发育正常无肌间刺鱼类新品种培育方法

摘要

发育正常无肌间刺鱼类新品种培育方法，涉及一种无肌间刺鱼类新品种培育方法。本发明提供了一种在不影响鱼类正常生长的情况下，将肌间刺去除的方法。本发明发育正常无肌间刺鱼类新品种培育方法：一、敲除原有鱼类品种受精卵中的bmp6基因，获得F0代个体；二、对F0代进行突变体筛选，配组获得F1代群体；三、对F1代群体进行突变体筛选，选取具有相同移码突变的个体进行交配，构建F2代，筛选出F2中的纯合突变个体；四、对F2代纯合突变个体进行扩繁，获得无肌间刺鱼类的新品种。本发明能够获得肌间刺缺失的品系，且不影响生长，能够稳定遗传，可以解决生产上肌间刺小，难以发现，不易剔除的难题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种无肌间刺鱼类新品种培育方法。

背景技术

根据世界粮农组织的报告，全球鱼类养殖产量的90％来自于27种鱼类，而在这27种鱼类中有12种含有肌间刺，养殖产量占鱼类养殖产量的69％以上。肌间刺是硬骨鱼类的一种特有骨骼，位于肌节间的小骨骼，由肌腱或韧带骨化而来。因肌间刺的存在，会造成人们在食用过程中的不便，甚至身体伤害，同时也造成了鱼肉产品加工上的麻烦，因此肌间刺的遗传改良成为鱼类遗传育种的重要目标性状之一。

目前已有采用杂交育种制备少肌间刺品系的方法，如国家发明专利“异育银鲫新品系优化选育育苗方法”(专利号：ZL201010140103.X)和“一种生长快及少肌间刺的杂交鲂鲌的构建方法”(专利公开号：CN201710788633)，获得了肌间刺数量少的异育银鲫新品系和鲂、鲌杂交新品种。随着基因编辑技术的发展，鲍宝龙等(发明专利申请号：202010451275.2)采用基因编辑对鲢、鳙mstn基因进行了敲除，建立了肌间刺变粗的鲢和鳙新品种选育方法。高泽霞等研究发现，在斑马鱼中敲除scxa基因，可获得肌间刺数量减少70％以上的品系(发明专利申请号：201911104496.6；Nie et al.,2020)，但根据研究发现，此肌间刺数量减少的斑马鱼品系肋骨等主轴骨骼发育异常，影响了鱼体的正常生长(Nieet al.,2020；Kague et al.,2019)。虽然目前有采用基因编辑技术减少肌间刺数量的方法，但均有一些缺陷，影响鱼类正常生长。

发明内容

本发明提供一种在不影响鱼类正常生长的情况下，将肌间刺去除的方法。

本发明发育正常无肌间刺鱼类新品种培育方法：

一、敲除原有鱼类品种受精卵中的bmp6基因，获得F

二、对F

三、对F

四、对F

本发明通过基因编辑技术定向编辑鱼类的bmp6基因，能够获得肌间刺缺失的品系，且不影响生长，能够稳定遗传，可以解决生产上肌间刺小，难以发现，不易剔除的难题。通过基因编辑的方法可获得大量可稳定遗传的突变体鱼类。

