基于褪黑激素的用于胃肠外施用的制剂

摘要

本发明涉及适合于胃肠外施用于新生儿的褪黑激素制剂。具体地，本发明涉及包含褪黑激素的纳米微粒的用于治疗新生儿脑损伤的药物制剂。该制剂可以是在使用前要被重构的粉末形式或在适合的水性媒介物中的随时可用的悬浮液形式。本发明还涉及该制剂的制备方法及其治疗用途。

说明书

本申请是申请日为2015年3月11日、申请号为20580012135.2、发明名称为“基于褪黑激素的用于胃肠外施用的制剂”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及适合于胃肠外施用的褪黑激素制剂。

具体地，本发明涉及包含褪黑激素纳米微粒的用于治疗新生儿脑损伤的制剂。

背景技术

新生儿、尤其是如果是早产新生儿极易感自由基氧化性损伤。实际上，出生时的婴儿：a)因从含氧量低的子宫内环境中迁移至子宫外生活而天然暴露于含氧量高的攻击，并且这种差异对在产房内复苏期间需要补充供氧的新生儿甚至更为显著；b)他们更易于感染，尤其是早产新生儿；c)他们具有减少的抗氧化防御；d)他们具有高水平的游离铁，其促进Fenton反应，从而导致高毒性自由基产生。氧化性应激可能也促成几种新生儿疾病的严重性，因为它可能通常同时影响各种器官，从而根据受损严重的器官产生不同的征兆。所述疾病包括支气管肺发育不良/慢性肺病(BDP/CLD)、早产儿视网膜病(ROP)和坏死性小肠结肠炎(NEC)。随后，显而易见自由基牵涉围产期脑损伤，并且影响动脉导管和肺循环。

为了抵抗自由基损伤，已经提出了许多在足月儿和早产儿中增加抗氧化能力的策略，并且已经使用对比结果实验了几种药物。

N-[2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)乙基]乙酰胺、称作褪黑激素是主要在松果腺中由神经递质5-羟色胺合成的内源性物质。褪黑激素在各种重要的生理功能中起关键作用，包括生物周期节律调节以及视觉、生殖、脑血管、神经内分泌和神经免疫学作用。褪黑激素是高度有效的自由基清除剂，其还通过刺激抗氧化酶合成和通过提高谷胱甘肽水平促进细胞的抗氧化潜能。另外，知晓褪黑激素通过保护线粒体动态平衡抵抗细胞能量耗尽，并且通过刺激复合物I和IV活性保护线粒体ATP合成。此外，经证实褪黑激素减弱小神经胶质活化和典型地与局部缺血缺氧发作相关的神经炎症应答。除了其充分记录的神经保护效能外，褪黑激素还是有意义的药物，这归因于其安全性及其通过所有生理屏障的和达到亚细胞室的能力。

鉴于这些特性，在最近的十年期间，褪黑激素已经开始被视为围产期窒息中有吸引力的神经保护剂。

另一方面，褪黑激素的口服生物利用度低且极为可变。此外，褪黑激素难溶于水并且在水中快速降解。在现有技术中，报告了证据，其显示在水溶液中的褪黑激素在所有pH值下逐步丧失效能，并且在暴露于光或氧时不稳定。在这方面，还众所周知一些稳定剂和/或防腐剂可能存在导致毒理学问题的可能性，尤其是在婴儿群体中。

另外，褪黑激素在婴儿中的药代动力学特性与成年人不同；因此，不能从成年人的研究中推断褪黑激素用于足月儿和早产儿的剂量。近期，Robertson N等人(Brain 136(1),2013,90-105)已经证实，对新生小猪静脉内施用褪黑激素在显著高剂量下(5mg/kg/h)增加低体温的神经保护作用。尽管如此，但是在该研究中使用的制剂不适合于在人体新生儿中施用。

鉴于该背景技术，所以高度有利的是提供物理学和化学上稳定、安全的制剂，其适合于胃肠外途经以便将高剂量的褪黑激素递送至新生儿，从而有效地治疗新生儿疾病，优选新生儿脑损伤。

使用本发明的制剂解决了将治疗剂量的褪黑激素安全和有效地递送至新生儿的问题。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及分散于水性媒介物中的粉末形式的药物制剂，该制剂包含：

i)纳米微粒，所述纳米微粒由与一种或多种磷脂类和任选地稳定剂的混合的作为活性成分的褪黑激素组成，所述一种或多种磷脂类选自磷脂酰胆碱类、磷脂酰甘油类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰丝氨酸类、磷脂酰肌醇、卵磷脂类，其中所述磷脂的至少一种被吸附在褪黑激素表面上；

ii)冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自甘露醇、甘油、丙二醇、甘氨酸、蔗糖、乳糖和海藻糖及其混合物。

