白质的其他实例可以在Lindy et al.(2018)和Heyne et al.(2018)中找到，每一篇均通过引用整体并入本文。

在一些方面，可以修饰蛋白质或多肽以增加血清稳定性。因此，当本申请涉及“修饰的蛋白质”或“修饰的多肽”的功能或活性时，本领域普通技术人员应理解，这包括例如与未修饰的蛋白质或多肽相比具有其他优势的蛋白质或多肽。特别考虑到针对“修饰的多肽”，可以实施涉及“修饰的蛋白质”的实施方案，反之亦然。

重组蛋白可能具有氨基酸的缺失和/或取代；因此，具有缺失的蛋白质，具有取代的蛋白质，以及具有缺失和取代的蛋白质，都是修饰的蛋白质。在一些实施方案中，这些蛋白质还可以包括插入或添加的氨基酸，例如具有融合蛋白或具有接头的蛋白质。“修饰的缺失蛋白质”缺乏天然蛋白质的一个或多个残基，但是可以具有天然蛋白质的特异性和/或活性。“修饰的缺失蛋白质”也可以具有降低的免疫原性或抗原性。修饰的缺失蛋白质的实例是至少一个抗原区的氨基酸残基缺失的蛋白质，该抗原区域即被确定为在具体生物中具有抗原性的蛋白质区域，例如可以施用修饰蛋白的生物的类型。

取代或置换变体通常在蛋白质内的一个或多个位点包含一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可以被设计为调节多肽的一种或多种特性，特别是其效应子功能和/或生物利用度。取代可以是保守的，也可以不是保守的，即一种氨基酸被形状和电荷相似的一种氨基酸置换。保守取代是本领域公知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸到丝氨酸，精氨酸到赖氨酸，天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸，天冬氨酸到谷氨酸，半胱氨酸到丝氨酸，谷氨酰胺到天冬酰胺，谷氨酸到天冬氨酸，甘氨酸到脯氨酸，组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺，异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸，亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸，赖氨酸到精氨酸，甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸，苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，丝氨酸到苏氨酸，苏氨酸到丝氨酸，色氨酸到酪氨酸，酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸，缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。

除缺失或取代外，修饰的蛋白质可具有残基的插入，其通常涉及在多肽中添加至少一个残基。这可以包括插入靶向肽或多肽或仅插入单个残基。下文讨论了称为融合蛋白的末端添加物。

术语“生物学功能等同物”在本领域中是众所周知的，并且在本文中进一步做了详细定义。因此，包括约70％至约80％或约81％至约90％，或甚至约91％至约99％的与对照多肽的氨基酸相同或在功能上等同的氨基酸，只要维持蛋白质的生物学活性即可。在某些方面，重组蛋白的生物学功能可以与其天然对应物相同。

还应当理解，氨基酸和核酸序列可以包括其他残基，例如其他N-或C-末端氨基酸或5'或3'序列，但仍基本上如所公开的序列之一所示，只要序列满足上述标准即可，包括在涉及蛋白质表达的情况下维持生物蛋白质活性。末端序列的添加特别适用于这样的核酸序列，该核酸序列可以例如包括位于编码区5'或3'部分侧翼的各种非编码序列，或者可以包括各种已知出现在基因内的内部序列，即内含子。

如本文所用，蛋白质或肽通常是指但不限于大于约200个氨基酸、最多从基因翻译的全长序列的蛋白质，大于约100个氨基酸的多肽，和/或约3至约100个氨基酸的肽。为了方便起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。

如本文所用，“氨基酸残基”是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸中断氨基酸残基的序列。在其他实施方案中，该序列可以包含一个或多个非氨基酸部分。在具体实施方案中，蛋白质或肽的残基序列可以被一个或多个非氨基酸部分中断。

因此，术语“蛋白质或肽”涵盖包含在天然存在的蛋白质中发现的20种常见氨基酸中的至少一种或至少一种修饰的或不常见氨基酸的氨基酸序列。

本发明的某些实施方案涉及融合蛋白。这些分子可具有在N或C末端连接于异源结构域的治疗性蛋白。例如，融合还可以使用来自其他物种的前导序列来允许蛋白质在异源宿主中的重组表达。另一种有用的融合包括添加蛋白亲和标签，例如血清白蛋白亲和标签或六个组氨酸残基，或免疫活性结构域，例如抗体表位，优选切割的抗体表位，以促进融合蛋白的纯化。非限制性亲和标签包括聚组氨酸、几丁质结合蛋白(chitin bindingprotein,CBP)、麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)。

生成融合蛋白的方法是本领域技术人员众所周知的。可以例如通过从头合成完整的融合蛋白，或通过连接编码异源结构域的DNA序列，然后表达完整的融合蛋白来产生此类蛋白。

通过将基因与编码肽接头的桥接DNA片段连接起来，可以促进恢复亲本蛋白功能活性的融合蛋白的产生，该肽接头在串联连接的多肽之间被剪接。接头的长度应足以允许所得融合蛋白正确折叠。

II.剪接调节剂

代表性的剪接修饰剂是LMI070(Spinraza

仅在存在LMI070的情况下才包括新外显子，并且可以在本公开系统中用于控制基因表达的选择性剪接事件的实例包括但不限于SF3B3(chr16:70,526,657-70,529,199)、BENC1(chr17:42,810,759-42,811,797)、GXYLT1(chr12:42,087,786-42,097,614)、SKP1(chr5:134,173,809-134,177,053)、C12orf4(chr12:4,536,017-4,538,508)、SSBP1(chr7:141,739,167-141,742,229)、RARS(chr5:168,517,815-168,519,190)、PDXDC2P(chr16:70,030,988-70,031,968)、STRADB(chr2:201,469,953-201,473,076)、WNK1(chr12:894,562-896,732)、WDR27(chr6:169,660,663-169,662,424)、CIP2A(chr3:108,565,355-108,566,638)、IFT57(chr3:108,191,521-108,206,696)、WDR27(chr6:169,660,649-169,662,458)、HTT(chr4:3,212,555-3,214,145)、SKA2(chr17:59,112,228-59,119,514)、EVC(chr4:5,733,318-5,741,822)、DYRK1A(chr21:37,420,144-37,473,056)、GNAQ(chr9:77,814,652-77,923,557)、ZMYM6(chr1:35,019,257-35,020,472)、CYB5B(chr16:69,448,031-69,459,160)、MMS22L(chr6:97,186,342-97,229,533)、MEMO1(chr2:31,883,262-31,892,301)和PNISR(chr6:99,416,278-99,425,413)。LMI070的存在增强了新外显子的内含并且可以在本公开系统中用于控制基因表达的选择性剪接事件的实例包括但不限于CACNA2D1(chr7:82,066,406-82,084,958)、SSBP1(chr7:141,739,083-141,742,248)、DDX42(chr17:63,805,048-63,806,672)、ASAP1(chr8:130,159,817-130,167,688)、DUXAP10(chr14:19,294,564-19,307,199)、AVL9(chr7:32,558,783-32,570,372)、DYRK1A(chr21:37,419,920-37,472,960)、FAM3A(chrX:154,512,311-154,512,939)、FHOD3(chr18:36,740,620-36,742,886)、TBCA(chr5:77,707,994-77,777,000)、MZT1(chr13:72,718,939-72,727,611)、LINC01296(chr14:19,092,877-19,096,652)、SF3B3(chr16:70,541,627-70,544,553)、SAFB(chr19:5,654,060-5,654,457)、GCFC2(chr2:75,702,163-75,706,652)、MRPL45(chr17:38,306,450-38,319,088)、SPIDR(chr8:47,260,788-47,280,196)、DUXAP8(chr22:15,815,315-15,828,713)、PDXDC1(chr16:15,008,772-15,009,763)、MAN1A2(chr1:117,442,104-117,461,030)、RAF1(chr3:12,600,376-12,604,350)和ERGIC3(chr20:35,548,787-35,554,452)。对于上述列表，每个基因组位置均包括LMI070靶向的上游和下游外显子以及间插内含子序列(intervening intronic sequence)。