附图说明

图1是实施例1突变检测交配策略示意图；Wild type为野生型个体、Cas9F

图2是实施例1中野生型菌落PCR产物测序峰图，下划线为靶位点，方框为bmp6基因敲除位点。

图3是实施例1中突变型菌落PCR产物测序峰图，下划线为靶位点，方框为bmp6基因敲除位点。

图4是实施例1中野生型AB系斑马鱼骨骼染色图做参照，存在明显肌间刺。

图5是实施例1中纯合突变型斑马鱼骨骼染色图，肌间刺完全缺失。

图6是实施例1中纯合突变型斑马鱼骨骼染色图，肌间刺完全缺失，并标注局部。

图7是图6局部放大图，箭头所示为肌间刺缺失。

图8是图6局部放大图，箭头所示为肌间刺缺失。

图9是实施例2中野生型AB系和纯合突变型斑马鱼体重生长对比曲线，WT为野生型，Mutant为突变型，纯合突变型斑马鱼和野生型AB系斑马鱼体重生长无显著性差异。

图10是实施例2中野生型AB系和纯合突变型斑马鱼体长生长对比曲线，WT为野生型，Mutant为突变型，纯合突变型斑马鱼和野生型AB系斑马鱼体长生长无显著性差异

图11是实施例3中野生型AB系和纯合突变型斑马鱼不同发育时期骨骼发育对比观察图。图11中A为8dpf野生型(体长6.12mm)；B为8dpf突变型(体长5.96mm)；C为14dpf野生型(体长7.32mm)；D为14dpf突变型(体长7.92mm)；E为20dpf野生型(体长9.87mm)；F为20dpf突变型(体长10.16mm)；G为26dpf野生型(体长11.27mm)；H为26dpf突变型(体长11.66mm)；I为32dpf野生型(体长12.38mm)；J为32dpf突变型(体长12.67mm)；K为38dpf野生型(体长15.42mm)；L为38dpf突变型(体长15.07mm)；M为44dpf野生型(体长17.02mm)；N为44dpf突变型(体长16.84mm)；O为50dpf野生型(体长17.98mm)；P为50dpf突变型(体长18.41mm)；Q为56dpf野生型(体长19.04mm)；R为56dpf突变型(体长19.85mm)。Af为臀鳍；Br为鳃条骨；Ct为椎体；Df为背鳍；Fp为支鳍骨；Fr为鳍条骨；Fro为额骨；Ga为鳃弓；Hs为脉棘；Hy为下咽骨；Imb为肌间刺；La为泪骨；Na为髓弓；Ns为髓棘；Or为眶骨；Op为鳃盖骨；Ot为耳石；Pa为颅顶骨；Pef为胸鳍；Pf为腹鳍；Pr为前上颌骨；Pra为前鳃盖骨；R为肋骨；Qu为方骨；Sc为上枕骨；So为上眶骨；Su为下鳃盖骨；Vc为脊柱。

图12是实施例4中野生型AB系斑马鱼和纯合突变型斑马鱼繁殖性能比较，突变型斑马鱼在受精率、孵化率和畸形率与野生型斑马鱼相比无显著性差异。图中A图为受精率，B图为孵化率，C图为畸形率，a表示野生型(wild type)和突变型(mutant)无显著性差异。

图13是实施例1中敲除前后——野生型AB系敲除前，杂合突变(变异序列)敲除后，序列对比图，注：-代表缺失碱基。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式发育正常无肌间刺鱼类新品种培育方法：

一、敲除原有鱼类品种受精卵中的bmp6基因，获得F

二、对F

三、对F

四、对F

本实施方式可采用基因编辑方法敲除原有鱼类品种受精卵中的bmp6基因。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一采用TALEN或CRISPR/Cas9方法对bmp6基因进行敲除。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：采用CRISPR/Cas9法对bmp6基因进行敲除：

①在bmp6基因外显子区域设计靶位点；

②采用体外转录的方法获得含有靶位点的sgRNA；

③将sgRNA与Cas9mRNA或者Cas9蛋白按比例混合，得到基因编辑试剂；

④将基因编辑试剂显微注射到亲本配对繁殖获得的单细胞期受精卵中。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点是：③中Cas9mRNA或Cas9蛋白与sgRNA的摩尔浓度为1:1～1:5。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点是：④中每个受精卵基因编辑试剂的注射量为1nL～5nL。其它步骤及参数与实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点是：步骤二将显微注射基因编辑试剂的F

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一的不同点是：步骤三：

3.1、将F

3.2、根据F

3.3、将F

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一的不同点是：步骤四：

4.1、F

4.2、对无肌间刺、基因型相同的纯合突变个体进行群体交配，获得生长正常的无肌间刺的群体。其它步骤及参数与实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一的不同点是：bmp6基因的外显子区域设计N个基因敲除靶位点。其它步骤及参数与实施方式一至八之一相同。

本实施方式中N为大于等于1的自然数。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一的不同点是：sgRNA的上游引物为

bmp6基因敲除靶位点中x为16～20；

sgRNA的下游引物的3’端加粗部分序列为与gRNA骨架5’端序列互补的序列，该下游引物为

实施例1、

斑马鱼发育正常无肌间刺新品种培育：

用野生型AB系斑马鱼(来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所自动循环水系统)。光暗周期比率为14h:10h(14h Light:10h Dark)；按雌雄3:2的比例将性成熟、健康的斑马鱼放入产卵盒内，用挡板将雌雄鱼分开。次日注射前将挡板取出，使其完成产卵与受精。