有利地，在分散于水性媒介物中时，褪黑激素的浓度包含1.0-20mg/ml。

更优选地，所述磷脂具有高于80％的纯度。

在第二个方面，本发明涉及用于制备上述药物制剂的方法，包括下列步骤：i)将褪黑激素和一种或多种赋形剂溶于有机溶剂；ii)通过使用微型喷射反应器技术对作为抗溶剂的水的受控沉淀生成所述纳米微粒；iii)添加所述冷冻保护基；和iv)除去残留的有机溶剂和水。

在第三个方面，本发明涉及褪黑激素纳米微粒、其制备方法及其作为药物的用途。

在第四个方面，本发明涉及上述褪黑激素纳米微粒，其用于预防和/或治疗新生儿疾病，优选用于治疗新生儿脑损伤。

在第五个方面，本发明涉及上述褪黑激素纳米微粒在制备用于预防和/或治疗新生儿疾病、优选用于治疗新生儿脑损伤的药物中的用途。

在第六个方面，本发明提供用于预防和/或治疗患者中的新生儿疾病的方法，包括施用治疗有效量的上述褪黑激素纳米微粒。

在第七个方面，本发明涉及用于临时制备(estemporaneous preparation)的药剂盒：a)上述药物制剂；b)药学上可接受的水性媒介物；c)用于包含所述药物制剂和所述水性媒介物的容器装置。

定义

关于褪黑激素，术语“药物”、“活性成分”和“活性物质”可以互换使用。

术语“赋形剂”用于包括不明确的磷脂类和稳定剂。

术语“纳米微粒”是指具有包含1-1000纳米大小的直径的颗粒。所述直径可以根据本领域技术人员已知的方法测定，例如使用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜检查(TEM)。

表述“被吸附在表面上”是指赋形剂粘附在药物表面。该过程在表面上生成了赋形剂薄膜。可以通过FT-IR光谱法或通过示差扫描量热法(DSC)，根据本领域技术人员公知的操作测定赋形剂的吸附。典型地，就FT-IR分析而言：i)应当记录赋形剂和褪黑激素的参比光谱；ii)为了证实出现的吸收，干燥纳米微粒的FT-IR光谱应当仅显示赋形剂峰。就DSC分析而言，干燥的纳米微粒的热痕迹不应当显示药物的吸热熔化峰。

术语“抗溶剂”是指几乎没有或无对药物的溶剂化能力的液体。

术语“安全”是指适合于注射的药物制剂，其能够满足药物产品的注射能力标准，被新生儿充分耐受且没有可能对这些患者人群有害、抗原性或毒性的赋形剂。

表述“不溶于水或难溶于水”如参考欧洲药典(European Pharmacopoeia)2003年第4版2891页中所定义的在水中的溶解度使用。

术语“磷脂类”是指一类由甘油、磷酸基团、中性或两性离子部分作为表征部分(胆碱、丝氨酸、肌醇等)组成的脂质。甘油部分可以被长链脂肪酸(C

每个磷脂类型是对酯化脂肪酸而言变化的不同种类的混合物。

例如，根据来源的不同，磷脂酰胆碱类可以由不同比例的如下成分构成：1,2-二月桂基sn-甘油-3-磷酸胆碱，一般称作二月桂基-磷脂酰胆碱；1,2-肉豆蔻酰基sn-甘油-3-磷酸胆碱，一般称作二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，一般称作二棕榈酰基-磷脂酰胆碱；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，一般称作棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱；1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，一般称作棕榈酰基-亚油酰基-磷脂酰胆碱；1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，一般称作硬脂酰基-油酰基-磷脂酰胆碱；1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，一般称作硬脂酰基-亚油酰基-磷脂酰胆碱。

表述"纳米微粒中的药物负荷"是指已经载入纳米微粒的药物与其剂量的总含量之比。可以根据已知方法测定它，例如，通过过滤，然后测定上清液中药物的残留含量。上清液中药物的含量越低，则药物的负荷约有效。否则，可以在用乙醇溶解纳米微粒时，通过HPLC测定法测定药物负荷。

术语"临时制备"用于表示所有这样的情况，其中药物制剂并非制备成随时可用的(ready-to-use)，而是在制备粉末后随后的时间(通常是在接近给患者施用的时间)制备。