还包括可以使用的诸如LMI070等剪接调节剂的类似物，例如6-(萘-2-基)-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；6-(苯并[b]噻吩-2-基)-N-甲基-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；2-(6-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基氨基)-哒嗪-3-基)苯酚；2-(6-(甲基-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯并[b]-噻吩-5-腈；6-(喹啉-3-基)-N-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；3-(苯并[b]-噻吩-2-基)-6-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基氧基)哒嗪；2-(6-(甲基-(2,2,6,6-四-甲基哌啶-4-基)氨基)-哒嗪-3-基)苯酚；6-(6-(甲基-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)-哒嗪-3-基)萘-2-醇；6-(苯并[b]-噻吩-2-基)-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；7-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)异喹啉；6-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基y)哒嗪-3-基)异喹啉；N-甲基-6-(喹啉-7-基)-N-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；N-甲基-6-(喹啉-6-基)-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；6-(异喹啉-7-基)-N-甲基-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；6-(异喹啉-6-基)-N-甲基-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；6-(咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基-哒嗪-3-基)-甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-胺；甲基-[6-(6-苯基-吡啶-3-基)-哒嗪-3-基]-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-胺；甲基-[6-(6-吡咯-1-基-吡啶-3-基)-哒嗪-3-基]-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-胺；甲基-[6-(6-吡唑-1-基-吡啶-3-基)-哒嗪-3-基]-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-胺；甲基-(6-喹喔啉-2-基-哒嗪-3-基)-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-胺；甲基-(6-喹啉-3-基-哒嗪-3-基)-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-胺；N-甲基-6-(酞嗪-6-基)-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；6-(苯并[c][1,2,5]噁二唑-5-基)-N-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；6-(苯并[d]噻唑-5-基)-N-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；6-(2-甲基苯并-[d]噁唑-6-基)-N-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；5-氯-2-(6-(甲基(1,2,2,6,6-五甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；3-(6-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；5-氯-2-(6-(1,2,2,6,6-五甲基哌啶-4-基氨基)哒嗪-3-基)苯酚；4-羟基-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苄腈；3-[6-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基氧基)-哒嗪-3-基]-萘-2-醇；2-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-4-三氟甲基-苯酚；2-氟-6-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-苯酚；3,5-二甲氧基-2-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-苯酚；4,5-二甲氧基-2-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-苯酚；5-甲氧基-2-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]哒嗪-3-yl}-苯酚；4,5-二氟-2-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-苯酚；5-氟-2-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-苯酚；3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苄腈；1-烯丙基-6-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；6-(苯并[b]噻吩-2-基)-N-(1,2,2,6,6-五甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；N-烯丙基-3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯甲酰胺；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；5-(5-甲基-噁唑-2-基)-2-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]哒嗪-3-yl}-苯酚；5-(4-羟甲基)-1H-吡唑-1-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(1H-咪唑-1-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(3-氨基-吡唑-1-基)-2-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]哒嗪-3-yl}-苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1-(2-吗啉代-乙基)-1H-吡唑-4-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯酚；5-(5-氨基-1H-吡唑-1-基)-2-(6-(甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-4-(1H-吡唑-1-基)苯酚；2-{6-[(2-羟基-乙基)-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]哒嗪-3-yl}-5-吡唑-1-基-苯酚；2-(6-(哌啶-4-基氧基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；2-(6-(((2S,4R,6R)-2,6-二甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；2-(6-((-2,6-二甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；2-(6-((-2,6-二甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；5-(1H-吡唑-1-基)-2-(6-(吡咯烷-3-基氧基)哒嗪-3-基)苯酚；2-(6-((-2-甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；(S)-5-(1H-吡唑-1-基)-2-(6-(吡咯烷-3-基甲氧基)哒嗪-3-基)苯酚；(R)-5-(1H-吡唑-1-基)-2-(6-(吡咯烷-3-基甲氧基)哒嗪-3-基)苯酚；2-(6-((3-氟哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)-苯酚；2-[6-(1,2,2,6,6-五甲基-哌啶-4-基氧基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；5-吡唑-1-基-2-[6-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基氧基)-哒嗪-3-基]-苯酚；5-(1H-吡唑-4-基)-2-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)苯酚；2-(6-哌嗪-1-基-哒嗪-3-基)-5-吡唑-1-基-苯酚；3-[6-(氮杂环丁烷-3-基氨基)-哒嗪-3-基]-萘-2-醇；2-[6-(氮杂环丁烷-3-基氨基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(3,5-二甲基-哌嗪-1-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(7-甲基-2,7-二氮杂螺[4.4]壬-2-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-(6-[1,4]二氮杂-1-基-哒嗪-3-基)-5-吡唑-1-基-苯酚；2-{6-[4-(2-羟基-乙基)-哌嗪-1-基]-哒嗪-3-yl}-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(3,6-二氮杂-二环[3.2.1]辛-3-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(2,7-二氮杂螺[3.5]壬-7-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(3-羟基-甲基-哌嗪-1-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(4-氨基-4-甲基-哌啶-1-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(3-二甲基-氨基-哌啶-1-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(1,2,2,6,6-五甲基-哌啶-4-基氨基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-[6-(3,3-二甲基-哌嗪-1-基)-哒嗪-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚；2-(6-(7-(2-羟乙基)-2,7-二氮杂螺[4.4]-壬-2-基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；2-(6-((3aR,6aS)-六氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1H)-基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；3-(6-(哌嗪-1-基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；5-吡唑-1-基-2-[6-(1,2,3,6-四氢-吡啶-4-基)-哒嗪-3-基]-苯酚；2-(6-哌啶-4-基-哒嗪-3-基)-5-吡唑-1-基-苯酚；3-(6-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；3-(6-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；3-(6-(2,2,6,6-四甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；3-(6-(1-甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；3-(6-(哌啶-4-基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；3-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；3-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；[3-(7-羟基-6-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-萘-2-基氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯；7-(3-氨基-丙氧基)-3-{6-[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-萘-2-醇；N-[3-(7-羟基-6-{6[甲基-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-4-基)-氨基]-哒嗪-3-yl}-萘-2-基氧基)-丙基]-乙酰胺；7-(3-羟基丙氧基)-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；7-(3-甲氧基丙氧基)-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；7-(2-吗啉代乙氧基)-3-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；3-(6-(哌啶-4-yl甲基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；5-(1H-吡唑-1-基)-2-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)甲基)哒嗪-3-基)苯酚；3-甲氧基-2-(6-(甲基(2,2,6-三甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(5-甲基噁唑-2-基)苯酚；2-(6-((6S)-6-((S)-1-羟乙基)-2,2-二甲基哌啶-4-基氧基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；7-羟基-6-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-2-萘甲腈；3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-7-(哌啶-1-yl甲基)萘-2-醇；3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-7-(吡咯烷-1-yl甲基)萘-2-醇；1-溴-6-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；1-氯-6-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2,7-二醇；7-甲氧基-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；7-甲氧基-3-(6-(甲基(1,2,2,6,6-五甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；7-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-7-(四氢-2H-吡喃-4-基)萘-2-醇；7-(二氟甲基)-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；7-((4-羟基-2-甲基丁-2-基)氧基)-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；7-(3-羟基-3-甲基丁氧基)-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)萘-2-醇；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯-1,3-二醇l；3-甲氧基-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯酚；5-(1H-吡唑-4-基)-2-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-3-(三氟甲氧基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(三氟甲氧基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)-3-(三氟甲氧基)苯酚；4-(3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(三氟甲氧基)苯基)1-甲基吡啶-2(1H)-酮；3-甲氧基-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯酚；3-甲氧基-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)苯酚；3-甲氧基-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(吡啶-3-基)苯酚；5-(1-环戊基-1H-吡唑-4-基)-3-甲氧基-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；3′,5-二甲氧基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-[1,1′-二苯基]-3-醇；3-(苄氧基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(5-甲基噁唑-2-基)苯酚；3-乙氧基-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(5-甲基噁唑-2-基)苯酚；3-(环丙基甲氧基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)-哒嗪-3-基)-5-(5-甲基噁唑-2-基)苯酚；2-甲基-5-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-1H-苯并[d]咪唑并l-6醇；5-氯-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(1H-吡唑-1-基)-2-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；3-羟基-4-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苄腈；2-(6-((2,2-二甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-1-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-4-(1H-吡唑-4-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-4-(4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-4-(4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)苯酚；4-(1H-吲哚l-2-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；4-(1-环戊烯-1-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-4-(1H-吡唑-3-基)苯酚；4-(4-羟基-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)吡啶-2-醇；4-(4-羟基-3-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)苯基)1-甲基吡啶-2(1H)-酮；4-(4-羟基-3-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)苯基)吡啶-2-醇；5-(1H-吲唑-7-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；4-氯-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯酚；4-氟-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯酚；5-氟-4-(1H-咪唑-4-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-氟-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-4-(1H-吡唑-4-基)苯酚；5-氟-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-4-(1H-吡唑-5-基)苯酚；6-羟基-5-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮；6-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-1,4-二氢茚并[1,2-c]吡唑-7-醇；6-羟基-5-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮肟盐酸盐；5-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-2,3-二氢-1H-茚-1,6-二醇；2-氨基-6-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-8H-茚并[1,2-d]噻唑-5醇盐酸盐；9-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5,6-二氢咪唑并[5,1-a]异喹啉-8醇盐酸盐；4-羟基-3-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-N-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)苯甲酰胺；4-(4-(羟甲基)-1H-吡唑-1-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(1H-吡唑-4-基)-2-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)甲基)哒嗪-3-基)苯酚；6-(3-(苄氧基)异喹啉-6-基)-N-甲基-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；6-(1-(苄氧基)异喹啉-7-基)-N-甲基-N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哒嗪-3-胺；3-氟-5-(2-甲氧基吡啶-4-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚盐酸盐；4-(3-氟-5-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)吡啶-2(1H)-酮盐酸盐；4-(3-氟-5-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)-1-甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐；5-(3-氟-5-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)-1-甲基吡啶-2(1H)-酮盐酸盐；3-氟-5-(1H-吡唑-4-基)-2-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)苯酚盐酸盐；5-氯-3-氟-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚盐酸盐；3-氟-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯酚盐酸盐；3-氟-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯酚盐酸盐；5-(5-甲氧基吡啶-3-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(3-羟基-4-(6-甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)吡啶-2醇；4-(3-羟基-4-(6-甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)吡啶-2醇；5-(6-甲氧基吡啶-3-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)-3-(三氟甲基)吡啶-2醇；5-(3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)-1-甲基吡啶-2(1H)-酮；4-(3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)-1-甲基吡啶-2(1H)-酮；5-(2-甲氧基吡啶-4-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；4-(3-羟基-4-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)苯基)吡啶-2醇；5-(6-(二甲基氨基)吡啶-3-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；4-(3-羟基-4-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)苯基)1-甲基吡啶-2(1H)-酮；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(嘧啶-5-基)苯酚；5-(3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)吡啶-3醇；1-环丙基-4-(3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)吡啶-2(1H)-酮；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯酚；5-(1-环戊烯-1-基)(cyclopent-1-en-1-yl)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(咪唑并[1,5-a]吡啶-7-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(2-甲基吡啶-4-基)苯酚；5-(1H-咪唑-2-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(1H-咪唑-4-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；5-(咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(4-硝基-1H-咪唑-2-基)苯酚；2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)-5-(2-甲基-1H-咪唑-4-基)苯酚；5-(1,2-二甲基-1H-咪唑-4-基)-2-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯酚；1-(3-羟基-4-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)苯基)-1H-吡唑-4-甲酰胺；2-(6-((3aR,6aS)-5-(2-羟乙基)六氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1H)-基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯酚；2-(6-((3aR,6aS)-六氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1H)-基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯酚；2-(6-((3aR,6aS)-5-甲基六氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1H)-基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯酚；4-(3-羟基-4-(6-(5-甲基六氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1H)-基)哒嗪-3-基)苯基)1-甲基吡啶-2(1H)-酮；4-(3-羟基-4-(6-((3aR,6aR)-1-甲基六氢吡咯并[3,4-b]吡咯-5(1H)-基)哒嗪-3-基)苯基)1-甲基吡啶-2(1H)-酮；2-(6-(2,7-二氮杂螺[4.5]癸-2-基)哒嗪-3-基)-5-(1H-吡唑-4-基)苯酚；和4-(4-(6-(2,7-二氮杂螺[4.5]癸-2-基)哒嗪-3-基)-3-羟苯基)-1-甲基吡啶-2(1H)-酮。

另外一个代表性的剪接调节剂是具有下述结构的RG7916(Roche/PTC/SMAF,

另一个代表性的剪接调节剂是具有下述结构的RG7800(Roche)：

RG7800化学结构

CAS号：1449598-06-4。

还包括可以使用的诸如RG7916和RG7800等剪接调节剂的类似物，例如2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aS)-8a-甲基-1,3,4,6,7,8-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aR)-8a-甲基-1,3,4,6,7,8-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-(1,4-二氮杂-1-基)-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-(1,4-二氮杂-1-基)-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aS)-8a-甲基-1,3,4,6,7,8-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aR)-8a-甲基-1,3,4,6,7,8-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-(4,7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-(4,7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)-9-甲基-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-(4,7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(3S,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-(4,7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(3S,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；和7-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-[(3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基]-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-9-甲基-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-氟-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；7-氟-9-甲基-2-(2-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；2-(2,8-二甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基)-7-氟-9-甲基-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；或其药学上可接受的盐。

剪接调节剂的另一个代表性家族是美国专利号9,682,993公开的化合物(舒丁霉素)，包括(5',Z)-5-(((lR,4R)-4-((2JE',4JE)-5-((3R,55')-7,7-二甲基-l,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基-2,4-戊二烯-l-基)环己基)氨基)-5-氧-3-戊烯-2-基氨基甲酸甲酯和(5',Z)-5-(((lR,4R)-4-((2JE',4JE)-5-((3R,55')-7,7-二甲基-l,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基-2,4-戊二烯-l-基)环己基)氨基)-5-氧-3-戊烯-2-基二甲基氨基甲酸酯。

剪接调节剂的又一个代表性家族是普拉二烯内酯(pladienolide)化合物，包括在以下专利申请中公开的那些：WO 2002/060890、WO 2004/01 1459、WO 2004/011661、WO2004/050890、WO 2005/052152、WO 2006/009276、WO 2008/126918和WO 2015/175594，每个申请都通过引用并入本文。普拉二烯内酯化合物的一个实例是(8E,12E,14E)-7-((4-环庚基哌嗪-1-基)羰基)氧基-3,6,16,21-四羟基-6,10,12,16,20-五甲基-18,19-环氧二十三(epoxytricosa)-8,12,14-三乙撑四胺(trien)-11-内酯，也称为E7107，其是天然产物普拉二烯内酯D的半合成衍生物。

III.给药方法

可以通过本文描述的方法或用途来施用或治疗任何合适的细胞或哺乳动物。通常，疑似具有或表达与疾病状态相关的反常或异常蛋白的哺乳动物需要本文所述的方法。

哺乳动物的非限制性示例包括人、非人类灵长类(例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家畜(例如狗和猫)、农场动物(例如马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。在某些实施方案中，哺乳动物是非啮齿类哺乳动物(例如人、猪、山羊、绵羊、马、狗等)。在某些实施方案中，非啮齿类哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。在某些实施方案中，哺乳动物可以是动物疾病模型，例如具有或表达与疾病状态相关的反常或异常蛋白的动物模型，或蛋白质表达不足而引起疾病状态的动物模型。

本文所述方法或组合物治疗的哺乳动物(个体)包括成人(18岁或以上)和儿童(小于18岁)。成人包括老人。代表性成年人的年龄为50岁或以上。儿童的年龄范围为1-2岁，或2-4岁、4-6岁、6-18岁、8-10岁、10-12岁、12-15岁和15-18岁。儿童还包括婴儿。婴儿的年龄通常为1-12个月。

在某些实施方案中，方法包括向本文所述哺乳动物施用多个病毒颗粒或纳米颗粒，其中降低、减少、预防、抑制或延迟疾病状态例如神经退行性疾病的一种或多种症状发作的严重性、频率、进展或时间。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物施用多个病毒颗粒或纳米颗粒，以治疗疾病状态例如神经退行性疾病的不良症状。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物施用多个病毒颗粒或纳米颗粒，以稳定、延迟或预防疾病状态例如神经退行性疾病的恶化或进展或逆转和不良症状。

在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物的中枢神经系统或本文所述的其一部分施用多个病毒颗粒或纳米颗粒，从而将病状态例如神经退行性疾病的一种或多种症状发作的严重性、频率、进展或时间降低、减少、预防、抑制或延迟至少约5至约10天、约10至约25天、约25至约50天或约50至约100天。

在某些实施方案中，症状或副作用包括早期、中期或晚期症状；行为、性格或语言症状；吞咽、运动、癫痫、震颤或烦躁症状；共济失调；和/或认知症状，例如记忆力、组织能力。

在一些实施方案中，基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。这样的方法可以用于向培养的细胞或宿主生物的细胞施用编码抑制性RNA、治疗性蛋白或CRISPR系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如本文所述载体的转录本)、裸核酸和与诸如脂质体的递送载体(vehicle)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，它们在递送到细胞中后具有游离基因组或整合的基因组。有关基因治疗程序的综述，请参见Anderson,1992；Nabel&Feigner,1993；Mitani&Caskey,1993；Dillon,1993；Miller,1992；Van Brunt,1988；Vigne,1995；Kremer&Perricaudet,1995；Haddada et al.,1995；and Yu et al.,1994。

核酸的非病毒递送方法包括外泌体、脂转染、核转染、显微注射、基因枪法、病毒微体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体和试剂增强型DNA摄取(agent-enhanced uptake of DNA)。脂转染描述于(例如U.S.Pat.Nos.5,049,386,4,946,787；和4,897,355)，并且脂转染试剂在市场上有售(例如Transfectam