利用ChopChop在线(或者通过克隆获得bmp6序列，若因基因组复制导致bmp6基因具有多个拷贝，则需要获得所有拷贝的核苷酸序列)查找bmp6的靶位点GGN

表1

基因靶位点设计：

sgRNA的上游引物为

sgRNA的下游引物的3’端加粗序列为与gRNA骨架5’端序列互补的序列，该下游引物为

因此，本实施例中2个sgRNA的上游引物序列分别为

分别PCR扩增获得2个位点的sgRNA：

用浓度为10μM的sgRNA的上游引物和sgRNA的下游引物(因为上游引物和下游引物的gRNA骨架序列互补，所以可以无模板PCR扩增)，进行PCR扩增，扩增程序为95℃变性3min，进行30个循环的95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec；72℃延伸5min。获得PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，条带为120bp。检测后用PCR产物纯化回收试剂盒将PCR产物纯化回收，测定浓度待用。

sgRNA体外转录：

用NEB HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒(E2050S)体外分别合成2个位点的sgRNA，建立30μl体系：包括gRNA PCR回收产物1μg、NTP Buffer Mix 10μl、T7RNAPolymerase Mix 2μl、并用无酶水补足30μl。37℃转录4h，反应结束加入20μl无酶的水，混匀后加入2μl DNA酶DNase I，在37℃消化15min，去除未反应的DNA。将体外转录的sgRNA用RNA纯化试剂盒化回收后加入20μl无RNA酶的水。测定回收产物浓度，回收产物浓度在1000～4000ng/μl，保存在-80℃冰箱待用。

显微注射：

2种体外转录的sgRNA和Cas9蛋白按3:1的摩尔浓度比混合后室温孵育10min，加入25％的酚红后，注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中。sgRNA终浓度大于50ng/μl，对照组注射25％的酚红。

突变检测策略：

F

突变检测方法：

在胚胎或者鳍条样品中加入40μl裂解液(裂解液成分：蛋白酶K 0.5mg/ml、1MTris(PH8.0)10mM、KCl 50mM、0.3％T ween 20、0.3％NP 40)。用PCR仪消化样本，55℃50min，98℃10min。裂解后Vortex混匀，1000-2000rpm离心1-2min，取上清液作为PCR扩增模板。取2μl上清液为模板，20μl扩增体系，扩增程序同sgRNA的PCR扩增。用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测突变，将获得的突变F

敲除结果：

对外显子1的2个靶位点的野生型AB系(图2)和杂合突变F

骨骼染色观察：

采用阿尔新蓝和莤素红进行骨骼双染色，在F

骨骼染色发现，野生型AB系斑马鱼存在肌间刺(如图4所示)，纯合突变型斑马鱼肌间刺完全缺失(如图5～8所示)，纯合突变型斑马鱼品系的肋骨等主轴骨骼发育正常无影响。

实施例2

纯合突变型生长发育观察：

对14个野生型AB系斑马鱼家系和13个纯合突变型家系的生长进行了连续观察和测量，发现在15dph、30dph、45dph、60dph和70dph 5个发育时期中，纯合突变型斑马鱼的体重和体长与野生型AB系无显著性差异(如图9和图10所示)。

采用实施例1中获得的纯合突变型与野生型AB系杂交，杂交子代自交，构建F

实施例3

纯合突变型骨骼发育观察：

对3个野生型AB系和3个纯合突变型斑马鱼家系在9个发育时期进行了骨骼发育观察，阿尔新蓝和莤素红骨骼染色发现，除肌间刺外，纯合突变型斑马鱼的骨骼发育和野生型斑马鱼基本一致(如图11所示)。

采用实施例1中获得的突变纯合系与野生型AB系杂交，杂交子代自交，构建F

实施例4

纯合突变型繁殖能力分析：

对比了14个野生型AB系斑马鱼家系和13个纯合突变型家系的繁殖性能，发现纯合突变型斑马鱼在受精率、孵化率和畸形率上与野生型AB系斑马鱼家系无显著性差异(如图12所示)。

采用实施例1中获得的纯合突变型与野生型AB系杂交，杂交子代自交，构建F

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作出了描述，若在本发明基础上作出一些修改或改进，而其并不偏离本发明之精神，均属于本发明要求保护的范围。