对于临时制备形式的制剂，表述“化学上稳定的”是指在室温下(25℃±2℃)储存至少1天、优选3天、更优选1周时，显示无药物从纳米微粒中损耗且无药物降解的制剂。

对于随时可用的制剂，表述“化学上稳定的”是指在室温下(25℃±2℃)储存至少3天、优选1周、更优选1个月、甚至更优选3个月时，显示无药物从纳米微粒中损耗且无药物降解的制剂。

对于临时制备形式的制剂，表述“物理上稳定的”是指这样的制剂，其显示在室温(25℃±2℃)下在储存至少1天、优选3天的过程中实质上无粒度生长，易于再分散，且在再分散时，既未观察到聚集物，也未观察到从水性媒介物中快速分离，从而防止活性成分重复施用。

对于随时可用的制剂，表述“物理上稳定的”是指这样的制剂，其显示在室温(25℃±2℃)下在储存至少3天、优选1周的过程中实质上无粒度生长，易于再分散，且在再分散时，既未观察到聚集物，也未观察到从水性媒介物中快速分离，从而防止活性成分重复施用。

术语“治疗有效量”是指在递送至新生儿时提供所需的生物学效果的活性成分用量。

术语“预防”是指用于减少疾病发生的治疗用途。

术语“治疗”是指用于减轻、治愈、缓解症状、减轻症状、诱导疾病消退疗法的治疗用途。

发明详述

褪黑激素因其抗氧化活性及其其它药理学特性而可以成功地应用于预防和/或治疗一些新生儿疾病。

然而，施用相当高剂量的必要性使得研发液体制剂是困难的。

因此，本发明的目的在于提供物理学和化学上稳定的、安全的药物制剂，其适合于新生儿中的胃肠外施用途经，其中褪黑激素的浓度有利地包含1.0-20mg/ml。

更有利地，该浓度应当包含1.2-15mg/ml，甚至更有利地为3-12mg/ml，优选5-10mg/ml。

在本发明的一个具体的实施方案中，褪黑激素的浓度应当为5mg/ml。

褪黑激素可以作为游离碱或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物的形式使用。

所述药物制剂包含褪黑激素纳米微粒和再混悬于水性媒介物中的冷冻保护剂。

有利地，所述纳米微粒具有包含20-1000纳米的直径，更有利地30-500纳米，甚至更有利地40-350纳米，优选60-250纳米。

在一个优选的实施方案中，所述直径可以包含100-200纳米，因为所述大小适合于通过过滤灭菌。

已经通过动态光散射(DLS)，根据本领域技术人员已知的实验条件测定了纳米微粒的直径。

在所述实施方案中，至少一种磷脂被吸附在褪黑激素表面上，按照这样的方式，在重新混悬于水性媒介物中时，可以避免聚集和/或颗粒生长。

此外，众所周知，低药物负荷可以导致均一性问题。

令人惊奇地发现，通过适当选择磷脂，能够在纳米微粒中实现高药物负荷，其有利地等于或高于65重量％，优选高于80％、更优选高于90％。

最终，可以保证药物制剂在其处理和储存期间的稳定性，无需将纳米微粒保持在受控的温度和/或相对湿度条件下。

磷脂类是可生物降解的、无毒性的、非抗原性物质，这使得它们成为用于胃肠外施用的适合的候选物。

所述磷脂选自磷脂酰胆碱类、磷脂酰甘油类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰丝氨酸类、磷脂酰肌醇、卵磷脂类及其混合物，且任选地其与可能有助于稳定纳米微粒的药剂的混合使用。

有利地，所述磷脂具有对新生儿胃肠外施用可接受的纯度，优选高于80％，更优选高于90％，甚至更优选等于或高于99％。

在本发明的一个实施方案中，如果预期使用磷脂的混合物，则例如，可以从大豆油、向日葵油或蛋黄中提取不同来源的卵磷脂类。例如，具有不同纯度的卵磷脂类可以商购自Sigma Aldrich Co,St.Louis,MO,USA或Lipoid AG,Steinhausen,Switzerland或AppliChem GmbH,Darmstadt,Germany。

在另外的实施方案中，可以使用用于胃肠外施用的足够纯度和品质的单一磷脂类，例如，购自LipoidAG。

在一个具体的实施方案中，可以使用磷脂酰胆碱或氢化磷脂酰胆碱，其分别作为Lipoid S100或Phospholipon 80H商购自Lipoid AG。

在一个更优选的实施方案中，使用作为Lipoid S 100购自Lipoid AG的90％纯度的磷脂酰胆碱。

在本发明的一个优选的实施方案中，使用磷脂酰胆碱和卵磷脂的混合物，优选的比例按重量计包含70:30-99:1，更优选的比例按重量计包含80:20-98:2。

任选地，可以将可能有助于稳定纳米微粒的另外的药剂(下文的稳定剂)加入到制剂中以进一步增加褪黑激素纳米微粒的物理稳定性并且调节纳米微粒的粒度。另一方面，应当适当控制所述稳定剂的量以避免胶束形成。