在一些实施方案中，递送经由使用递送核酸的RNA或DNA病毒基系统。在某些方面，病毒载体可以直接(体内)施用于患者，或者它们可以用于体外或离体治疗细胞，然后施用于患者。在一些实施方案中，病毒基系统包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。

A.病毒载体

术语“载体(vector)”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体)或可以通过插入或掺入核酸来操纵的其他载体(vehicle)。载体，例如病毒载体，可以用于将核酸序列引入/转移到细胞中，从而其中的核酸序列被转录，并且如果编码蛋白质的话，则随后被细胞翻译。

“表达载体”是专门的载体，其含有具有在宿主细胞中表达所需的必需调控区的基因或核酸序列。表达载体可以至少含有用于在细胞中增殖的复制起点和任选的其他元件，例如异源核酸序列、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、ITR和多腺苷酸化信号。

病毒载体衍生自或基于一种或多种包含病毒基因组的核酸元件。示例性病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。

术语“重组”，作为诸如重组病毒，例如慢病毒或细小病毒(例如，AAV)载体的修饰语，以及诸如重组核酸序列和多肽等序列的修饰语，是指这些组合物已经以自然界中通常不会发生的方式受到了操纵(即改造)。重组载体，例如AAV、逆转录病毒或慢病毒载体的具体实例是，将野生型病毒基因组中通常不存在的核酸序列插入病毒基因组中。重组核酸序列的实例是，核酸(例如基因)编码克隆到载体中的抑制性RNA，该RNA具有或不具有该基因通常与病毒基因组相关的5′、3′和/或内含子区域。尽管术语“重组”在本文中并不总是用于指代载体，例如病毒载体，以及诸如多核苷酸等序列，但是尽管如此，仍明确包括包括“重组”形式，包括核酸序列、多核苷酸、转基因等在内。

重组病毒“载体”通过以下方式衍生自病毒的野生型基因组，例如AAV、逆转录病毒或慢病毒：使用分子方法从病毒中除去野生型基因组并替换为非天然核酸，例如核酸序列。通常，例如，对于AAV，将AAV基因组的一个或两个末端反向重复(ITR)序列保留在重组AAV载体中。“重组”病毒载体(例如rAAV)与病毒(例如AAV)基因组有所区别，因为相对于病毒基因组核酸，全部或部分病毒基因组已被非天然序列替代，例如编码反式激活子的核酸，或编码抑制性RNA的核酸，或编码治疗性蛋白的核酸。因此，这种非天然核酸序列的掺入将病毒载体定义为“重组”载体，在AAV的情况下，其可以称为“rAAV载体”。

1.腺相关病毒

腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(parvoviridae)的小型非致病病毒。迄今为止，已经鉴定出许多血清学上不同的AAV，并且已经从人或灵长类中分离出十几种。AAV与该家族其他成员的区别在于它的复制依赖辅助病毒。

AAV基因组可以以染色体外状态存在，而不整合到宿主细胞基因组中；拥有广泛的宿主；在体外和体内均可转导分裂细胞和非分裂细胞，并维持高水平的转导基因表达。AAV病毒颗粒具有热稳定性；耐溶剂、去污剂、pH和温度变化；并且可以进行柱纯化和/或在CsCl梯度上或通过其他方式浓缩。AAV基因组包含正链或负链的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。AAV的约5kb的基因组由正负两个单链DNA的一个片段组成。基因组的末端是短的末端反向重复(ITR)，该末端反向重复可以折叠成发夹结构，并作为病毒DNA复制的起点。

AAV“基因组”指经最终包装或封装而形成AAV颗粒的重组核酸序列。AAV颗粒通常包含用AAV衣壳蛋白包装的AAV基因组。在重组质粒用于构建或制造重组载体的情况下，AAV载体基因组不包括“质粒”中与重组质粒的载体基因组序列不对应的部分。重组质粒的这一非载体基因组部分称为“质粒骨架”，该骨架对于质粒的克隆和扩增很重要，这是增殖和重组病毒生产所必需的过程，但本身并没有包装或封装到病毒颗粒中。因此，AAV载体“基因组”是指AAV衣壳蛋白包装或封装的核酸。

AAV病毒体(颗粒)是直径约25nm的非包裹的二十面体颗粒。AAV颗粒包含由三个相关衣壳蛋白VP1、VP2和VP3组成的二十面体对称性，这三个相关的衣壳蛋白相互作用，一起形成衣壳。正确的ORF通常编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。通常发现这些蛋白质的比例分别为1:1:10，但比例可能有所不同，并且都衍生自右侧的ORF。VP1、VP2和VP3衣壳蛋白通过使用选择性剪接的和不寻常的起始密码子而彼此不同。缺失分析表明，从选择性剪接的信息翻译而来的VP1的去除或改变导致传染性颗粒产量降低。VP3编码区域的突变导致无法产生任何单链后代DNA或感染性颗粒。

AAV颗粒是包含AAV衣壳的病毒颗粒。在某些实施方案中，AAV颗粒的基因组编码VP1、VP2和VP3多肽中的一个、两个或全部。

大多数天然AAV的基因组通常包含两个开放阅读框(ORF)，它们有时称为左ORF和右ORF。左ORF通常编码非结构性Rep蛋白、Rep 40、Rep 52、Rep 68和Rep 78，除了产生单链子代基因组外，它们还参与复制和转录的调控。Rep蛋白中的两个与AAV基因组优先整合到人类19号染色体q臂区有关。已证明Rep68/78具有NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。一些Rep蛋白具有核定位信号以及几个潜在的磷酸化位点。在某些实施方案中，AAV(例如，rAAV)的基因组编码一些或所有Rep蛋白。在某些实施方案中，AAV(例如，rAAV)的基因组不编码Rep蛋白。在某些实施方案中，一种或多种Rep蛋白可以反式递送，因此不包括在包含编码多肽的核酸的AAV颗粒中。

AAV基因组的末端包含短的末端反向重复(ITR)，该末端反向重复有可能折叠成担任病毒DNA复制起点的T形发夹结构。因此，AAV的基因组包含位于单链病毒DNA基因组侧翼的一个或多个(例如，一对)ITR序列。每个ITR序列的长度通常为约145个碱基。在ITR区内，已经描述了两个被认为对ITR功能至关重要的元件，即GAGC重复基序和末端分解位点(terminal resolution site,trs)。已证明当ITR呈线性或发夹构型时，重复基序与Rep结合。这种结合被认为将Rep68/78定位在trs处，用于进行以位点和链特异性方式发生的切割。这两个元件除了在复制中的作用外似乎对病毒整合至关重要。第19染色体的整合位点中包含具有邻近trs的Rep结合位点。已证明这些元件是功能性的，并且是基因座特异性整合所必需的。

在某些实施方案中，AAV(例如，rAAV)包含两个ITR。在某些实施例中，AAV(例如，rAAV)包含一对ITR。在某些实施方案中，AAV(例如，rAAV)包含一对位于至少编码具有功能或活性的多肽的核酸序列侧翼(即在每个5′和3′末端)的ITR。

AAV载体(例如，rAAV载体)可以加以包装，并在本文中称为“AAV颗粒”，用于细胞的后续离体、体外或体内感染(转导)。如果将重组AAV载体封装或包装到AAV颗粒中，则该颗粒也可以称为“rAAV颗粒”。在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAV颗粒。rAAV颗粒通常包含rAAV载体或其一部分。rAAV颗粒可以是一种或多种rAAV颗粒(例如，多种AAV颗粒)。rAAV颗粒通常包含封装或包装rAAV载体基因组的蛋白质(例如衣壳蛋白)。注意，提到rAAV载体也可以用于表示rAAV颗粒。

任何合适的AAV颗粒(例如，rAAV颗粒)都可以用于本文的方法或用途。rAAV颗粒和/或其中包含的基因组可以衍生自AAV的任何合适的血清型或毒株。rAAV颗粒和/或其中包含的基因组可以衍生自AAV的两种或更多种血清型或毒株。因此，rAAV可以包含AAV的任何血清型或毒株的蛋白质和/或核酸或其部分，其中AAV颗粒适合感染和/或转导哺乳动物细胞。AAV血清型的非限制性实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10和AAV-2i8。

在某些实施方案中，多个rAAV颗粒包含相同毒株或血清型(或亚组或变体)或衍生自相同毒株或血清型(或亚组或变体)的颗粒。在某些实施方案中，多种rAAV颗粒包含两种或更多种不同的rAAV颗粒(例如，不同血清型和/或毒株)的混合物。

如本文所用，术语“血清型”是用于表示AAV具有衣壳的在血清学上不同于其他AAV血清型的区别。血清区别性是基于与另一种AAV相比针对一种AAV的抗体之间缺乏交叉反应性来确定的。这样的交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)所致。尽管包括衣壳变体在内的AAV变体可能在血清学上与参考AAV或其他AAV血清型没有区别，但与参考AAV血清型或其他AAV血清型相比，它们至少相差一个核苷酸或氨基酸残基。

在某些实施方案中，rAAV颗粒不包括某些血清型。在一个实施方案中，rAAV颗粒不是AAV4颗粒。在某些实施方案中，rAAV颗粒在抗原或免疫学上不同于AAV4。区别可以通过标准方法来确定。例如，可以用ELISA和蛋白质印迹来确定病毒颗粒在抗原或免疫学上是否不同于AAV4。此外，在某些实施方案中，rAAV2颗粒保留不同于AAV4的组织向性。

在某些实施方案中，基于第一血清型基因组的rAAV载体对应于包装该载体的一种或多种衣壳蛋白的血清型。例如，包含AAV载体基因组的一种或多种AAV核酸(例如，ITR)的血清型对应于包含rAAV颗粒的衣壳的血清型。

在某些实施方案中，rAAV载体基因组可以基于不同于包装载体的一种或多种AAV衣壳蛋白的血清型的AAV(例如，AAV2)血清型基因组。例如，rAAV载体基因组可以包含AAV2衍生的核酸(例如ITR)，而三种衣壳蛋白中的至少一种或多种衍生自不同的血清型，例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8血清型或其变体。

在某些实施方案中，与参考血清型有关的rAAV颗粒或其载体基因组所具有的多核苷酸、多肽或其子序列包含或组成为，与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8颗粒的多核苷酸、多肽或子序列相同至少60％或更多(例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)的序列。在具体实施方案中，与参考血清型有关的rAAV颗粒或其载体基因组所具有的衣壳或ITR序列包含或组成为，与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8血清学的衣壳或ITR序列相同至少60％或更多(例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)的序列。

在某些实施方案中，本文的方法包括使用、施用或递送rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rRh10、rRh74或rAAV-2i8颗粒。

在某些实施方案中，本文的方法包括使用、施用或递送rAAV2颗粒。在某些实施方案中，rAAV2颗粒包含AAV2衣壳。在某些实施方案中，rAAV2颗粒包含一种或多种衣壳蛋白(例如VP1、VP2和/或VP3)，该衣壳蛋白与天然或野生型AAV2颗粒的相应衣壳蛋白相同至少60％、65％、70％、75％或更多，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最多100％。在某些实施方案中，rAAV2颗粒包含的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白与天然或野生型AAV2颗粒的相应衣壳蛋白相同至少75％或更多，例如80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最多100％。在某些实施方案中,rAAV2颗粒是天然或野生型AAV2颗粒的变体。在一些方面，与天然或野生型AAV2颗粒的衣壳蛋白相比，AAV2变体的一种或多种衣壳蛋白具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多个氨基酸取代。

在某些实施方案中，rAAV9颗粒包含AAV9衣壳。在某些实施方案中，rAAV9颗粒包含一种或多种衣壳蛋白(例如VP1、VP2和/或VP3)，该衣壳蛋白与天然或野生型AAV9颗粒的相应衣壳蛋白相同至少60％、65％、70％、75％或更多，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最多100％。在某些实施方案中，rAAV9颗粒包含的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白与天然或野生型AAV9颗粒的相应衣壳蛋白相同至少75％或更多，例如80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％，最多100％。在某些实施方案中，rAAV9颗粒是天然或野生型AAV9颗粒的变体。在一些方面，与天然或野生型AAV9颗粒的衣壳蛋白相比，AAV9变体的一种或多种衣壳蛋白具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多个氨基酸取代。

在某些实施方案中，rAAV颗粒包含一种或两种ITR(例如，一对ITR)，该ITR与天然或野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10或AAV-2i8的相应ITR相同至少75％或更多，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％，等最多100％，只要它们保留一种或多种所需的ITR功能(例如，形成发夹的能力，这允许DNA复制；将AAV DNA整合到宿主细胞基因组中；和/或如果需要进行包装)即可。

在某些实施方案中，rAAV2颗粒包含一种或两种ITR(例如，一对ITR)，该ITR与天然或野生型AAV2颗粒的相应ITR相同至少75％或更多，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最多100％，只要它们保留一种或多种所需的ITR功能(例如形成发夹的能力，这允许DNA复制；将AAV DNA整合到宿主细胞基因组中；和/或如果需要进行包装即可。