有利地，所述稳定剂可以是生育酚，优选D,Lα-生育酚，也称作维生素E。在另一个实施方案中，所述药剂可以是脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，优选钠盐。所述稳定剂可以单独使用或以其混合物的形式使用。

适合于胃肠外施用于新生儿的纯度和品质的所述药剂商购自Sigma Aldrich Co,St.Louis,MO,USA或Alfa Aesar GmbH,Karlsruhe Germany)。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述稳定剂是C12-C24饱和或不饱和脂肪酸，优选C14-C18饱和或不饱和脂肪酸，更优选棕榈酸或油酸或其药学上可接受的盐。

在一个甚至更优选的实施方案中，所述稳定剂是纯度高于99％的商购自LipoidAG的油酸钠。

本发明的药物组合物还包含任意重量比的冷冻保护剂，其选自甘露醇、甘油、丙二醇、甘氨酸、蔗糖、乳糖和海藻糖及其混合物，优选任意重量比的甘露醇、海藻糖和甘氨酸、更优选甘露醇或海藻糖或其混合物。

在本发明的优选实施方案之一中，所述冷冻保护剂是甘露醇和海藻糖的混合物，其比例按重量计包含6:4-4:6，更优选按重量计1:1的比例。

实际上，已经发现，所述冷冻保护剂的混合物显著改善了在水性媒介物中的粉末形式的纳米微粒的再分散性。此外，包含所述冷冻保护剂的混合物的药物组合物被证明是化学和物理学稳定的。

有利地，所述冷冻保护剂可以以能够产生这样的浓度的量存在：5-100mg/ml，优选20-80mg/ml，更优选25-50mg/ml。更有利地，应当使用具有适合于胃肠外施用于新生儿的纯度的冷冻保护剂，例如，其购自Sigma Aldrich Co,St.Louis,MO,USA或BDH Middle EastLLC,Qatar。

有利地，在本文公开的药物制剂中，褪黑激素的存在量可以为2-85重量％，其余部分为占5-50重量％的一种或多种磷脂，或任选地其与稳定剂的混合物和10-93重量％的冷冻保护剂。

在本发明的一个具体的实施方案中，褪黑激素的存在量可以为5-15重量％，磷脂任选地与稳定剂的混合物中的存在量包含15-60重量％，且冷冻保护剂的量包含25-80重量％。

有利地，如果在纳米微粒中，褪黑激素仅与一种或多种磷脂组合使用，而不使用稳定剂，则褪黑激素与磷脂的比例按重量计可以为0.1:99.9-90:10。

在一些实施方案中，该比例按重量计可以在90:10-20:80之间改变。

在另外的实施方案中，例如，当单独或以其与卵磷脂的混合物使用磷脂酰胆碱时，该比例按重量计可以在2:98-25:75之间改变。

如果在纳米微粒中，褪黑激素与磷脂和稳定剂组合使用，则该比例按重量计可以为98:1:1-30:40:30。

例如，如果褪黑激素与磷脂酰胆碱和脱氧胆酸或其盐组合使用，则该比例按重量计可以为5:90:5-30:55:15。更优选该比例按重量计为10:80:10。

如果褪黑激素与磷脂酰胆碱和油酸钠组合使用，则该比例按重量计有利地为10:89.999:0.001-30:40:30。在一个具体的实施方案中该比例按重量计可以包含10:89.999:0.001-15:84.9:0.1。

在这方面，在一些示例性的实施方案中，该比例按重量计可以为：14.3:85.67:0.03或14.3:85.685:0.015或14.3:85.693:0.007或14.3:85.697:0.003。

在另一个具体的实施方案中，该比例按重量计可以为30:40:30-20:60:20。

在这方面，在一些示例性的实施方案中，该比例按重量计可以为26:47:27或23:55:22。

如果褪黑激素与卵磷脂和维生素E组合使用，则该比例按重量计相应地可以为45:50:5-96:3:1。示例性比例按重量计可以为55:43:3或76:20:4或85:10:5。