在某些实施方案中，rAAV9颗粒包含一种或两种ITR(例如，一对ITR)，该ITR与天然或野生型AAV2颗粒的相应ITR相同至少75％或更多，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等，最多100％，只要它们保留一种或多种所需的ITR功能(例如形成发夹的能力，这允许DNA复制；将AAV DNA整合到宿主细胞基因组中；和/或如果需要进行包装)即可。

rAAV颗粒包含的ITR可以具有任何合适数目的“GAGC”重复。在某些实施方案中，AAV2颗粒的ITR包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个“GAGC”重复。在某些实施方案中，rAAV2颗粒包含的ITR包含三个“GAGC”重复。在某些实施方案中，rAAV2颗粒包含的ITR具有少于四个“GAGC”重复。在某些实施方案中，rAAV2颗粒包含的ITR具有四个以上的“GAGC”重复。在某些实施方案中，rAAV2颗粒的ITR包含Rep结合位点，其中前两个“GAGC”重复的第四个核苷酸是C而不是T。

可以掺入rAAV载体中以包装/封装成rAAV颗粒的示例性的合适DNA长度可以为约5kb或更少。在具体实施方案中，DNA的长度小于约5kb，小于约4.5kb，小于约4kb，小于约3.5kb，小于约3kb或小于约2.5kb。

可以使用本领域已知的合适重组技术(例如参见Sambrook et al.,1989)来生成包括指导RNAi或多肽表达的核酸序列的rAAV载体。通常将重组AAV载体包装成具有转导能力的AAV颗粒，并使用AAV病毒包装系统进行增殖。具有转导能力的AAV颗粒能够结合并进入哺乳动物细胞并随后将核酸货物(例如异源基因)递送至细胞核。因此，将具有转导能力的完整rAAV颗粒配置为转导哺乳动物细胞。配置为转导哺乳动物细胞的rAAV颗粒通常没有复制能力，并且需要其他蛋白质机制才能自我复制。因此，被配置为转导哺乳动物细胞的rAAV颗粒经改造结合并进入哺乳动物细胞并向该细胞递送核酸，其中用于递送的核酸通常位于rAAV基因组中的一对AAV ITR之间。

用于产生具有转导能力的AAV颗粒的合适宿主细胞包括但不限于可以或已经用作异源rAAV载体受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可以使用来自稳定的人细胞系HEK293(可通过例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)以登录号ATCC CRL1573获得的细胞)的细胞。在某些实施方案中，用修饰的人胚胎肾细胞系(例如HEK293)产生重组AAV颗粒，该细胞系是用5型腺病毒DNA片段转化的，并表达腺病毒E1a和E1b基因。修饰的HEK293细胞系易于转染，并提供了特别方便的产生rAAV颗粒的平台。产生能够转导哺乳动物细胞的高滴度AAV颗粒的方法是本领域已知的。例如，可以如Wright,2008和Wright,2009中所述制备AAV颗粒。

在某些实施方案中，通过在AAV表达载体转染之前或与其同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞，将AAV辅助功能引入宿主细胞。因此，有时将AAV辅助构建体用于至少提供AAVrep和/或cap基因的瞬时表达，以补充生产性AAV转导所必需的缺失AAV功能。AAV辅助构体通常缺少AAV ITR，并且既不能复制也不能包装自身。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，例如常用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45，它们编码Rep和Cap表达产物。编码Rep和/或Cap表达产物的许多其他载体，是已知的。

2.逆转录病毒

在本文的方法、组合物和用途中用作递送剂的病毒载体包括逆转录病毒载体(参见例如Miller(1992)Nature,357:455-460)。逆转录病毒载体非常适合将核酸递送到细胞中，因为它们能够将未重排的单拷贝基因递送到广泛的啮齿类动物、灵长类和人体细胞中。逆转录病毒载体整合到宿主细胞的基因组中。与其他病毒载体不同，它们仅感染分裂细胞。

逆转录病毒是RNA病毒，使得病毒基因组是RNA。当宿主细胞感染逆转录病毒时，基因组RNA被逆转录成DNA中间体，该中间体非常有效地整合到感染细胞的染色体DNA中。这种整合的DNA中间体称为原病毒。原病毒的转录和组装成传染性病毒，是在适当的辅助病毒存在下或在含有适当序列的细胞系中进行的，该序列允许封装而不会同时产生污染性辅助病毒。如果用于封装的序列是通过与适当载体共转染而提供的，则产生重组逆转录病毒不需要辅助病毒。

逆转录病毒基因组和原病毒DNA具有三个基因：gag、pol和env，其侧翼是两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白，env基因编码病毒包膜糖蛋白。pol基因编码的产物包括RNA指导的DNA聚合酶逆转录酶、整合酶以及蛋白酶，RNA指导的DNA聚合酶逆转录酶将病毒RNA转录成双链DNA，整合酶将逆转录酶产生的DNA整合到宿主染色体DNA中，蛋白酶的作用是加工编码的gag和pol基因。5'和3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和多腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。

逆转录病毒载体描述于Coffin et al.,Retroviruses,Cold Spring HarborLaboratory Press(1997)。逆转录病毒的实例是莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murineleukemia virus,MMLV)或鼠干细胞病毒(murine stem cell virus,MSCV)。逆转录病毒载体可以是具有复制能力的或是复制缺陷的。通常，逆转录病毒载体是复制缺陷型的，其中另外几轮病毒体复制和包装所必需的基因的编码区缺失或被其他基因替代。因此，一旦初始靶细胞被感染，病毒就无法继续其典型的裂解途径。此类逆转录病毒载体和产生此类病毒的必要试剂(例如包装细胞系)可商购获得(参见例如可从Clontech获得的逆转录病毒载体和系统，例如目录号634401、631503、631501等，Clontech,Mountain View,Calif.)。

可以通过用待递送的核酸分子替代复制所需的病毒基因，来产生作为递送的试剂的这种逆转录病毒载体。所得的基因组在每个末端都含有LTR，在LTR之间有一个或多个所需基因。产生逆转录病毒的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，国际公开的PCT申请号WO1995/026411)。可以在含有一个或多个辅助质粒的包装细胞系中产生逆转录病毒载体。包装细胞系提供衣壳产生和载体的病毒体成熟所需的病毒蛋白(例如gag、pol和env基因)。通常，使用至少两个单独的辅助质粒(分别含有gag和pol基因；和env基因)，以使载体质粒之间不会发生重组。例如，可以使用标准转染方法，例如磷酸钙介导的转染，将逆转录病毒载体转移到包装细胞系中。包装细胞系是本领域技术人员众所周知的，并且是可商购获得的。示例性包装细胞系是GP2-293包装细胞系(目录号631505、631507、631512，Clontech)。在制备病毒体足够时间后，收获病毒。如果需要，收获的病毒可用于感染第二包装细胞系，例如产生宿主嗜性不同的病毒。最终结果是没有复制性能力的包括感情线的核酸但缺少其他结构基因的重组逆转录病毒，从而不能在宿主细胞中形成新病毒。

阐明逆转录病毒载体在基因疗法中的用途的参考文献包括：Clowes et al.,(1994)J.Clin.Invest.93:644-651；Kiem et al.,(1994)Blood 83:1467-1473；Salmonsand Gunzberg(1993)Human Gene Therapy 4:129-141；Grossman and Wilson(1993)Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114；Sheridan(2011)Nature Biotechnology,29:121；Cassani et al.(2009)Blood,114:3546-3556。

3.慢病毒

慢病毒是复杂的逆转录病毒，除常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有其他具有调控或结构功能的基因。较高的复杂性使病毒能够像在潜伏感染过程中一样调节其生命周期。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒HIV-1HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒SIV。通过多重减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如使env、vif、vpr、vpu和nef基因缺失，从而使载体在生物学上是安全的。慢病毒载体是本领域众所周知的(参见例如美国专利6,013,516和5,994,136)。

重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可以用于体内和离体基因转移以及核酸序列的表达。例如，在美国专利5,994,136中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两种或更多种携带包装功能的载体转染，即gag、pol和env以及rev和tat，美国专利5,994,136通过引用并入本文。

慢病毒基因组和原病毒DNA具有逆转录病毒中发现的三个基因：gag、pol和env，其侧翼是两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和多腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有其他基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。

邻近5'LTR的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA衣壳化有效封装到颗粒(Psi位点)所需的序列。如果病毒基因组中缺少封装(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒体)所需的序列，则顺式缺陷会阻止基因组RNA封装。但是，所得突变体仍然能够指导所有病毒体蛋白的合成。

4.其他病毒载体

用于基因递送的病毒载体的开发和利用正在不断的改善和发展。考虑了其他病毒载体，如痘病毒；例如牛痘病毒(Gnant et al.,1999；Gnant et al.,1999)、α病毒；例如，辛德比斯病毒、森林脑炎病毒(Lundstrom,1999)、呼肠孤病毒(Coffey et al.,1998)和甲型流感病毒(Neumann et al.,1999)，用于本公开，并且可以根据本发明靶系统必要性能来选择。

5.嵌合病毒载体

正在开发嵌合或杂种病毒载体，用于治疗性基因递送，并且考虑用于本公开中。已经描述了嵌合痘病毒/逆转录病毒载体(Holzer et al.,1999)、腺病毒/逆转录病毒载体(Feng et al.,1997；Bilbao et al.,1997；Caplen et al.,2000)和腺病毒/腺相关病毒载体(Fisher et al.,1996；美国专利5,871,982)。这些“嵌合”病毒基因转移系统可以利用两种或更多种亲本病毒物种的有利特征。例如，Wilson等人(Wilson et al.)提供的嵌合载体构建体包含腺病毒的一部分、AAV 5'和3'ITR序列以及选择的转基因，如下所述(美国专利5,871,983，专门通过引用并入本文中)。

B.纳米颗粒

1.脂质基纳米颗粒

在一些实施方案中，脂质基纳米颗粒是脂质体、外来体、脂质制剂或另一脂质基纳米颗粒，例如脂质基囊泡(例如DOTAP：胆固醇囊泡)。脂质基纳米颗粒可以带正电、带负电或中性。

a.脂质体

“脂质体”是通用术语，涵盖各种通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的单层和多层脂质载体。脂质体可以被表征为具有囊泡结构，该囊泡结构具有通常包含磷脂的双层膜和通常包含水性组合物的内部介质。本文提供的脂质体包括单层脂质体、多层脂质体和多囊泡脂质体。本文提供的脂质体可以带正电、带负电或中性。在某些实施方案中，脂质体在电荷上是中性的。

多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。当包含磷脂的脂质悬浮在过量的水溶液中时，此类脂质体自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间截留了水和溶解的溶质。亲脂性分子或具有亲脂性区域的分子也可以溶解在脂质双层中或与脂质双层结合。

在具体方面，可以将多肽、核酸或小分子药物例如封装在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层中，经由与脂质体和多肽/核酸两者结合的连接分子附着于脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合等等。

如本领域普通技术人员已知的，可以通过不同的方法制备本实施方案使用的脂质体。例如，将磷脂，例如中性磷脂二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)溶解在叔丁醇中。然后将脂质与多肽、核酸和/或其他组分混合。将吐温20(Tween 20)添加到脂质混合物中，使得吐温20为组合物重量的约5％。将过量叔丁醇加入到该混合物中，使得叔丁醇的体积为至少95％。将混合物涡旋，在干冰/丙酮浴中冷干并冷干过夜。将冷干的制剂储存在-20℃下，可使用长达三个月。当需要时，在0.9％盐水中重构冷干的脂质体。

或者，可通过在容器例如梨形玻璃烧瓶中的溶剂中混合脂质来制备脂质体。容器的体积应应当是脂质体预期悬浮液体积的十倍。使用旋转蒸发仪，在约40℃、负压下除去溶剂。通常根据所需的脂质体体积，在约5分钟至2h(小时)内除去溶剂。可以在干燥器中在真空下进一步干燥组合物。干燥的脂质通常会在约1周后丢弃，因为它会随着时间的流逝趋向变质。

可以在无菌、无热原的水中以约25-50mM的磷脂通过摇动水化干燥的脂质，直到所有脂质膜重悬浮为止。然后可以将水性脂质体分成等分试样，将每个等分试样置于小瓶中，冻干并在真空下密封。

可以使如上所述制备的干燥脂质或冻干脂质体脱水，并在蛋白质或肽的溶液中重构，并用合适的溶剂例如DPBS稀释至合适的浓度。然后将混合物在涡旋混合器中剧烈摇动。未封装的其他物质，例如包括但不限于激素、药物、核酸构建体等试剂，通过29,000×g离心去除，并洗涤脂质体颗粒。以适当的总磷脂浓度例如约50-200mM重悬浮洗涤后的脂质体。可以根据标准方法确定封装的其他材料或活性剂的量。在确定封装在脂质体制剂中的其他物质或活性剂的量后，可以将脂质体稀释至适当的浓度，并在4℃下保存直至使用。包含脂质体的药物组合物通常会包含药学上可接受的无菌载体或稀释剂，例如水或盐溶液。