可以将本文公开的纳米微粒以干燥固体形式和在使用前临时制备的分散体形式的相关药物制剂形式储存。

或者，可以通过将褪黑激素纳米微粒和冷冻保护剂分散于适合的水性媒介物制备随时可用的药物制剂。

可以使用适合于胃肠外施用的任意药学上可接受的水性媒介物，例如注射用水。否则，可以使用适当浓度的盐水溶液或葡萄糖溶液，该浓度应当由本领域技术人员调整。在一些实施方案中，可以优选生理盐水溶液(0.9％w/v氯化钠)。

在另外的实施方案中，可以有利地使用5％或10％w/v浓度的葡萄糖水溶液。

本发明的药物制剂可以包含另外的赋形剂，例如pH缓冲剂，例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液，优选磷酸盐；和防腐剂。

有利地，所述药物制剂的pH包含4.5-8.0，优选5.5-7.5。

在一个具体的实施方案中，本发明的药物制剂包含如下成分的纳米微粒：5-15重量％的褪黑激素、40-60重量％的磷脂酰胆碱和油酸钠的混合物和35-45重量％的作为冷冻保护剂的甘露醇，该纳米微粒分散于药学上可接受的水性媒介物中，其中，优选在分散时，褪黑激素的浓度为5mg/ml。

在另一个具体的实施方案中，本发明的药物制剂包含由与15-25重量％的磷脂酰胆碱和卵磷脂的混合物和作为冷冻保护剂的60-80重量％的甘露醇和海藻糖的混合物混合的5-15重量％的褪黑激素组成的纳米微粒，其待分散于药学上可接受的水性媒介物中。优选地，在分散于所述媒介物中时，褪黑激素的浓度为5mg/ml。

由于本发明的药物制剂应当适合于胃肠外施用，所以其渗透性(osmoticity)具有特别的重要性。因此，本发明的制剂应当具有下述的重量克分子渗透浓度：低于600mOsm/kg，有利地为180mOsm/kg-500mOsm/kg，更有利地为200-400mOsm/kg，优选250-350mOsm/kg。

在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的药物制剂可以通过静脉内注射或通过输注施用。

如果通过输注施用，则可以恰好在使用前将该药物制剂再分散于盐水或葡萄糖水溶液并且通过适当的输注泵递送。

由于在文献中报告了褪黑激素通过胎盘，所以在一个可选的实施方案中，本发明的药物制剂可以在出生前施用于孕妇(Miller SL等人J Pineal Res.2014年1月23日；Alers NO等人BMJ Open.2013年12月23日；3(12))。

典型地，制剂中褪黑激素的浓度和由此的其剂量随患者的性别、体重和成熟度以及患者症状的严重性的不同而改变。本领域技术人员能够确定这些因素并且由此调整该浓度。

作为一个实例，可以每天一次或多次施用本发明的药物制剂，以便实现1-40mg/kg/天(die)的剂量，有利地是5-35mg/kg/天，优选30mg/kg/天。

在优选的实施方案之一中，通过以5mg/kg/小时输注施用该制剂，持续6小时，以便总剂量为30mg/kg/天。

本发明还提供用于制备本发明药物制剂的方法，该方法包括下列步骤：

i)将褪黑激素和一种或多种赋形剂溶于有机溶剂；

ii)通过使用微型喷射反应器技术对作为抗溶剂的水的受控沉淀生成所述纳米微粒；

iii)添加冷冻保护剂；和

iv)除去残留的有机溶剂和水。

根据磷脂和/或稳定剂类型的不同，适合的有机溶剂可以选自下组，包括、但不限于DMSO、甲醇、异丙醇或乙醇，优选DMSO或乙醇，更优选乙醇。

然而，由于发现残留有机溶剂明显地危害本发明纳米微粒的物理稳定性，所以应当根据本领域中报道的方法除去它们。

优选地，通过使步骤iii)结束时得到的悬浮液根据本领域技术人员公知的方法进行冻干步骤除去它们。

在冻干后，收集所述药物制剂，得到粉末，使用前重构或再混悬于适合的水性媒介物，得到随时可用的药物制剂。

微型喷射反应器技术的细节和操作参数公开在US 2011/0294770中，将其教导引入本文参考。

为了优化沉淀步骤，本领域技术人员应当根据其知识适当调整所有参数，特别是有机溶液和水的流速及其混合比。

任选地，本发明的纳米微粒和/或其药物制剂是无菌的。

可以根据已知方法实现灭菌。例如，可以通过γ射线照射对纳米微粒灭菌，而可以通过过滤或通过高压灭菌处理对随时可用的药物制剂灭菌。

本发明的褪黑激素纳米微粒及其药物制剂可以用于预防和/或治疗其中存在氧化性应激贡献的任意新生儿疾病。这些疾病包括、但不限于支气管肺发育不良/慢性肺病(BDP/CLD)、早产儿视网膜病(ROP)、坏死性小肠结肠炎(NEC)和因围产期窒息和低氧-缺血性脑病(HIE)导致的脑损伤。