可用于本实施方案的其他脂质体包括阳离子脂质体，例如，WO02/100435A1、美国专利5,962,016、美国申请2004/0208921、WO03/015757A1、WO04029213A2、美国专利5,030,453和美国专利6,680,068中所述的离子脂质体，上述专利或专利申的全部内容通过引用并入本文，而没有免责声明。

在制备这类脂质体时，可以使用本文描述的或本领域普通技术人员已知的任何方案。制备脂质体的其他非限制性实例描述于美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040中，各自通过引用并入本文。

在某些实施方案中，脂质基纳米颗粒是中性脂质体(例如，DOPC脂质体)。如本文所用，“中性脂质体”或“不带电荷的脂质体”定义为具有一种或多种产生基本上中性的净电荷(基本上不带电荷)的脂质成分的脂质体。“基本上中性”或“基本上不带电荷”是指，在给定群体(例如，脂质体群体)内，如果有的话，很少的脂质成分包括未被另一成分的相反电荷抵消的电荷(即少于10％的成分包含未抵消的电荷，更优选少于5％，最优选少于1％)。在某些实施方案中，中性脂质体可以主要包括在生理条件下(即，在约pH 7下)自身是中性的脂质和/或磷脂。

本实施方案的脂质体和/或脂质基纳米颗粒可包含磷脂。在某些实施方案中，在创制脂质体时，可以使用单一种类的磷脂(例如，可以使用中性磷脂如DOPC产生中性脂质体)。在其他实施方案中，可以使用一种以上的磷脂来创制脂质体。磷脂可以来自天然来源或合成来源。磷脂包括，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺；因为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱在生理条件下(即，在约pH 7下)是不带电荷的，所以这些化合物对于产生中性脂质体可能特别有用。在某些实施方案中，使用磷脂DOPC产生不带电荷的脂质体。在某些实施方案中，可以使用不是磷脂的脂质(例如胆固醇)。

磷脂包括甘油磷脂和某些鞘脂。磷脂包括但不限于二油酰磷脂酰胆碱(“DOPC”)、卵磷脂酰胆碱(“EPC”)、二月桂酰磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“MPPC”)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“PMPC”)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(“PSPC”)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“SPPC”)、二月桂酰磷脂酰甘油(“DLPG”)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)、二棕榈酰磷脂酰甘油(“DPPG”)、二硬脂酰磷脂酰甘油(“DSPG”)、二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺("DSPE")、二油酰磷脂酰甘油(“DOPG”)、二豆蔻酰磷脂酸(“DMPA”)、二棕榈酰磷脂酸(“DPPA”)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(“DMPS”)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(“DPPS”)、脑磷脂酰丝氨酸(“BPS”)、脑鞘磷脂(“BSP”)、二棕榈酰鞘磷脂(“DPSP”)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油3-磷酸胆碱(“DAPC”)、1,2-二花生酰(diarachidoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DBPC”)、1,2-二烯二十二酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱(“DEPC”)、二油酰磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(“POPC”)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和二亚油酰磷脂酰胆碱。

b.外泌体

“细胞外囊泡”和“EV”是细胞衍生和细胞分泌的微囊泡，作为类别，其包括外泌体、外泌体样囊泡、核外颗粒体(由直接来自质膜上的囊泡发芽产生)、微粒、微囊泡、脱落的微囊泡(SMV)、纳米颗粒，甚至(大)凋亡泡或小体(由于细胞死亡而导致)或膜颗粒。

如本文所用，术语“微囊泡”和“外泌体”是指直径(或在颗粒不是球形的情况下，最大尺寸)为约10nm至约5000nm，更通常为30nm至1000nm，最通常为约50nm至750nm的膜状颗粒，其中外泌体膜的至少一部分直接从细胞获得。最常见的是，外泌体的大小(平均直径)最大为供体细胞大小的5％。因此，特别考虑的外泌体包括从细胞脱落的外泌体。

可以在任何合适的样品类型例如体液中检测到外泌体，或从其中分离。如本文所用，术语“分离”是指从其天然环境中分离出来，并且旨在包括至少部分纯化，并且可以包括实质纯化。如本文所用，术语“样品”是指适合本发明提供的方法的任何样品。样品可以是包括适合检测或分离的外泌体的任何样品。样品的来源包括血液、骨髓、胸膜液、腹膜液、脑脊液、尿液、唾液、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液、母乳、汗液、眼泪、关节液和支气管清洗液。一方面，样品是血液样品，包括例如全血或其任何级分或组分。适用于本发明的血液样品，可以从包括血细胞或其成分的任何已知来源提取，例如静脉、动脉、外周、组织、脐带等。例如，可以使用众所周知的常规临床方法(例如，抽取和处理全血的程序)获得并处理样品。一方面，示例性样品可以是从患有癌症的个体抽取的外周血。

也可以从组织样品中分离外泌体，例如手术样品、活检样品、组织、粪便和培养的细胞。当从组织来源分离外泌体时，为了获得单细胞悬浮液，使组织均质化可能是必须的，然后裂解细胞以释放外泌体。当从组织样品中分离外泌体时，选择不导致外泌体破坏的均质化和裂解程序非常重要。优选在生理上可接受的溶液中，例如缓冲盐水、生长培养基、各种水性培养基等，从体液中分离本文考虑的外泌体。

可从新鲜采集的样品或已冷冻储存或冷藏的样品中分离外泌体。在一些实施方案中，可以从细胞培养基中分离外泌体。虽然不是必需的，但是，如果在用体积排斥聚合物(volume-excluding polymer)沉淀之前澄清液体样品以除去样品中的任何碎屑，则可以获得更高纯度的外泌体。澄清方法包括离心、超离心、过滤或超滤。最典型的是，外泌体可以通过本领域众所周知的多种方法分离。一种优选的方法是从体液或细胞培养上清液中进行差分分离。分离外泌体的示例性方法描述于(Losche et al.,2004；Mesri and Altieri,1998；Morel et al.,2004)。或者，也可以如(Combes et al.,1997)所述通过流式细胞术分离外泌体。

一种分离外泌体的公认方案包括超速离心，通常与蔗糖密度梯度或蔗糖垫(sucrose cushion)组合，以使相对低密度的外泌体漂浮。由于大小分布可能与其他微囊泡或大分子复合体重叠，因此通过连续差分离心分离外泌体变得复杂。此外，离心提供的手段可能不足以基于囊泡的大小分离囊泡。但是，顺序离心与蔗糖梯度超速离心组合使用时，可以提供外泌体的高度富集。

另一种选择是，使用超速离心途径的替代方法，根据大小分离外泌体。已经报道了使用超滤方法成功地纯化了外泌体，该方法比超速离心耗时少，并且不需要使用特殊设备。同样，可以使用商业试剂盒(EXOMIR

在另一个实施方案中，外泌体可以通过常用于富集外泌体样品的技术来捕获，例如那些涉及免疫特异性相互作用(例如免疫磁性捕获)的技术。免疫磁性捕获，也称为免疫磁性细胞分离，通常涉及将针对特定细胞类型上发现的蛋白质的抗体附着到小顺磁珠上。当抗体涂覆的珠与样品(例如血液)混合时，它们会附着并包围特定的细胞。然后将样品置于强磁场中，从而使珠沉淀到一侧。去除血液后，捕获的细胞与珠子一起保留。该通用方法的许多变型在本领域中是众所周知的，并且适合用于分离外泌体。在一实例中，可以使外泌体附着于磁珠(例如，醛/硫酸盐珠)，然后将抗体添加到混合物中以识别附着于珠的外泌体表面上的表位。

本领域技术人员应当理解，在装载货物之前或之后，可以通过包括靶向部分来进一步改变外来体，以增强其作为递送货物的载体的实用性。就这一点而言，可以改造外泌体，以掺入将特定细胞特异性靶向组织类型的实体。这种靶标特异性实体，例如对靶标细胞或组织上的受体或配体具有亲和力的肽，可以例如通过使用本领域确立已久的方法融合至外泌体膜标记物，来整合在外泌体膜内。

2.非脂质纳米颗粒

还考虑了球形核酸(SNA TM)构建体和其他纳米颗粒(特别是金纳米颗粒)，作为将嵌合小基因递送至预期靶细胞的手段。由于它们的密集装载，大多数货物(例如DNA)仍与细胞内部的构建体结合，从而赋予核酸稳定性和对酶促降解的抗性。对于所研究的所有细胞类型(例如神经元、肿瘤细胞系等)，构建体显示出99％的转染效率，而无需载体或转染剂。构建体的独特靶结合亲和性和特异性允许对匹配的靶序列具有出色的特异性(即有限的脱靶效应)。构建体明显优于领先的常规转染试剂(Lipofectamine2000和Cytofectin)。构建体可以进入多种培养的细胞、原代细胞和组织，而没有明显的毒性。如通过全基因组微阵列研究和细胞因子特异性蛋白测定法所测量的，构建体引发的全局基因表达变化最小。可以使用任何数量的单一或组合试剂(例如蛋白质、肽、小分子)来定制构建体的表面。参见，例如Jensen et al.,Sci.Transl.Med.5,209ra152(2013)。

可以用与连接在聚乙二醇(PEG)末端的Arg-Gly-Asp(RGD)肽配体聚乙二醇化的聚乙烯亚胺(PEI)构建带有核酸货物的自组装纳米颗粒。可以通过将等体积的阳离子聚合物和核酸的水溶液混合，使可电离的氮(聚合物)的摩尔净含量为磷酸盐(核酸)的2-6倍来制备纳米复合材料(nanoplex)。阳离子聚合物与核酸之间的静电相互作用导致形成平均粒径分布为约100nm的多聚体，因此在本文中称为纳米复合材料(参见，例如，Bartlett et al.,PNAS,104:39,2007)。

C.封装的细胞植入

可将本文的嵌合小基因离体递送至细胞，然后将其封装并植入，以便将靶基因递送至患者。例如，可以通过植入封装的细胞将从患者或供体分离的引入有外源异源核酸的细胞直接递送给患者。植入封装的细胞的优点是，通过封装减少了对细胞的免疫应答。因此，本文提供了向个体施用一个或多个基因修饰的细胞的方法。递送的细胞数量取决于所需的效果、具体核酸、所治疗的个体和其他类似因素，并且可以由本领域技术人员确定。

为了基因治疗的目的而可引入核酸的细胞包括任何所需的可用细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如获自骨髓、脐带血、外周血或胎儿肝的细胞。例如，基因修饰的细胞可以是多能或全能干细胞(包括诱导的多能干细胞)，或者可以是胚胎细胞、胎儿细胞或完全分化的细胞。基因修饰细胞可以是来自相同个体的细胞，或者可以是来自与受体个体相同或不同物种的细胞。在优选的实例中，用于基因治疗的细胞对于患者是自体的。基因修饰细胞和移植细胞的方法是本领域已知的。

通常，将核酸引入细胞，然后在体内施用所得重组细胞。可以通过本领域已知的任何方法进行这样的引入，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。将外源基因引入细胞的许多技术是本领域已知的(参见例如Loeffler and Behr,Meth.Enzymol.(1993)217:599-618；Cotten et al.,Meth.Enzymol.(1993)217:618-644；Cline,Pharmac.Ther.(1985)29:69-92)，并且只要受体细胞所需的发育和生理功能不受破坏，就可以使用。在具体实例中，该方法是允许核酸稳定转移至细胞，从而使核酸可被细胞表达，可被其细胞后代遗传和表达的方法。

可以使用涂覆有藻酸盐/聚赖氨酸复合体的藻酸盐微胶囊进行封装。水凝胶微胶囊已得到广泛研究，用于组织工程和再生医学的活细胞或细胞聚集体的封装(Orive,etal.Nat.Medicine 2003,9,104；Paul,et al.,Regen.Med.2009,4,733；Read,etal.Biotechnol.2001,19,29)。一般而言，将胶囊设计成允许氧气和营养物质容易地扩散到封装的细胞中，同时释放细胞分泌的治疗性蛋白，并保护细胞免受通过免疫系统的攻击。这些已被开发为潜在治疗剂，用于包括I型糖尿病、癌症以及诸如帕金森病等神经退行性病症在内的一系列疾病(Wilson et al.Adv.Drug.Deliv.Rev.2008,60,124；Joki,etal.Nat.Biotech.2001,19,35；Kishima,et al.Neurobiol.Dis.2004,16,428)。一种最常见的胶囊制剂是基于可以通过离子交联形成的藻酸盐水凝胶。在典型的方法中，首先将细胞与黏性藻酸盐溶液混合。然后使用不同的方法，例如空气剪切、声振动或静电液滴形成，将细胞悬浮液加工成微滴(Rabanel et al.Biotechnol.Prog.2009,25,946)。藻酸盐液滴在与诸如Ca2+或Ba2+等二价离子的溶液(例如Ca2+或Ba2+)接触后凝胶化。

公开了用于将哺乳动物细胞移植到个体内的胶囊。由生物相容性水凝胶成型聚合物封装待移植的细胞形成胶囊。为了抑制囊的过度生长(纤维化)，胶囊的结构防止细胞材料位于胶囊的表面上。另外，胶囊的结构确保与细胞发生足够的气体交换，并且营养物质被封装在其中的细胞吸收。任选地，所述胶囊还含有一种或多种封装在其中的用于控制释放的抗炎药。

所公开的组合物由包封待移植细胞的生物相容性水凝胶成型聚合物形成。可用于形成合适水凝胶的材料的实例包括多糖，例如藻酸盐、胶原蛋白、壳聚糖、纤维素硫酸钠、明胶和琼脂糖，水溶性聚丙烯酸酯、聚膦嗪(polyphosphazine)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(环氧烷烃)、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及其共聚物和共混物。参见，例如，美国专利5,709,854、6,129,761、6,858,229和9,555,007。

IV.药物组合物

如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”是指适于一种或多种给药途径、体内递送或接触的生物学上可接受的组合物、制剂、液体或固体或其混合物。“药学上可接受的”或“生理上可接受的”组合物是在生物学上或其他方面不是不期望的物质，例如，可以将该物质施用于个体而不会引起实质上不期望的生物学作用。这样的组合物，“药学上可接受的”和“生理上可接受的”制剂和组合物可以是无菌的。这样的药物制剂和组合物可以用于例如向个体施用病毒颗粒或纳米颗粒。

这样的制剂和组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如水包油或油包水)、悬浮剂、糖浆、酏剂、分散剂和悬浮介质、包衣、等渗和吸收促进或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。还可以将补充性活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)掺入制剂和组合物中。

药物组合物通常含有药学上可接受的赋形剂。这类赋形剂包括任何下述药剂：该药剂本身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，并且可以在没有过度毒性的情况下施用。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇、吐温80和液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。其中可以包括药学上可接受的盐，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，这类载体中可以存在辅助物质，例如表面活性剂、湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

如本文所述或本领域技术人员已知的，可以将药物组合物配制为与具体给药或递送途径相容。因此，药物组合物包括适合通过各种途径施用或递送的载体、稀释剂或赋形剂。

适合注射或输注病毒颗粒或纳米颗粒的药物形式可包括，任选地封装在脂质体中的适合临时制备无菌注射或可输注溶液或分散液的无菌水溶液或分散液。在所有情况下，最终形式均应为无菌液体，并在制造、使用和储存条件下稳定。液体载体(carrier)或载体(vehicle)可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适混合物的溶剂或液体分散介质。可以例如通过形成脂质体，通过在分散剂的情况下维持所需的粒径，或通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或盐(例如氯化钠)。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，延长可注射组合物的吸收。

病毒颗粒或纳米颗粒的溶液或悬浮剂可任选包含一种或多种以下成分：无菌稀释剂(例如注射用水)、盐溶液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))、人工CSF、表面活性剂、不挥发油、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、甘油或其他合成溶剂；抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。

适合本发明的组合物、方法和用途的药物制剂、组合物和递送系统是本领域已知的(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药剂学和实践)(2003)20

可以以剂量单位形式配制病毒颗粒、纳米颗粒及其组合物，以易于给药和剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位都含有经计算可与所需药物载体一起产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。剂量单位形式取决于被认为产生所需效果所需的病毒颗粒或纳米颗粒的数量。必需的量以单剂量配制，或者可以以多个剂量单位配制。可以将剂量调节至合适的病毒颗粒或纳米颗粒浓度，任选地与抗炎剂组合，并包装使用。

在一个实施方案中，药物组合物应包含足够的遗传物质以提供治疗有效量，即足以减轻或改善所讨论疾病状态的症状或不利影响的量或足以赋予所需益处的量。

如本文所用，“单位剂型”是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位任选地与药物载体(赋形剂、稀释剂、载体或填充剂)一起都含有预定量，当以一个剂量或多个剂量施用时，该预定量产生所需效果(例如，预防或治疗效果)。单位剂型可以在例如安瓿和小瓶中,可以包括液体组合物，或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可以在体内给药或递送之前添加无菌液体载体。单个单位剂型可包括在多剂量试剂盒或容器中。因此，例如，可以以单个或多个单位剂型包装病毒颗粒、纳米颗粒及其药物组合物，以便于给药和剂量均匀。

含有病毒颗粒或纳米颗粒的制剂通常包含有效量，该有效量是本领域技术人员容易确定的。病毒颗粒或纳米颗粒通常可以为组合物的约1％至约95％(w/w),或者如果合适的话甚至更高。要施用的量取决于诸如考虑用来治疗的哺乳动物或人个体的年龄、体重和身体状况等因素。本领域普通技术人员可以通过建立剂量反应曲线的常规试验来确定有效剂量。

V.定义

术语“多核苷酸”、“核酸”和“转基因”在本文可互换使用，是指所有形式的核酸、核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)及其聚合物。多核苷酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA，以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反剪接RNA或反义RNA)。多核苷酸可包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸(例如，变体核酸)。多核苷酸可以是单链、双链或三链体、线性或环状，并且可以具有任何合适的长度。在讨论多核苷酸时，根据以5′至3′方向提供序列的惯例，本文可以描述具体多核苷酸的序列或结构。

编码多肽的核酸通常包含编码该多肽的开放阅读框。除非另有说明，否则具体核酸序列也包括简并密码子取代。

核酸可包括一个或多个与开放阅读框可操作地连接的表达控制元件或调控元件，其中一个或多个调控元件经配置指导由开放阅读框编码的多肽在哺乳动物细胞中的转录和翻译。表达控制/调控元件的非限制性实例包括转录起始序列(例如启动子、增强子、TATA盒等)、翻译起始序列、mRNA稳定性序列、聚A序列、分泌序列等。可以从任何合适的生物基因组获得表达控制/调控元件。

“启动子”是指通常在编码序列上游(5')，通过识别RNA聚合酶和适当转录所需的其他因子来指导和/或控制编码序列表达的核苷酸序列。“启动子”包括为短DNA序列的最小启动子，该短DNA序列由TATA盒和任选地用于指定为了控制表达而添加了调控元件的转录起始位点的其他序列组成。

“增强子”是可以刺激转录活性，并且可以是启动子的固有元件或增强表达水平或组织特异性的异源元件的DNA序列。它可以在任一方向(5'->3'或3'->5')上起作用，甚至在位于启动子上游或下游时也可以发挥功能。

启动子和/或增强子可以整体衍生自天然基因，或由衍生自自然界中发现的不同元件的不同元件组成，或甚至由合成DNA片段组成。启动子或增强子可包含参与蛋白质因子结合的DNA序列，所述蛋白质因子响应于刺激、生理或发育条件而调节/控制转录起始的有效性。

非限制性实例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(例如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、pol II启动子、pol III启动子、合成启动子、杂合启动子等。另外，衍生自诸如鼠类金属硫蛋白基因等非病毒基因的序列也可在本文中找到用途。示例性的组成型启动子包括下述编码某些组成型或“持家”功能的基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子,以及本领域技术人员已知的其他组成型启动子。另外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地起作用。这些尤其包括：SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复(LTR)；以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。因此，任何以上提及的组成型启动子都可以用于控制异源基因插入物的转录。

“转基因”在本文用于方便地指意图引入或已经引入细胞或生物中的核酸序列/多核苷酸。转基因包括任何核酸，例如编码抑制性RNA或多肽或蛋白质的基因，并且相对于天然存在的AAV基因组序列通常是异源的。

术语“转导”是指通过载体(例如病毒颗粒)将核酸序列引入细胞或宿主生物。因此，通过病毒颗粒将转基因引入细胞中可以称为细胞的“转导”。转基因可以整合或不整合到转导细胞的基因组核酸中。如果引入的转基因整合到入受体细胞或生物的核酸(基因组DNA)中，则可以稳定地维持在该细胞或生物中，并进一步传递至受体细胞或生物的后代细胞或生物或由其遗传。最后，引入的转基因可以在受体细胞或宿主生物的额外染色体外中存在或仅短暂存在。因此，“转导的细胞”是已经通过转导的方式引入了转基因的细胞。因此，“转导的”细胞是其中已导入转基因的细胞或其后代。转导的细胞可以增殖、转基因转录并表达编码的抑制性RNA或蛋白质。对于基因治疗用途和方法而言,转导的细胞可以在哺乳动物中。

在存在诱导剂的情况下，仅表达或在较大程度上表达受诱导型启动子控制的转基因(例如，在存在某些金属离子的情况下，受金属硫蛋白启动子控制的转录大大增加)。诱导型启动子包括当结合诱导因子时刺激转录的响应元件(RE)。例如，存在血清因子、类固醇激素、视黄酸和环状AMP的RE。为了获得可诱导的应答，可以选择含有具体RE的启动子，并且在某些情况下，RE本身可以附着于不同的启动子，从而赋予重组基因诱导性。因此，通过选择合适的启动子(组成型对诱导型；强对弱型)，可以控制基因修饰细胞中多肽的存在和表达水平。如果编码多肽的基因受诱导型启动子的控制，则通过将基因修饰细胞原位暴露在允许多肽转录的条件下，例如通过腹膜内注射控制该基因转录的诱导型启动子的诱导剂，来触发多肽的原位递送。例如，通过使基因修饰细胞与含有适当(即诱导)金属离子的溶液原位接触，来增强基因修饰细胞原位表达受金属硫蛋白启动子控制的基因编码的多肽。

当核酸/转基因与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接的”。编码RNAi或多肽的核酸/转基因或指导多肽表达的核酸可包括用于控制编码的多肽转录的诱导型启动子或组织特异性启动子。与表达控制元件可操作地连接的核酸也可以称为表达盒。

在某些实施方案中，本文所述的方法和用途使用CNS特异性启动子或诱导型启动子、增强子等。CNS特异性启动子的非限制性实例包括从髓磷脂碱性蛋白(MBP)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的基因中分离的启动子。诱导型启动子的非限制性实例包括蜕皮激素、四环素、低氧和IFN的DNA响应元件。

在某些实施方案中，表达控制元件包含CMV增强子。在某些实施方案中，表达控制元件包含β肌动蛋白启动子。在某些实施方案中，表达控制元件包含鸡β肌动蛋白启动子。在某些实施方案中，表达控制元件包含CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子。

如本文所用，术语“修饰”或“变体”及其语法变化是指核酸、多肽或其子序列偏离参考序列。因此，修饰的序列和变体序列可以具有与参考序列基本相同、更大或更小的表达、活性或功能，但是至少保留了参考序列的部分活性或功能。变体的具体类型是突变蛋白，其是指由具有突变例如错义或无义突变的基因编码的蛋白。

“核酸”或“多核苷酸”变体是指与野生型相比已经基因发生了改变的修饰的序列。该序列可以是基因修饰的，而不改变编码的蛋白质序列。或者，可以对该序列进行基因修饰以编码变体蛋白。核酸或多核苷酸变体也可以指这样的组合序列，该组合序列已被密码子修饰以编码仍然保留与参考序列例如野生型蛋白序列的至少部分序列同一性的蛋白质，或者已经被密码子修饰以编码变体蛋白。例如，会改变这类核酸变体的一些密码子而不改变由此编码的蛋白质的氨基酸，并且会改变该核酸变体的一些密码子，这反过来又改变由此编码的蛋白质的氨基酸。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用。由本文公开的“核酸”或“多核苷酸”或“转基因”编码的“多肽”包括部分或全长天然序列，以及天然存在的野生型和功能多态性蛋白，其功能性子序列(片段)以及其序列变体，只要该多肽保留某种程度的功能或活性即可。因此，在本发明的方法和用途中，不需要由酸序列编码的这类多肽与在治疗的哺乳动物中有缺陷的或活性、功能或表达不足、缺乏或不存在的内源性蛋白质相同。

修饰的非限制性实例包括一个或多个核苷酸或氨基酸取代(例如，约1至约3、约3至约5、约5至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、约25至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约100、约100至约150、约150至约200、约200至约250、约250至约500、约500至约750、约750至约1000或更多核苷酸或残基)。

氨基酸修饰的实例是保守氨基酸取代或缺失。在具体实施方案中，修饰序列或变体序列保留了未修饰序列(例如，野生型序列)的至少部分功能或活性。

氨基酸修饰的另一个实例是引入了病毒颗粒衣壳蛋白中的靶向肽。已经鉴定出将重组病毒载体或纳米颗粒靶向中枢神经系统例如血管内皮细胞的肽。因此，例如，修饰的重组病毒颗粒或纳米颗粒可以靶向沿脑血管排列的内皮细胞。

如此修饰的重组病毒可以相对于一种类型的组织(例如肝组织)优先结合另一种类型的组织(例如CNS组织)。在某些实施方案中，携带修饰的衣壳蛋白的重组病毒可以通过以高于可比较的未修饰的衣壳蛋白的结合水平“靶向”脑血管上皮组织。例如，具有修饰的衣壳蛋白的重组病毒可以以比未修饰的重组病毒大50％至100％的水平结合至脑血管上皮组织。