具体地，本发明的褪黑激素纳米微粒可以用于预防和/或治疗以细胞死亡为特征的病理学情况，特别是HIE。

本发明的褪黑激素纳米微粒还可以用于预防和/或治疗其它低氧-缺血性新生儿脑损伤，包括围产期脑卒中(Perinatal Arterial Stroke)(PAS)和脑室周围白质软化(Periventricular Leucomalakia)(PVL)。

目前，低温被视为用于围产期窒息和HIE的有效治疗方法形态。因此，本发明褪黑激素与低温的组合的应用可以导致比单独的低温更大的脑神经保护作用，由此改善中期和长期临床结果。

由于新生儿且特别是那些早产的新生儿对氧化的防护性低且高度易感自由基介导的氧化性损伤，所以本发明的纳米微粒还可以用于减轻具有脓毒症、呼吸窘迫综合征或手术应激的新生儿的氧化性应激。

此外，考虑到其已知的极为良好的安全特征，可以施用本发明的褪黑激素纳米微粒以便预防和/或治疗任意的疾病(其中褪黑激素可能具有一些有益性)。例如，它们可以用作许多应用的协作剂(coadjuvant)，包括典型地与儿科年龄相关的病症，例如：

-睡眠异常和开始和维持睡眠困难。其中有睡眠时相延迟综合征(DSPS)和睡眠时相前移综合征(advance sleep-phase syndrome)(ASPS)；

-影响不规则睡眠唤醒模式的神经损伤，例如：心智和智力发育迟滞(mental orintellectual disabilities)、精神发育迟滞、学习失能、孤独性谱群疾病、Rett综合征、结节性硬化症、发育性残疾和Angelman综合征；

-睡眠问题，包括延迟性睡眠发作、睡眠或就寝时间抵抗、清醒时疲劳延长和日间嗜睡以及注意力缺陷伴多动障碍(ADHD)、Smith Magenis综合征(SMS)和Sanfilippo综合征(SFS)。

本发明还涉及用于临时制备的药剂盒，其包含：a)本发明的药物制剂；b)药学上可接受的水性媒介物；c)用于包含所述药物制剂和所述水性媒介物的容器装置。

在一个优选的实施方案中，作为药学上可接受的水性媒介物，可以使用注射用水。

在另一个实施方案中，可以使用生理盐水溶液(0.9％w/v氯化钠)。

参照下列实施例示例本发明。

实施例1-磷脂酰胆碱存在下的褪黑激素纳米微粒的制备

为了制备该纳米微粒，将褪黑激素以25或50mg/mL的浓度在具有5-300mg/mL浓度的磷脂酰胆碱(Lipoid S 100，Lipoid AG)的存在下溶于乙醇。

使用微型喷射反应器技术使这些溶液对水沉淀。在沉淀过程期间，将褪黑激素溶液的流速调整至1-4ml/min并且将水的流速调整至10mL/min。0.1或0.2巴的气压用于确保产生均匀纳米微粒。在沉淀过程的自始至终将微型喷射反应器温度调整至25-40℃。

在30℃真空除去残留的有机溶剂。

为了测定药物负荷，通过0.02μm注射器式滤器过滤水相纳米微粒中游离褪黑激素浓度并且以16000r.p.m.离心90min。

还在粒度方面通过经动态光散射(DLS)测定其直径表征褪黑激素纳米微粒。

将结果报道在表1中。

表1

正如可以理解的，可以制备具有低于约15％的游离褪黑激素含量的褪黑激素纳米微粒。样品的一些具有低于200纳米的粒度，其适合于过滤灭菌。

实施例2–在磷脂酰胆碱和脱氧胆酸钠存在下褪黑激素纳米微粒的制备

将褪黑激素以25或50mg/mL的浓度在具有5-200mg/mL浓度的磷脂酰胆碱(LipoidS 100，Lipoid AG)和15或25mg/mL浓度的脱氧胆酸钠的存在下溶于乙醇。在沉淀期间，将褪黑激素溶液的加工流速(process flow rate)调整至3-4ml/min并且将水的流速调整至10mL/min。0.2巴的气压用于确保产生均匀纳米微粒。在沉淀过程的自始至终将微型喷射反应器温度调整至25-40℃。

在30℃真空蒸发残留的有机溶剂。

此外，对于所有制剂，纳米微粒悬浮液接近一定体积(made up to volume)以便将活性成分浓度再调整至约5mg/ml。

如实施例1中报道的，在粒度方面表征得到的褪黑激素纳米微粒。

此外，在用乙醇溶解时，通过HPLC测定纳米微粒中的总褪黑激素含量。

将结果报道在表2中。

表2

正如可以理解的，在实验误差范围内，褪黑激素的浓度与高于95％的药物负荷一致。

所述粒度包含100-200nm。

实施例3-褪黑激素纳米微粒的稳定性

将实施例2的样品5(其中褪黑激素、磷脂酰胆碱和脱氧胆酸钠以10:80:10重量比使用)放入小瓶并且储存在室温下。1周储存后，表征纳米微粒悬浮液的褪黑激素含量和粒度，如实施例2中报道的。

将结果报道在表3中。

表3

正如上文观察到的，经证实所述制剂可以稳定证实1周。

实施例4-冻干制剂

根据下列程序通过添加甘露醇作为冷冻保护剂冻干实施例2的样品1和5：

将得到的冻干的纳米微粒分散于注射用水，得到不同浓度的褪黑激素和甘露醇。

分析得到的样品的含量和粒度，如实施例2中报道的。

将结果报道在表4中。

表4

经证实这些制剂是充分可分散的。特别地，添加25或50mg/mL甘露醇在冻干后产生纳米微粒的完全分散性。

实施例5-卵磷脂和维生素E存在下褪黑激素纳米微粒的制备

为了制备所述纳米微粒，将褪黑激素以150或200mg/mL的浓度在浓度为0.7mg/mL的卵磷脂(Lipoid AG)和浓度为0.5、1.2mg/ml的维生素E的存在下溶于DMSO。

在沉淀过程期间，调整褪黑激素和水的流速以便具有1:1v/v的混合比。

0.2巴的气压用于确保产生均匀纳米微粒。在沉淀过程的自始至终将微型喷射反应器温度调整至25-40℃。

在30℃真空蒸发残留的有机溶剂。

然后，对于所有制剂，纳米微粒悬浮液接近一定体积以便将活性成分浓度再调整至约5mg/ml。

将组成报道在表5中。

表5

实施例6-磷脂酰胆碱和油酸钠存在下褪黑激素纳米微粒的制备

将褪黑激素以25mg/mL的浓度在浓度为150mg/ml的磷脂酰胆碱(Lipoid S 100,Lipoid AG)和浓度为0.05mg/ml的油酸钠(Lipoid Natriumoleat B,Lipoid AG)的存在下溶于乙醇。在沉淀过程期间，将褪黑激素溶液的流速调整至3-4ml/min，而将水的流速调整至10mL/min。0.2巴的气压用于确保产生均匀纳米微粒。在沉淀过程的自始至终将微型喷射反应器温度调整至25-40℃。

然后，对于所有制剂，纳米微粒悬浮液接近一定体积以便将活性成分浓度再调整至约5mg/ml。

如实施例1中报道的，在粒度方面表征得到的纳米微粒。

将结果报道在表6中。

表6

然后在添加甘氨酸或甘露醇时冻干样品，如实施例4中报道的，以便达到25mg/ml的冷冻保护剂的终浓度。

实施例7-磷脂酰胆碱和卵磷脂的存在下褪黑激素纳米微粒的制备

将褪黑激素(50mg/ml)在不同比例的磷脂酰胆碱(Lipoid S 100,Lipoid AG)和大豆卵磷脂(Lipoid S PC-3,Lipoid AG)的存在下溶于乙醇。在沉淀过程期间，将褪黑激素溶液的流速调整至2ml/min，并且将水的流速调整至10mL/min。0.2巴的气压用于确保产生均匀纳米微粒。在沉淀过程的自始至终将微型喷射反应器温度调整至25-40℃。