“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。在大多数生物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)则参与将DNA中包含的信息转移到蛋白质中。本发明还涵盖所公开的核苷酸序列和由此编码的蛋白质或部分长度蛋白质的片段和变体。“片段”或“部分”是指全长或小于全长的核苷酸编码序列或多肽或蛋白质的氨基酸序列。在某些实施方案中，片段或部分具有生物学功能(即，保留5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％野生型活性或功能)。

分子的“变体”是与天然分子的序列实质上相似的序列。对于核苷酸序列，变体包括那些由于遗传密码的简并性而编码天然蛋白质的相同氨基酸序列的序列。诸如此类的天然存在的等位基因变体可以通过使用分子生物学技术，例如通过聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过使用定点诱变产生的那些编码天然蛋白质的核苷酸序列，以及编码具有氨基酸取代的多肽的那些核苷酸序列。通常，本发明的核苷酸序列变体与天然(内源)核苷酸序列的序列同一性会为至少40％、50％、60％至70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％到79％，通常至少80％，例如81％-84％，至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％。在某些实施方案中，变体具有生物学功能(即，保留5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的野生型活性或功能)。

具体核酸序列的“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在由密码子指定精氨酸的每个位置，可以将密码子改变为所述的任何相应密码子，而不改变编码的蛋白质。这样的核酸变异是“沉默变异”，是“保守修饰变异”的一种。除另有说明外，本文所述编码多肽的每个核酸序列还描述了每种可能的沉默变异。本领域技术人员应当认识到，可以通过标准技术修饰核酸中的每个密码子(除了ATG、ATG通常是蛋氨酸的唯一密码子)，以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”隐含在每个所述序列中。

术语多核苷酸序列的“实质同一性”是指，使用一种本文所述比对程序，利用标准参数，与参考序列相比，多核苷酸所包含的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％，或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。本领域技术人员应当认识到，可以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来适当调节这些值，以确定由两条核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。为了这些目的，氨基酸序列的实质同一性通常是指至少70％、至少80％、90％或甚至至少95％的序列同一性。

在多肽的上下文中，术语“实质同一性”是指，多肽包含在指定的比较窗口内与参考序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％，或甚至95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。两条多肽序列相同的指示是，一条多肽与针对第二条多肽产生的抗体具有免疫反应性。因此，多肽与第二条多肽相同，例如，其中两个肽的不同之处仅为保守取代。

术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是预防、抑制、减少或降低不希望的生理变化或病症，例如病症的发展、进程或恶化。处于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解，疾病程度的减轻、疾病症状或不良反应的稳定(即，没有恶化或进展)、疾病进展的延迟或延缓、疾病状态的改善或减轻以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。与未接受治疗的预期生存期相比，“治疗”还可能意味着生存期延长。需要治疗的那些包括已经患有疾病状况或病症的那些以及易感的那些(例如，通过遗传测定所确定的)。

除非另有说明，否则术语“包括/含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。

除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法和用途可以任何合适的顺序执行。除非另有要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”或“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不构成对本发明范围的限制。说明书中的任何语言都不应解释为表示任何未要求保护的要素对于实施本发明是必不可少的。

本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书公开的每个特征都可以由具有相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征(例如修饰的核酸、载体、质粒、重组载体序列、载体基因组或病毒颗粒)是等同或相似特征的上位实例。

如本文所使用的，除非上下文另有明确指出，否则形式“一个/种(a)”、“一种(an)”和“该/所述(the)”包括单数和复数对象。因此，例如，提及“核酸”包括多个这类核酸，提到“载体”包括多个这类载体，以及提到“病毒”或“AAV或rAAV颗粒”包括多个这类病毒体/AAV或rAAV颗粒。

本文所用术语“约”是指在参考值的10％(正负)之内的值。

除非本文另外指出，否则本文对数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且将每个单独值都并入说明书中，就如同其在本文中被单独列举一样。

因此，除非上下文另有明确指出，否则所有数值或数值范围均包括该范围内的整数以及该范围内数值或整数的分数。因此，作为说明，提到80％或更多的同一性包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％、etc.、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等，依此类推。

提到大于(大于)或小于(小于)某个整数分别包括大于或小于该参考数字的任何数字。因此，例如，提到小于100包括99、98、97等，一直到数字一(1)；小于10包括9、8、7等，一直到数字一(1)。

如本文所所用，除非上下文另有明确指出，否则所有数值或范围都包括在这类范围内值和整数的分数以及在这类范围内整数的分数。因此，作为说明，提到数值范围，例如1-10，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，依此类推。因此，提到范围1-50包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，最多并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，依此类推。

提到一系列范围包括组合该系列内不同范围边界值的范围。因此，作为说明，提到一系列范围，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000，包括范围10-20、10-50、30-50、50-100、100-300、100-1,000、1,000-3,000、2,000-4,000、4,000-6,000等。

VI.试剂盒

本发明提供了具有包装材料和一种或多种组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页，该标签或包装插页包括组分的描述或体外、体内或离体使用其中组分的说明书。试剂盒可包含此类组分的集合，例如核酸、重组载体、病毒颗粒、剪接调节剂分子，以及任选的第二活性剂，例如另一种化合物、试剂，药物或组合物。

试剂盒是指容纳试剂盒的一种或多种组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分，并且可以由通常用于这类目的的材料(例如纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。

标签或插页可包括其中一种或多种组分的标识信息，有效成分的剂量、临床药理学，包括作用机理、药代动力学和药效学。标签或插页可以包括识别制造商、批号、制造地点和日期、有效期的信息。标签或插页可以包括识别制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。标签或插页可以包括有关可以使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或插入物可以包括针对临床医生或个体在方法、用途或治疗方案(treatment protocol)或治疗方案(therapeutic regimen)中使用一种或多种试剂盒组分的说明书。说明书可以包括剂量、频率或持续时间，以及用于实施本文所述任何方法、用途、治疗方案或预防或治疗方案的说明。

标签或插页可以包括组分可以提供的任何益处的信息，例如预防或治疗益处。标签或插页可以包括有关潜在的不利副作用、并发症或反应的信息，例如关于不适合使用具体组合物的情况警告个体或临床医生。当个体已经、打算或正在服用一种或多种可能与组合物不相容的其他药物时，或者个体已经、打算或正在进行另一种与组合物不相容的治疗方案(treatment protocol)或治疗方案(therapeutic regimen)时，也可能发生不利的副作用或并发症，因此，说明书可能包括有关此类不相容的信息。

标签或插页包括“印刷品”，例如纸或纸板，或单独或粘贴于组分、试剂盒或包装材料(例如盒子)上，或附着于含有试剂盒组件的安瓿、管或小瓶上。标签或插页可以另外包括计算机可读介质，例如条形码打印标签、磁盘、光盘，例如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3，或电存储介质，例如RAM和ROM，或这些的混合体，例如磁性/光学存储介质、闪存、混合体和存储卡类型。

VII.实施例

已经描述了本发明的许多实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而非限制请求保护的本发明的范围。

实施例1

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是由SMN1基因突变引起的常染色体隐性遗传病。同源SMN2基因不能在功能上补偿SMN1突变，因为外显子7在大多数SMN2转录本中发生跳读，从而产生不稳定的蛋白质

近来，诱导SMN2外显子7内含的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)Nusinersen(Ionis)已成为第一种被FDA批准的治疗SMA的药物

LMI070(Spinraza

RG7916(Roche/PTC/SMAF

在一实施方案中，用药物诱导的SMN2选择性剪接进行基因表达控制。一方面，SMN2小基因与编码哺乳动物反式激活子的cDNA融合，在该反式激活子中，外显子7的内含或排除决定反式激活子的翻译。小剪接修饰剂分子LMI070可以矫正用于反式激活子表达的外显子7跳读，然后会诱导从优化的靶基因表达盒转录。

实施例2

生成了嵌合SMN2/反式激活子小基因，其中反式激活子的产生取决于SMN2外显子7内含。所得的反式激活子结合优化的启动子，并激活下游人工miRNA的表达(图2)。该系统具有：1)处于关闭状态的miRNA最小表达，2)反式激活子显著诱导miRNA的表达，3)控制反式激活子水平，以及随后控制miRNA表达水平，和4)允许包装成单个重组腺相关病毒(AAV)的大小。RNAi表达控制会避免持续共择RNAi途径，并使脱靶基因的长期意外沉默降至最低。

将哺乳动物反式激活子的多个DNA结合位点克隆到我们优化的miRNA启动子的上游。反式激活子是经修饰结合具体DNA结合序列的哺乳动物锌指蛋白和单纯疱疹病毒Vp16结构域的融合蛋白

为了调控反式激活子的表达，将反式激活子克隆到自切割的2A肽和包含概括SMN2剪接所需的外显子6-7和外显子8的5'末端以及最小内含子间插序列的SMN2小基因的下游

生成了靶向HTT外显子2(mi2.4v1)或HTT外显子44(miHDS1v6A)的非等位基因特异性人工miRNA序列。这些miRNA序列是使用siSPOTR40设计的，具有有限的脱靶谱。此外，设计了用作对照的具体种子控制(seed-controlled)miRNA序列(mi2.4v1C和miHDS1v6a)。这些miRNA对照不会沉默HTT表达，但含有相同的miRNA种子(5'核苷酸2-8)以分别匹配mi2.4v1和miHDS1v6a脱靶谱(图6a-b)。

实施例3

体外研究：中型多棘神经元(Medium spiny neurons,MSN)代表纹状体中95％的神经元细胞群，是HD中受影响最大的细胞类型，并且是这些研究的主要靶细胞。因此，所有体外研究均采用MSN。MSN培养物可以通过对正常或HD患者的人成纤维细胞进行直接神经转化而获得

通过rAAV2/1对MSN培养物进行转导，rAAV2/1是AAV血清型，可在小鼠脑中体内和在MSN培养物中体外有效转导MSN神经元

由于排名前20位的内源性miRNA负责人脑中75％的miRNA：mRNA结合位点

实施例4

体内调控：将在调控的启动子系统(rAAV.RPmi2.4v1)控制下表达mi2.4v1的rAAV2/1病毒注射到N171-82Q转基因小鼠的纹状体中，N171-82Q转基因小鼠是表达小鼠脑中突变亨廷顿蛋白的前171个氨基酸的确立已久的小鼠模型

接下来，使用先前研究的数据作为何时可能需要重新剂量给药的指导，确定对于相似的功效水平脉冲HTT靶向RNAi触发器的频率。小鼠(n＝15只雄性小鼠/组)在注射前进行基线轮转测试，以使各组归一化，然后向两侧注射实验或对照AAV载体±LMI070。加速旋转法提供了用于检测HD模型中运动障碍的灵敏措施。注射AAV后，以先前确定的剂量施用LMI070，以在24-48小时内达到50％或更高的沉默水平，然后每周一次或每周两次再给药。与之前一样

预期LMI070诱导的RNAi脉冲会持续24-48小时，从而减少mHTT水平≥50％。一旦消除了LMI070，mi2.4v1水平应下降，而mHTT水平不再受到抑制(图7)。先前使用反义寡核苷酸分子(ASO)的研究报告了，在短暂ASO输注后，疾病表型的逆转比HTT沉默持续的时间更长。因此，RNAi的脉冲可能需要维持数天甚至数周，这与在靶向mHTT的ASO情况下所见相似。由于1％(CSI3)和10％(CSI)的SMN2/反式激活子转录本中包括SMN2外显子7，因此在不存在LMI070的情况下，RNAi启动子可能被部分激活。如果人工miRNA的水平高于最丰富的miRNA的转录本水平，则这可能会是个问题。通过使用较弱的启动子来控制反式激活子的表达(例如pGK、mCMV)，可以解决此问题。根据以前的研究，预计LMI070对小鼠没有毒性，但是如果观察到毒性，则已经设计了其他小分子来诱导SMN2外显子7内含，其能替代LMI070。由于LMI070可以口服施用，且LMI070和某些rAAV血清型可以穿过血脑屏障，因此与目前需要多次鞘内给药的ASO治疗相比，该系统还提供了开发用于脑神经退行性疾病的微创治疗的可能性。

实施例5

先前使用来自HD患者和小鼠模型的组织样本的研究报告了转录组失调是HD脑中发生的主要事件，发生在疾病的初始阶段和在观察到细胞丧失之前

实施例6

突变HTT沉默矫正的选择性剪接事件：用沉默HTT表达的rAAV.U6mi2.4v1或rAAV.U6miHDS1v6，并用rAAV.U6mi2.4v1C或rAAV.U6miHDS1v6aC作为种子匹配对照，对来自HD人类患者和对照的MSN培养物进行转导(图6)。请注意，通过使用两种不同的有效靶向HTT表达的miRNA序列及其种子匹配miRNA对照，我们能够区分由于mHTT沉默导致的选择性剪接事件与由于RNAi脱靶导致的那些事件。