通过添加1:1重量比的甘露醇和海藻糖作为冷冻保护剂，根据实施例4的条件，冻干样品1。

对于所有制剂，将得到的冻干粉末分散于注射用水，得到约5mg/ml的褪黑激素浓度。

将得到的制剂的组成和褪黑激素纳米微粒的粒度报道在表7中。

表7

分析得到的样品的药物负荷和粒度，如实施例1中报道的。

经证实全部制剂是充分可分散的，其中药物负荷高于80％。

实施例8-冻干的药物制剂的稳定性

将如实施例7中制备的冻干制剂1的样品储存在25℃和40℃下，以评价制剂的稳定性。

在每一时间点，用水再混悬冻干物，并且在再混悬后即刻(0h)以及在室温(约25℃)下储存8(8h)和24小时(24h)后评价。

通过HPLC检查化学稳定性，同时在视觉上评价物理学稳定性。如实施例1中报道的测定粒度。还评价了pH。

将结果报道在表8中。

表8

所述制剂被证明是化学和物理学稳定的至少3个月。作为重构的悬浮液，还被证明稳定至少24小时。

实施例9-在卵磷脂和维生素E的存在下包含褪黑激素纳米微粒的的药物制剂的制备

为了制备纳米微粒，将褪黑激素以25或50mg/mL的浓度在50mg/mL浓度的卵磷脂(Lipoid AG)和0.5、1、2或4mg/ml浓度的维生素E的存在下溶于乙醇。

在沉淀过程期间，调整褪黑激素溶液和水的流速，以便具有1:2.5v/v的混合比。

0.2巴的气压用于确保产生均匀纳米微粒。在沉淀过程的自始至终将微型喷射反应器温度调整至25-40℃。

然后，如实施例4中报道的，在添加甘氨酸或甘露醇时，冻干样品，以便达到50-100mg/ml的冷冻保护剂的终浓度。

本发明还包括下述具体实施方案：

1.待分散于水中的药物制剂，该制剂包含：

i)纳米微粒，所述纳米微粒由与一种或多种磷脂类和任选的稳定剂混合的作为活性成分的褪黑激素组成，所述一种或多种磷脂类选自磷脂酰胆碱类、磷脂酰甘油类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰丝氨酸类、磷脂酰肌醇类、卵磷脂类，其中所述磷脂的至少一种被吸附在褪黑激素表面上；

ii)冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自甘露醇、甘油、丙二醇、甘氨酸、蔗糖、乳糖和海藻糖及其混合物。

2.根据具体实施方案1的药物制剂，其中在分散于水性媒介物中时，褪黑激素的浓度包含1.0-20mg/ml。

3.根据具体实施方案1或2的药物制剂，其中所述磷脂具有高于80％的纯度。

4.根据具体实施方案1-3中任一项的药物制剂，其中所述磷脂是磷脂酰胆碱或其与卵磷脂的混合物。

5.根据前述具体实施方案中任一项的药物制剂，其中所述稳定剂选自生育酚类、脱氧胆酸或其药学上可接受的盐和C12-C20饱和或不饱和脂肪酸。

6.根据具体实施方案5的药物制剂，其中生育酚是维生素E。

7.根据具体实施方案5的药物制剂，其中脱氧胆酸是钠盐的形式。

8.根据具体实施方案5的药物制剂，其中所述脂肪酸是油酸或其钠盐。

9.根据前述具体实施方案中任一项的药物制剂，其中所述冷冻保护剂是甘露醇或海藻糖或其混合物。

10.根据前述具体实施方案中任一项的药物制剂，包含另外的赋形剂，所述赋形剂选自pH缓冲剂和防腐剂。

11.用于制备根据具体实施方案1-10中任一项的药物制剂的方法，包括下列步骤：i)将褪黑激素和一种或多种赋形剂溶于有机溶剂；ii)通过使用微型喷射反应器技术对作为抗溶剂的水的受控沉淀生成纳米微粒；iii)添加冷冻保护剂；和iv)除去残留的有机溶剂和水。

12.根据具体实施方案11的方法，其中通过冻干除去步骤iv)的有机溶剂和水。

13.纳米颗粒，所述纳米颗粒由与一种或多种磷脂类和任选的稳定剂混合的作为活性成分的褪黑激素组成，所述一种或多种磷脂类选自磷脂酰胆碱类、磷脂酰甘油类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰丝氨酸类、磷脂酰肌醇类、卵磷脂类，其中所述磷脂的至少一种被吸附在褪黑激素表面上。

14.用于制备根据具体实施方案13的纳米微粒的方法，包括下列步骤：i)将褪黑激素和一种或多种赋形剂溶于有机溶剂；ii)通过使用微型喷射反应器技术对作为抗溶剂的水的受控沉淀生成所述纳米微粒；iii)除去残留的有机溶剂和水。

15.根据具体实施方案13的褪黑激素纳米微粒，用于预防和/或治疗新生儿疾病。

16.药剂盒，包含：a)根据具体实施方案1-10中任一项的药物制剂；b)药学上可接受的水性媒介物；c)用于包含所述药物制剂和水性媒介物的容器装置。