AAV转导后一周，当mHTT表达减少50％时，收获细胞并提取总RNA，以确定选择性剪接变化。使用TruSeq Stranded mRNA Sample prep kit(TruSeq链式mRNA样品制备试剂盒,Illumina)制备RNA-seq文库，并发送以使用Illumina HiSeq 4000进行测序。使用允许每个测序片段最多3个错配和每个25bp种子最多2bp错配的STAR软件(2.5或更高版本)，RNA-seq测序片段(read)会定位到人类基因组(hg38)和转录组(Ensemble,版本89)。Cuffdiff会用于使用FPKM metric

然后，生成由侧翼外显子和选择性剪接外显子以及最小间插内含子序列组成的嵌合eGFP小基因，并将其克隆到我们AAV穿梭载体中eGFP cDNA的上游。设计这些小基因，使得在mHTT蛋白抑制使剪接谱“归一化”为对照MSN培养物的剪接谱后会减少eGFP表达。为了测试该系统，首先将用表达靶向突变HTT的miRNA的rAAV2/1或种子匹配对照，加上表达eGFP小基因(或未修饰的eGFP作为对照)的rAAV，转导MSN培养物。通过蛋白质印迹和基于荧光的定量测定来确定eGFP表达的动力学。然后那些相应地响应mHTT抑制的小基因用于代替SMN2小基因(图2)，并在Tg(N171-82Q)和zQ175 HD小鼠模型中测试。

这种疾病调控的表达系统会通过利用响应于mHTT表达而发生的选择性剪接变化来控制RNAi。预计会在HD和对照MSN培养物之间鉴定出大量的选择性剪接变化。选择性剪接变化预计不仅限于外显子跳读，而且还限于其他四种类型的选择性剪接模式。有望鉴定出RNA转录本同种型之间>2倍失衡的几项事件，并且预计这些比率会在mHTT蛋白沉默后发生变化。如果未发现符合>2倍比例标准的外显子跳读剪接事件，则这可以通过以下方式来解决：类似于对SMN2小基因所做的操作，将具体序列修饰引入侧翼内含子/外显子构建体中，以提高接近但不超过该比例的比例。在这项研究的最后，会获得一组可用来替代SMN2小基因的疾病调控的小基因。

HD中差异剪接的内含子的实例MIR4458HG(5:8457767–8459932),PCDH1(5:141869432–141878222),BMP8A(1:39523698–39523806),TLL1(4:166039442–166042026),KCNH1(1:210684139–210775347),FGFR1(8:38414035–38414151),MGST1(12:16606133–16607935),AC097515.1(4:16503132–16508540),ATP2B3(X:153559943–153560675),RPL22(1:6197757–6199564),AC109439.2(5:136753973–136754359),SLCO5A1(8:69705230–69738039),AC025154.2(12:49962381–49963491),SART3(12:108539090–108542769),TRPM1(15:31067188–31067878),RAI1(17:17683704–17684064),EMC1(1:19233136–19234179),ACYP2(2:54115757–54135452),TLL1(4:165995179–166003390),HMGCS1(5:43298976–43313021),CASTOR3(7:100202591–100204020),TRPM1(15:31076985–31101656),ABCA8(17:68918186–68918426),DMD(X:31507454–31627672),MACF1(1:39084439–39102702),HIPK1(1:113957185–113958065),CNTN2(1:205062002–205062439),ROBO2(3:77644896–77646053),EVC2(4:5685480–5689156),WWC1(5:168428142–168428706),ISPD(7:16258483–16258919),PDCL(9:122823083–122826615),CCDC91(12:28255663–28257201),CDK16(X:47219106–47222272),ATP2B3(X:153543169–153546087),TINAGL1(1:31585486–31585752),NBPF20(1:145401132–145402166),IFT122(3:129458678–129460853),MFAP5(12:8655448–8655785),MED21(12:27030273–27030733),COBLL1(2:164722523–164727105),MYRIP(3:40234054–40244445),ARHGAP24(4:85827976–85923647),NDST3(4:118105106–118114805),ZNF251(8:144754746–144755404),LIPM(10:88815225–88815356),GATD1(11:770399–770992),TMEM132C(12:128696104–128697223),RUBCNL(13:46378006–46387676),JDP2(14:75432337–75437897),NEDD4L(18:58046019–58165787),ST13(22:40844910–4085643),AL662884.4(6:32153637–32153998),C6orf118(6:165299503–165300363),BDNF-AS(11:27640006–27658237),ARHGEF7(13:111283400–111286146),MYBPC1(12:101663561–101667731),RAPSN(11:47438932–47441158),SMYD1(2:88096785-88103057),MRLN(10:59738563-59738997),KLHL40(3:42688718-42688868),TRDN-AS1(6:123497253-123503718),VGLL2(6:117271065-117272453),ITGA7(12:55686315-55687970),LMOD3(3:69109122-69118698),VGLL2(6:117268492-117270542),ZIM2(19:56822837-56823589),KLHL40(3:42688303-42688609),TRIM55(8:66150467-66152376),COBL(7:51073386-51085165),RYR1(19:38504361-38504747),MYOM1(18:3102631-3112297),PDE4DIP(1:149010596-149012590),NCAM1(11:113240834-113242804),TPM3(1:154167941-154169304),SMYD1(2:88091143-88093516),MYBPC2(19:50459007-50459110),TRDN(6:123218741-123221486),TRDN(6:123252436-123255080),MICU1(10:72508270-72524734),MEF2D(1:156480778-156482436),ZIM2(19:56817580-56817745),SRPK3(X:153781146-153781215),COL25A1(4:109010376-109048167),STAC3(12:57248199-57250992),LMOD3(3:69120061-69122092),MAP4(3:47912422-47914816),TRIM72(16:31214298-31214731),TRIM63(1:26066441-26067335),ASB4(7:95536551-95537570),CHRND(2:232528657-232529938),MYPN(10:68197479-68199367),FBP2(9:94559133-94563341),ITGB1(10:32901636-32907062),IL17B(5:149377026-149379204),BVES-AS1(6:105162161-105179832),COL23A1(5:178239180-178240460),TRDN-AS1(6:123438123-123438943),IL17B(5:149374601-149376735),LINC01916(18:65424072-65441689),AC131025.3(5:149329831-149332694),FBP2(9:94563462-94567269),MFAP5(12:8648204-8649500),MEF2D(1:156479797-156480642),AL358473.2(1:201040375-201040621),INPP4B(4:142086257-142108092),RYR1(19:38448512-38448648),MACF1(1:39340718-39340803),ITGB1BP2(X:71302334-71302410),DUSP13(10:75097886-75101866),SAMD8(10:75101962-75103893),LSP1(11:1884025-1884279),C1orf105(1:172465364-172468448),RYR2(1:237773649-237778665),TBX18(6:84748088-84756697),MYPN(10:68194513-68195449),TBX18(6:84744326-84747919),PYGM(11:64755559-64757778),MYLK4(6:2679409-2680220),LTK(15:41507291-41507561),DCAF6(1:168004794-168015780),LRRFIP2(3:37121537-37121634),MFAP5(12:8654482-8655414),FRMPD1(9:37729854-37730983),MYOM2(8:2057781-2059152),ADAMTS14(10:70674996-70702311),AFAP1L1(5:149306405-149307401),GFPT1(2:69350184-69354258),UBE4B(1:10105745-10106196),CCDC141(2:178869306-178871426),ITGA4(2:181480267-181481597),RGR(10:84254444-84254696),AL139317.5(14:52861035-52861586),ABI3BP(3:100838285-100838401),AC008429.3(5:172956029-172957153),AC004233.2(16:2998389-2998493),AC027045.2(17:9781595-9791130),ITGB1BP2(X:71302557-71303261),EYA4(6:133448180-133456555),PRPF18(10:13597672-13600243),LINC00592(12:52180964-52185378),PPP1R27(17:81834654-81834763),MYLK4(6:2680292-2683020),MYF6(12:80708239-80708523),CLEC3B(3:45026472-45030826),VCL(10:74109157-74111908),COL25A1(4:108819330-108819811),PHYHD1(9:128940498-128940598),ANKRD29(18:23601310-23612091),HSPA12B(20:3748392-3749231),UBE4B(1:10107375-10117458),AGL(1:99850899-99850974),CCDC141(2:178853625-178855346),AGMO(7:15418654-15431004),SAMD8(10:75108210-75109008),TRPC6(11:101471387-101472136),KRT17P5(17:18423550-18423656),TMEM241(18:23237246-23252959),ENPP1(6:131868127-131869357),PHLDB1(11:118644692-118645355),MYF5(12:80717565-80718357),C12orf42(12:103368999-103401606),RBFOX1(16:7671600-7676773),CYP2J2(1:59916101-59926536),SYPL2(1:109478010-109479377),TTN(2:178799732-178799824),COL6A3(2:237395205-237396726),KLHL30(2:238148023-238149006),SYNJ2(6:158059354-158061991),FNDC1(6:159246970-159249038),AC100871.2(8:124040007-124045766),CYSLTR1(X:78283541-78327304),HSPG2(1:21865810-21868884),MET(7:116775112-116777388),ISCU(12:108562737-108564059)以及PXN(12:120216582-120216840)。

实施例7

以下方法用于获得图8-15所示的数据。简而言之，用浓度为25nM的LMI070处理Hek293细胞。处理后12小时，使用Trizol提取RNA，然后进行DNAseI处理。在Agilent(安捷伦)生物分析仪上评估样品的质量控制，所有样品的RIN值均大于9.8，并送往IlluminaRiboZero Gold进行总RNA文库制备，并使用Illumina HiSeq4000进行测序。由Illumina测序获得150bp的双端测序(pair end sequencing)测序片段。使用STAR比对器(aligner)，将从Illumina平台获得的Fastq文件与人类基因组GRCh38进行比对。将从STAR输出的SAM格式比对文件排序，转换为BAM格式，并使用Samtools进行索引。为了可视化比对的任何区域处的剪接，在IGV中打开BAM文件，并使用Sashimi绘图功能将其可视化。

为了鉴别含有高水平差异剪接的感兴趣的区域，创建了定制R程序。此定制R程序的输入是STAR“.SJ.out.tab”输出的剪接接界(splice junction)矩阵。这些文件含有在每个剪接接界处获得的原始计数，这些原始计数是由STAR在比对过程中计算的。创建此定制R程序的目的是鉴别治疗组和对照组之间的高度差异的剪接位置。以下步骤用于鉴别这些区域。1)将输入文件读入R。2)为数据集中的每一行(剪接位点)创建唯一的位置ID。3)将所有样品合并到一个数据帧中。4)计算每个剪接位点ID的平均计数、计数总和以及计数的标准偏差。4)将NA(不可用)值替换为0。5)在对照中，以sum＝0提取出所有剪接位点(行)。6)按平均计数值从高到低对提取的读数进行排序。这产生了具有最高差异表达水平的剪接位点的列表，在对照中总计数为0。

下述方法用于获得图19中的数据。通过PCR验证了在上述分析中鉴定出的最相关基因。从用LMI070(25nM)处理的HEK293细胞中提取RNA。使用经设计结合通过LMI070处理生成的新外显子的上游和下游的PCR引物。如在PCR上观察到的，在用LMI070处理的样品上检测到更高尺寸的PCR产物(图16)。使用Sanger测序对这些PCR产物进行测序，以确保包括鉴定的新外显子序列。

实施例8

使用下述方法来获得图19所示的数据。用表达SMN2小基因的质粒(0.3μg)转染HEK293细胞，并在4小时后用不同剂量的RG7800(10nM、100nM、1μM和10μM)处理。转染后24小时，收获RNA，进行DNAseI处理，并使用PCR反转录1μg RNA以评估SMN2小基因剪接。在3％的琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并使用ChemiDoc Imaging System(Bio-Rad)和Imagine Lab分析软件对外显子7的产生进行定量。

使用下述方法来获得图21所示的数据。用编码CRISPRi沉默系统的质粒(dCas9、sgRNA和MCP-Krab表达盒)转染HEK293细胞。重要的是，将dCas9克隆到SMN2剪接调控盒下，以用RG7800控制dCas9蛋白的表达。转染后24小时，使用Puromicin(3μM，24h)选择细胞，传代至新平板上，并用RG7800(1μM)处理。在RG7800处理后36h，使用被动裂解缓冲液(Promega,CA)裂解HEK293细胞，并通过蛋白质印迹测定亨廷顿蛋白(HTT)、Cas9和β联蛋白(Beta cat)蛋白水平。测定β联蛋白水平作为加载对照。使用ChemiDoc Imaging System(Bio-Rad)和Imagine Lab分析软件对HTT、Cas9和Beta Cat蛋白水平进行定量。

鉴于本公开，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经按照优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述方法以及所述方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体而言，显而易见的是，化学和生理相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时会获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改都视为在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

下述参考文献在一定程度上提供了示例性程序详情或补充本文所述内容的其他详情，这些参考文献通过引用明确地并入本文。

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